HU224222B1 - Stabil folyékony interferon-készítményformák és eljárás interferon stabilizálására - Google Patents

Abstract

A találmány olyan folyékony készítményre vonatkozik, amely interferontés 0,3%–5% (t/tf) mennyiségben egy aminosav-stabilizálószerttartalmaz, melyet savas jellegű aminosavakból, argininből és glicinbőlálló aminosavcsoportból választanak ki, ahol a folyékony készítménynem liofilizált interferonból van előállítva, és a folyékonykészítmény utólag sem kerül liofilizálásra. A találmány a fentikészítmények előállítására is vonatkozik. A folyékony készítménytelőnyösen egy olyan tartály tartalmazza, melynek legalább az egyikfelülete egy, az interferonra nézve inert anyaggal van bevonva.

Description

(54) Stabil folyékony interferon készítmény-formák és eljárás interferon stabilizálására (57) Kivonat

A találmány olyan folyékony készítményre vonatkozik, amely interferont és 0,3%-5% (t/tf) mennyiségben egy aminosav-stabilizálószert tartalmaz, melyet savas jellegű aminosavakból, argininből és glicinből álló aminosavcsoportból választanak ki, ahol a folyékony készítmény nem liofilizált interferonból van előállítva, és a folyékony készítmény utólag sem kerül liofilizálásra. A találmány a fenti készítmények előállítására is vonatkozik. A folyékony készítményt előnyösen egy olyan tartály tartalmazza, melynek legalább az egyik felülete egy, az interferonra nézve inért anyaggal van bevonva.

HU 224 222 Β1

A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 3 lap ábra)

HU 224 222 Β1

A találmány a humán béta-interferon stabilizálására szolgáló eljárásokra és stabil béta-interferon folyékony készítményformákra vonatkozik.

Az interferonok olyan proteinek, amelyek számos biológiai hatást fejtenek ki, például antivirális, immunmoduláló és antiproliferatív hatást. Az interferonok fajspecifikus, viszonylag kis, egyláncú polipeptidek, amelyeket emlőssejtek termelnek különböző induktív anyagok - mint a vírusok, polipeptidek, mitogének és hasonlók - hatására adott válaszként. Az interferonok az állati szöveteket és sejteket megvédik virális támadások ellen, és fontos szerepet töltenek be a gazda védekezőmechanizmusában. A legtöbb esetben az interferonok jobb védelmet biztosítanak azon faj szöveteinek és sejtjeinek, amely az interferonokat termeli, mint más típusú szöveteknek és sejteknek, és ez azt jelenti, hogy a humán eredetű interferon sokkal hatásosabbnak bizonyul az emberi betegségek kezelésében, mint a más fajokból származó interferonok.

A humán interferonoknak több megkülönböztethető típusa van. Ezeket általában leukocita (alfa-interferon), fibroblaszt (béta-interferon) és immun (gamma-interferon) interferonként osztályozzák, nagyszámú variánsaikkal együtt. Az interferonok általános ismertetése megtalálható különféle közleményekben és monográfiákban. Például: „The Interferon System” [W. E. Stewart, Springer Verlag, N. Y., 1979] és „Interferon Therapy [World Health Organization Technical Report Series 676, World Health Organization, Genf, 1982], melyet referenciának tekintünk.

Az interferon alkalmazásának módja lényeges tényező ezen fontos terápiás szer klinikai felhasználásánál. Az interferont leggyakrabban szisztémásán adják be, intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióban némi eredménnyel olyan rendellenességek kezelésében, mint a hajas sejtes leukémia, szerzett immunhiányos szindróma (AIDS) és az ezzel összefüggő Kaposi-szindróma. Ismeretes azonban, hogy a proteinek tisztított formában különösen hajlamosak a degradációra. Ami a béta-interferont illeti, az interferondegradáció primer mechanizmusa(i) oldatban az aggregáció és a dezamidáció. Az interferon instabilitása oldatokban és más termékekben korlátozza a felhasználhatóságát.

A klinikai használatra előállított interferon-gyógyszerkészítmények az interferont szokásosan liofilizált (azaz fagyasztva szárított) készítmény formájában tartalmazzák komplex szerves vivőanyagokkal és stabilizátorokkal együtt, ilyenek például a nemionos felületaktív anyagok, a különböző cukrok, szerves polialkoholok és/vagy a humán szérumalbumin. Ilyen liofilizált készítményeket ismertetnek például az alábbi szabadalmi dokumentumokban.

A WO 88/09674 számú nemzetközi közzétételi iratban gamma-interferon stabilizált készítményeit ismertetik, amelyek laktobionsavat és egy acetát/glicin puffért tartalmaznak. A laktobionsav hozzáadása megelőzi a magasabb rendű aggregátumok képződését a liofilizált készítmény rekonstitúciója során.

Az EP 0 163 111 számú európai szabadalmi leírásban olyan aminosavakat ismertetnek, mint például az arginin és glutamin, melyek képesek növelni a liofilizált interferonkészítmények oldhatóságát vízben a rekonstitúció során.

Az EP 0 284 249 számú európai közrebocsátási iratban olyan liofilizált interferonkészítményeket írnak le, melyek glicint vagy humán szérumalbumint (HSA), egy puffért (például acetát) és egy izotóniás szert (például NaCI) tartalmaznak. Ezek mindegyike szükséges egy stabil, liofilizált készítmény létrehozásához.

A US 4,496,537 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírásban liofilizált interferonkészítményeket ismertetnek, melyek foszfát-puffért, glicint és humán szérumalbumint tartalmaznak. A kitanítás szerint a glicin és a humán szérumalbumin együttes alkalmazása megnöveli a liofilizált készítmény rekonstitúcióját, azaz újra oldatba vitelét.

A liofilizált készítményeknek az a hátránya, hogy komplex csomagolást igényelnek, mivel külön hozzájuk kell csomagolni az injekcióhoz való steril vizet. Ezenkívül a liofilizált készítmények használat előtt számos manipulációt igényelnek, ennélfogva az injekció elkészítése során növekszik a tűszúrások eshetősége és a komponensek elcsöppenése. Ezek a manipulációk különösen azoknál a betegpopulációknál problematikusak, amelyeknél gyenge az izomzat és rossz a koordinációs készség, ilyenek a szklerózis multiplexes (multíple sclerosis=MS) betegek. Az MS betegek saját maguknak is beadhatják az interferont, ezért egy olyan adagolási forma, amelyet sokkal könnyebb beadni, mint a jelenleg forgalmazott liofilizált termékeket, fontos hozzáadott értéket jelent a megcélzott betegpopuláció számára. Az interferon egyszerű folyékony készítményformái szerfelett kívánatosak azért, hogy elkerüljük a készítmény feloldását, ami akkor szükséges, amikor liofilizált készítmények használatára kerül sor.

Az interferont tartalmazó, nemliofilizált készítményformák szintén tartalmazhatnak komplex vivőanyagokat, például humán szérumalbumint, polialkoholokat, cukrokat és anionos felületaktív stabilizálóanyagokat. Lásd például: WO 89/10756 számú nemzetközi közzétételi irat (Hara et al.; polialkohol és p-hidroxi-benzoát használatát ismertetik).

A találmány a fenti problémákat annak a felismerésnek a nyomán oldja meg, hogy ugyanis a béta-interferon stabilizálható, amennyiben olyan pufferolt oldatokban készítik el, amelyek pH-ja 4-7,2 közé esik, és az oldatok stabilizálószerként aminosavat tartalmaznak, és néhány esetben sót is (ha az aminosav nem tartalmaz töltéssel rendelkező oldalláncot). A béta-interferont nem liofilizáljuk, hanem mihelyt az általános gyakorlattal rendelkező szakemberek az ismert eljárások alkalmazásával az alapanyagokból előállítják, közvetlenül a találmány szerinti készítményformába visszük be.

A találmány tárgyát tehát - egyik kiviteli alakban egy olyan folyékony készítmény képezi, amely egy interferont és egy stabilizálószert - körülbelül 0,3-5 t/tf-százalék közötti mennyiségben - tartalmaz. A stabilizálószer egy aminosav, amelyet savas jellegű aminosavak, arginin és glicin közül választunk ki. A fo2

HU 224 222 Β1 lyékony készítményt utólag nem liofilizáljuk. Ezenkívül előnyös, ha a folyékony készítmény egy olyan tartályban van - például fecskendőben - amelynek a folyadékkal érintkező felülete olyan anyaggal van bevonva, amely inért az interferonra nézve, mint például a szilikon vagy a poli(tetrafluor)-etilén. Az előnyös készítmények béta-interferont vagy rekombináns technikával előállított interferont tartalmaznak olyan pufferben, amelynek a pH-ja körülbelül 4,0 és körülbelül 7,2 között van. A találmány szerinti további készítményformák például a következők:

(1) 20 mM acetátpuffer (pH 5,0) - a puffért előzőleg nem liofilizáljuk - amely béta-interferont plusz egy további alkotórészt tartalmaz, amelyet a következők közül választunk ki: a) 150 mM arginin.HCI; b) 100 mM nátrium-klorid és 70 mM glicin; c) 150 mM arginin.HCI és 15 mg/ml humán szérumalbumin; d) 150 mM arginin.HCI és 0,1% Pluronic F-68; e) 140 mM nátrium-klorid; f) 140 mM nátrium-klorid és 15 mg/ml humán szérumalbumin; és 140 mM nátrium-klorid és 0,1% Pluronic F-68.

(2) béta-interferont 170 mM L-glutaminsavat és 150 mM nátrium-hidroxidot tartalmazó oldat (pH 5,0), az oldatot előzőleg nem liofilizáljuk;

(3) 20 mM foszfátpuffer (pH 7,2) - a puffért előzőleg nem liofilizáljuk - amely béta-interferont plusz egy további alkotórészt tartalmaz, amelyet a következők közül választunk ki: a) 140 mM arginin-HCI és b) 100 mM nátrium-klorid és 70 mM glicin.

A találmány egy másik kiviteli alakját egy folyékony interferonkészítmény-forma parenterális bevitelre alkalmas készlete képezi. A készlet egy folyékony készítményformát - pH 4-6 között - tartalmazó tartályból áll, amelyben az említett folyadék a béta-interferon - amelyet előzőleg nem liofilizáltunk - gyógyszerészetileg hatásos mennyiségét és egy aminosav-stabilizálószer 5 tömegszázaléknyi mennyiségét vagy ennél kisebb mennyiségét tartalmazza; továbbá használati utasításokat tartalmaz.

