JP5490972B2 - タンパク質注射製剤 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、有効成分として生理活性タンパク質と、無痛化剤として少なくとも１種類の糖類とを含み、添加剤として他のタンパク質を含まない、ｐＨが６．５〜７．４であることを特徴とする注射用医薬製剤に関する。さらに、本発明は、注射用医薬組成物に、少なくとも１種の糖類を混和し、かつｐＨを６．５〜７．４とすることによって、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法にも関する。
背景技術
生理活性タンパク質（例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、モノクローナル抗体等）は、不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線などに起因して変性、凝集、会合、重合、酸化、加水分解、ジスルフィド交換反応等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招くなど安定性の問題がある。
従来、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミン等のタンパク質が添加されている。これらのアルブミン等のタンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスの混入等の危険性を回避するために煩雑な製造工程を要する。しかしながら、アルブミン等のタンパク質を添加しない場合には、溶液のｐＨに依存して、注射用製剤投与時の疼痛の問題が生じることを本発明者らは見いだした。
他方、生理活性タンパク質は、溶液製剤にした場合、酸性の方が比較的安定であり、例えば、エリスロポエチンの場合はｐＨ６．０付近の酸性で安定であることが知られている。
しかしながら、このような酸性状態が注射投与時の疼痛を引き起こす要因となりうることから、これらをさらに抑制することが求められている。
本発明の目的は、注射用タンパク質製剤において、投与時の疼痛が抑制され、かつ安定性が改善されて、長期保存可能である製剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、注射用医薬組成物に、少なくとも１種の糖類を混和することによって、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、等張化剤として従来用いられていた塩化ナトリウム等の塩類の代わりに糖類を含む場合に、投与時の疼痛が抑制され、また、ｐＨが６．５〜７．４である場合にさらに投与時の疼痛が抑制されること、及び糖類を添加することにより、ｐＨが６．５〜７．４である製剤は主剤である生理活性タンパク質の安定性でも改善され、長期保存可能であることを見出し、本発を完成した。
本発明は、有効成分として生理活性タンパク質と、無痛化剤として少なくとも１種類の糖類とを含み、添加剤として他のタンパク質を含まない、ｐＨが６．５〜７．４であることを特徴とする注射用製剤（以下「本発明の製剤」または「本願製剤」という）を提供する。
さらに、本発明は、注射用医薬組成物（以下「注射用組成物」という）に、少なくとも１種の糖類を混和し、かつｐＨを６．５〜７．４とすることを特徴とする、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法（以下「本発明の方法」または「本願方法」という）を提供する。
好ましい態様としては、以下のものがあげられる。
本発明は、糖類がマンニトール、ソルビトール、トレハロース及びショ糖からなる群から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、糖類がマンニトールであることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、ｐＨが６．８〜７．２であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、生理活性タンパク質がエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、モノクローナル抗体であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、生理活性タンパク質がエリスロポエチンであることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、安定化剤としてさらにヒスチジン及び／またはその塩を含むことを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、糖類がマンニトールであることを特徴とする、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる前記方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書でいう、「無痛化剤」とは、注射剤投与時の疼痛を抑制するための添加剤をいう。
本発明において無痛化剤として用いられる糖類とは、単糖、オリゴ糖及び多糖からなる狭義の糖類のみならず糖アルコール類も包含するものである。ここで、糖アルコール類とは、カルボニル基が還元された鎖状の多価アルコールのみならず、環状のアルコールをも包含する。
これらの例としては、ブドウ糖、果糖、白糖、マルトース、乳糖、ショ糖、マンノース、ラフィノース、マンニトール、キシリトール、ガラクチトール、グルシトール、イノシトール、ソルビトール、フラクトース、ラクトース、トレハロース、グリセリンがあげられる。好ましくは、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、イノシトール及びブトウ糖が用いられ、より好ましくは、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びショ糖、さらに好ましくは、マンニトールが用いられる。
本発明に用いる糖類の量は、本願製剤の浸透圧比または本願方法における注射用組成物に糖類を添加した後の浸透圧比が、各々約０．５〜約２．０、好ましくは約１に調整できるような量である。ここでいう『浸透圧比』とは、生理的浸透圧に対する相対比で表されるものである。すなわち、０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウムの水溶液の浸透圧比を１．０として塩化ナトリウムの濃度換算によって定めた浸透圧比を意味する。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン等の造血因子及びモノクロナール抗体が好ましく、さらに好ましくはＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及びモノクローナル抗体である。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質としては、例えば糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナ抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
