CZ291488B6

CZ291488B6 - Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi

Info

Publication number: CZ291488B6
Application number: CZ20001772A
Authority: CZ
Inventors: Thomas Wayne Strickland; Thomas Edward Byrne; Steven George Elliott
Original assignee: Kirin-Amgen, Inc.
Priority date: 1989-10-13
Filing date: 2000-05-12
Publication date: 2003-03-12
Also published as: PT95586A; AU646822B2; SK284429B6; JP2983629B2; FI105688B; CZ291471B6; NO912281L; SK497290A3; IL95971A0; DE69033301D1; NO301832B1; ZA908166B; EP0428267A2; EP0428267B1; IL125175A; PT95586B; JP3073905B2; IE903663A1; NO912281D0; CA2027635A1

Abstract

Erythropoietin, sest vaj c z biologicky aktivn ch erythropoietinov²ch molekul, maj c ch stejn² po et sialov²ch kyselin na molekulu, kde uveden² po et je vybr n ze skupiny, zahrnuj c 1 a 14. Farmaceutick kompozice, obsahuj c terapeuticky · inn mno stv v²Üe uveden ho erythropoietinu a farmaceuticky p°ijateln °edidlo, p° sadu nebo nosi .\

Description

Erythropoietin a farmaceutická kompozice na jeho bázi

Oblast techniky

Vynález se týká erythropoietinu a farmaceutické kompozice na jeho bázi.

Dosavadní stav techniky

Erythropoietin je glykoproteinový hormon zjištěný při zrání erythroidních progenitorových buněk na erythrocyty. Má podstatný význam při regulaci hladin červených krvinek v oběhu. Přirozeně se vyskytující erythropoietin je produkován játry během fetálního života a ledvinami u dospělých a cirkuluje v krvi a stimuluje produkci Červených krvinek v kostní dřeni. Anemie je téměř vždy důsledek renálního poškození, působícího snížení produkce erythropoietinu v ledvinách. O rekombinantním erythropoietinu, produkovaném technikami genového inženýrství, zahrnujícími expresi proteinového produktu hostitelskými buňkami transformovanými genem kódujícím erythropoietin bylo zjištěno, zeje účinný, jestliže je použije při léčení anemie vzniklé z chronického renálního poškození.

Dosud byla dostupnost erythropoietinu velmi omezena. I když je protein přítomen v lidské moči, vylučovaná množství jsou příliš nízká pro praktický zdroj erythropoietinu pro terapeutické využití. Pacienti postižení aplastickou anemií vykazují zvýšení hladiny urinámího erythropoietinu ve srovnání se zdravými individui, ale omezené množství takové moče rovněž činí tento zdroj nepraktickým. Purifikace lidského urinámího erythropoietinu podle Miyakeho a spol., J. Biol. Chem., 252, 5558 (1977), používá jako výchozí materiál moč od osob s aplastickou anemií.

Identifikace, klonování a exprese genů, kódujících erythropoietin je popsána v patentu US 4 703 008 Linnem. Popis purifikace rekombinantního erythropoietinu z buněčného media, podporujícího růst savčích buněk, obsahujících rekombinantní erythropoietinové plasmidy je např. zahrnuta v patentu US 4 667 016 Laie a spol. Exprese a získání biologicky aktivního rekombinantního erythropoietinu ze savčích hostitelských buněk, obsahujících erythropoietinový gen v rekombinantním plasmidu, poskytuje v první řadě dostatečné množství erythropoietinu vhodného pro terapeutické aplikace. Dále znalost genové sekvence a dostupnost větších množství purifikovaného proteinu umožňuje lepší pochopení působení tohoto proteinu.

Biologická aktivita proteinu je závislá na jeho struktuře. Zejména primární struktura proteinu (tj. jeho aminokyselinová sekvence) poskytuje informaci, která umožňuje formulaci sekundární (např. α-helix nebo β—list) a terciární (trojrozměrné přehyby) struktury polypeptidu během a po jeho syntéze. Přerušení vlastních sekundárních a terciárních struktur zavedením mutací nebo chemických nebo enzymatickým zpracováním, může vést ke snížení biologické aktivity.

V prokaryotních organismech jsou biologické aktivity proteinů z velké části ovládány výše uvedenými strukturami. Na rozdíl od proteinů z prokaryotních buněk je mnoho buněčných povrchů a sekretovaných proteinů produkovaných v eukaiyotních buňkách modifikováno jednou nebo více oligosacharidovými skupinami. Tato modifikace označovaná jako glykosylace může výrazně ovlivnit fyzikální vlastnosti proteinů a může také být důležitá pro stabilitu proteinu, sekreci a subcelulámí lokalizaci. Vlastní glykosylace může mít základní význam pro biologickou aktivitu. Některé geny z eukaiy otních organismů, když jsou exprimovány v bakteriích (např. E. coli), které postrádají celulámí procesy pro glykosylaci proteinů, poskytují proteiny, které mají malou nebo žádnou aktivitu díky nedostatku glykosylace.

Glykosylace se uskutečňuje při specifických místech podél polypeptidového hlavního řetězce a je obvykle dvou typů: O-vázané oligosacharidy jsou spojené se serinovými nebo threoninovými

-1 CZ 291488 B6 zbytky, zatímco N-vázané oligosacharidy jsou připojeny k asparaginovým zbytkům, jestliže jsou tyto části sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina s výjimkou prolinu. Struktury N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a cukerných zbytků nalezené v každém typu, jsou rozdílné. Jeden typ cukru je obvykle nalezen na obou, je jím N-acetyl5 neuraminová kyselina (dále nazývaná jako sialová kyselina). Sialová kyselina je obvykle terminální zbytek obou N-vázaných a O-vázaných oligosacharidů a díky svému negativnímu náboji uděluje glykoproteinu kyselý charakter.

Jak lidský z moče získaný erythropoietin, i rekombinantní erythropoietin (exprimovaný v savčích 10 buňkách), mající aminokyselinovou sekvenci 1-165 lidského erythropoietinu, obsahují tři

N-vázané a jeden O-vázaný oligosacharidový řetězec, kde tyto řetězce tvoří asi 40 % celkové molekulové hmotnosti glykoproteinu. N-vázané glykosylace probíhá na asparaginových zbytcích, umístěných v polohách 24, 38 a 83, zatímco O-vázaná glykosylace probíhá na serinovém zbytku umístěném v poloze 126 (Lai a spol., J. Biol. Chem. 261, 3116 (1986); Broudy 15 a spol. Arch. Biochem. Biophys. 265, 329 (1988). Oligosacharidové řetězce mohou být modifikovány terminálními zbytky sialové kyseliny. Enzymatické zpracování glykosylovaného erythropoietinu pro odstranění zbytků sialové kyseliny vede ke ztrátě in vivo aktivity, ale nepůsobí ztrátu aktivity in vitro (Lowy a spol., Nátuře 185, 102 (1960); Goldwasser a spol., J. Biol. Chem. 249, 4202 (1974)). Toto chování může být využito při rychlém odstranění asialo20 erythropoietinu z oběhu po interakci s hepatickým proteinem, který váže asialoglykoprotein (Morrell a spol. J. Biol. Chem. 243, 155 (1968); Briggs a spol. Am J. Phisiol. 227, 1385 (1974); Ashwell a spol., Methods Enzymol. 50, 287 (1978)). Erythropoietin tak vykazuje in vivo biologickou účinnost pouze, když je sialylová, a je tak zabráněno jeho vazbě hepatickým vázacím proteinem.

Úloha jiných složek v oligosacharidových řetězcích není definována dostatečně. Bylo zjištěno, že neglykosylovaný erythropoietin má velmi sníženou in vivo aktivitu ve srovnání s glykosylovanou formou, ale udržuje si aktivitu in vitro (Dordal a spol. Endocrinology 116, 2293 (1985); Linův patent výše). V další studii nicméně odstranění N-vázaných nebo O-vázaných oligosacharido30 vých řetězců jednotlivě nebo společně mutagenesí asparaginových nebo serinových zbytků, které jsou glykosylačními místy, výrazně snižuje in vitro aktivitu přeměněného erythropoietinu, který je produkován v savčích buňkách (Dube a spol. J. Biol. Chem. 263,17516 (1988)).

Glykoproteiny jako je erythropoietin mohou být separovány na různě nabité formy za použití 35 technik jako je isoelektrická fokusace (IEF). Jsou uváděny IEF studie surového a částečně purifikovaných erythropoietinových přípravků (Lukowsky a spol., J. Biochem 50, 909 (1972); Shelton a spol. Biochem. med. 12, 45 (1975); Fuhr a spol. Biochem. Biophys. Res Comm. 98, 930 (1981)). Nanejvýš tři nebo čtyři frakce mající erythropoietinovou aktivitu byly rozlišeny IEF v těchto studiích a žádná nebyla charakterizována s ohledem na obsah cukrů. Dále nebyl 40 stanoven žádný vztah mezi isoelektrickými body frakcí a jejich biologickou aktivitou.