A találmány egy további kiviteli alakjában egy emlősöknél parenterális bevitelre alkalmas gyógyszerkészítményt ismertetünk, amely lényegében a béta-interferon - amelyet előzőleg nem liofilizáltunk - hatásos mennyiségét tartalmazza egy olyan pufferben, amely a pH-t 4,0-6,0 közötti tartományban tartja és egy aminosav-stabilizálószert tartalmaz, megfelelő ionerősség mellett. A) készítményt tárolótartály - például fecskendő - tartalmazza. Előnyös, ha a tárolótartályban nincs oxigéntartalmú gáz/folyadék határfelület (azaz az interferonoldat nem lehet kitéve oxigént tartalmazó gáz hatásának a készítés és a tárolás alatt). A béta-interferon lényegében megtartja antivirális aktivitását körülbelül °C és körülbelül 25 °C közötti hőmérsékleteken való tárolás alatt legalább 3 hónapig.

Folyékony gyógyszerkészítményekben a béta-interferon stabilizálására szolgáló találmány szerinti eljárás - amikor is a készítmény lényegében legalább hónapig megtartja fizikai stabilitását körülbelül 2-25 °C közötti hőmérsékleten való tárolás alatt - abból áll, hogy a következő alkotórészeket keverjük össze: a) a béta-interferon hatásos mennyiségét; b) egy puffért, amely a pH-t 4,0-7,2 között tartja megfelelő ionerő mellett; és c) egy aminosav-stabilizálószert.

A) készítményben lévő folyadékot előzőleg nem liofilizáljuk és nem tesszük ki oxigéntartalmú gáz hatásának a készítés és tárolás alatt.

A folyékony készítményformáknak számos előnye van a liofilizált készítményformákhoz képest. Az előnyök a következők: (i) a folyékony készítményformához szükséges kisebb injekciós térfogat kevesebb kényelmetlenséggel jár, mint egy nagyobb térfogat; (ii) a komplex vivőanyagok helyettesítése egyszerű aminosavakkal lehetővé teszi, hogy a késztermék minőségét szigorúbban ellenőrizzük; (iii) a csomagolást nagymértékben egyszerűsíti, hogy kiküszöbölhető külön oldószer (injekcióhoz való desztillált víz=water fór injection=WFI), valamint külön fecskendő és üvegcse hozzácsomagolása; (iv) az adagolás pontossága javul, ugyanis kevesebb folyadék átvitelére van szükség; és (v) a termék biztonságos volta javul, mivel az egyszerű beadás csökkenti a tűszúrások eshetőségét és az injekció elkészítésekor a komponensek elcsöppenését.

A találmány tárgyát képezi tehát, hogy rendelkezésre bocsátjuk a béta-interferon biológiailag aktív, stabil, folyékony készítményformáját injekciós alkalmazásokban való felhasználásra.

A találmány egy másik tárgyát egy olyan készítményforma képezi, amely nem igényli a béta-interferonkészítmény előzetes liofilizálását.

A találmány további tárgyát egy olyan eljárás képezi, amellyel meggátoljuk egy béta-interferon folyékony készítményforma stabilitásának megszűnését azáltal, hogy a) elkerüljük kavitáció (cavitation) és/vagy légtér (head space) képződését a folyékony készítmény előállítása folyamán vagy b) a folyékony készítményformát olyan légtérrel tároljuk, amely inért gázból - ilyen az argon vagy a nitrogén - áll.

A találmány tárgyát képezi ezenkívül egy olyan folyékony készítményforma, amely folyékony állapotban hosszú ideig való tárolást tesz lehetővé, és ezzel megkönnyíti az alkalmazás előtti tárolást és szállítást. A találmány másik tárgyát olyan folyékony készítményforma képezi, amely - tekintve, hogy kiküszöböljük a liofilizálás és a feloldás lépéseit - könnyen elkészíthető és beadható.

Vonatkozik a találmány az egyszerű aminosavaknak, mint alternatív stabilizátoroknak a használatára, az általánosan alkalmazott szérumalbumin helyett vagy mellett, ami könnyebbé teszi a termék minőségének ellenőrzését.

A találmány vonatkozik még olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely nemliofilizált béta-interferont tartalmaz, és ezért kisebb költséggel állítható elő.

A találmány további előnyei részben megtalálhatók az alábbi leírásban, részben a leírásból válnak nyilvánvalókká, vagy a találmány szerinti gyakorlatból lesznek megismerhetők. A mellékelt ábrák - amelyek az ismertetéshez tartoznak és ennek részét képezik - a találmány elvét szemléltetik, és a leírással együtt annak magyarázatául szolgálnak.

HU 224 222 Β1

Az alábbiakban az ábrák rövid ismertetése következik.

1. ábra: A diagram a bulk-ban előállított folyadékban maradt béta-interferonmonomer százalékát mutatja a folyadékban oldott oxigén százalékának függvényében.

2. ábra: A diagram a proteinkoncentrációt ábrázolja a kiindulási anyag koncentrációjának százalékában a BG9589-1 folyékony készítményforma tárolási idejének függvényében. A „4 °C” (betöltött négyszögek) jelű mintákat 2-8 °C között inkubáltuk. A többi mintát 25 °C-on (betöltött körök), 33 °C-on (betöltött háromszögek) és 40 °C-on (betöltött rombuszok) inkubáltuk.

3. ábra: A diagram a proteinkoncentrációt ábrázolja a kiindulási anyag koncentrációjának százalékában a BG9589-3 folyékony készítményforma tárolási idejének függvényében. A „4 °C” (betöltött négyszögek) jelű mintákat 2-8 °C között inkubáltuk. A többi mintát 25 °C-on (betöltött körök), 33 °C-on (betöltött háromszögek) és 40 °C-on (betöltött rombuszok) tároltuk.

A találmány a jelenlegi stratégiákkal és konstrukciókkal kapcsolatos problémákat és hátrányokat leküzdi, és az interferon stabilizálására egy egyszerű eljárást és egy javított tárolási stabilitással rendelkező egyszerű interferonkészítmény-formát bocsát rendelkezésre. A találmány részben azon felismeréseinken alapul, miszerint

a) a béta-interferon különösen instabil, és aggregálódik amikor oxigénnel érintkezik, akár, amikor aktívan átbuborékol a folyadékon, akár, amikor statikusan érintkezik vele, például egy légtérben (head space);

b) a folyékony béta-interferonkészítmények, amelyekben nincs vivőanyag - például humán szérumalbumin - különösen hajlamosak üvegfelülethez adszorbeálódni (akár kémiai reakció, akár fizikai kötődés révén); és

c) a béta-interferon alacsony ionerő mellett aggregálódik, folyékony állapotban pedig ionos közegre van szüksége a stabilitáshoz.

A találmány ezért humán béta-interferon stabilizálására szolgáló olyan eljárásokra vonatkozik, amelyek elkerülik ezeket a kelepcéket, és stabilizált béta-interferonból előállított folyékony készítményformákra.

A) Definíciók

A „puffét” kifejezés gyenge sav és egy só oldataira vonatkozik, amelyek a sav anionját tartalmazzák vagy egy gyenge bázis és sójának oldataira. Pontosabban, az „acetát” kifejezés - amikor ebben a leírásban használjuk (lásd még az 1. táblázatot) - egy olyan pufferrendszerre vonatkozik, amely előnyösen nátrium-acetátot és ecetsavat tartalmaz és a „foszfát” kifejezés egy olyan pufferrendszerre vonatkozik, amely előnyösen dinátrium-hidrogén-foszfátot (7 H₂O), illetve nátrium-dihidrogén-foszfátot (1 H₂O) tartalmaz. Ezenkívül a 2. táblázatban szereplő azon oldatokat, amelyek egy savas jellegű aminosavat tartalmaznak nátrium-hidroxiddal kombinálva, noha olyan értelemben nem tekintjük puffereknek, mint ahogy ez a kifejezés a szakterületen ismert, mégis ehhez a definícióhoz soroljuk.

A „vivőanyag” kifejezés minden olyan vegyületre vonatkozik, amelyeket a feldolgozás és/vagy tárolás alatt hozzáadunk egy folyékony készítményhez abból a célból, hogy megváltoztassuk a búik tulajdonságait, növeljük stabilitását és/vagy beállítsuk ozmolalitását.

A „stabilizálószer” kifejezés egy olyan vivőanyagra vonatkozik, amely javítja vagy más módon fokozza a stabilitást.

A „stabilitás kifejezésnek szükségből formai definíciója van, és az interferonaktivitás - például anti-virális aktivitás - és/vagy interferonstruktúra viszonylagos időbeli állandóságát jelenti.

A „kavitációs” („cavitated”) kifejezés bármilyen olyan folyékony interferonkészítmény-formára vonatkozik, amely nyomásváltozások vagy fizikai rázás miatt oxigént tartalmazó buborékokkal (például levegővel) érintkezett, legalábbis a termelés és tárolás folyamán. A „kavitáció” („cavitation”) kifejezés arra vonatkozik, hogy oxigéntartalmú gáz/folyadék határfelület képződött a folyékony interferonkészítmény-forma előállítása, tárolása és felhasználása néhány pontján. A „kavitációs kifejezés azt is jelenti, hogy a folyékony interferonkészítmény-formákban az oldottoxigén-szintek túllépik a körülbelül 10%-os légköri egyensúlyi értékeket olyan hőmérsékleteken, amelyek általában előfordulnak legalábbis az előállítás és tárolás folyamán.

A „parenterális” kifejezés ebben a leírásban magában foglalja a szubkután, intravénás, intramuszkuláris, iontraszternális, intraperitoneális, oftalmikus, intraspinális injekciós vagy infúziós technikákat.

A „gyógyszerészetileg elfogadható só” kifejezés minden olyan szerves vagy szervetlen hozzáadott sóra vonatkozik, amelyek viszonylag nem toxikusak, és betegre nézve ártalmatlanok olyan koncentrációkban, amelyek összhangban vannak az effektív aktivitással úgy, hogy a sónak tulajdonítható mellékhatások ne veszélyeztessék az interferon jótékony hatását.