本発明のタンパク質製剤又は本願方法に用いる注射用組成物は、添加剤としてのタンパク質を含まない。
ここでいう、「添加剤としてのタンパク質」とは、現在市場に供給されている製品に、タンパク質製剤の化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤として含有されている、アルブミン、精製ゼラチンなどをいう。
本願製剤及び本願方法における注射用組成物は、さらに安定化剤を含んでもよい。安定化剤は、１種または２種以上を組み合わせて添加してもよい。
これらの安定化剤としては、アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、リジン等及び／又はその塩があげられ、好ましくは、ヒスチジン及び／またはその塩が用いられる。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に添加する安定化剤の量は、一般には０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）である。
本発明の製剤及び本願方法における注射用組成物には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤は、１種または２種以上を組み合わせて添加してもよい。
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に添加する界面活性剤の量は、一般には０．０００２５〜０．５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤、防腐剤等を含有してもよい。例えば、防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの四級アンモニウム塩、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラベン類などを挙げることができ、これらの１種又は２種以上の成分を用いることができる。含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。
本願製剤及び本願方法の注射用組成物に用いる緩衝剤としては、注射剤に通常緩衝剤として用いられる酸とその塩、あるいは塩基とその塩の混合液を含み、例えばリン酸、酢酸、塩酸、フタル酸、ホウ酸、クエン酸、炭酸、コハク酸及びこれらの塩などがあげられ、好ましくはリン酸緩衝液（リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液及び／又は酢酸緩衝液が用いられる。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に用いる緩衝剤の濃度は、本願製剤、または糖類を添加した後の注射用組成物の全体量に対して、一般には０〜３００ｍＭであり、好ましくは０〜１００ｍＭである。
本願製剤のｐＨ及び本願方法の注射用組成物の糖を混和した後の好ましいｐＨは、６．５〜７．４であり、より好ましくは、６．８〜７．２である。
上記ｐＨを調整するにあたっては、塩酸などの酸、水酸化ナトリウムなどの塩基など通常用いられるｐＨ調整剤を用いて調節することができる。
本発明のタンパク質製剤または本願方法に用いる生理活性タンパク質は、溶液、凍結乾燥、噴霧乾燥状態などのものを含むが、最も好ましくは溶液状態のものである。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法の注射用組成物又は生理活性タンパク質は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはディスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することができる。凍結乾燥製剤の場合には、使用時に純水（注射用水）に溶解して使用できる。
本発明の注射剤は、点滴も包含し、例えば、皮下注、静注、筋注などで投与される。
本発明において用いる生理活性タンパク質の濃度は、使用するタンパク質、治療すべき疾患の種類、患者の重症度、患者の年齢等に応じて決定できる。一般的には、本願製剤、または糖類を添加した後の注射用組成物の全体量に対して、０．５μｇ〜１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む。例えばＥＰＯの場合には溶液製剤中のＥＰＯの量は、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ（約０．５〜３０００μｇ／ｍｌ）、好ましくは２００〜１０００００ＩＵ／ｍｌ（約１〜６００μｇ／ｍｌ）、さらに好ましくは７５０〜７２０００ＩＵ／ｍｌ（約４〜４００μｇ／ｍｌ）である。また、Ｇ−ＣＳＦの場合には、一般には最終投与濃度で１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。生理活性タンパク質が免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ヒト型化抗体などの抗体である場合には、一般には最終投与濃度で０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜１５０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の製剤は後述の実施例に示すように、投与時の疼痛が改善されており、また、２５℃−３ヶ月間、２５℃−６ヶ月間及び４０℃−２週間の保存後にも、極めて安定な製剤である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例１ 疼痛試験
比較剤として、等張化剤として塩化ナトリウムを用い、ｐＨ６に調整された注射剤を用い、水素イオン濃度（ｐＨ）及び等張化剤の種類を変更したサンプルによるヒトにおける投与時の痛みの差異を検討した。
Ａ．試験方法
試験薬剤：
比較剤（Ａ薬剤）及びｐＨ、等張化剤を変更した以下のＢ〜Ｅのサンプル（表１に各サンプルのｐＨと組成を示す）を製造した。なお、いずれの薬剤も緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ；安定化剤としてのＬ−ヒスチジンは０．１％；及び吸着防止剤としてのポリソルベート８０は０．００５％。
試験薬剤の投与方法：
上記（表１）サンプルの内、２種類のサンプルを割付表（表２）に従って準備し、所定量（０．５ｍＬ）を各々注射筒にとり、各被験者（健常人１８名）の上腕部に一定時間（約３０秒）をおいて投与した（最も痛みが強いと考えられるＡ（従来技術に基づくサンプル）を１回目に投与し、２回目は割り付けられたシーケンスのサンプルを投与する）。１回目のサンプルとの痛みの差及び１、２回目の痛みの程度を調査票に記入した。
評価項目および評価尺度：
以下の３項目について薬液注入中と薬液注入後に評価した。
▲１▼痛みの差異
１回目（Ａ薬剤）の痛みの程度を中心とした前後９段階（計１９段階）で２回目の痛みの程度を評価し、１回目と比べて２回目の痛みの差を相当するスケールバー上に記入した（表３）。
▲２▼痛みスケール
１−２回目の投与毎に痛みの程度を次の６段階で評価し、記録した。なお、６段階評価においては、以下の表４に示す「痛みなし」を０、「かすかな痛み」を１、「軽い痛み」を２、「中くらいの痛み」を３、「強い痛み」を４、「非常に激しい痛み」を５として評価した。