V průběhu purifíkace urinárního erythropoietinu z lidské moče, popisované v práci Miyakeho a spol. supra, byly zjištěny dvě erythropoietinové frakce z chromatografie na hydroxylapatitu označené jako II a ΙΠΑ, mající stejnou specifickou aktivitu. Následující analýza cukrů frakce 45 II a IIIA prokázala, že frakce II má větší průměrný obsah sialové kyseliny než frakce IIIA (Dordal a spol. supra).

Podstatou předloženého vynálezu je poskytnout separované a izolované isoformy erythropoietinu, mající definovaný obsah sialovaných kyselin a biologickou aktivitu. Farmaceutické 50 přípravky, obsahující takové molekuly by mohly být terapeuticky prospěšné.

-2CZ 291488 B6

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je erythropoietin, sestávající z biologických aktivit erythropoietinových molekul, majících stejný počet sialových kyselin na molekulu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14.

Dále je předmětem vynálezu také farmaceutická kompozice, obsahující terapeuticky účinné množství výše uvedeného erythropoietinu a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 představuje analytický isoelektrickofokusační gel z dělení rekombinantních erythropoietinových isoforem. Gelové dráhy 1-11 představují isoformy v rozmezí od méně kyselých (vyšší pí) ve dráze I ke kyselejším (nižší pí) ve dráze 11. Čištěný rekombinantní erythropoietin obsahující směs isoforem 9-14 je také uveden v poslední levé a pravé dráze gelu.

Obr. 2 představuje vztah mezi počtem sialových kyselin na erythropoietinovou isoformu a specifickou aktivitu in vivo každé isoformy. vyjádřenou jako jednotky na mg erythropoietinového polypeptidu. Na obr. 2A, byla koncentrace každé erythropoietinové isoformy stanovena Bradfordovou proteinovou zkouškou, na obr. 2B, byla koncentrace stanovena absorbancí při 280 nm, na obr. 2C, byla koncentrace stanovena pomocí RIA.

Obr. 3 představuje analytický isoelektrofokusační gel definovaných směsí rekombinantních erythropoietinových isoforem připravených aniontovýměnnou chromatografii za různých podmínek. Gelové dráhy 1-6 představují erythropoietinové isoformy eluované při vysocesolném promývání po promývání Q-Sepharové kolony 150 mM kyselinou octovou, pH4,7, 150 mM kyselinou octovou (nepufrovaná), 200 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 250 mM kyselinou octovou, pH 4,7, 300 mM kyselinou octovou, pH 4,7 nebo 300 mM kyselinou octovou (nepufrovanou). Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující směs isoforem získaný za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, stím rozdílem, že DEAE-agarozová chromatografie je nahrazena chromatografii na Q-Sepharose, je znázorněn ve dráze zcela vlevo na gelu.

Obr. 4 představuje separaci erythropoietinových isoforem 8 až 12 získaných zpracováním média buněk na sloupci Q-Sepharozy gradientem klesajícího pH a zvyšující se iontové síly. Podíly z frakcí označených 2 až 40 byly podrobeny analytické isoelektrické fokusaci. Čištěný rekombinantní erythropoietin obsahující směs isoforem, získaných za použití postupů popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol. supra, s tím rozdílem, že DEAE-agarosová chromatografie byla nahrazena chromatografii na Q-Sepharose, je uveden v poslední levé dráze tohoto gelu.

Obr. 5 představuje aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu. Čtverečky označují asparaginové zbytky, ke kterým jsou připojeny karbohydrátové řetězce a hvězdičky označují threoninové a serinové zbytky modifikované karbohydrátem. Další glykosylační místa poskytnutá v analozích z příkladu 6 jsou indikována mutacemi asparaginu, šeřinu a threoninu.

Obr. 6A, 6B a 6C představují série stupňů klonování při generování plasmidů pro konstrukci a analýzu analogů lidského erythropoietinu. Tyto analogy mají aminokyseliny změněné jak je uvedeno na obr. 5, které poskytují další glykosylační místa.

-3CZ 291488 B6

Obr. 7 představuje analýzy Western blot COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythropoietinových analogů. Analogy /Asn⁹, Ser¹'/EPO, /Asn⁶⁹PEPO, /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO jsou konstruovány jak ie popsáno v příkladu 6. Analogy /Pro¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO, /Asn¹²⁶, Ser^12s/EPO a /Thr¹², Ser¹²⁷/EPO, které neobsahují další karbohydrátové řetězce jsou zde uvedeny pro srovnání.

Obr. 8 představuje Western blon analýzu COS buněčných supernatantů sekvencí lidského erythropoietinu a indikovaných erythropoietinových analogů po zpracování sN-glykanasou. Analogy /Thr^I27EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO jsou konstruovány jak je popsáno v příkladu 6. Analogy /Val¹²⁶/EPO, /Pro¹²⁴/EPO, /Pro¹²⁵/EPO, /Thr¹²⁵/EPO, /Pro¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO a /Thr¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO jsou uvedeny pro srovnání.

Obr. 9 představuje isoelektrofokusační gel poolů 2, 3 a 4 získaných chromatografií na Q-Sepharose a C4 reverzní fázi zpracováním buněčného média, které podporuje růst CHO buněk transfektovaných erytropoietinovou cDNA, obsahující /Thr^l25/mutaci. Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující směs isoforem je získán za použití postupů, popsaných v příkladu 2 práce Laie a spol., supra, s tím rozdílem, že DEAE-agarosová chromatografie je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose, tyto erythropoietiny jsou uvedeny v levých a pravých drahách gelu.

Podle předloženého vynálezu jsou poskytovány isoformy erythropoietinu. Isoelektrická fokusace (IEF) dělí proteiny na základě náboje. Při umístění do gradientu pH a působením elektrického pole budou proteiny migrovat k bodu, ve kterém nemají náboj sítě a zůstávají na tomto místě. Toto je isoelektrický bod (pl) proteinu. Každý jednotlivý pru pozorovaný při IEF představuje molekulu mající určitý pl a tím tedy obecně i stejný náboj a jsou nazvány jako isoformy. Použitý výraz „erythropoietinová isoforma“ označuje erythropoietinové přípravky, mající jediné pl a mající stejné aminokyselinové sekvence.

Ve výhodném provedení je erythropoietin produkt exprese exogenní DNA sekvence, která byla transfektována do jiných eukaryotních hostitelských buněk než lidských, tj., ve výhodném provedení je erythropoietin „rekombinantní erythropoietin“. Rekombinantní erythropoietin je výhodně produkován postupem popsaným Línem, patent US 4 703 008, uvedeným zde pro úplnost. Rekombinantní erythropoietin je výhodně čištěn podle obecných postupů popsaných v příkladu 2 patentu US 4 667 016 Laie a spol., který je zde uveden jako odkaz nebo alternativně postupem popsaným v příkladu 2, kde chromatografie na DEAE agarose je nahrazena chromatografií na Q-Sepharose. V modifikaci se sloupcem Q-Sepharosa se 55 mM NaCI nahradí 25 mM NaCI v pufrovaném roztoku pro uvedení kolony na neutrální pH a 140 mM NaCI se nahradí 75 mM NaCI v pufrovaném roztoku pro eluci erythropoietinu z kolony. Tento materiál při analýze elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodacylsulfátem sodným, migruje jako jediný druh (tj. pruh). Jestliže se čištěný erythropoietin podrobí IEF, jsou v gelu zřejmé násobné pruhy, které indikují, že jsou přítomné různě nabité formy glykoproteinu.

Bylo nalezeno, že jednotlivé isoformy rekombinantních erythropoietinu, mající aminokyselinovou sekvenci z moče získaná lidského erythropoietinu odpovídají erythropoietinovým molekulám, majícím od 1 do 14 sialových kyselin a každá isoforma přítomná v Čištěném rekombinantním erythropoietinu má in vivo aktivitu, která má vztah k počtu sialových kyselin isoformy. Výraz „erythropoietin“, jak je zde použit, zahrnuje přirozeně získaný erythropoietin, z moče získaný lidský erythropoietin jakož i nepřirozeně se vyskytující polypeptidy, mající aminokyselinovou sekvenci a glykosylaci dostatečně duplikativní s přirozeně se vyskytujícím erythropoietinem pro získání in vivo biologických vlastností takových, že buňky kostní dřeně zvyšují produkci retikulocytů a červených krvinek.

Surové přípravky erythropoietinu mají mnoho isoforem, ale materiál čištěný například Laien a sol. supra příklad 2, obsahuje převážně šest isoforem při analýze IEF. Dále byla detekována

-4CZ 291488 B6 nejméně jedna další isoforma vyšší kyselosti při použití chromatografických postupů popsaných v příkladu 4. (Tato více kyselá forma, migrující při > 14 sialových kyselinách na IEF gelu může obsahovat negativní náboje nesialové kyseliny jak je zřejmé z odolnosti vůči štěpení sialidasou). Tyto isoformy se od sebe lisí obsahem sialové kyseliny. Jak je uvedeno v příkladech, je toto doloženo izolací 10 takových isoforem při preparativní IEF a stanovením obsahu sialové kyseliny u pěti z nich. Z isoforem zkoušených na obsah sialové kyseliny bylo zjištěno, že pět isoforem obsahuje buď 9, 10, 11, 12, nebo 13 zbytků sialové kyseliny.