Egy vegyület „hatásos mennyisége” az a mennyiség, amely eredményre vezet, vagy amely a kezelendő speciális állapotra befolyást gyakorol. Egy „hatásos mennyiség” azt is jelenti, hogy az antivirális aktivitásra végzett CPE-tesztben pozitív eredményt ad (azaz antivirális hatást fejt ki).

Az interferon „gyógyszerészetileg hatásos mennyisége” ebben a leírásban egy olyan szernek a koncentrációját jelenti (százalékban), amely az orvos- és gyógyszerésztudomány ismerete szerint speciális állapotok kezelésében biztonságos és hatásos.

A „vérrel izotóniás” (váltakozva az „izotonicitás” kifejezést is használják) kifejezés olyan folyékony interferonkészítményre vonatkozik, amelyben a komponensek koncentrációja elégséges ahhoz, hogy ozmotikus tulajdonsága lényegében azonos legyen a vérével, azaz a készítményformával érintkező sejtek megtartják alakjukat, és ozmózisnyomás következtében lényegében nem szenvednek el nettó víztranszportot.

HU 224 222 Β1

A „poliionos szerkezetű” (váltakozva a „polielektrolit tulajdonságú” kifejezés is használatos) kifejezés egy olyan nagy molekulatömegű anyagra vonatkozik, amely, amennyiben a találmány szerinti készítményformákban használjuk, elektrolitként viselkedik, és maximalizálja az ionerőt egy adott ozmolalitáshoz. Ez a meghatározás azon alapul, hogy felismertük, miszerint a béta-interferont a magas ionerősség stabilizálja, ámbár az összionerőt behatárolja, hogy az oldatnak izotóniásnak kell lennie a vérrel (lásd a 7. példát). Az ionerő adott ozmolalitás melletti maximalizálásának előnyös módja egy olyan vivőanyag használata, amely poliionos szerkezetű.

Egy anyag, amely „inért az interferonra nézve” egy olyan anyagot jelent, amely legalább olyan tulajdonságú, hogy fizikailag és/vagy kémiailag nem reagál az interferonnal.

B) Interferonok előállítása

A találmány minden interferontípusra általában alkalmazható, beleértve a természetes interferont, a rekombináns DNS-technikával előállított interferont és a kémiai szintézissel vagy módosítással előállított interferont. A találmány fibroblasztokból, leukocitákból és limfocitákból származó, vagy emberi vagy bármilyen más megfelelő fajból származó interferontartalmú vagy interferontermelő szöveteredetű nyers, részlegesen tisztított és tisztított interferonra alkalmazható. A találmány a legelőnyösebben humán fibroblasztinterferonra (béta-interferonra) alkalmazható.

A legelőnyösebb béta-interferon a rekombináns forma. A proteinek - beleértve a különböző interferonokat - termelésére használt rekombináns DNS-technikák ismertek, és semmilyen módon nem korlátozzák a találmányt. Lásd például a 4,399,216, 5,149,636, 5,179,017 (Axel et al.), és 4,470,461 (Kaufman) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat. A béta-interferon rekombináns technikával való termelése vonatkozásában lásd például: 0 42313 számú európai szabadalmi leírás (Fiers; béta-interferonexpresszió); 4,966,843 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (McCormick et al.; interferon expressziója CHO-sejtekben); 5,326,859 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (Sugano et al.; béta-interferon kódoló DNS). A béta-interferon akár rekombináns technikával, akár kémiailag módosítható és akár szérumtartalmú, akár szérummentes táptalajban termelhető. A béta-interferonformák variánsokat is magukban foglalnak, ilyenek a ciszteinre kimerített mutánsok [4,588,585 és 4,737,642 (Mark et al.) számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások] és a metioninra kimerített mutánsok (EP 260 350 számú európai szabadalmi leírás; Wang et al.). A protein elsődleges aminosavszekvenciája megnövelhető cukorrészekkel (glikozilálás) végzett módosítással vagy más kiegészítő molekulákkal. Egyéb módosulások mehetnek végbe a gazdasejt poszttranszlációs feldolgozórendszerei révén. A láncban lévő individuális aminosavmaradékok tovább módosíthatók oxidációval, redukcióval vagy másféle módosítással, és a protein elhasítható aktív fragmentumok előállítása céljából. Egy speciális rekombináns béta-interferon valódi kémiai szerkezete ennélfogva számos faktortól függ, és ez nem korlátozza a találmány oltalmi körét. Az itt leírt készítményekben felhasznált minden ilyen béta-interferonprotein megtartja bioaktivitását, amennyiben ezeket alkalmas környezeti feltételek közé helyezzük.

A rekombináns béta-interferontermelés egyik módszere szerint úgy járunk el, hogy humán béta-interferongénnel transzfektált kínaihörcsögpetefészek(CHO=Chinese hamster ovary) sejteket tenyésztünk. A CHO-sejtek, amelyek fetális borjúszérumot tartalmazó szuszpenziós állótenyészetben növekednek, rekombináns béta-interferont szekretálnak. A sejtek körülbelül 35 °C hőmérsékletű CO₂-inkubátorban (5% CO₂) elhelyezett hengeres palackokban is tenyészthetők. Több hengeres palack tartalmát egyesíthetjük, és ezzel nagyméretű fermentorokat olthatunk be, amennyiben megkívánt a léptéknövelés. Egy adott fermentorban a tenyésztést körülbelül 6 napig folytatjuk, és ekkorra az aktív béta-interferontermék felszaporodik a táptalajban. A tenyészetet ezután learathatjuk, majd a sejteket eltávolítjuk a terméket tartalmazó táptalajból, például tangenciális folyadékszűréssel.

C) Interferonok tisztítása

Az interferontisztítási sémák jól kidolgozottak és rendelkezésre állnak a szakterületen átlagos gyakorlattal rendelkezők számára. Ezek az eljárások magukban foglalnak egy- vagy többlépéses eljárásokat, beleértve a különböző kromatográfiás elválasztási lépéseket. Lásd például az 5,015,730 számú (Friesen et al.; affinitáskromatográfia és HPLC); a 4,541,952 számú (Hosoi et al.; kelátképzéses kromatográfia) amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat.

Az egyik módszer például kihasználja a béta-interferonmolekula rendkívül hidrofób és viszonylag bázikus tulajdonságát, valamint erős affinitását a fémionok megkötéséhez. [Lásd például: Knight, Fahey: „Humán Fibroblast Interferon, an Improved Purification”, J. Bioi. Chem., 256, 3609-3611 (1981) és Edy et al.: „Purification of Humán Fibroblast Interferon by Zinc Chelate Chromatography, J. Bioi. Chem., 232, 5934-5935 (1981); mindkét közleményt referenciának tekintjük].

Röviden összefoglalva: az izolálási és tisztítási lépések folyamán a béta-interferont egy sor Sepharose oszlophoz (Pharmacia Biotech) kötjük, majd sókkal és polialkohollal oldjuk ki. Mihelyt a végső Sepharose eluátumot felhígítottuk és alacsony pH-ra állítottuk, az oldatban lévő béta-interferon SP Sepharose-hoz (Pharmacia Biotech) kötődik. Az oszloptöltetben maradt proteinek sokkal bázikusabbak, mint a monomer béta-interferon, tehát sokkal szorosabban kötődnek az oszlophoz, mint az interferon. A béta-interferont ez az oszlop elválasztja a DNS-től és a vírusoktól. Az oszlopot ezután egy sorozat nátrium-klorid-tartalmú pufferrel mossuk.

Az interferonterméket most egy olyan kelátképző Sepharose oszlophoz (Pharmacia Biotech) kötjük, amelyre előzőleg cinket vittünk fel (lásd fentebb: Edy et

HU 224 222 Β1 al.). Ezt az oszlopot oxigénmentes atmoszférában működtetjük, hogy a molekulában lévő szabad szulfhidrilcsoportot megvédje. Ugyanígy végezzük a további lépéseket is. A tisztított interferont megsavanyítjuk és alacsony pH-η tartjuk a visszamaradt vírusok inaktiválása végett. Semlegesítés után az interferont átszűréssel (cross flow filtration) koncentráljuk és a puffért semleges pufferoldatra cseréljük. A puffercsere csökkenti a cink és a szerves vegyületek koncentrációját. Ezután a búik interferon -70 °C-on tárolható a formulálási lépésekig.

D) Interferonok formulálása

A példaként fent leírt tisztítási eljárásban, és az első puffercsere után, egy második puffercserét indítunk el, kivételt képez, ha a semleges pufferoldatot egy olyan pH 4 és 7,2 közötti pufferrel helyettesítettük, amely stabilizálószert tartalmaz. Részletesebb leírását lásd alább. A kapott interferontartalmú készítményt „gyártásközi termék”-nek („process intermediate”) nevezzük és lefagyasztva tároljuk. Lásd a 7. példát.

Amennyiben fagyasztott állapotban tároljuk az inerferont (inért gáz - ilyen az argon vagy a nitrogén - atmoszféra alatt), felolvaszthatjuk, majd átnyomhatjuk 0,22 mikronos szűrőn egy kitáráit edénybe, előnyösen rozsdamentes acéledénybe, amelyben a gyártásközi termékhez egy előzőleg szűréssel sterilizált oldószerből annyit adunk, ameddig a kívánt végterméksúlyt el nem érjük. Az oldószer azonos azzal a pufferrel, amelyet a második puffercseréhez használtunk, a folyékony végterméket ezután szűréssel sterilizáljuk aszeptikus körülmények melletti eljárásokkal, például sorba kötött két 0,22 mikronos szűrő használatával és egy zárt edénybe töltjük le, előnyösen olyan rozsdamentes edénybe, amely az inért gáz számára egy bemeneti nyílással, egy gáztalanító szelep/szürő kombinációval és egy befolyó/kifolyó bemerülőcsővel van ellátva. A végterméket benyomatjuk a bemerülőcsövön keresztül a zárt edénybe. Inért gáz, például nitrogén használatával, nyomással szállítjuk a végterméket egy olyan készülékhez - a szivattyúfejhez - amely alkalmas steril fecskendők aszeptikus töltésére.