「痛みスケール」の評価項目では、小さい値が痛みの程度が弱い尺度の指標を用いた。そのため、各評価項目は、その数値が小さいほど薬液による痛みが少ない。
▲３▼痛みスケールの１回目（Ａ薬剤）との差
▲２▼の評価と１回目（Ａ薬剤）と２回目の差。
Ｂ． 解析方法
▲１▼薬液注入中と薬液注入後の各評価項目について分散分析を実施した。
▲２▼［薬剤］Ｂ，Ｅ（解析上、ＢをｐＨ６と仮定した）をｐＨ６．０、［薬剤］Ｃ，ＤをｐＨ７．０とした変数［ｐＨ］と、薬剤Ｂ，ＣをＮａＣｌ、薬剤Ｄ，Ｅをマンにトールとした変数［ＩＳＯ］として、分散分析を実施した。「痛みスケール」の解析では、Ａ薬剤からＥ薬剤までの全体の解析を行わず、Ｂ薬剤からＥ薬剤までの比較を行った。ただし、Ａ薬剤については、グラフ中で平均値±標準誤差を参考として示し、他薬剤との比較は行わなかった。
Ｃ． 結果
１． 痛みの差異
痛みの差異の薬液注入中及び薬液注入後の解析結果を各々図１及び２に示す。
１．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果について検討（薬剤の主効果）を行ったところ、ＢからＥの各薬剤はＤ＜Ｃ＜Ｂ≒Ｅの順に痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約５段階改善した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さく、ｐＨ７ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約４段階改善した。
▲３▼等張化剤の効果を時期毎に検討したところ、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが小さかった。
１．２． 薬液注入後
▲１▼薬剤の効果について検討（薬液の主効果）を行ったところ、ＢからＥの各薬剤はＤ＜Ｂ≒Ｃ≒Ｅの順に痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約３段階改善した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さかった。
▲３▼等張化剤の効果を検討したところ、いずれの等張化剤もＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約２段階改善した。
２． 痛みスケール
痛みのスケールの薬液注入中及び薬液注入後の解析結果を各々図３及び４に示す。
２．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、Ｄ＜Ｃ＝Ｅ＜Ｂの順で痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して「痛みのスケール」で約２段階改善した。また、検定の結果、Ｄ薬剤は他のいずれの薬剤の間でも有意差が認められた。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７はｐＨ６よりも痛みが小さく、Ａ薬剤に比して「痛みのスケール」で約１段階改善した。
▲３▼等張化剤の効果を検討したところ、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが有意に小さかった。
２．２． 薬液注入後
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、何れの薬剤も約１．５前後の痛みのスケールでほぼ同等であったが、若干Ｄが低い値を示した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも低い値を示した。
▲３▼等張化剤の効果について検討したところ、いずれの場合でも約１．５段階前後の痛みのスケールであり、マンニトールとＮａＣｌはほぼ同等の値を示した
３． 痛みスケールの差
薬液注入中及び薬液注入後の痛みのスケールと１回目（Ａ薬剤）の痛みのスケールとの差を求め、解析した結果を各々図５及び６に示す。
３．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、Ｄ＜Ｃ＜Ｅ＜Ｂの順で痛みが小さかった。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、有意にｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さく、「痛みの差異」の場合と同様の結果であった。
▲３▼等張化剤ついての検討では、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが有意に小さかった。
３．２． 薬液注入後
エリスロポエチン（遺伝子組換ＥＰＯ）溶液製剤（１５００ＩＵ／ｍｌ）を調製して用いた。緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；Ｄ−マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ。
Ｂ．試験方法
各処方の試作品について，２５℃−６カ月間保存し，純度試験〔類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）〕，純度試験〔類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）〕及び定量〔液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）〕を行った。
各々の試験方法について以下に説明する。
１．純度試験［類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）］
（１）試験方法
試料溶液，標準溶液及び分子量マーカー溶液それぞれにつき，電気泳動法により試験を行い，ウェスタンブロット法により検出した。
２．純度試験［類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）］
（１）試験方法
試料の７．５μＬにつき，電気泳動法により試験を行い，抗エリスロポエチン抗体（ポリクローナル抗体として調製）を用いたウェスタンブロット法により検出する。
検出された３２ｋｄ付近のバンドをデンシトメーターで読み取り，試料の染色強度より濃度を算出した。
３．定量［液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）］
エリスロポエチン（遺伝子組換ＥＰＯ）溶液製剤（１５００ＩＵ／ｍｌ）を調製して用いた。緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；Ｄ−マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ。
Ｂ．試験方法
各処方の試作品について，２５℃−６カ月間保存し，純度試験〔類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）〕，純度試験〔類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）〕及び定量〔液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）〕を行った。
各々の試験方法について以下に説明する。