Existuje vztah mezi relativní in vivo specifickou aktivitou erythropoietinu a počtem zbytků sialové kyseliny na molekulu erythropoietinu od isoformy 5 do 11 (každá isoforma je zde označena počtem sialových kyselin na molekulu erythropoietinu). Isoformy 11 až 14 mají přibližně stejnou in vivo specifickou aktivitu. Isoformy 5-14 byly studovány pokud jde o jejich in vivo aktivitu exhypoxickou polycythemickou biozkouškou na myších a množství každé přítomné isoformy je stanoveno Bradfordovou proteinázou zkouškou, absorbance při 280 nm nebo radioimunozkouškou (RLA.) erythropoietinu. RIA stanovení (Egrie a spol. Immunobiology 172, 213 (1986)) vyjádřené jako jednotky/ml jsou rozděleny mezi 212,770 jednotkami/mg erythropoietinového polypeptidu, průměrná specifická aktivita čištěného erythropoietinu stanovené pomocí RIA udává proteinové koncentrace izolovaných isoforem nebo směsí isoforem, vyjádřených jako mg erythropoietinového polypeptidu/ml. Jak je uvedeno v příkladech, relativní in vivo aktivita se postupně zvyšuje od isoformy 5 do isoformy 11 (viz tabulka 2).

In vivo specifické aktivity, které jsou zde uváděny, jsou měření relativních in vivo specifických aktivit a nejedná se o absolutní in vivo specifické aktivity. Pro účely této přihlášky jsou specifické aktivity použity pouze pro srovnání relativních aktivit isoforem, studiem za stejných podmínek ve stejných pokusech, zahrnujících stejné vnitřní standardy, stejný typ zvířat, mající stejné analytické údaje použité pro výpočet specifické aktivity, stejnou zkoušku pro stanovení obsahu proteinu. Není předpokládáno, že jakákoliv hodnota in vivo specifické aktivity uvedená pro jakoukoliv isoformu představuje základní nebo absolutní hodnotu pro tuto isoformu.

Předložený vynález poskytuje erythropoietinové isoformy. Specifické isoformy erythropoietinu, získané v souladu s předloženým vynálezem ajejich vlastnosti se mohou měnit v závislosti na zdroji výchozího materiálu, například isoformy z moče získaného lidského erythropoietinu jsou odlišné od isoforem rekombinantního erythropoietinu. Ve výhodném provedení se vynález týká erythropoietinové isoformy mající specifický počet (např. pevný počet vyšší než 0) sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, uvedený počet je zvolen ze skupiny zahrnující 1 až 14. Výhodný je počet 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14. V dalším provedení je počet vyšší než 14, výhodně 16 až 23.

Tento vynález také poskytuje přípravky, obsahující dvě nebo více erythropoietinových isoforem. V jednom provedení kompozice zahrnují směs isoforem, majících více než předeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu erythropoietinu, např. vyšší než 11 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu nebo vyšší než 12 sialových kyselin na molekulu, např. směs isoforem 12, 13 a 14. V dalším provedení kompozice obsahují směsi isoforem, mající předeterminovaný počet sialových kyselin na erythropoietinovou molekulu, např. méně než 12, ale více než 8 sialových kyselin na molekulu jako je např. směs isoforem 9, 10 a 11. Vynález také poskytuje přípravky obsahující erythropoietinové isoformy, kde jsou relativní množství isoforem stejná nebo rozdílná. Například směs isoforem 9, 10 a 11 by mohly mít isoformy v různých poměrech jako je 1:1:1, 2:3:1 nebo 20:20:1.

Výhodně přípravky obsahují směsi méně než čtyř isoforem, například směs isoforem 11, 12 a 13, nebo směs 12 a 14, nebo směs 7 a 13.

Pro přípravu směsí erythropoietinových isoforem vynález také poskytuje způsoby současné izolace vybraných erythropoietinových isoforem. Tyto postupy zahrnují izolaci individuálních isoforem takovými technikami jako je isoelektrická fokusace nebo příprava směsí isoforem,

-5CZ 291488 B6 majících predeterminovaný počet sialových kyselin na molekulu (například vyšší než 11) takovými technikami jako je iontovýměnná chromatografie nebo chromatofokusace. Všechny tyto techniky jsou založeny na separaci proteinů podle náboje.

Obecně, iontovýměnná chromatografie a chromatofokusace zahrnují aplikaci buď surového lidského erythropoietinu (buněčné kondiciované médium), nebo čištěného materiálu na sloupec pryskyřice za podmínek, kdy dochází k vázání některých nebo všech erythropoietinových isoforem na pryskyřici. U surových erythropoietinových přípravků je výhodné aplikovat protein na sloupec při asi pH 7, zatímco pro čištěné přípravky může být protein aplikován na kolonu při pH 7 až asi pH 4. Po promytí sloupce pufrem při asi pH 4 se ty erythropoietinové isoformy, které zůstaly vázány na sloupci ionexu, eluují při zvyšujícím se pH a koncentraci soli pufru nebo aplikací gradientu snižujícího se pH a zvyšující se iontové síly při pH asi 4. Při chromatofokusaci jsou isoformy eluovány ze sloupce gradientem snižujícího se pH nebo promýváním sloupce vysokou koncentrací soli.

Jedno provedení vynálezu se týká savčích (např. z ovaria čínského křečka, CHO) hostitelských buněk, která přednostně syntetizují erythropoietinové isoformy, mající více než specifický počet, např. více než 10 sialových ky selin na molekulu. Erythropoietinové molekuly mají N-vázané nebo O-vázané oligosacharidové struktury, které mohou limitovat obsah sialové kyseliny v molekule. Například, tetraantennámí (čtyř-rozvětvené) N-vázané oligosacharidy nejobvykleji poskytují čtyři možná místa pro připojení sialové kyseliny, zatímco bi- a triantennární oligosacharidové řetězce, které mohou nahradit tetraantennámí formu na asparaginových připojovacích míst, mohou obvykle připojovat nejvýše dvě nebo tři sialové kyseliny. O-Vázané oligosacharidy obvykle poskytují dvě místa pro připojení sialové kyseliny. Erythropoietinové molekuly tak mohou akomodovat celkem 14 zbytků sialové kyseliny stím, že všechny tři N-vázané oligosacharidy jsou tetraantennámí. Kultury savčích buněk jsou prohledávány na ty buňky, které mají přednostně připojeny tetraantennámí řetězce k rekombinantnímu erythropoietinu, a tedy maximalizovaný počet míst pro připojení sialové kyseliny.

Navázané oligosacharidy erythropoietinu z moče obsahují sialovou kyselinu na obou spojeních a 2,3 a a 2,6 ke galaktóze (Takeuchi a spol., J. Biol. Chem. 263, 357 (1988)). Typicky je sialová kyselina v a 2,3 spojení připojena ke galaktóze a 1,6 rozvětvením mannózy a sialové kyseliny v a 2,6 spojení je připojena ke galaktóze a 1,3 rozvětvením mannózy. Enzymy, které připojují tyto sialové kyseliny (β-galaktosid a 2,6 sialyltransferáza) jsou nejúčinnější při připojování sialové kyseliny k mannóze a 1,6 a mannóze a 1,3 větvení.

Dihydrofolát reduktázu (DHFR) postrádající buňky ovaria čínského křečka (CHO) se obvykle používají jako hostitelské buňky pro produkci rekombinantních glykoproteinů včetně rekombinantního erythropoietinu. Tyto buňky neexprimují enzym β-galaktosid a 2,6-sialyltransferázu, a proto nepřidávají sialovou kyselinu k a 2,6 spojení N-vázaného oligosacharidu glykoproteinů produkovaných v těchto buňkách. (Mutsaers a spol. Eur. J. Biochem. 156, 651 (1986); Takeuchi a spol. J. Chromatogr. 400, 207 (1987)). Následkem toho rekombinantní erythropoietid produkovaný CHO buňkami postrádá sialovou kyselinu na spojení 2,6 ke galaktóze (Sasaki a spol., (1987), supra; Takeuchi a spol., (1987), supra). V dalším provedení vynálezu je erythropoietin použit pro produkci isoforem připravován v CHO buňkách, které jsou transfektovány funkčním β-galaktosid a 2,6-sialyltransferázovým genem pro získání inkorporace sialové kyseliny do a 2,6 vazby ke galaktóze. Viz Lee a spol. J. Biol. Chem. 264,13848 (1989), práce je zde uvedena jako odkaz pro popis technik pro získání modifikovaných CHO buněk nebo jiných savčích hostitelských buněk.

Do vynálezu jsou rovněž zahrnuty některé analogy lidského erythropoietinu. Použitý výraz „analog lidského erythropoietinu“ představuje erythropoietin s jedním nebo více náboji v aminokyselinové sekvenci lidského erythropoietinu, což vede ke zvýšení počtu míst pro připojení sialové kyseliny. Analogy jsou poskytovány místně řízenou mutagenezi, zahrnující adice, delece

-6CZ 291488 B6 nebo substituce aminokyselinových zbytků, což přeměňuje místa tak, že jsou dostupná pro glykosylaci. Takové analogy mají větší počet karbohydrátových řetězců než lidský erythropoietin.