Steril fecskendők aszeptikus töltéséhez több módszer áll rendelkezésre, és a használt speciális módszerrel nem szándékozzuk korlátozni a találmány oltalmi körét. Az egyik módszer szerint például egy HYPAK autoklávozható fecskendőtöltő készüléket (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ) használunk. A fecskendőket hegyükre helyezett sapkával autoklávozzuk. Az ilyen típusú készülék általában magában foglal egy vákuumkamrát, amely az interferonkészítménnyel megtöltendő fecskendőket tartalmazza. A kamrát aszeptikus környezetben helyezzük el. Minden fecskendő nyitott végével függőlegesen helyezkedik el a kamrában, és egy dugattyúszárral vannak párosítva, amely a fecskendőhenger nyitott végébe illik. A szár úgy van szerkesztve, hogy záróelemet vigyen be a hengerbe, hogy a folyadékot belül tartsa. A behelyezés után egy kis légtér (head space) marad a fecskendőben. A kamrát evakuáljuk és inért, oxigénmentes gázzal (például: argon, nitrogén) többször visszaöblítjük, és ha a végső vákuumot elérjük, a szárakat egy rövid távolságra mechanikusan betoljuk a nyitott fecskendőhengerbe, és a záróelemek automatikusan bejutnak a megfelelő fecskendőkbe. A kamrát ezután szűrt levegővel szellőztetjük át, hogy a kamrán belüli nyomás újra elérje az atmoszferikus szinteket. A vákuum nagysága határozza meg az inért gázt tartalmazó légtér méretét.

Az általánosan használt speciális rendszerben a fecskendők függőleges helyzetűek és egy forgótányéron lévő fog tartja őket ebben a helyzetben. A fecskendők először egy tű alá kerülnek, amely behatol a fecskendőbe. A tű inért gázzal (például: argon, nitrogén) tölti meg a fecskendő belsejét. A tű ezután visszahúzódik a fecskendőből. A fecskendő ezután egy második tű alá helyeződik, amely behatol a fecskendőbe. Ez a tű egy olyan szivattyúhoz kapcsolódik, amely a terméket a fecskendőbe tölti. A második tű ezután visszahúzódik a fecskendőből. A fecskendő ezután egy harmadik tű alá kerül, amely behatol a fecskendőbe. A dugattyút (előzőleg autoklávozva) ezután inért, oxigénmentes gázzal (például nitrogénnel vagy argonnal) nyomjuk be a fecskendőbe, majd a tű visszahúzódik a fecskendőből. A dugattyú úgy helyezkedik el, hogy inertgáz-tér maradjon a folyadék teteje és a dugattyú alja között.

1. Vivőanyag

Előnyös, ha a vivőanyag egy poliionos anyag, amely maximalizálja az ionerőt egy adott ozmolalitás mellett, például ilyen egy polielektrolit, amely heparint vagy más polimerféleséget is tartalmazhat. Amint ezt a

4. példában megtárgyaljuk, a béta-interferont a magas ionerő stabilizálja, de az összionerőnek határt szab, hogy az oldatnak a vérrel izotóniásnak kell lennie. Ezért egy adott ozmolalitásnál az ionerő maximalizálásának előnyös útja egy poliionos anyag használata. A találmány szerinti béta-interferonoldatok a vérrel izotóniásak (körülbelül 290 miliozmol/kg).

A találmány számára legelőnyösebb stabilizálószer egy olyan aminosav, amely bármelyik savas jellegű aminosav (például glutaminsav, aszparaginsav) lehet, vagy egy olyan aminosav, amelyet az arginin és glicin közül választunk ki. A legelőnyösebb aminosav-stabilizálószer az arginin, amelynek savas jellegű formáját (arginin.HCI) használjuk pH 5,0 oldatokban. Előnyös a savas jellegű L-glutaminsav is. Anélkül, hogy bármelyik elmélethez kívánnánk csatlakozni, tény, hogy a poliionos vivőanyagokat részesítik előnyben, és ennek valószínűleg az az oka, hogy az arginin és a lizin (három töltéssel rendelkező csoportot tartalmaznak) jobban stabilizálja az interferont, mint a glicin (két töltött csoporttal rendelkezik, másfelől azonban jobban stabilizál, mint bármelyik vizsgált, töltés nélküli anyag).

Amennyiben a vivőanyag arginin.HCI, koncentrációja 0,5-5% (tömeg/térf.) között lehet és a legelőnyösebb koncentráció a 3,13% (150 mM arginin.HCI-nak felel meg). Amennyiben a vivőanyag glicin, koncentrációja 0,5-2% (tömeg/térf.) között lehet, a legelőnyö6

HU 224 222 Β1 sebb koncentrációja pedig 0,52% (azaz 66,7 mM és 266,4 mM között és legelőnyösebben 70 mM). Ha a vivőanyag glutaminsav, koncentrációját 100 mM és 200 mM közé állítjuk be. A legelőnyösebb koncentrációja 170 mM (azaz 1,47%-tól 2,94%-ig (tömeg/térf.) terjedhet és a legelőnyösebb koncentráció a 2,5%.

Folyékony béta-interferonkészítmény-formák stabilizálószereiként különböző vivőanyagokat analizáltunk a következő pufferrendszert alkalmazva: 50 mM nátrium-acetát és jégecet 100 mM nátrium-kloriddal kombinálva (pH 5,0). A folyékony interferonmintákat vagy hővel terheltük 37 °C-on 1-3 héten át, vagy 1-3 napig rotátorra helyezve, mechanikai terhelésnek tettük ki. A kezelt mintákat a béta-interferon stabilitására nézve teszteltük, mégpedig az 1. példában leírt módszerekkel. Mint a 7. példában részletesebben leírjuk, azok a készítmények mutatták a legjobb stabilitást, amelyeket pH 5,0 mellett aminosav vivőanyagot (adott esetben nátrium-klorid-tartalommal) tartalmazó nátrium-acetáttal pufferoltunk.

2. Az interferon

Előnyös interferon a fibroblaszt béta-interferon, a legelőnyösebb az emlőssejtek által termelt rekombináns humán interferon. A rekombináns humán béta-interferon egy szabad szulfhidrilcsoportot és legalább egy diszulfidkötést tartalmazhat. Egy különösen kedvelt molekula egy szabad szulfhidrilcsoportot tartalmaz a 17. pozícióban és molekulánként egy diszulfidkötést a 31. és 141. pozíció között. Ismeretes, hogy a természetes humán IFNp esetében N-glikoziláció fordul elő az Asn-80-nál. A találmány szerinti folyékony készítményformák koncentrációtartománya körülbelül 30 pg/ml-től körülbelül 250 pg/ml-ig terjed. Az előnyös koncentrációtartomány 48-78 pg/ml közé esik, és a legelőnyösebb koncentráció körülbelül 60 pg/ml. A nemzetközi Standardértékekkel kapcsolatos kikötés szerint a Biogen belső standardot a Világegészségügyi Szervezet nemzetközi interferonstandardjához (WHO International Standard fór Interferon; természetes Gb-23-902-531) standardizáltuk úgy, hogy a koncentrációtartomány lU-ban (nemzetközi egység) kifejezve (0,5 ml injekció-térfogatra) körülbelül 6 MIU-tól 50 MIU-ig terjed és a legelőnyösebb koncentráció a 12MIU.

3. Puffer

A találmány szerint használandó szerves sav és foszfátpufferek - amelyek a pH-t körülbelül 4,0-7,2 tartományban, előnyösen körülbelül 4,5-5,5 tartományban, a legelőnyösebben pedig pH 5,0-en tartják - hagyományos, szerves savakból és ezek sóiból készített pufferek lehetnek. Ilyenek a citrátpufferek (például: mononátrium-citrát - dinátrium-citrát keverék; citromsav trinátrium-citrát keverék; stb.), szukcinátpufferek (például: borostyánkősav - mononátrium-szukcinát keverék; borostyánkősav-nátrium-hidroxid keverék; borostyánkősav - dinátrium-szukcinát keverék stb.), tartarátpufferek (például: bórkősav - nátrium-tartarát keverék; bórkősav - kálium-tartarát keverék; bórkősav - nátrium-hidroxid keverék; stb.), fumarátpufferek (például: fumársav - mononátrium-fumarát keverék; fumársav dinátrium-fumarát keverék; mononátrium-fumarát - dinátrium-fumarát keverék; stb.), glükonátpufferek (például: glükonsav - nátrium-glükonát keverék; glükonsav - nátrium-hidroxid keverék; glükonsav - kálium-glükonát keverék; stb.), oxalátpufferek (például: oxálsav nátrium-oxalát keverék; oxálsav - nátrium-hidroxid keverék; oxálsav - kálium-oxalát keverék; stb.), laktátpufferek (például: tejsav - nátrium-laktát keverék; tejsav nátrium-hidroxid keverék; tejsav - kálium-laktát keverék; stb.), foszfátpufferek (például: egybázisú nátrium-foszfát/kétbázisú nátrium-foszfát) és acetátpufferek (például: ecetsav - nátrium-acetát keverék; ecetsav - nátrium-hidroxid keverék; stb.).

Az alábbi példákban különböző pufferkoncentrációkat használunk és különböző pH-értékű nátrium-foszfát-, nátrium-citrát-, nátrium-szukcinát-, nátrium-karbonát- és nátrium-acetát-puffereket alkalmazunk a legmegfelelőbb puffer meghatározása érdekében. A béta-interferonmintákat vagy 37 °C-ra helyezzük 6 naptól 2 hétig, vagy rotátorra helyezzük 7-9 órára, hogy siettessük a degradációs folyamatokat. Ezután meghatározzuk a minták kémiai tulajdonságait. A minták vizsgálatát optikai sűrűségmeghatározással, peptidtérképezéssel, méretkizárásos HPLC-vel, redukáló és nemredukáló SDS-PAGE/Western-blot analízissel és izoelektromos fokuszálás/Western-blot analízissel (IEF) végezzük. A vizsgálatok leírását alább, az 1. példa tartalmazza. Minden kísérleti béta-interferonmintát a kiindulási béta-interferonanyaggal vagy a 2-8 °C közé helyezett béta-interferonmintákkal hasonlítottuk össze. Adataink azt mutatták, hogy a pH a legfontosabb faktor, amely meghatározza béta-interferonmintáink stabilitását és hogy a minták pH 4,0-5,0 között stabilabbak, mint pH 7,0-en, vagy ennél magasabb pH-η. Mindazonáltal számos béta-interferonkészítmény-formát tudtunk kidolgozni fiziológiás pH (pH 7,2) mellett is. Lásd a 6. példát.