１．純度試験［類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）］
（１）試験方法
試料溶液，標準溶液及び分子量マーカー溶液それぞれにつき，電気泳動法により試験を行い，ウェスタンブロット法により検出した。
２．純度試験［類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）］
（１）試験方法
試料の７．５μＬにつき，電気泳動法により試験を行い，抗エリスロポエチン抗体（ポリクローナル抗体として調製）を用いたウェスタンブロット法により検出する。
検出された３２ｋｄ付近のバンドをデンシトメーターで読み取り，試料の染色強度より濃度を算出した。
３．定量［液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）］
（１）試験方法
液体クロマトグラフ法により試験を行い，エリスロポエチンのピーク面積よりエリスロポエチンの含量（対表示力価％）を求めた。
４．考察および／または結論
［エリスロポエチン溶液の安定性に及ぼすｐＨの影響について］
エリスロポエチン溶液（１５００ＩＵ／ｍＬ）の２５℃−６ヶ月保存後のＨＰＬＣ法による残存率とｐＨの関係（処方Ａ〜Ｄの結果をまとめたもの）を表６に示す。測定結果のバラツキを考慮した時、ＨＰＬＣ法による残存率はｐＨ６．０〜７．０では差がなく，ｐＨ７．５で低下した。
［エリスロポエチン溶液の安定性に及ぼす糖の影響について］
エリスロポエチン溶液（１５００ＩＵ／ｍＬ）の２５℃−６ヶ月保存後のＨＰＬＣ法による残存率とＭａｎ添加の関係（処方Ａ，Ｃと処方Ｅ，Ｆを比較した結果）を表７に示す。ｐＨ６．０及びｐＨ７．０のいずれの処方も安定性に問題はなかったものの、ＨＰＬＣ法による含量は，ｐＨ６．０ではＭａｎ非添加処方が，ｐＨ７．０ではＭａｎ添加処方が若干高い値を示した。
［結論］
以上の結果から，注射投与時の疼痛軽減及び製剤の安定性の点で、薬液ｐＨを７．０とし，等張化剤としてＤ−マンニトールを含有することを特徴としたエリスロポエチン溶液製剤であるＦ処方が最も好ましいことがわかる。
Ｆ処方とＡ処方の２５℃−６ヶ月保存における安定性を比較すると、Ｆ処方はＡ処方と比べて，残存率及び分解物種とも同等であった。
このことから，Ｆ処方はＡ処方と同様に１０℃保存において２年以上安定であると推定された。
本発明は、有効成分として生理活性タンパク質と、無痛化剤として少なくとも１種類の糖類とを含み、添加剤として他のタンパク質を含まない、ｐＨが６．５〜７．４であることを特徴とする注射用医薬製剤に関する。さらに、本発明は、注射用医薬組成物に、少なくとも１種の糖類を混和し、かつｐＨを６．５〜７．４とすることによって、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法にも関する。
背景技術
生理活性タンパク質（例えば、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、モノクローナル抗体等）は、不安定で、外的因子の影響を受けやすく、温度、湿度、酸素、紫外線などに起因して変性、凝集、会合、重合、酸化、加水分解、ジスルフィド交換反応等の物理的、化学的変化を生じ、結果として大きな活性の低下を招くなど安定性の問題がある。
従来、これら化学的、物理的変化を抑制するために、安定化剤として一般的に使用されているヒト血清アルブミン等のタンパク質が添加されている。これらのアルブミン等のタンパク質を安定化剤として添加することに関しては、ウィルスの混入等の危険性を回避するために煩雑な製造工程を要する。しかしながら、アルブミン等のタンパク質を添加しない場合には、溶液のｐＨに依存して、注射用製剤投与時の疼痛の問題が生じることを本発明者らは見いだした。
他方、生理活性タンパク質は、溶液製剤にした場合、酸性の方が比較的安定であり、例えば、エリスロポエチンの場合はｐＨ６．０付近の酸性で安定であることが知られている。
しかしながら、このような酸性状態が注射投与時の疼痛を引き起こす要因となりうることから、これらをさらに抑制することが求められている。
本発明の目的は、注射用タンパク質製剤において、投与時の疼痛が抑制され、かつ安定性が改善されて、長期保存可能である製剤を提供することである。
本発明のさらなる目的は、注射用医薬組成物に、少なくとも１種の糖類を混和することによって、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法を提供することである。
発明の開示
本発明者らは、鋭意検討した結果、等張化剤として従来用いられていた塩化ナトリウム等の塩類の代わりに糖類を含む場合に、投与時の疼痛が抑制され、また、ｐＨが６．５〜７．４である場合にさらに投与時の疼痛が抑制されること、及び糖類を添加することにより、ｐＨが６．５〜７．４である製剤は主剤である生理活性タンパク質の安定性でも改善され、長期保存可能であることを見出し、本発を完成した。
本発明は、有効成分として生理活性タンパク質と、無痛化剤として少なくとも１種類の糖類とを含み、添加剤として他のタンパク質を含まない、ｐＨが６．５〜７．４であることを特徴とする注射用製剤（以下「本発明の製剤」または「本願製剤」という）を提供する。
さらに、本発明は、注射用医薬組成物（以下「注射用組成物」という）に、少なくとも１種の糖類を混和し、かつｐＨを６．５〜７．４とすることを特徴とする、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる方法（以下「本発明の方法」または「本願方法」という）を提供する。
好ましい態様としては、以下のものがあげられる。
本発明は、糖類がマンニトール、ソルビトール、トレハロース及びショ糖からなる群から選択される少なくとも１種類であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、糖類がマンニトールであることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、ｐＨが６．８〜７．２であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、生理活性タンパク質がエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、モノクローナル抗体であることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、生理活性タンパク質がエリスロポエチンであることを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、安定化剤としてさらにヒスチジン及び／またはその塩を含むことを特徴とする、前記注射用製剤を提供する。
本発明は、糖類がマンニトールであることを特徴とする、注射用製剤の投与時の疼痛を減少させる前記方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態
本明細書でいう、「無痛化剤」とは、注射剤投与時の疼痛を抑制するための添加剤をいう。
本発明において無痛化剤として用いられる糖類とは、単糖、オリゴ糖及び多糖からなる狭義の糖類のみならず糖アルコール類も包含するものである。ここで、糖アルコール類とは、カルボニル基が還元された鎖状の多価アルコールのみならず、環状のアルコールをも包含する。