Jejich analogy mající zvýšenou biologickou aktivitu jsou konstruovány zvyšováním obsahu sialové kyseliny v molekule erythropoietinu. Analogy mající obsah sialové kyseliny vyšší než bylo nalezeno u lidského erythropoietinu jsou připravovány přidávání glykosylačních míst, která nebudou poškozovat sekundární nebo terciární konformaci potřebnou pro biologickou aktivitu. Výhodně analog lidského erythropoietinu má 1,2 nebo 3 přídavná místa pro N-glykosylaci nebo O-glykosylaci. Například leucin v poloze 69 je nahrazen asparaginem za vzniku sekvence Asn-Leu-Ser, která slouží jako čtvrté místo pro N-glykosylaci. Taková změna může obvykle poskytnout až čtyři další sialové kyseliny na molekulu. Příklady dalších změn, které generují další N- nebo O-glykosylační místa jsou alaniny v polohách 125 a 127 na asparagin a serin, alanin v poloze 125 na threonin a alaniny v polohách 124 a 125 na prolin a threonin. Pro odborníky bude zřejmé, že předložený vynález zahrnuje mnohé další analogy lidského erythropoietinu, mající další místa pro glykosylaci.

Do rozsahu vynálezu rovněž spadají farmaceutické přípravky obsahující terapeuticky účinné množství specifické isoformy nebo směs isoforem společně se vhodným ředidlem, přísadou a/nebo nosičem vhodným při erythropoietinové terapii. Výraz „terapeuticky účinné množství“, který je zde použit, zahrnuje množství, které vyvolává terapeutické účinek při daných podmínkách a režimu podání. Podání erythropoietinových isoforem se výhodně provádí parenterálním způsobem. Specifický způsob bude záviset na podmínkách, které jsou ošetřovány. Podání erythropoietinových isoforem je výhodně provedeno v části přípravku, který obsahuje vhodný nosič jako je lidský sérový albumin, vhodné ředidlo jako je pufrovaný salinický roztok a/nebo vhodná přísada. Potřebná dávka bude taková, že její množství dostačuje ke zvýšení hematokritů pacienta a bude záviset na obtížnosti podmínek, která mají být ošetřovány, způsobu podání a podobně.

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu, ale nikterak jej neomezují. Erythropoietinový standard použitý v in vivo biostudiích v příkladech je rekombinantní erythropoietinový standard, který byl standardizován vůči částečně čištěnému erythropoietinovému standardu z moče. Takto jsou měřeny pouze relativní in vivo specifické aktivity. In vivo specifické aktivity jsou vyjádřeny v ,jednotkách/ml“, ,.jednotkách/mg“ a jednotkách/A_2go“ a nějako „IU/ml“, „IU/mg“ a IU/A_2g0“, protože použitý ervthropoietinový standard není přímo korelován k mezinárodnímu existujícímu standardu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace isoforem rekombinantního erythropoietinu

Rekombinantní erythropoietin je produkován jak je popsáno Línem, supra. Rekombinantní erythropoietin použitý jako výchozí materiál pro izolaci první a třetí isoformy je čištěn podle postupu popsaného v příkladu 2 práce Laie a spol., supra. Výchozí materiál pro izolaci druhé a páté isoformy je čištěn podle Laie a spol., supra za použití modifikace Q-Sepharosové chromatografie. Tvto přípravky obsahují směs isoforem rekombinantního erythropoietinu majících stejné aminokyselinové sekvence jako lidský erythropoietin získaný z lidské moče a obsahují převážně isoformy 9 až 14. Výchozí materiál pro přípravu čtvrté isoformy je materiál, který je eluován během 5 mM kyselina octová/1 mM glycin/6M močovinového promývání aniontovýměnné kolony v příkladu 2 práce Laie a spol. Tato frakce obsahuje isoformy s méně než nebo obsahující 9 sialových kyselin a byly dále čištěna gelovou filtrační chromatografií jak je

-7CZ 291488 Β6 popsáno v příkladu 2 práce Laie a spol. před použitím v preparativním isoelektrickém fokusačním postupu. Příprava šesté isoformy používá jako výchozí materiál čištěný přípravek rekombinantního erythropoietinu mající od 4 do 13 sialových zbytků. Tento materiál byl čištěn jak je popsáno v příkladu 2 Laie a spol. s výjimkou pro modifikaci iontovýměnné kolony (eluce rekombinantního erythropoietinu gradientem chloridu sodného při pH 8,4 a vypuštění promývání kyselinou octovou/močovinou), která vede k retenci nejvíce isoforem, přítomných ve výchozím materiálu.

Šest různých přípravků individuálních isoforem bylo zpracováno preparativní isoelektrickou fokusaci na granulovaném gelu (Ultrodex, LKB) v podstatě jako LKB Application Notě 198. Pharmalyte (Pharmacia) 2,5-5 amfolyte (Pharmacia) jsou používány a gelové lože obsahuje 5 M močoviny.

V první přípravě na gel aplikuje přibližně 20 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,8 ml 20 mM citrátu sodném/lOOmM chloridu sodném, pH 7,0 a zpracovává fokusaci při 8 W po přibližně 16 hodin. Po isoelektrické fokusaci se proužky isoforem v gelu vizualizují přitisknutím papíru ke gelovému loži. Vyrobí se otisk a pak se fixuje namočením ve třech provedeních (přibližně 10 minut, teplota místnosti) do fixačního roztoku (40% methanol/10% kyselina octová/10% TCA/3,5% sulfosalicylová kyselina), podrobí další změně (asi 10 minut) - 40% methanol/10% kyselina octová (30 až 60 °C), barví se 15 minut při 60 °C v 0,125% Coomassie Blue R-250/40% methanol/10% kyselina octová a pak se odbarví v 7,5% methanolu/10% kyselině octové pro vizualizaci oddělených isoforem. Oblast granulovaného gelového lože, obsahující isoformy. Oblast granulovaného gelového lože, obsahující isoformy (~ 50 % pryskyřice) se odebere, přidá se voda (v 16 ml) a kaše se nalije na misku 14 x 62 cm a odpaří na asi 40 g čisté hmotnosti. Tento přípravek se zpracuje fokusaci podruhé a otisk gelového lože se připraví jak bylo výše uvedeno. Část gelu, obsahující každou ze šesti rozlišitelných isoforem se odebere z gelového lože.

Za účelem eluce isoforem z gelu, se přidá ke každé isoformě roztok, obsahující 10 mM Tris-HCl, pH 7,0/5 mM Chaps pro přípravu kaše. Kaše se umístí do malých kolon a promyjí Tris-Chaps pufrem. Výtok kolonou byl odebrán a aplikován odděleně na malé kolony (otevřené uspořádání kolony), obsahující Vydac C4 pryskyřici s reverzní fází ekvilibrovanou ve 20% ethylonu/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony se postupně vyvíjejí 20% ethanolem/10 mM Tric-HCl, pH 7,0, 35% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0, a 65% ethanolem/10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Frakce eluované 65% ethanolem/10 mM tris-HCl, pH 7,0. Frakce eluované 65% ethanolem/10 mM Tris se zředí 1:1 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a zahustí a pak se pufr nahradí lOmM Tris-HCl, pH 7,0 za použití Centricon-10 (Amicon) mikrokoncentrátoru. Analytická isoelektrická fokusace tohoto přípravku se provede v podstatě jak je popsáno v LKB technická poznámka 250 za použití Servalyte 3-5 ampholinů (Serva) v polyakrylamidovém gelu, obsahujícím 5 M močoviny.

Ve druhé přípravě se na gel aplikuje asi 26 mg rekombinantního erythropoietinu v 6,5 ml deionizované vody a fokusuje se při 2,5 W po 35 minut a 10 W asi 17 hodin. Proužky fokusovaného proteinu, která jsou viditelné v gelovém loži se odeberou jako 11 různých skupin, každá skupina se převede do asi 7,5 ml deionizované vody a 20 ml každého z výsledných supematantů z těchto skupin se podrobí analytické isoelektrické fokusaci, jak je popsáno výše. Ke každé ze skupin se přidá 5 ml 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 a kaše se umístí každá do malé kolony a ponechá se vytéci kapalná fáze. Pryskyřice se promyje přibližně třemi objemy 0,5 M Tris-HCl, pH 7 a promývací roztok se spojí s proteklou kapalinou. Eluované roztoky se zahustí a pufr se vymění za 20 mM citrátu sodného/100 mM chloridu sodného, pH 7,0 za použití Amicon ultrafíltračního zařízení majícího vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000. Koncentrované roztoky (asi 0,5 ml) pak procházejí 0,22 mikrometrovým filtrem zacetátu celulózy. Vzhledem k analytické isoelektrické fokusaci bylo nalezeno pět skupin, obsahujících převážně jednotlivé isoformy 10, 11, 12, 13 a 14.