4. Kavitáció

Magas pH-η (pH >8,0) a béta-interferonban a legtöbb szabad szulfhidrilcsoport oxidálódik. Ezen a pH-n a diszulfidkötések átrendeződnek. Búik közti termékeinkben a béta-interferon némi aggregálódását mutattuk ki méretkizárásos kromatográfiával, nemredukáló SDS-PAGE módszerrel és lézerfényszórásos módszerrel. Ezután észrevettük, hogy az aggregált béta-interferon képződése valószínűleg az oldottoxigén-szintjétől függ. Kidolgoztuk az eljárás azon kritériumait, amelyek biztosítják, hogy a folyékony interferonkészítmény-formákban ne forduljon elő kavitáció, éspedig: a) ha lehetséges, ne legyen jelen oxigéntartalmú gáz/folyadék határfelület az előállítás és tárolás folyamán; és/vagy b) ne képződjenek buborékok az előállítás és tárolás alatt; és/vagy c) a készítményformákban az oldottoxigén-szinteket az atmoszferikus egyensúlyi helyzet 10%-a alatt kell tartani az előállítás és tárolás hőmérséklete mellett. Lásd a 3. példát.

5. Az interferon adszorpciója felületekhez

Azt is megállapítottuk, hogy az interferon bizonyos felületekhez adszorbeálódik, és amennyiben üvegedényben tartjuk, az edénynek legalább azt a felületét,

HU 224 222 Β1 amely az interferonnal érintkezik, be kell vonni vagy valahogyan be kell fedni egy olyan anyaggal, amely meggátolja vagy lényegében kiküszöböli az adszorpciót. Ez a felület az adszorpcióval szemben vagy kémiailag, vagy fizikailag lehet inért. Az erre a célra szolgáló anyagokat a szakterületen jártas szakemberek ismerik. Ilyenek például a porlasztóit vagy égetett szilikon, polipropilén vagy poli(tetrafluor-etilén) (PTFE). Az általunk előnyösnek tartott 60 pg/ml-es folyékony készítményformákat (BG9589-1, 2, 3 és 4; lásd alább az 1. táblázatot) 1 ml-es I típusú üvegből készített, porlasztott szilikonnal (Becton Dickinson) bevont fecskendőkbe és 0,75 ml-es I típusú üvegfiolákba töltöttük le. A mintákat ezután reverz fázisú HPLC-vel (rpHPLC) analizáltuk proteinkoncentráció meghatározás céljából. Az adatok azt mutatták, hogy kevesebb protein volt oldatban azokban a mintákban, amelyeket az üvegfiolákba töltöttünk, mint a szilikonnal bevont, letöltött fecskendőkben. Lásd az 5. példát.

6. Előnyös készítményformák

Elvégeztük a protein stabilitásának kinetikai vizsgálatát. Erre a célra négy folyékony készítményt használtunk, ezek végső koncentrációit az alábbi 1. táblázat tartalmazza. Mindegyik készítmény 60 pg/ml béta-interferont tartalmazott. A 2. táblázatban egyéb módon formuláit készítményeket ismertetünk, amelyek közül néhány például Pluronic F-68-at (gyártja: BASF) tartalmaz felületaktív anyagként.

1. táblázat

pH-rendszer	Vivőanyag	Végső pH
20 mM acetát	150 mM arginin.HCI	5,0 („BG9589-1”)
20 mM acetát	70 mM glicin 100 mM nátrium-klorid	5,0 („BG9589-2)
20 mM foszfát	140 mM arginin.HCI	5,0 („BG9589-3”)
20 mM foszfát	70 mM glicin 100 mM nátrium-klorid	5,0 („BG9589-4”)

A) készítményformák alkotórészei USP-minőségű anyagok. A részletes összetételt lásd alább.

BG9589-1

Alkotórész (alapanyag) Mennyiség

Arginin.HCI, USP 15,8 mg

Jégecet, USP 0,167 mg

Nátrium-acetát-víz (1/3), USP 0,972 mg

Béta-interferon-1a 30 pg

Injekcióhoz való víz, USP 0,5 ml

BG9589-2

Alkotórész (alapanyag) Mennyiség

Glicin, USP 2,628 mg

Jégecet, USP 0,185 mg

Nátrium-acetát - víz (1/3), USP 0,932 mg

Béta-interferon-1a 30 pg

Injekcióhoz való víz, USP 0,5 ml

Nátrium-klorid 2,922 mg

BG9589-3

Alkotórész (alapanyag) Mennyiség

Arginin.HCI, USP 14,725 mg

Dinátrium-hidrogén-foszfát-víz (1/7) 2,332 mg

Nátrium-dihidrogén-foszfát - víz (1/1) 0,359 mg

Béta-interferon-1 a 30 pg

Injekcióhoz való víz, USP 0,5 ml

BG9589-4

Alkotórész (alapanyag) Mennyiség

Dinátrium-hidrogén-foszfát - víz (1/7) 1,984 mg

Nátrium-dihidrogén-foszfát - víz (1/1) 0,359 mg

Béta-interferon-1 a 30 pg

Glicin 2,628 mg

Nátrium-klorid 2,922 mg

Injekcióhoz való víz, USP 0,5 ml

2. táblázat

Alternatív készítményformák

pH-rendszer	Vivőanyag	Végső pH
20 mM acetát	150 mM arginin.HCI és 15 mg/ml humán szérumalbumin	5,0
20 mM acetát	150 mM arginin-HCI és 0,1% Pluronic F-68	5,0
20 mM acetát	140 mM nátriumklorid	5,0
20 mM acetát	15 mg/ml humán szérumalbumin 140 mM nátriumklorid	5,0
20 mM acetát	0,1% Pluronic F-68 140 mM nátriumklorid	5,0
170 mM L-glutaminsav, 150 mM nátriumhidroxid	15 mg/ml humán szérumalbumin	5,0
170 mM L-glutaminsav, 150 mM nátriumhidroxid	0,1% Pluronic F-68	5,0

A találmány szerinti készítményformákba más anyagokat is bevihetünk. Ilyenek lehetnek például a következő konzerválószerek (az előnyös százalékok tömeg/térf.%-ot jelentenek): fenol (körülbelül 0,2%); metil-parabén (0,08%); propil-parabén (0,008%); m-krezol (0,1%); klór-butanol (0,25%); benzil-alkohol (0,1%); Thimerosal (0,1%). A proteinaggregáció és -dezaminálódás meghatározására szolgáló analízisre alapozva (az adatokat nem közöltük), a legelőnyösebb konzerválószer a klór-butanol és a benzil-alkohol.

7. Készletek parenterális alkalmazáshoz

A találmány előnyös kiviteli alakjai a folyékony készítményformák parenterális alkalmazásához csomagolt készletet tartalmaznak. A csomag a következőket

HU 224 222 Β1 tartalmazhatja: a találmány szerinti folyékony készítményformákkal előre megtöltött fecskendőket, több alkoholos tampont, legalább egy tűt, egy vagy több tapadó kötszert és használati utasítást. Értékelendő az is, hogy a találmány szerinti folyékony készítményformák a hagyományos kevés tűt igénylő rendszerekben használhatók.

E) interferonok alkalmazása

A találmány szerinti interferonkészítmények antivirális aktivitással rendelkeznek. Lásd a 7. példát. Ami a klinikai használatot illeti, az interferon mennyisége, amelyet bármilyen speciális esetben beadnak, valamint az interferon alkalmazásának gyakorisága bizonyos faktoroktól függ, mégpedig a használt interferon típusától, a kezelendő betegségtől és a beteg interferonkezelésre adott válaszától.

A folyékony interferonkészítményeket előnyösen használják súlyosbodó szklerózis multiplex kezelésére. A természetes béta-interferon és a rekombináns béta-interferon liofilizált folyékony (azaz feloldott) formáit olyan betegeknél alkalmazták, akik súlyosbodó szklerózis multiplextől szenvedtek. [Jacobs et al., Annals of Neurology, 39, 285-294 (1966); lásd a cikkben idézett referenciákat; Jacobs és Munschauer: „Treatment of multiple sclerosis with interferon” című fejezet (223-250 old.) a „Treatment of multiple sclerosis: trial design results and future perspectives című kiadványban (szerk.: R. A. Rudnick et al.) London; Speringer (1992)]. A szklerózis multiplex kezelésére a jelen találmányban leírt folyékony készítményformák használata ugyanazokat a kezelési módokat és rendszabályokat követi, ugyanazon primer következményváltozatokkal, mint amelyeket Jacobs és munkatársai közleményükben (lásd fent) leírtak.

A találmány szerinti folyékony készítményformák használhatóságának meghatározása végett toxikológiai vizsgálatokat végeztünk a folyékony készítményforma alkalmazásához társult szövetiirritáció megállapítására. A találmány szerinti folyékony készítményformák toxikológiai vizsgálatát nyulakon végeztük. Lásd a

8. példát.

Az alábbi példákat a találmány kiviteli alakjainak szemléltetésére szánjuk, és nem úgy tekintendők, mint amelyek korlátoznák a találmány oltalmi körét.

1. példa

Vizsgálati módszerek

Számos jól ellenőrzött módszert használtunk, hogy folyékony készítményformáinkban meghatározzuk a béta-interferon fizikokémiai tulajdonságait. Ezek a módszerek más interferonok tulajdonságainak monitorozására is használhatók.

Az oldhatatlan aggregátumok jelenlétét/hiányát abszorpcióméréssel - 320 nm-en - és fényáteresztési méréssel - 580 nm-en - monitoroztuk. Az oldott proteinkoncentrációját vagy abszorpcióméréssel, 278-280 nm-en (extinkciós koefficiens: 1,5), vagy reverz fázisú nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC) határoztuk meg, standardként a formuláláshoz használt pufferben oldott béta-interferon ismert koncentrációit használtuk. A folyékony készítményformák mintáit a vizsgálat előtt lecentrifugáltuk. Az oldható aggregátum százalékát úgy határoztuk meg, hogy az aggregátumokat méretkizárásos kromatográfiával - TSK-val G2000SWXL oszlop (Toso Haas, Montgomeryville, PA) - választottuk el a béta-interferonmonomertől. A 280 nm-nél kapott csúcsokat használtuk az oldható aggregátum százalékának kiszámításához.