これらの例としては、ブドウ糖、果糖、白糖、マルトース、乳糖、ショ糖、マンノース、ラフィノース、マンニトール、キシリトール、ガラクチトール、グルシトール、イノシトール、ソルビトール、フラクトース、ラクトース、トレハロース、グリセリンがあげられる。好ましくは、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、ショ糖、イノシトール及びブトウ糖が用いられ、より好ましくは、マンニトール、ソルビトール、トレハロース及びショ糖、さらに好ましくは、マンニトールが用いられる。
本発明に用いる糖類の量は、本願製剤の浸透圧比または本願方法における注射用組成物に糖類を添加した後の浸透圧比が、各々約０．５〜約２．０、好ましくは約１に調整できるような量である。ここでいう『浸透圧比』とは、生理的浸透圧に対する相対比で表されるものである。すなわち、０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウムの水溶液の浸透圧比を１．０として塩化ナトリウムの濃度換算によって定めた浸透圧比を意味する。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質は、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン等の造血因子、インターフェロン、ＩＬ−１やＩＬ−６等のサイトカイン、モノクローナル抗体、組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、血清アルブミン、血液凝固第ＶＩＩＩ因子、レプチン、インシュリン、幹細胞成長因子（ＳＣＦ）などを含むが、これらに限定されない。タンパク質の中でも、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、トロンボポエチン等の造血因子及びモノクロナール抗体が好ましく、さらに好ましくはＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ及びモノクローナル抗体である。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質とは、哺乳動物、特にヒトの生理活性タンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するものであり、天然由来のもの、および遺伝子組換え法により得られたものを含むが、好ましいのは遺伝子組換え法により得られたものである。遺伝子組換え法によって得られるタンパク質には天然タンパク質とアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列の１又は複数を欠失、置換、付加したもので前記生物学的活性を有するものを含む。さらには、生理活性タンパク質はＰＥＧ等により化学修飾されたものも含む。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質としては、例えば糖鎖を有するタンパク質が挙げられる。糖鎖の由来としては、特に制限はないが、哺乳動物細胞に付加される糖鎖が好ましい。哺乳動物細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞等があるが、この中でも、ＣＨＯ細胞が最も好ましい。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がＥＰＯである場合には、ＥＰＯはいかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト尿より種々の方法で抽出し、分離精製したもの、遺伝子工学的手法（例えば特開昭６１−１２２８８号）によりチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト由来の細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＥＰＯも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。さらに、糖鎖のついていないＥＰＯをＰＥＧ等により化学修飾したものも含む。また、ＥＰＯのアミノ酸配列中のＮ−結合炭水化物鎖結合部位もしくはＯ−結合炭水化物鎖結合部位において、１以上のグリコシル化部位の数を増加させるように改変したＥＰＯ類似体も含む（例えば、特開平８−１５１３９８号、特表平８−５０６０２３号参照）。さらには、糖鎖結合部位の数は変化させずに、シアル酸等の含量を増加させることにより糖鎖の量を増加させたものであってもよい。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がＧ−ＣＳＦである場合には、Ｇ−ＣＳＦは高純度に精製されたＧ−ＣＳＦであれば全て使用できる。本発明におけるＧ−ＣＳＦは、いかなる方法で製造されたものでもよく、ヒト腫瘍細胞の細胞株を培養し、これから種々の方法で抽出し分離精製したもの、あるいは遺伝子工学的手法により大腸菌などの細菌類；イースト菌；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＯＳ細胞などの動物由来の培養細胞などに産生せしめ、種々の方法で抽出し分離精製したものが用いられる。好ましくは大腸菌、イースト菌又はＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。最も好ましくはＣＨＯ細胞によって遺伝子組換え法を用いて生産されたものである。さらには、ＰＥＧ等により化学修飾されたＧ−ＣＳＦも含む（国際特許出願公開番号ＷＯ９０／１２８７４参照）。
本発明において有効成分として使用する生理活性タンパク質がモノクローナル抗体である場合には、モノクローナル抗体はいかなる方法で製造されたものでもよい。モノクローナ抗体は、基本的には公知技術を使用し、感作抗原を通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作成できる。さらに、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体に限られるものではなく、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変されたキメラ抗体を含む。あるいは再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）したヒト抗体を本発明に用いることもできる。これはヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域によりヒト抗体の相補性決定領域を置換したものであり、その一般的な遺伝子組換手法も知られている。その既知方法を用いて、本発明に有用な再構成ヒト型化抗体を得ることができる。
本発明のタンパク質製剤又は本願方法に用いる注射用組成物は、添加剤としてのタンパク質を含まない。
ここでいう、「添加剤としてのタンパク質」とは、現在市場に供給されている製品に、タンパク質製剤の化学的、物理的変化を抑制するために安定化剤として含有されている、アルブミン、精製ゼラチンなどをいう。
本願製剤及び本願方法における注射用組成物は、さらに安定化剤を含んでもよい。安定化剤は、１種または２種以上を組み合わせて添加してもよい。