-8CZ 291488 B6

Ve třetí přípravě se na gel aplikuje asi 30 mg rekombinantního erythropoietinu ve 21,8 ml destilované vody a fokusuje se při 2 W po 25 minut, při 10 W po 20 hodin a 15 W 15 minut. Proužky proteinu, odpovídající individuálním isoformám jsou pozorovány vizuálně a odebrány z gelového lože. K isoformám izolovaným z gelu se přidá destilovaná voda, připraví se kaše a vzniklé supernatanty se analyzují analytickou isoelektrickou fokusací. Ke každé kaši se přidá stejný objem 1 M Tris-HCl, pH 7,2, suspense se umístí do oddělených malých kolon a kapalná fáze se nechá vytéci z kolony pro eluci isoforem. Každý výtok se zahustí a pufr se vymění za 20 mM sodný citrát/100 mM chlorid sodný, pH 7.0 za použití Amicon zařízení pro ultrafiltraci s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000. Analytický isoelektrofokusační gel informuje v tom, že byly získány skupiny, obsahující zejména jednotlivé isoformy 9,10, 11, 12, 13 a 14.

Čtvrtá příprava isoformy používá jako výchozí materiál erythropoietin, obsahující isoformy 3-9 (připravené výše). Před preparativní isoelektrickou fokusací provedenu v postatě jak bylo popsáno výše pro přípravu 1 až 3, byly ampholyty (Pharmalyte 2,5-5) prefrakcionovány v Rotofor (Bio-Rad, Richmond, CA) buňce pro isoelektrickou fokusací s kapalnou fází, pro získání ampholytů vhodnějších pro nižší isoelektrické body výchozího materiálu. Prefrakcionace se provádí smísením 6,7 ml Pharmalytu 2,5-5 s 15 g močoviny a přidáním vody na objem 50 ml. Směs se frakcionuje v Rotoforu při 10 W 1 °C po 5 1/2 hodiny za použití 0,lM kyseliny fosforečné a 0,1 M hydroxidu sodného jako anolytu a katolytu. Amfolytové frakce, mající zjištěné pH mezi 4,5 a asi 6 byly použity pro isoelektrickou fokusací plochého lože.

Amfolyty byly získány z isoforem za použití Centrieluteru (Amicon, Danvers, MA) 10000 MW Centriconu (Amicon) za použití následujících parametrů: 0,18 Tris pufr 8,8, 100 volt, 25-30 mA, po 3 hodiny. Isoformy byly pak pufrem převedeny do 0,1 M chloridu sodného gelovou filtrací za použití Sephadexu G-25 (Pharmacia). Analytická isoelektrická fokusace pěti výsledných poolů prokázala, že obsahují isoformy 4, 5, 6, 7 a 8. Isoforma 4 vykazuje několik proužků což indikuje, že prošla určitou degradací.

Příprava páté isoformy byla modifikována přídavkem prefokusačního stupně k postupu isoelektrické fokusace na plochém loži. V této modifikaci nebyl přidán protin ke směsi amfolyt/močovina/gel před elektroforézo, ale byl přidán do isoelektrického fokusačního zařízení s následujícím vývojem gradientu pH v gelovém loži. Po prefokusaci po 75 minut (1500 volt/h) byly sekce gelového lože ve vzdálenosti 2,25 - 4,25 cm od katody odebrány, smíseny s roztokem erythropoietinu a přidány zpět ke gelovému loži. Po isoelektrické fokusací byly isoformy 10, 11, 12, 13 a 14 eluovány z gelového lože a odděleny od amfolytů ultrafiltraci za použití zařízení Centricon-10 (Amicon).

Prefokusační modifikace byl uskutečněny pro to, aby charakteristiky ultrafialové absorbance přípravků, obsahujícím isoformy byly podrobnější těmto charakteristikám výchozího rekombinatního erythropoietinu. Zlepšení ve spektrálních charakteristikách může být zřejmé z poměru absorbance při 280 a 260 nm u izolovaných isoforem. Průměrný poměr absorbance při 280 nm kabsorbanci při 260 nm (A280/A260) pro isoformy z přípravků 2 a 3 (ne-prefokusované) je 1,36+ 0,11, zatímco průměrný poměr A280/A260 pro přípravky 5 a 6 (pre-fokusované) je 1,68 ± 0,20. Jestliže je isoforma č. 14 vyloučena z propočtů, průměrný A280/A260 poměry jsou 1,39 ±0,11 a 1,74 ± 0,09 pro přípravky 2 a 3 a 5 a 6. (Isoforma 14 může mít nejtypičtější spektrum, protože je přítomna v nejmenších množstvích a je tak více náchylná k interferencím stopovou kontaminací amfolytovými komponentami nebo protože je nejbližší elektrodě během provádění isoelektrické fokusace na plochém loži.). Průměrná A280/A260 poměr pro rekombinantní erythropoietin připravený podle příkladu 2 Laie a spol (modifikovaný jak bylo popsáno použitím Q-Sepharosy jako aniontovýměnné pryskyřice) je 1,91 ± 0,04.

Jak je popsáno výše, vychází materiál pro přípravu isoformy č. 6 byl rekombinantní erythropoietinový přípravek obsahující isoformy 4-13. Amfolyty byly pre-fokusovány v zařízení Rotofor jako ve čtvrté přípravě. Pro isoelektrickou fokusací na plochém loži byly použity amfolytové frakce, mající pH mezi 3,7 a 4,8. Ploché lože bylo prefokusováno postupem jako

-9CZ 291488 B6 v přípravě č. 5 a isoformy 9, 10, 11, 12 a 13 byly získány po ultrafiltraci (Centricon-10) pro odstranění amfolytů.

Příklad 2

Obsah sialové kyseliny v isoformách rekombinantního erythropoietinu

Isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 a eiythropoietin čištěný postupy popsanými Laiem a spol., supra (směs isoforem 9 až 14) jsou pufrem převedeny do 0,10 - 0,15 M chloridu sodného a analyzovány na obsah sialové kyseliny modifikací postupu podle Jourdiana a spol., J. Biol. Chem. 246, 430 (1971). Zbytky sialové kyseliny jsou odštěpeny od glykoproteinů hydrolýzou 0,35 M kyselinou sírovou při 80 °C po 30 minut a roztoky jsou neutralizovány hydroxidem sodným před analýzou. Za účelem vyhodnocení množství přítomného erythropoietinového proteinu se provede stanovení proteinu podle Bradforda (Bradford Anal. Biochem.72, 248 (1976)) za použití rekombinantního erythropoietinu, majícího aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu jako standard za použití zkušebních reagencií a mikrozpůsobu podle Bio-Rad. Výsledky vyjádřené jako moly sialové kyselina na mol erythropoietinu, jsou uvedeny v tabulce 1. Isoformy jsou označeny podle počtu sialových kyselin na molekulu a rozsah od málo kyselých (isoforma 9) do nejkyselejších (isoforma 13). Isoformy 9-13 jsou uvedeny vgelových drahách 6-10 obr. 1. Množství isoformy 14 jsou nedostatečná k přesnému měření obsahu sialové kyseliny. Obsah sialové kyseliny v této isoformě je odhadnut z její migrace na IEF gelech vzhledem k dalším isoformám. Obsah sialové kyseliny isoforem 5-8 (přípravek č. 4) nebyl měřen, ale je pravděpodobně odhadnut z jejich migrací na IEF gelech.

Tabulka 1

Isoforma erythropoietinu isoforma 13 isoforma 12 isoforma 11 isoforma 10 isoforma 9 směs isoforem (9-14) mol sialové kyseliny/mol erythropoietinu

12,9 ±0,5

11,8 ±0,2

11,0 ±0,2

9.8 ± 0,3

8.9 ± 0,6

11,3 ±0,2

Příklad 3

Aktivita isoforem rekombinantního erythropoietinu

Isoformy izolované jak bylo popsáno v příkladu 1 byly hodnoceny podle absorbance při 280 nm, Bradfordovou proteinovou zkouškou a pomocí RIA pro erythropoietin pro stanovení množství přítomného rekombinantního erythropoietinu. Exhypoxická polycythemická biostudie na myších (Cotes a spol., Nátuře 191, 1065 (1961) se použije pro stanovení in vivo biologické aktivity. Kvantifikace množství erythropoietinového proteinu přítomného podle radioimunozkoušky pro erythropoietin poskytuje výsledky mající vyšší relativní in vivo specifickou aktivitu pro některé isoformy, protože zjevně snížená imunoreaktivita isoforem, obsahujících velké množství sialové kyseliny vede k podhodnocení koncentrace erythropoietinu a tak k nadhodnocení in vivo specifické aktivity pro nejvíce negativní isoformy. Stanovení z biostudie na myších, vyjádřená jako jednotky/ml, jsou děleny koncentracemi odpovídajících proteinů pro získání in vivo specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidů. Tyto specifické aktivity jsou uvedeny v tabulce 2.

-10CZ 291488 B6

V tabulce 2, je „n“ počet nezávislých přípravků isoforem, které spolupůsobí hodnotu specifické aktivity. V nejvíce případech byly provedeny in vivo studie pro každý přípravek isoformy. Některé in vivo údaje pomáhají při výpočtech specifické aktivity ve všech třech sloupcích. Jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu byly stanoveny z absorbance při 280 nm, z hodnot radioimunozkoušky nebo z výsledků Bradfordovy proteinové zkoušky. Čištěný rekombinantní erythropoietin, obsahující isoformy 9-14 byl použit jako standard vBradfordově proteinové zkoušce. ,.n“ může být menší pro výpočty provedené za použití Bradfordovy proteinové zkoušky, protože některé přípravky nebyly v době provádění Bradfordovy zkoušky dostupné.