A peptidgerinc stabilitását nátrium-dodecil-szulfát-poliakrilamid gélelektroforézissel (SDS-PAGE) bizonyítottuk. A béta-interferont merkapto-etanollal redukáltuk nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében, a 10-20%-os gradiensgélben (MiniPlus Sepragel, Integrated Separation Systems, Natick, MA) végzett elektroforézis előtt. A proteineket ezután elektroforetikus úton nitrocellulóz membránra vittük át, majd immunológiai kimutatást végeztünk antibéta-interferon-antitest és torma-peroxidázzal konjugált kecske-antiegér antitest használatával. Lásd például: Gél Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, 2. kiadás; B. D. Hames, D. Rickwood, IRL Press.

Az effektív felületi töltésváltozást, amelyet dezamidáció és más kémiai változások okoznak, poliakrilamid gélen izoelektromos fokuszálással (IEF 3-10 MiniPlus Sepragel, Integrated Separation Systems) monitoroztuk (lásd: Gél Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach).

A mentionin oxidációját, az aszparaginsav dezamidációját és az egyéb lehetséges kémiai változásokat is monitoroztuk, éspedig peptidtérképezéssel. A béta-interferont Endoproteinase Lys-C-vel (Wako Pure Chemicals) emésztettük ditiotreitol jelenlétében, és a kapott peptidfragmentumokat reverz fázisú HPLC-vel választottuk el. Lásd általánosságban: K. Kalgahtgi, C. Horváth: „Rapid Peptide Mapping by High Performance Liquid Chromatography”, J. Chromatography, 443, 343-354 (1988).

Az N-en kötött oligoszacharidprofilt Fluorophore-Assisted-Carbohydrate-Electrophoresis (FACE) rendszerrel (Glyco, Inc., Novato, CA) határoztuk meg. Az aszparaginon kötött (N-en kötött) oligoszacharidokat Peptide N-glycosidase F enzimmel szabadítottuk fel a glükoproteinekből, ezután fluoroforral jeleztük a redukálóvégeken reduktív aminálással, majd poliakrilamid gélen végeztük az elválasztást és a mennyiségi meghatározást.

Az interferonok antivirális aktivitását többféle módszerrel határozzák meg. Ezek részletesebb leírását lásd W. E. Stewart, The Interferon System (Springer Verlag, 2. kiadás, 1981) című kiadványban. A Cytopathic Effect Inhibition Assay (CPE; citopátiás hatás gátlási vizsgálat) különösen jól használható az interferon antivirális aktivitásának meghatározására. Az általunk előnyben részesített módszer a WHO Technical Report Series No. 725 (Annex 1, 1985) füzetben van leírva, amelyet referenciának tekintünk. Röviden összefoglalva: a CPE-módszer azzal indul, hogy béta-interferon házi standard törzsoldatot készítünk, amelyet előzőleg

HU 224 222 Β1 a WHO-referenciastandardhoz kalibráltunk. A törzsoldatot, amelynek a koncentrációja 10 000 E/ml, 10% magzati marhaszérumot és 4 mM L-glutamint tartalmazó D-MEM+ táptalajban készítjük el. A vizsgálat napján a standardot, a kontrollt és a mintákat D-MEM+ táptalajjal hígítjuk, 3 külön hígítást sorozatban:

a) 32 E/ml-rel kezdünk és 2-szeres hígításokkal folytatjuk;

b) 12 E/ml-rel kezdünk és 1,5-szeres hígításokkal folytatjuk;

c) 6 E/ml-rel kezdünk és 1,2-szeres hígításokkal folytatjuk.

A hígításokból 50 μΙ-eket mérünk be 96 tartályos mikrotitrálólemezek tartályoszlopaiba. Hígítást sorozatonként egy lemezt használunk. Ezután A549 sejteket (ATCC katalógusszám: CCL-185, Rockville, MD) D-MEM+ táptalajban 5*10⁵ sejt/ml - mérünk minden tartályba. A bemért mennyiség tartályonként 50 μΙ, amely mind a sejteket, mint a béta-interferont kétszeresére hígítja. A sejteket és az interferont 37 °C-on inkubáljuk 5% szén-dioxidban, 15-20 órán át. A lemezek tartalmát fertőtlenítő vödörbe rázzuk és a tartályokhoz hozzáadunk táptalajjal megfelelően hígított 100 μΙ EMC (encephalomyo-carditis)-vírust. A vírust és a sejteket 37 °C-on 5% szén-dioxidban inkubáljuk 30 órán át. A lemezek tartalmát fertőtlenítővödörbe rázzuk, majd a lemezekhez 0,75%-os kristályibolya festéket adunk. Öt-tíz perc múlva a lemezeket desztillált vízzel mossuk és hagyjuk megszáradni. Minden egyes lemez tartalmaz sejtnövekedést kontrolláló tartályokat, amelyek sem interferont, sem EMC-t nem tartalmaznak, továbbá vírus-kontrolltartályokat, amelyek EMC-t és sejteket tartalmaznak, de interferont nem, valamint interferonstandard hígítást sort. A lemezeket vizuálisan olvassuk le, hogy meghatározzuk minden oszlopban az élő sejteket tartalmazó utolsó tartályt (>25% összefolyt bíbor festődés). A kimutatási határt a standardnak az a legalacsonyabb koncentrációja határozza meg, amely véd a vírus citotoxicitásától. Az utolsó pozitív tartályban lévő minta hígítását megszorozzuk a standardra meghatározott kimutatásihatár-koncentrációval és a minta hígítási faktorával, és így megkapjuk a minta interferonaktivitását (MU/ml). A geometriai középérték meghatározásához és a 95%-os konfidenciaintervallumok kiszámításához az egyes lemezeken kapott eredményeket logaritmikus egységekre számítjuk át.

2. példa

A pufferrendszer kiválasztása

Három pufferkészletet készítettünk, mindegyik 9-10 különböző alkotórészt tartalmazott. Az I készlet egy sorozat nátrium-foszfát és/vagy 100 mM nátrium-klorid-oldatot tartalmazott, pH 4,0-7,2 között. A II készlet nátrium-citrát puffersorozatot tartalmazott pH 4,0-7,0 között. A III készlet nátrium-szukcinát-nátrium-acetát és nátrium-karbonát pufferoldat-sorozatot tartalmazott 100 mM nátrium-kloriddal kombinálva, a pH-értékek 4,0-től 7,2-ig terjedtek. Két másik oldatban a nátrium-kloridot 50 mM nátrium-szulfáttal helyettesítettük, és az oldatok pH-ja 4,0 és 7,2 volt.

A felolvasztott béta-interferon bulk-ot a különböző pufferekkel dializáltuk egy éjszakán át 2-8 °C-on, legalább kétszeri puffercserével, majd használat előtt sterilre szűrtük az oldatot. A proteinkoncentrációkat a 278 nm-en mért abszorpcióval (extinkciós koefficiens:

1,5 mg^-1ml.cm^_1) határoztuk meg. Minden minta 140 pg/ml vagy 150 pg/ml béta-interferont tartalmazott. A mintákat megszűrtük és négy készletre osztottuk úgy, hogy 2,2 ml-es Eppendorf-csövekbe töltöttük (a csöveket nem töltöttük tele). Az egyik készletet 2-8 °C-ra helyeztük; a másikat 37 °C-on tartottuk 6 naptól 2 hétig, a harmadikat rotátorra helyeztük 7-9 óra hosszat, az utolsó készletet zéróidő-kontrollnak használtuk. Az oldhatatlan aggregátumoknak tulajdonítható proteinveszteség százalékát úgy számítottuk ki, hogy a különböző kezelések folytán bekövetkező proteinkoncentráció-veszteséget elosztottuk a kiindulási koncentrációval.

Eredmények

Az oldhatatlan aggregátumok miatt bekövetkezett proteinveszteség százalékát úgy számítottuk ki, hogy a proteinkoncentráció-veszteséget elosztottuk a kiindulási proteinkoncentrációval. Az összes adat statisztikai analízise azt mutatta, hogy a pH 4,0 és 5,0 pufferekkel készített interferonmintákban az aggregáció miatti proteinveszteség százaléka alacsonyabb, mint a magasabb pH-értékű mintáké. A 37 °C-on inkubált interferonmintákban - pH 4,0 és 5,0 mellett - az aggregáció miatti veszteség körülbelül 10-15% között volt; 6,0-nál magasabb pH-értékek mellett a veszteségek 40-50%-ra nőttek. Kimutattuk, hogy az interferonmintákban 6,0-nál magasabb pH-értékek mellett több az oldható aggregátum. Ezenfelül peptidtérképezéssel meghatároztuk, hogy ahogyan a pH-t 4,0-től 7,2-ig növeljük, lényegében lineárisan növekszik a dezamidált interferon mennyisége is; pH 7,0-en és magasabb pH-η az interferon több, mint 85%-a dezamidálódott a vizsgálat során. A mintákban lévő proteinfajta izoelektromos pontját (pl; azaz azt a pH-t, amely mellett a protein nem vándorol elektromos térben és a proteinen a töltés középértéke zéró) lEF/Western-blot módszerrel mértük. A biotok azt mutatták, hogy a nátrium-citrátos mintákban extra pl sávok vannak, és hogy a nátrium-szukcinátos mintákban a sávintenzitás eltolódott. A foszfátnak nem volt pufferkapacitása pH 5,0-ön. A nátrium-acetát nátrium-kloriddal pH 5,0 mellett nem mutatott változást a sávmintázatban vagy sávintenzitásban.

3. példa

A kavitáció hatása

A 2. példában leírt pH-változtatási kísérlet folyamán felfedeztük, hogy a tárolt csövekben lévő légtér lényegesnek tűnt néhány mintában a proteinveszteség szempontjából. Amikor a 2,2 ml-es csövek 1,5 ml mintát tartalmaztak, nem észleltünk proteinveszteséget. Ezzel szemben az 1,2 ml-es töltés jelentős aggregátumnövekedést okozott. Ez egybevág azokkal a megfigyeléseinkkel, miszerint a tisztítási eljáráskor végzett vírusinaktiválási lépés alatt az aggregált béta-interfe10

HU 224 222 Β1 ronképződés az ezen lépés folyamán oldottoxigénszintjétől függ.