これらの安定化剤としては、アミノ酸、例えば、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、リジン等及び／又はその塩があげられ、好ましくは、ヒスチジン及び／またはその塩が用いられる。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に添加する安定化剤の量は、一般には０．００１〜１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０１〜１．０％（ｗ／ｖ）である。
本発明の製剤及び本願方法における注射用組成物には界面活性剤をさらに含むことができる。界面活性剤は、１種または２種以上を組み合わせて添加してもよい。
好ましい界面活性剤はポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、特に好ましいのはポリソルベート２０、２１、４０、６０、６５、８０、８１、８５であり、最も好ましいのはポリソルベート２０及び８０である。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に添加する界面活性剤の量は、一般には０．０００２５〜０．５％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）である。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物には、所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、含硫還元剤、酸化防止剤、防腐剤等を含有してもよい。例えば、防腐剤としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどの四級アンモニウム塩、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル、パラオキシ安息香酸ブチルなどのパラベン類などを挙げることができ、これらの１種又は２種以上の成分を用いることができる。含硫還元剤としては、Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−アセチルホモシステイン、チオクト酸、チオジグリコール、チオエタノールアミン、チオグリセロール、チオソルビトール、チオグリコール酸及びその塩、チオ硫酸ナトリウム、グルタチオン、並びに炭素原子数１〜７のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有するもの等が挙げられる。また、酸化防止剤としては、エリソルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、α−トコフェロール、酢酸トコフェロール、Ｌ−アスコルビン酸及びその塩、Ｌ−アスコルビン酸パルミテート、Ｌ−アスコルビン酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリアミル、没食子酸プロピルあるいはエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、ピロリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤が挙げられる。さらには、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機塩；クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、酢酸ナトリウムなどの有機塩などの通常添加される成分を含んでいてよい。
本願製剤及び本願方法の注射用組成物に用いる緩衝剤としては、注射剤に通常緩衝剤として用いられる酸とその塩、あるいは塩基とその塩の混合液を含み、例えばリン酸、酢酸、塩酸、フタル酸、ホウ酸、クエン酸、炭酸、コハク酸及びこれらの塩などがあげられ、好ましくはリン酸緩衝液（リン酸一水素ナトリウム−リン酸二水素ナトリウム系）及び／又はクエン酸緩衝液及び／又は酢酸緩衝液が用いられる。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法における注射用組成物に用いる緩衝剤の濃度は、本願製剤、または糖類を添加した後の注射用組成物の全体量に対して、一般には０〜３００ｍＭであり、好ましくは０〜１００ｍＭである。
本願製剤のｐＨ及び本願方法の注射用組成物の糖を混和した後の好ましいｐＨは、６．５〜７．４であり、より好ましくは、６．８〜７．２である。
上記ｐＨを調整するにあたっては、塩酸などの酸、水酸化ナトリウムなどの塩基など通常用いられるｐＨ調整剤を用いて調節することができる。
本発明のタンパク質製剤または本願方法に用いる生理活性タンパク質は、溶液、凍結乾燥、噴霧乾燥状態などのものを含むが、最も好ましくは溶液状態のものである。
本発明のタンパク質製剤及び本願方法の注射用組成物又は生理活性タンパク質は、例えば通常密封、滅菌されたプラスチックまたはガラス容器中に収納されている。容器はアンプル、バイアルまたはディスポーザブル注射器のような規定用量の形状で供給することができ、あるいは注射用バックまたは瓶のような大用量の形状で供給することができる。凍結乾燥製剤の場合には、使用時に純水（注射用水）に溶解して使用できる。
本発明の注射剤は、点滴も包含し、例えば、皮下注、静注、筋注などで投与される。
本発明において用いる生理活性タンパク質の濃度は、使用するタンパク質、治療すべき疾患の種類、患者の重症度、患者の年齢等に応じて決定できる。一般的には、本願製剤、または糖類を添加した後の注射用組成物の全体量に対して、０．５μｇ〜１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む。例えばＥＰＯの場合には溶液製剤中のＥＰＯの量は、一般には１００〜５０００００ＩＵ／ｍｌ（約０．５〜３０００μｇ／ｍｌ）、好ましくは２００〜１０００００ＩＵ／ｍｌ（約１〜６００μｇ／ｍｌ）、さらに好ましくは７５０〜７２０００ＩＵ／ｍｌ（約４〜４００μｇ／ｍｌ）である。また、Ｇ−ＣＳＦの場合には、一般には最終投与濃度で１〜１０００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜８００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは５０〜５００μｇ／ｍｌである。生理活性タンパク質が免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ヒト型化抗体などの抗体である場合には、一般には最終投与濃度で０．１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜２００ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは１０〜２００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは１０〜１５０ｍｇ／ｍｌである。
本発明の製剤は後述の実施例に示すように、投与時の疼痛が改善されており、また、２５℃−３ヶ月間、２５℃−６ヶ月間及び４０℃−２週間の保存後にも、極めて安定な製剤である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。本発明の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