Erythropoietin čištěný podle postupů popsaných Laiem a spol., supra a obsahující směs isoforem 9 až 14 byl použit jako standard ve zkouškách RIA a in vivo.

Relativní specifické aktivity vyjádřené jako jednotky / mg erythropoietinového polypeptidu mohou být převedeny na jednotky/A₂₈o násobením 0,807 mg erythropoietinového polypeptidu/A₂go. Přepočítávací faktor je získán násobením extinkčního koeficientu erythropoietinu (1,345 mg/A₂₈o) obsah proteinu v erythropoietinovém glykoproteinu (asi 60% hmotnostních, Davis a spol., Biochemsitry 26, 2633 (1987)) pro vyjádření mg erythropoietinového polypeptidu/A₂₈o (tj. 1,345 mg erythropoietinu/A₂₈o x 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinu = 0,807 mg polypeptidu/A₂8o). Dále specifické aktivity vyjádřené jako jednotky/mg erythropoietinového polypeptidu mohou být násobeny faktorem 0,60 mg polypeptidu/mg erythropoietinového glykoproteinu pro získání specifických aktivit vyjádřených jako jednotky/mg erythropoietinového glykoproteinu.

Tabulka 2

Isoforma	U/mg polypeptidu (Bradfordova proteinová zkouška)	n	U/mg polypeptidu (z A280)	n	U/mg polypeptidu (z RIA)	n
14	289,400 ±3,100	2	205,800 1 37,700	2	366,700 i 55,900	2
13	307,600 ± 30,600	4	258,700 1 59,500	5	337,200140,200	5
12	275,200 i 55,600	4	258,400141,700	5	287,700 i 42,600	5
11	282,700141,100	3	255,800167,300	4	251,400162,700	4
10	188,000 ± 1,900	1	170,300134,500	3	171,900131,600	3
9			96,600 146,700	2	113,600139,600	2
8	65,20013,800	1	70,60014,100	1	61,00013,500	1
7	46,200 i 5,800	1	50,3001 6,300	1	42,800 i 5,400	1
5	16,6001 1,700	1	18,3001 1,900	1	15,5001 1,600	1

Údaje z tabulky 2 jsou také znázorněny na obr. 2A, 2B a 2C. Tyto údaje ukazují, že relativní in vivo aktivita erythropoietinu se zvyšuje jako funkce obsahu sialové kyseliny až do isoformy č. 11. Isoformy č. 11—14 mají v podstatě stejnou relativní in vivo bioaktivitu. (Toto je nejzjevnější, jestliže je koncentrace isoformy 14 vyjádřena použitím hodnoty z Bradfordovy zkoušky. Bradfordova hodnota může být pro isoformu 14 přesnější, protože jsou obecně získány nižší hodnoty, a to vede k obtížím při stanovení pomocí A₂₈o a nejzřejmějšímu snížení reaktivity v RIA pro velmi negativní formy, jak bylo uvedeno dříve). Vyšší in vivo specifická aktivita erythropoietinových isoforem, majících více sialových kyselin je nej pravděpodobněji způsobena delším průběhem poločasu životnosti těchto forem. Isoformy 9 a 13 jsou značeny radioaktivním jodem (¹²⁵I) a byla stanovena rychlost jejich štěpení u krys. Poločas životnosti v oběhu byl výrazně delší pro isoformu 13 než pro isoformu 9.

-11 CZ 291488 B6

Příklad 4

Dělení směsí isoforem rekombinantního erythropoietinu chromatografií na Q-Sepharose

Buněčná kondiciovaná média z produkce rekombinantního erythropoietinu podle postupů popsaných Linem, supra, se koncentrují a diafiltrují proti 10 mM Tris, pH 7, 2. Koncentrace proteinu se stanoví Bradfordovou mikroproteinovou zkouškou za použití hovězího sérového albuminu jako standardu. 19,6 ml roztoku, obsahujícího 40 mg celkového proteinu se připraví ve 20 μΜ CuSO₄, filtruje přes 0,45 mikrometrový filtr a vloží na 4 ml kolonu (1,05 výška x 2,2 cm průměr) plněnou náplní Q Sepharose Fast Flow (Pharmacia), která byla ekvilibrována 10 mM Tris, pH 6,8 až 7,0 při 4 °C. Po aplikaci vzorku se kolona promyje dvěma objemy kolony pufru. Průtok kolony je asi 1 ml/min. Pro dělení směsí isoforem erythropoietinu se použije šest oddělených kolon.

Kolony se promyjí 6 až 9 objemy pufru o nízkém pH: kolona č. 1, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 2, 200 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina, upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 3, 250 mM octová kyselina, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 NaOH, kolona č. 4, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina upraveno na pH 4,7 pomocí NaOH, kolona č. 5, 150 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina, kolona č. 6, 300 mM kyselina octová, 1 mM glycin, 20 μΜ CuSO₄, 6 M močovina. pH kolon se zvyšuje na asi pH 7 promýváním každé kolony 8 až 11 objemy kolony 10 mM Tris-HCl, 55 mM NaCl, 20 μΜ CuSO₄, pH 7. Definované erythropoietinové isofomiové směsi jsou z kolon eluovány promýváním 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl. 20 μΜ CuSO₄, pH 7,0.

Eluované isoformové pooly z každé kolony se zahustí a rozpouštědlo se vymění vodou za použití Amico Cetnricon-10 mikrokoncentrátoru. Výsledky analytické isoelektrické fokusace těchto koncentrovaných poolů jsou uvedeny na obr. 3: Gelové dráhy 1-6 představují definované směsi erythropoietinových isoforem eluovaných z kolon 1-6. „Isoformová směs“ uvedená v poslední pravé dráze gelu na obr. 3 představuje buněčné médium, které je aplikováno na kolonu Q-Sepharosy jak je popsáno výše, kolona se promyje 5 mM kyseliny octové, 1 mM glycinu, 20 μΜ CuSO₄, 6M močoviny a směs isoforem erythropoietinu se eluuje z kolony za použití výše popsaných postupů. Tato eluovaná směs isoforem se dále čistí podle postupů popsaných v práci Laie a spol., supra, před analytickou isoelektrickou fokusací.

Příklad 5

Frakcionace isoforem rekombinantního erythropoietinu za použití nízkého pH gradientu na Q-Sepharose

V dalším postupu jsou isoformy erythropoietinu separovány za použití grafientu se snižováním, pH a zvyšováním iontové síly. Koncentrované diafiltrované, erythropoietin obsahující médium se vnese na kolonu Q-Sepharosy v poměru asi 40 mg celkového proteinu/ml gelu. Kolona se pak promyje asi dvěma objemy kolony 10 mM Tris HC1, pH 7,0 a pak asi 10 objemy kolony 2 mM kyseliny octové/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO₄/6 M močoviny (pH přibližně 4,8) pro odstranění kontaminujících proteinů a erythropoietinových isoforem, obsahujících méně než asi 7 zbytků sialové kyseliny. Isoformy, obsahující od přibližně 8 do přibližně 12 sialových kyselin jsou z kolony eluovány za použití gradientu od počátku 2 mM kyseliny octové v 6 M močoviny/1 mM glycinu/ 20 μΜ CuSO₄ a do až 40 mM kyseliny octové/6 M močoviny/1 mM glycinu/20 μΜ CuSO₄ (pH přibližně 4). Celkový objem gradientu je přibližně 49 objemů kolony a frakce přibližně jednoho objemu kolony se odebírají do nádob, obsahujících objem Tris pufru

- 12CZ 291488 B6 dostačující k uvedení pH do rozmezí 6 - 8,5 proto, aby se zabránilo dlouhodobému vystavení odebraných frakcí nízkému pH. Podíly frakcí se podrobí analytické isoelektrické fokusaci pro sledování separace. Obr. 4 ukazuje separaci isoforem 8-11, které může být dosaženo tímto postupem. Isoformy 12 - 14, které zůstávají vázány na koloně při konci gradientu, jsou eluovány promýváním pufrem, obsahujícím 10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, 20 μΜ CuSO₄ (pH 7,0). Isoformy (separované působením gradientu nebo eluované roztokem chloridu sodného) jsou prosté kontaminujících proteinů při chromatografii na reverzní fázi, následované filtrační gelovou chromatografií jak je popsáno v příkladu 2 v práci Laie a spol.

Příklad 6

Analogy lidského erythropoietinu, mající další glykosylační místa

A. Konstrukce analogů lidského erythropoietinu

Umístění existujících a navržených míst pro připojení karbohydrátu v erythropoietinové aminokyselinové sekvenci jsou uvedena na obr. 5 a postup přípravy těchto dalších glykosylačních míst je shrnut na obrázcích 6A-C a je popsán dále.