Röviden összefoglalva: a vírusinaktiválási lépésben a kelátképző Sepharose eluátum pH-ját (lásd a C fejezetet) 7,85 (±0,25)-ről 2,5-3,5-re állítjuk be 15%-os foszforsavval, a megsavanyított eluátumot 120-135 percig ezen a pH-η tartjuk és ezután 0,5 n nátrium-hidroxiddal visszaállítjuk a pH-t 6,7 (±0,7)-re. Ezeket a lépéseket 2-8 °C-on végezzük. Megterveztünk egy vizsgálatot annak meghatározására, hogy van-e összefüggés a béta-interferon aggregátumképződés és az oldott oxigén mennyisége között ebben a lépésben.

Anyagok és módszerek

A kelátképző Sepharose oszlopról kapott eluátumot 50 ml-enként vagy 100 ml-enként 100 ml-es hengeres piackokba osztottuk el. A palackokhoz 1 ml, argonnal kevert, 15%-os foszforsavat adtunk. A palackokat ezután 2 percig enyhén kevertettük, majd keverés nélkül 2 órán át 2-8 °C-on tartottuk. Ezt követően a palackokhoz 6,5 ml argonnal kevert nátrium-hidroxidot adtunk, majd a mintákat méretkizárásos kromatográfiával analizáltuk különböző időpontokban. A folyadékban oldott oxigént egy oxigénszondával (Orion, Model 860) folyamatosan mértük és a bázis hozzáadásakor regisztráltuk. Azokban a mintákban, amelyekben az oldott oxigén szintje 10% volt, vagy kevesebb, az argongáz átseperte a reakcióedény légterét.

Eredmények

Az adatok, amelyeket az 1. ábrán mutattunk be, világos összefüggést mutatnak a nátrium-hidroxid hozzáadásának időpontjában jelen lévő oldott oxigén és a béta-interferonmonomer kihozatala között a vírusinaktiválási lépés folyamán. A 10%, vagy ennél alacsonyabb oldottoxigén-koncentrációknál kapott kihozatali értékek jelentősen eltértek minden más olyan kihozataltól, amelyet más oxigénkoncentrációknál kaptunk. Az aggregátumot is vizsgáltuk (ezeket az adatokat itt nem közöljük) és megállapítottuk, hogy specifikus aktivitása 30—40-szeresére csökkent a búik közti termékhez képest. Meghatároztuk, hogy az aggregátum több, mint körülbelül 90%-a rezisztens az SDS denaturáló hatásával szemben, nemredukáló körülmények mellett, ami kovalens keresztkötésre enged következtetni. Redukáló körülmények mellett (2% béta-merkapto-etanol) az aggregátum a monomerhez közelít, és ez diszulfidkötéseket tartalmazó keresztkötést feltételez.

4. példa

Vivőanyag kiválasztása

Készítettünk egy sor béta-interferon (60 pg/ml) készítményformát különböző vivőanyagokkal egy előnyös pH 5,0 pufferben, amely 50 mM nátrium-acetátot és 100 mM nátrium-kloridot tartalmazott. A vivőanyagok glicint, arginin.HCI-ot, lizin.HCI-ot, szacharózt, glicerint, PEG3350-et, glutationt és Pluronic F-68-at tartalmaztak. A béta-interferon búik közti terméket 50 mM nátrium-acetátot és 100 mM nátrium-kloridot tartalmazó oldatban (pH 5,0) dializáltuk egy éjszakán át 2-8 °C-on, legalább kétszeri puffercserével, majd használat előtt megszűrtük. A béta-interferonkoncentrációkat a 278 nm-en mért abszorpcióból - a háttér levonásával - határoztuk meg. A mintákat a végső interferonkoncentrációra - körülbelül 60 pg/ml - hígítottuk. Az elkészített mintákat megszűrtük, 2 ml-enként 4 ml-es üvegfiolákba (nem szilikonozott) töltöttük, a légteret argonnal sepertük ki és a fiolákat lezártuk. A minták egy részét 2-8 °C-ra és 37 °C-ra helyeztük hétig. A minták másik részét mechanikai stressznek vetettük alá úgy, hogy szobahőmérsékleten forgattuk napon át.

A mintákat az 1. példában leírt módszerek szerint analizáltuk. Ezenkívül mértük az oldott oxigén százalékát egy Ciba-Corning Model 248 vérgáz-analizátorral. „Kísérleti” érték: a minták oxigén-parciálisnyomása mínusz a nitrogénnel kihajtott vakpufferben az oxigén parciális nyomása. „Kontroll”-érték: a szobahőmérsékleten tárolt vakpufferben az oxigén parciális nyomása mínusz a nitrogénnel kihajtott vak pufferben az oxigén parciális nyomása. Az oldott oxigén százaléka („kísérIeti7„kontroll”) mindig kisebb 30%-nál.

Eredmények

A 37 °C-on két hétig inkubált minták lEF/Western-blot és SDS-PAGE/Western-blot analízise sáveltolódást és intenzitásveszteséget mutatott, valamint a PEG3350-et és glutationt tartalmazó mintákban interferonmultimerek jelenlétét. Egy további hét 37 °C hőmérsékleten a glicerin vivőanyagnál extra sáv mutatkozott a biotokban. A szacharóz vivőanyag sáv-intenzitás veszteséget mutatott. Ezen első szűrési eljárás lehetővé tette számunkra, hogy számításba vegyük az arginin.HCI, glicin, nátrium-klorid és mannit részletesebb vizsgálatát.

5. példa

Az interferon adszorpciója

Felolvasztott béta-interferon bulk-ot dializáltunk a BG9589-1, 2, 3 és 4 jelű készítményformák előállításához (lásd az 1. táblázatot) egy éjszakán át 2-8 °C-on, legalább kétszeri puffercserével. A dializátumokat használat előtt megszűrtük. A proteinkoncentrációkat a 280 nm-en mért abszorpcióból (extinkciós koefficiens: 1,5 mg^-1.ml.cm^-1) határoztuk meg. A mintákat a végső koncentrációra - 60 pg/ml - hígítottuk. A hígított mintákat szűrtük és 1,0 ml hosszú, szilikonnal bevont BD fecskendőkbe (I típusú üveg) - a légteret nitrogénnel öblítettük át - töltöttük 0,5 ml-enként, három párhuzamossal, vagy 0,75 ml-enként töltöttük le, három párhuzamossal, 0,75 ml-es I típusú üvegfiolákba, amelyek légterét argonnal öblítettük át. A proteinkoncentrációkat reverz fázisú HPLC-vel (1. példa) határoztuk meg.

Eredmények

Az alábbi 3. táblázat a reverz fázisú HPLC-vel meghatározott proteinkoncentrációkat tartalmazza. Az adatok azt mutatják, hogy kevesebb protein van az üvegfiolákba töltött mintákban, mint a szilikonnal bevont letöltött fecskendőkben. Tehát szilikonozott fecskendőket használunk a folyékony interferon formulálásához.

HU 224 222 Β1

3. táblázat

	Üvegfiola (pg/ml) (S.D.)	Szilikonozott fecskendő (Mg/ml) (S.D.)
BG9589-1	59,3 (2,6)	63,3 (2,5)
BG9589-2	58,3 (0,7)	61,7 (0,1)
BG9589-3	56,4 (0,4)	58,8(1,1)
BG9589-4	55,5 (0,7)	59,3 (0,5)

6. példa

Készítményformák fiziológiás pH-n ionerő/foszfát

Előzetes vizsgálatokat végeztünk változó pufferkomponens-koncentrációk mellett foszfát/nátrium-klorid (pH 7,2) pufferrendszerekben, amelyekben a foszfátkoncentráció 10, 50 és 75 mM között változott, 0,2, 0,4 és 0,6 ionerő (l=ZC|Z_h ahol c, és Z| az I ionfajta moláris koncentrációját, illetve vegyértéktöltését jelenti) mellett, amelyet nátrium-klorid hozzáadásával állítottunk be.

Részletes munkatervet (full factorial design) használtunk a foszfátkoncentráció (10, 50 és 75 mM) és az ionerő (l=0,2,0,4 és 0,6) változatok vizsgálatára. A pufferekben a nátrium-dihidrogén-foszfát, dinátrium-hidrogén-foszfát és nátrium-klorid összetételeket egy olyan táblázat (spreadsheet) felhasználásával számítottuk ki (a kívánt ionerő elérése céljából), amelyet Ellis és Morrison: „Buffers of Constant lőnie Strength fór Studiying pH-dependent Processes” [Methods Enzymol., 87, 405-426 (1982)] című közleményéből vettünk át. Az egyenletek lehetővé tették, hogy adott pH-hoz, foszfátkoncentrációhoz és ionerőhöz az egyes pufferkomponensekből szükséges mennyiségeket meghatározzuk. A kísérletben használt kilenc oldat mindegyikét úgy kaptuk, hogy a béta-interferon búik félkésztermékben puffercserét végeztünk Pharmacia PD-10 sótalanító oszlopokon. A kapott oldatok pH-ja 7,20 (±0,15) volt. A koncentrációkat a 280 nm-en mért abszorpciókból számítottuk ki, majd a megfelelő pufferrel való hígítással 150 pg/ml béta-interferonra állítottuk be. A kapott oldatokat argon alatt, 0,22 mikronos szűrőkön sterilre szűrtük és 1,3 ml-enként 5 ml-es üvegfiolákba töltöttük argon légtérrel. A mintákat 37 °C-on 6 napon át inkubáltuk. A vizsgálatot három párhuzamossal végeztük. A mintákat az 580 nm-en mért fényáteresztés százaléka, a kinyert protein százaléka és lEF-PAGE/Western-blot vizsgálata alapján analizáltuk.