実施例
実施例１ 疼痛試験
比較剤として、等張化剤として塩化ナトリウムを用い、ｐＨ６に調整された注射剤を用い、水素イオン濃度（ｐＨ）及び等張化剤の種類を変更したサンプルによるヒトにおける投与時の痛みの差異を検討した。
Ａ．試験方法
試験薬剤：
比較剤（Ａ薬剤）及びｐＨ、等張化剤を変更した以下のＢ〜Ｅのサンプル（表１に各サンプルのｐＨと組成を示す）を製造した。なお、いずれの薬剤も緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ；安定化剤としてのＬ−ヒスチジンは０．１％；及び吸着防止剤としてのポリソルベート８０は０．００５％。
上記（表１）サンプルの内、２種類のサンプルを割付表（表２）に従って準備し、所定量（０．５ｍＬ）を各々注射筒にとり、各被験者（健常人１８名）の上腕部に一定時間（約３０秒）をおいて投与した（最も痛みが強いと考えられるＡ（従来技術に基づくサンプル）を１回目に投与し、２回目は割り付けられたシーケンスのサンプルを投与する）。１回目のサンプルとの痛みの差及び１、２回目の痛みの程度を調査票に記入した。
以下の３項目について薬液注入中と薬液注入後に評価した。
▲１▼痛みの差異
１回目（Ａ薬剤）の痛みの程度を中心とした前後９段階（計１９段階）で２回目の痛みの程度を評価し、１回目と比べて２回目の痛みの差を相当するスケールバー上に記入した（表３）。
１−２回目の投与毎に痛みの程度を次の６段階で評価し、記録した。なお、６段階評価においては、以下の表４に示す「痛みなし」を０、「かすかな痛み」を１、「軽い痛み」を２、「中くらいの痛み」を３、「強い痛み」を４、「非常に激しい痛み」を５として評価した。
「痛みスケール」の評価項目では、小さい値が痛みの程度が弱い尺度の指標を用いた。そのため、各評価項目は、その数値が小さいほど薬液による痛みが少ない。
▲２▼の評価と１回目（Ａ薬剤）と２回目の差。
Ｂ． 解析方法
▲１▼薬液注入中と薬液注入後の各評価項目について分散分析を実施した。
▲２▼［薬剤］Ｂ，Ｅ（解析上、ＢをｐＨ６と仮定した）をｐＨ６．０、［薬剤］Ｃ，ＤをｐＨ７．０とした変数［ｐＨ］と、薬剤Ｂ，ＣをＮａＣｌ、薬剤Ｄ，Ｅをマンにトールとした変数［ＩＳＯ］として、分散分析を実施した。「痛みスケール」の解析では、Ａ薬剤からＥ薬剤までの全体の解析を行わず、Ｂ薬剤からＥ薬剤までの比較を行った。ただし、Ａ薬剤については、グラフ中で平均値±標準誤差を参考として示し、他薬剤との比較は行わなかった。
Ｃ． 結果
１． 痛みの差異
痛みの差異の薬液注入中及び薬液注入後の解析結果を各々図１及び２に示す。
１．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果について検討（薬剤の主効果）を行ったところ、ＢからＥの各薬剤はＤ＜Ｃ＜Ｂ≒Ｅの順に痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約５段階改善した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さく、ｐＨ７ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約４段階改善した。
▲３▼等張化剤の効果を時期毎に検討したところ、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが小さかった。
１．２． 薬液注入後
▲１▼薬剤の効果について検討（薬液の主効果）を行ったところ、ＢからＥの各薬剤はＤ＜Ｂ≒Ｃ≒Ｅの順に痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約３段階改善した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さかった。
▲３▼等張化剤の効果を検討したところ、いずれの等張化剤もＡ薬剤に比して痛みの差異のスケールで約２段階改善した。
２． 痛みスケール
痛みのスケールの薬液注入中及び薬液注入後の解析結果を各々図３及び４に示す。
２．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、Ｄ＜Ｃ＝Ｅ＜Ｂの順で痛みが小さく、Ｄ薬剤ではＡ薬剤に比して「痛みのスケール」で約２段階改善した。また、検定の結果、Ｄ薬剤は他のいずれの薬剤の間でも有意差が認められた。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７はｐＨ６よりも痛みが小さく、Ａ薬剤に比して「痛みのスケール」で約１段階改善した。
▲３▼等張化剤の効果を検討したところ、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが有意に小さかった。
２．２． 薬液注入後
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、何れの薬剤も約１．５前後の痛みのスケールでほぼ同等であったが、若干Ｄが低い値を示した。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、ｐＨ７がｐＨ６よりも低い値を示した。
▲３▼等張化剤の効果について検討したところ、いずれの場合でも約１．５段階前後の痛みのスケールであり、マンニトールとＮａＣｌはほぼ同等の値を示した
３． 痛みスケールの差
薬液注入中及び薬液注入後の痛みのスケールと１回目（Ａ薬剤）の痛みのスケールとの差を求め、解析した結果を各々図５及び６に示す。
３．１． 薬液注入中
▲１▼薬剤の効果を検討したところ、Ｄ＜Ｃ＜Ｅ＜Ｂの順で痛みが小さかった。
▲２▼薬液ｐＨの効果を検討したところ、有意にｐＨ７がｐＨ６よりも痛みが小さく、「痛みの差異」の場合と同様の結果であった。
▲３▼等張化剤ついての検討では、マンニトールがＮａＣｌよりも痛みが有意に小さかった。
３．２． 薬液注入後
エリスロポエチン（遺伝子組換ＥＰＯ）溶液製剤（１５００ＩＵ／ｍｌ）を調製して用いた。緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；Ｄ−マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ。
各処方の試作品について，２５℃−６カ月間保存し，純度試験〔類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）〕，純度試験〔類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）〕及び定量〔液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）〕を行った。
各々の試験方法について以下に説明する。
１．純度試験［類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）］
（１）試験方法
試料溶液，標準溶液及び分子量マーカー溶液それぞれにつき，電気泳動法により試験を行い，ウェスタンブロット法により検出した。
２．純度試験［類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）］
（１）試験方法