Za použití in vitro mutagenese byly syntetizovány následující oligonukleotidové primery:

/Asn⁴, Ser⁶/EPO: 5' CGCCACCAAACCTCAGCTGTGACAGCCGA 3' /Asn⁹, Ser¹¹/ EPO: 5' ATCTGTACAACCGAAGCCTGGAGAGGT 3' /Asn⁶⁹/EPO: 5' GGGCCTGGCCAACCTGTCGGAAG 3' /Asn¹²⁴/ EPO: 5' TCCCCTCCAGATAATGCCTCAGCTGC 3' /Asn¹²⁵, Ser¹² /EPO: 5' CAGATGCGAACTCATCTGCTCCAC 3' /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/EPO: 5' AGGCCTGCAGGAATGGGAGCAGATGACCAGGTTG 3' /Thr¹²⁵/EPO: 5' TCCAGATGCGACCTCAGCTGCTC 3' /Pro¹²⁴, Thr^,25/EPO: 5' CCTCCAGATCCGACCTCAGCTGC 3'

Podtržené kodony představují oblasti chybného párování, kde aminokyseliny uvedené v závorkách nahrazují divoký typ aminokyselin.

/Asn⁴, Ser⁶/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa u Asn 4. /Asn⁹, Serⁿ/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 9. /Asn⁶⁹/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69. /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO byl konstruován přidáním N-glykosylačního místa kAsn 125. /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO byly konstruovány přidáním O-glykosylačního místa u Thr 125.

Následující oligonukleotidové primery jsou syntetizovány za použití in vitro mutagenese:

/Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO: 5'GGGCCTGGCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹/ EPO: 5' CAGGGCCTGTCCAACCTGACAGAAGCTGTC 3' /Asn¹²³, Thr¹²⁷/EPO: 5' CAGATGCGAACTCAACGGCTCCAC 3' /Asn¹²⁵, Thr¹²⁷, Thr¹³¹/EPO: 5' ATGCGAACTCAACGGCTCCACTCACAACAATCACT 3' /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO: 5' CCAGATCCAAATTCATCTGCTCCACTC 3' /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Thr¹²⁷/EPO: 5' CCAGATCCAAATTCAACAGCTCCACTC 3' /Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/EPO: 5'CCAGATGCGACAACAGCTGCTCCA 3' /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹/EPO:

Oligonukleotidový primer 5' AGATCCGACCACCGCTGCTCCAC 3' je použit pro přípravu /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr^Í26/EPO za použití /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EpPO cDNA jako výchozí látky. Oligo-13CZ 291488 B6 nukleotidový primer 5' TGCTCCACTCACAACAATCACTG 3' je pak použit pro přípravu /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Thr¹³¹/EPO.

/Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO a /Ser⁶⁸, Asn⁶⁹, Thr⁷¹/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačního místa k Asn 69 a zvýšením N-glykosylace na tomto místě. /Asn^1-5, Thr¹²⁷/EPO, /Asn¹²’, Thr¹²⁷, Thr¹³¹/EPO, /Pro¹²⁴, Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO a /Pro¹²⁴, Asn¹²’. Thr¹²⁷/EPO jsou konstruovány přidáním N-glykosylačního místa na Asn 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě. /Thr¹²⁵, Thr¹²⁶/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵, Thr¹²⁶, Ser¹³¹/EPO jsou konstruovány přidáním O-glykosylačního místa ke Thr 125 a zvýšením glykosylace na tomto místě.

Zdrojem erythropoietinové DNA pro in vitro mutagenesi byl plasmid Hul3, klon cDNA lidského erythropoietinu v pUC 8 (Law a spol. Proč Nati. Acad. Sci. 83, 6920 (1986)). Plasmidová DNA odvozená od Hul3 byla štěpena BstEII a BglII restrikčními enzymy, výsledné fragmenty DNA byla podrobeny elektroforéze na agarosovém gelu a z gelu byl izolován 810 bp fragment erythro15 poietinové DNA za použití GeneClean™ kitu a postupy doporučenými výrobcem (BIO 101, lne.). Plasmid pBRgHuEPO obsahuje erythropoietinový genomový gen jako BamHI fragment inzertovaný do derivátu pBR322, jak je popsáno ve zveřejněném patentu Lina, supra. pBRgHuEPO byl také štěpen pomocí BstEII a BglII a byl získán vektorový fragment 6517 bp. Ligace těchto dvou fragmentů vede klGTl. Pro konstrukci pEC-1, byl pDSVL (popsaný ve 20 zveřejněném patentu Lina, supra) štěpen BamHI a kněmu byl ligován izolovaný BamHI fragment velikosti 2,8 kilobází (kb) z IGT1, obsahující erythropoietinovou cDNA.

Za účelem přípravy jednořetězcové DNA pro mutagenesi in vitro, byl pEC-1 štěpen BamHI a BglII a byl izolován fragment 820 bp erythropoietinové cDNA. Byl ligován k BamHI místu 25 m!3mpl8 za vzniku ml3-EC-l. Jednořetězcová DNA byla získána ze supematantů E. coli kmen

RZ1032, infikovaného ml3-EC-l jak popsal Kunkel a spol. Methods in Enzymol. 154, 367 (1987) a Messing, Methods in Enzymol. 101, 20 (1983). Pro mutagenesi in vitro bylo smíseno přibližně 1 pg jednořetězcové DNA a 0,2 pmol jednoho ze syntetických primerů popsaných výše se 6 ml pufru (250 mM Tris pH 7,8, 50 mM MgCL a 50 ml dithiothreitolu). Pro připojení 30 primeru ktemplátu byl objem reakční směsi upraven na 10 μΐ vodou, směs byla zahřívána na °C po dobu 5 minut a pak nechána zchladnout na teplotu místnosti. Pro prodlužovací reakci bylo přidáno 2,5 ml dTTP, dATP, dGTP a ATP (všechny s 10 μΜ, dále 1 μΙ (1 jednotka) E. coli DNA polymerázy (Klenowůw fragment) a 1 μΐ (1 jednotka) T4 DNA ligázy. Směs pak byla inkubována přes noc při 14 °C a použita pro transformování E. coli JM 109 (Yanisch-Perron 35 a spol., Gene 33, 103 (1985)) jak je popsáno (Messing, supra).

Pro identifikaci mutantních klonů rozlišovací hybridizaci, byly plaky na nutričním agaru přeneseny na Gene Screen filtry (New England Nuclear). Filtry byly sušeny pod tepelnou lampou a pak inkubovány po dobu jedné hodiny v 6x SSC, obsahujícím 1 % SDS při 60 °C. Pro 40 hybridizaci byly oligonukleotidové primery uvedené výše (8 pmol) koncově označeny T4 polynukleotidovou kinázou a γ ³²P-označených ATP a inkubovány a filtry přes noc v 6x SSC, 0,5% SDS a 100 mg/ml DNA lososího sperma při 37 °C pro /Asn^l24/mutaci, 55 °C pro /Asn⁴, Ser⁶/ mutaci, 65 °C pro /Thr¹²⁵/ a /Pro¹²⁴, Thr¹² / mutace a 70 °C pro /Asn⁹, Ser¹¹/ a /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/ mutace. Příští den byly filtry třikrát promyty 6x SSC při teplotě místnosti a podrobeny 45 autoradiografii. Je-li to nutné byly pak filtry promyty 6x SSC při zvýšených teplotách, dokud nebyla detekována malá nebo žádná hybridizace u plaků, majících erythropoietinovou cDNA sekvenci divokého typu. Klony, které za těchto podmínek dávají pozitivní hybridizační signály byly identifikovány a retransfektovány do JMI09 k izolování čistého klonu. Dideoxy řetězcová terminační sekvenční analýza dokládá, že jsou přítomny mutace u asparaginového, serinového, 50 threoninového a prolinového zbytku.

Dvojřetězcové ml3 EC-1 DNA nesoucí /Asn⁴, Ser⁶/, /Asn⁹, Ser¹¹/, /Asn⁶⁹/, /Asn¹²⁴/, /Asn¹²⁵/, /Ser¹²⁷/, /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/ /Thr¹²⁵/ a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ změny byly získány z JMI09 transfektovaných buněk vaznou metodou (Holmes a spol., Anal. Biochem. 117, 193 (1981)). DNA byly štěpeny

- 14CZ 291488 B6 pomocí BstEII a XhoII a byl izolovány 810 bp fragmenty erythropoietinové DNA. pEC-1 byly štěpeny BstEII s následujícím parciálním štěpením Btlll a 5'konce výsledných fragmentů se defosforylují bakteriální alkalickou fosfatázou v 10 mM Tris, pH 8 při 60 °C po 60 minut. Byl izolován 7 kb vektorový fragment postrádající 810 bp BstEII—BglII a ligován kerythropoietinovým fragmentům uvedeným výše. Výsledné plasmidy (označené pEC-X, kde X znamená parciální mutaci) obsahují lidský erythropoietin se změněnými aminokyselinovými zbytky v označených pozicích.

cDNA klony sekvence lidského ervthropoietinu a analogů odpovídajících /Asn⁴, Ser⁶/, /Asn⁹, Ser¹¹/, /Asn⁶⁹/, /Asn¹²⁴/, /Asn¹²⁵, Šer¹²⁷/, /Asn¹⁶³, Ser¹⁶⁵/ /Thr¹²⁵/ a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/ erythropoietinových cDNA klonů byly transfektovány do COS-1 buněk (ATCC č. CRL-1650) elektrokorporací. COS-1 buňky byly z polotekutých disků odebrány, promyty médiem (modifikované Dulbecco základní médium, obsahující 5 % fetálního telecího séra a 1 % L-glutaminu/penicilinu/streptomycinu (Irvine Scientific) a resuspenduji na 4 x 10⁶ buněk/ml. Jeden mililitr buněk se přenese do elektroporační kyvety (Bio-Rad) a elektroporuje Bio-Rad Gene Pulserem™ při 25 pF a 1600 V za přítomnosti 100 až 200 pg nosiče DNA a 2 až 20 pg plasmidové DNA kódující erythropoietinový analog. Elektroporované buňky se umístí v koncentraci 2 x 10⁶ buněk na 60 mm misku pro tkáňovou kulturu v 5 ml média. Po dvou až čtyřech hodinách po umístění se médium nahradí 5 ml čerstvého média. Kondiciované médium se oddělí 3 až 5 dnů po elektroporací.

A. Zkouška aktivity erythropoietinového analogu

RIA byly provedeny podle Egrie a spol., supra. In vivo biologická aktivita erythropoietinových analogů byla stanovena exhypoxickou polycythemickou biostudií na myších (Cotes a spol., supra).

In vitro erythropoietinová aktivita byla stanovena zkouškou tvorby erythroidních kolonií jak je popsáno Iscovem a spol., J. Cell Physiol. 83, 309-320 (1974) s modifikacemi. Jednojademé buňky z buněk lidské kostní dřeně byly částečně čištěny na „focol-pague“ vložce a promyty Iscovým médiem před umístěním na plotnu pro odstranění adherentních buněk. Kultivační médium obsahuje 0,9 % methylcelulozy a neobsahuje jakýkoliv hovězí sérový albumin. Erythroidní kolonie byly spočteny po 8 až 10 dnech kultivace.

Erythropoietinové analogy transfektované a exprimované v COS buňkách jak je popsáno v sekci A, byly analyzovány v surových supematantech COS buněk pomocí RIA a zkouškou tvorby erythroidních kolonií. Lidská erythropoietinová sekvence má in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou stanovenou ve výše uvedeném pokusu. Analogy /Asn⁶⁹/EPO, /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO, /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²⁵/EPO vykazují in vitro aktivitu srovnatelnou s RIA aktivitou a postupuje důkaz o dalších karbohydrátových řetězcích (jak je stanoveno v sekci C). Tyto analogy jsou dále analyzovány transfekcí cDNA klonem kódujícím erythropoietinový analog do CHO buněk, čištěním erythropoietinového analogu a měřením in vivo biologické aktivity čištěného analogu.

C. Analýza Western Blot

Objem supematantů, obsahující 5-20 jednotek z COS buněk transfektovaných cDNA erythropoietinových analogů jak je popsáno v sekci A, byl imunoprecipitován přes noc při teplotě místnosti s králičí antierythropoietinovou polyklonální protilátkou. K imunopreciputátu bylo přidáno 20 až 80 μΐ 1:1 proteinu A-Sepharosy v salinickém rozsahu pufrovaném fosfátem (PBS) a ponecháno inkubovat jednu hodinu při teplotě místnosti. Vzorky byly odstraněny, promyty PBS a kde je to indikováno, byla peleta zpracována s N-glykanázou pro odstranění N-vázaného karbohydrátového řetězce. Vzorky byly analyzovány elektroforézou na 15% SDS-polyakrylamidovém gelu, přeneseny na nitrocelulózu a podrobeny Westernově analýze jak je popsáno (Burnette a spol., Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981); Elliot a spol. Gene 79, 167-180 (1989))

-15CZ 291488 B6 za použití směsi myších antierythropoietinových monoklonálních protilátek. Jedna z takových protilátek, 9G8A, je popsána Elliotem a spol. (1989) Blood 74, Supp. 1, A. 1228.

Analýza supernatantů COS buněk tranfektovaných /Asn⁶⁹/ EPO a /Asn¹²⁵, Ser¹²⁷/EPO cDNA dokládá zvýšení velikosti proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Zvýšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího N-vázaného karbohydrátového řetězce (obr. 7). Zpracování supernatantů z COS buněk transfektovaných /Thr¹²⁵/EPO a /Pro¹²⁴, Thr¹²’/ EPO cDNA s N-glykanázou dokládá zvětšenou velikost proteinu ve srovnání se sekvencí lidského erythropoietinu. Tato zvětšená velikost svědčí o přítomnosti dalšího O-vázaného karbohydrátového řetězce (obr. 8).

D. Izolace isoforem eryhtropoietinových analogů

Erythropoietinový analog /Thr^l25/EPO byl konstruován jak je popsáno v sekci A. 810 bp fragment erythropoietinové cDNA nesoucí /Thr^l25/mutaci byl izolován štěpením plasmidu pEC obsahující /Thr¹²⁵/ mutaci pomocí BstEII a BglII a ligací fragmentu k pDECA byl připraven z KDS a 2 následujícími kroky:

1) HindlII místo pDS a 2 bylo deletováno štěpením pDS a 2 DNA pomocí HindlII, zpracováním HindlII kohezivních konců sE. coli DNA polymerázou (Klonow fragment) adNTP, a religací tupě zakončeného vektoru. Výsledný plasmid je pDS α2 ΔΗ.

2) pDS a 2 ΔΗ byl štěpen pomocí Sáli a syntetický oligonukleotid mající SV40 „splice“ signál se Sáli linkerem připojeným ke 3' konci „splice“ signálu byl k němu ligován. Syntetický oligonukleotid měl následující sekvenci:

5' TCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGT CTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCA AAGAACTGCTCCTGAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGG AAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCTGCAACAAGCTGGTCGACC 3'

Výsledný plasmid byl pDS a 2 Δ H spoj.

3) pDS a 2 ΔΗ spoj byl štěpen Sáli a konec zpracování na tupo zpracováním s kohezivními konci s T4 DNA polymerázou a dNTP. 820 bp fragment BamHI-BglII lidské erythropoietinové cDNA byl na koncích natupo zpracován stejným postupem a ligován k plasmidu. Výsledný plasmid byl pDEC.

4) pDEC byl štěpen s KpnI a PvuII a na koncích zpracován na tupo zpracováním s kohezivními konci „mung beán“ nukleázou. Plasmid byl religován k deletovanému excisovanému KpnI-Pvull fragmentu za vzniku plasmidu pDEC Δ.

Plasmid pDECA, obsahující /Thr¹²⁵/ erythropoietinovou cDNA byl transfektován do -deficientních CHO buněk. 770 ml kondiciovaného média CHO buněk byl zakoncentrován za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000 a diafíltrován proti 10 mM Tris-HCl, pH 8,6 na celkový objem 34 ml. 17ml podíl koncentrátu byl nanesen na Q-Sepharosovou kolonu s rychlým průtokem (5 ml objem náplně) ekvi libro vanou stejným pufrem a eluován lineárním gradientem 0-250 mM NaCl v 10 mM Tris-HCl, pH 8,6. Podíly frakcí z kolony, buď nezpracované nebo štěpené N-glykanázou, byly analyzovány SDS-PAGE nebo IEF a pooly (označené 2, 3 a 4) byly připraveny na bázi isoformy a/nebo karbohydrátového složení frakcí. Každý pool byl nanesen na Vydac C4 kolonu (214TPB 2030, 1 cm průměr, 1,8-2,5 ml objem náplně, 0,34 ml/min) a promyt dvěma objemy kolony 20% ethanolu v 10 mM Tris-HCl, pH 7,0. Kolony byly eluovány lineárními gradienty 20-94% ethanolu, 10 mM Tris, pH 7,0. Pooly byly připraveny, naředěny do 10 mM Tris-HCl, pH 7,0 a naneseny na Q-Sepharosové kolony

-16CZ 291488 B6 s rychlým průtokem. Následujícím promýváním 10 mM Tris-HCI, pH 7,0, byly vzorky eluovány mM citrátem sodným, 250 mM NaCl, pH 7,0. Čištěné /Thr¹²’/ pooly byly analyzovány IEF a jsou uvedeny na obr. 9. EPO analogy je analyzován na in vivo biologickou aktivitu jak je popsáno výše (Cotes a spol., supra).

Vynález je popsán svými výhodnými provedeními, která však nijak vynález neomezují, naopak, jsou v něm zahrnuty různé modifikace a ekvivalenty v rámci připojených nároků, provedené v nejširším rozsahu tak, že zahrnují všechny takové modifikace a ekvivalenty.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Erythropoietin, sestávající z biologicky aktivních erythropoietinových molekul, majících stejný počet sialových kyselin na molekulu, kde uvedený počet je vybrán ze skupiny, zahrnující 1 až 14.

2. Erythropoietin podle nároku 1, mající 14 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.

3. Erythropoietin podle nároku 1, mající 13 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.

4. Erythropoietin podle nároku 1, mající 10 sialových kyselin na molekulu erythropoietinu.

5. Erythropoietin podle nároku 1, kde uvedená molekula je produktem exprese exogenní DNA sekvence v eukaryotické hostitelské buňce, která není lidská.

6. Erythropoietin podle nároku 1, kde uvedený erythropoietin má aminokyselinovou sekvenci lidského erythropoietinu.

7. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství erythropoietinu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, přísadu nebo nosič.