試料の７．５μＬにつき，電気泳動法により試験を行い，抗エリスロポエチン抗体（ポリクローナル抗体として調製）を用いたウェスタンブロット法により検出する。
検出された３２ｋｄ付近のバンドをデンシトメーターで読み取り，試料の染色強度より濃度を算出した。
３．定量［液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）］
エリスロポエチン（遺伝子組換ＥＰＯ）溶液製剤（１５００ＩＵ／ｍｌ）を調製して用いた。緩衝液種（リン酸塩）及び浸透圧比（１．０）は同じであり、添加量は以下の通りである：リン酸塩は約１０ｍｍｏｌ；ＮａＣｌは約２．５ｍｍｏｌ；Ｄ−マンニトールは約２５０ｍｍｏｌ。
各処方の試作品について，２５℃−６カ月間保存し，純度試験〔類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）〕，純度試験〔類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）〕及び定量〔液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）〕を行った。
各々の試験方法について以下に説明する。
１．純度試験［類縁物質：会合体（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）］
（１）試験方法
試料溶液，標準溶液及び分子量マーカー溶液それぞれにつき，電気泳動法により試験を行い，ウェスタンブロット法により検出した。
２．純度試験［類縁物質：低分子量分解物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｒ）法）］
（１）試験方法
試料の７．５μＬにつき，電気泳動法により試験を行い，抗エリスロポエチン抗体（ポリクローナル抗体として調製）を用いたウェスタンブロット法により検出する。
検出された３２ｋｄ付近のバンドをデンシトメーターで読み取り，試料の染色強度より濃度を算出した。
３．定量［液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ法）］
（１）試験方法
液体クロマトグラフ法により試験を行い，エリスロポエチンのピーク面積よりエリスロポエチンの含量（対表示力価％）を求めた。
４．考察および／または結論
［エリスロポエチン溶液の安定性に及ぼすｐＨの影響について］
エリスロポエチン溶液（１５００ＩＵ／ｍＬ）の２５℃−６ヶ月保存後のＨＰＬＣ法による残存率とｐＨの関係（処方Ａ〜Ｄの結果をまとめたもの）を表６に示す。測定結果のバラツキを考慮した時、ＨＰＬＣ法による残存率はｐＨ６．０〜７．０では差がなく，ｐＨ７．５で低下した。
エリスロポエチン溶液（１５００ＩＵ／ｍＬ）の２５℃−６ヶ月保存後のＨＰＬＣ法による残存率とＭａｎ添加の関係（処方Ａ，Ｃと処方Ｅ，Ｆを比較した結果）を表７に示す。ｐＨ６．０及びｐＨ７．０のいずれの処方も安定性に問題はなかったものの、ＨＰＬＣ法による含量は，ｐＨ６．０ではＭａｎ非添加処方が，ｐＨ７．０ではＭａｎ添加処方が若干高い値を示した。
以上の結果から，注射投与時の疼痛軽減及び製剤の安定性の点で、薬液ｐＨを７．０とし，等張化剤としてＤ−マンニトールを含有することを特徴としたエリスロポエチン溶液製剤であるＦ処方が最も好ましいことがわかる。
Ｆ処方とＡ処方の２５℃−６ヶ月保存における安定性を比較すると、Ｆ処方はＡ処方と比べて，残存率及び分解物種とも同等であった。
このことから，Ｆ処方はＡ処方と同様に１０℃保存において２年以上安定であると推定された。
図１は、痛みの差異の薬液注入中の解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図２は、痛みの差異の薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図３は、痛みのスケールの薬液注入中の解析結果を示す。
上段は、処方Ａ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に処理Ａと対比して、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に処理Ａと対比して、上記解析結果を示す。
図４は、痛みのスケールの薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、処方Ａ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に処理Ａと対比して、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に処理Ａと対比して、上記解析結果を示す。
図５は、痛みのスケール１回目との差の薬液注入中の解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図６は、痛みのスケール１回目との差の薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、ｐＨ６及び７別に、中段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図２は、痛みの差異の薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図３は、痛みのスケールの薬液注入中の解析結果を示す。
上段は、処方Ａ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に処理Ａと対比して、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に処理Ａと対比して、上記解析結果を示す。
図４は、痛みのスケールの薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、処方Ａ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に処理Ａと対比して、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に処理Ａと対比して、上記解析結果を示す。
図５は、痛みのスケール１回目との差の薬液注入中の解析結果を示す。
上段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、中段は、ｐＨ６及び７別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
図６は、痛みのスケール１回目との差の薬液注入後の解析結果を示す。
上段は、ｐＨ６及び７別に、中段は、処方Ｂ〜Ｅ別に、下段は、マンニトール処理（Ｍ）及びＮａＣｌ処理（Ｎ）別に、上記解析結果を示す。
Claims (3)
- 有効成分としてエリスロポエチンと、無痛化剤としてマンニトールとを含み、添加剤として他のタンパク質を含まない、ｐＨが６．８〜７．２の、凍結乾燥されていないエリスロポエチン溶液製剤であることを特徴とする皮下注用の注射用医薬製剤。
- ｐＨが７．０である、請求項１に記載の注射用製剤。
- 安定化剤としてさらにヒスチジン及び／またはその塩を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の注射用製剤。
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