Eredmények

A százalékos fényáteresztés analízise az ionerősség változtatása vonatkozásában az áteresztés növekvő tendenciáját mutatta (azaz az oldhatatlan proteinaggregátumok csökkenő mennyiségét) növekvő ionerősség mellett. A kinyert proteinszázalék hasonló tendenciát mutatott, jóllehet az lEF-PAGE/Western-blot analízis nem mutatott trendet az ionerő változtatásától függően a dezamidációban, minthogy minden minta egyformán dezamidálódott. Tehát, 37 °C-on 6 napig való tárolás után a minták csökkenő foszfátkoncentráció és növekvő ionerősség mellett, kevésbé mutattak hajlamot aggregációra. Azok a kísérleti eredmények, amelyeket a százalékos fényáteresztésre és a százalékos proteinkinyerésre kaptunk a változó foszfátkoncentráció függvényében (nem mutatjuk be), azt mutatták, hogy növekvő foszfátkoncentrációval csökken a százalékos fényáteresztés trendje, de egy varianciaanalízis kimutatta, hogy a különböző foszfátkoncentrációjú minták középértékeiben nincs szignifikáns különbség. A százalékos kinyerésre vonatkozó adatok javuló proteinkihozatalt mutattak alacsony foszfátkoncentrációknál (szignifikáns különbség volt 94% konfidenciaszint mellett). A foszfátkoncentráció változtatásával lEF-PAGE/Western-blotokon nem mutatkozott észrevehető trend.

Vivőanyag/só arány

Előzetes vizsgálatok (nem közöljük) arra mutattak, hogy néhány vivőanyaghoz feltehetően sókat kell hozzáadni (például nátrium-kloridot), hogy fennmaradjon a magas ionerő és hogy stabilizálóhatást fejtsenek ki pH 7,2 mellett. Olyan (factorial) tanulmányt terveztünk, amelyben vivőanyagokat (glicin, lizin, arginin, szacharóz és mannit) és a nátrium-klorid tört részeit (frakcióit) - amelyek az izotonicitást befolyásolják - használtuk (f_só=0,025, 0,75 és 1,0). A frakciót a következő egyenlettel számítottuk ki: f_Só=O_só/(O_só+O_vivöanyag), amelyben O_só és O_vjvöanyag a nátrium-klorid, illetve a vivőanyag ozmolalitását jelenti az oldatban, mOsm/kg-ban kifejezve. A sófrakció eszközül szolgál a só hatásainak összehasonlítására különböző vivőanyagok esetén. Minden minta tartalmazott adalékot az izotonicitás végett, különböző vivőanyag:só hányadossal (meghatározva az F_só egyenlettel).

Az egyes vivőanyagokból 10%-os (tömeg/térfogat) törzsoldatot készítettünk 20 mM foszfátpufferben (pH 7,2). Az oldatokat gáztalanítottuk, majd argonnal átszellőztettük. Készítettünk egy 250 mM nátrium-klorid, 20 mM foszfát összetételű (pH 7,2) törzsoldatot, amelyet gáztalanítottunk, majd argonnal átszellőztettünk. Egy béta-interferon búik közti terméket argonnal átszellőztetett 20 mM foszfátpufferrel (pH 7,2) szemben alaposan kidializáltunk. A kapott oldat béta-interferonkoncentrációját a 280 nm-en mért abszorpcióból határoztuk meg és foszfátpufferrel és a megfelelő vivőanyagot és sót tartalmazó törzsoldattal hígítottuk 60 pg/ml béta-interferonkoncentrációra és a kívánt só és vivőanyag feltételek elérése végett. A kapott mintákat szűréssel sterilizáltuk (0,22 mikronos szűrővel) és 1,0 ml-es - porlasztott szilikonos - Becton Dickinson I típusú üvegfecskendőbe töltöttük 0,5 ml-enként, nitrogén gáztérrel. A mintákat 40 °C-on tároltuk.

A 6. napon az arginin-, glicin- és szacharózmintákat abszorpcióméréssel - 320 és 280 nm-en - analizáltuk. Mindkét mérést a 0,22 mikronos szűrőn való szűrés előtt és utána is elvégeztük. A 2. héten az arginin-, lizin- és mannitmintákat hasonlóan analizáltuk, IEF-PAGE, redukáló SDS-PAGE és nemredukáló SDS-PAGE segítségével. A kontrollmintákat 2-8 °C között tároltuk és hasonlóan analizáltuk.

HU 224 222 Β1

Eredmények

Az la-béta-interferonkihozatal (a kontroll százalékában) növekszik a szacharózra és mannitra vonatkozó növekvő f_só értékkel és a maximális kihozatalt f_só=1 (130 mM nátrium-klorid) értéknél éri el. Argininre és lizinre vonatkoztatva a kihozatal növekvő f_Só-val csökken. A maximális kihozatal a glicines készítményformáknál pH 7,2-nél körülbelül fsó=0 ,75-nál érhető el.

A vivőanyag szűrésére végzett tanulmány, amelyben egy pH 7,2 foszfátpuffert használtunk különböző vivőanyagokkal - mint glicin, lizin, arginin, mannit és szacharóz, amelyeket izotonicitásig adagoltunk - az összes töltéssel nem rendelkező vivőanyag esetén gyenge kihozatalt mutatott. A dezamidálódás mértékét nem befolyásolták ezek az adalékok. Például: a redukáló és nemredukáló SDS-PAGE mindegyik készítményformában a nem glikozilált típusú béta-interferon veszteségét mutatta ki, és nagyobb multimersávokat mutatott ki izotóniás nátrium-klorid egyedüli használata és mannit használata esetén. Összefoglalva, szoros összefüggés van a vivőanyag ionos karaktere és azon tulajdonsága között, hogy mennyire képes stabilizálni ezekben a pufferrendszerekben a béta-interferont az aggregációval szemben, fiziológiás pH mellett. A nemionos adalékanyagok, mint a szacharóz és a mannit, úgy tűnik, nem adnak védelmet, vagy pedig ténylegesen elő is segíthetik a proteinveszteséget fiziológiás pH-π. A nátrium-klorid - oldott formában egyetlen töltéssel rendelkezik - jobban megfelel, mint akár a mannit vagy a szacharóz. Az aminosavak fiziológiás pH-n molekulánként két töltéssel rendelkeznek. A glicin esetében, a molekula zwitterionos tulajdonsága egymaga nem látszik elégségesnek a béta-interferon stabilizálására. Az arginin és a lizin - molekulánként mindegyik három töltéssel rendelkezik - jobban stabilizálja a béta-interferont, mint a csak nátrium-klorid vagy a glicin/nátrium-klorid tartalmú készítményformák.

7. példa

Stabilitási és kinetikai vizsgálatok

A) készítményformákat aszeptikusán töltöttük le, inért atmoszférában. A fecskendőket különböző hőmérséklet-tartományban változó időtartamokig inkubáltuk és a fecskendők tartalmát analizáltuk. Röviden összefoglalva: a felolvasztott búik béta-interferont BG9589-1, -2, -3 és -4 oldatok készítése végett egy éjszakán át 2-8 °C-on dializáltuk legalább két pufferváltással. A proteinkoncentrációkat a 280 nm-en mért abszorpciókból határoztuk meg (abszorpciós koefficiens:

1,5 ml/mg/cm). A mintákat egy végső, körülbelül 60 pg/ml-nek megfelelő la-béta-interferon-koncentrációra hígítottuk. Az 1. táblázat szerinti négy la-béta-interferonkészítmény-formát megszűrtük és 0,5 ml-enként 1,0 ml-es Becton Dickinson (BD) fecskendőkbe töltöttük, amelyeknek a belső felülete égetett szilikonnal vagy porlasztóit szilikonnal volt bevonva. A mintákat OD, méretkizárásos HPLC (SEC=sice exclusion chromatography), izoelektromos fókuszáló gélelektroforézis (IEF)/Western-blot, redukáló nátrium-dodecilszulfát-poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE)/Western-blot, peptidtérképezés, Fluorophore Assisted Carbohydrate Electrophoresis (FACE) és CPE bioassay segítségével analizáltuk. A fecskendő légterét nitrogéngáz töltötte ki. A fecskendőket 2-8 °C-on, 25 °C-on és 40 °C-on inkubáltuk 90 napig. A mintákat az 1. példában leírt módszerekkel analizáltuk.

Eredmények

Mintáink proteinkoncentrációjának analízisekor a koncentrációkat a különböző hőmérséklet mellett 90 napig tartott kiindulási anyag koncentrációihoz viszonyítottuk. A 2. ábrán látható, hogy a BG9589-1 teljes proteinstabilitást mutatott (nem volt proteinveszteség) 3 hónap múlva 2-8 °C hőmérséklet-tartományban (középérték 4 °C) és 25 °C-on inkubálva. Egy testhőmérsékletet megközelítő tárolási hőmérsékleten (33 °C) a protein körülbelül 18%-a degradálódott. A testhőmérsékletet meghaladó tárolási hőmérsékleten (40 °C) a harmadik hónap végén a protein körülbelül 30%-a degradálódott. Lényegében azonos eredményeket kaptunk BG9589-2-nél is (nem mutatjuk be). A 3. ábra a BG9589-3 2 hónapos tárolási vizsgálatának eredményeit mutatja. A proteindegradáció 4-25 °C mellett minimális volt, de gyorsan előrehaladt magasabb hőmérsékleteken. A BG9589-4 készítményformával kapott eredmények lényegében azonosak a 2. és 3. ábrán látható eredményekkel. Ezeket az adatokat a redukáló SDS-PAGE/Western-blotok alátámasztották.

Az „égetett” fecskendőkben a vizsgálat időtartama folyamán nem voltak kimutatható oldható aggregátumok. Nem észleltünk jelentős változásokat a proteinkoncentrációban, a citopátiás hatásban (CPE assay), oxidált AP6 százalékában és a szénhidrátprofilban. Nem voltak észlelhető változások a mintákban redukáló SDS-PAGE/Western-blot és lEF/Western-blot vizsgálatok szerint. A dezamidálódás százalékában némi növekedés mutatkozott a kezdeti időpontokhoz viszonyítva. Azonban a fecskendők töltésére használt búik köztitermékben 37%-os volt a dezamidálódás, amely magasabb, mint az anyag fecskendőbe való töltése után mért 33,8%-os érték. Ez utóbbi alacsony érték valószínűleg a vizsgálat variabilitásának tudható be. A „porlasztott” fecskendőkben a vizsgálat időtartama alatt nem tudtunk kimutatni oldható aggregátumokat. Nem észleltünk szignifikáns változásokat a proteinkoncentrációban, a CPE assay-ben, a dezamidáció százalékában, az oxidált AP6 százalékában és a szénhidrátprofilban. A mintákban nem voltak kimutatható változások redukáló SDS-PAGE/Western-blot és lEF/Western-blot analízis szerint. Röviden összegezve, az eddigi eredmények azt mutatták, hogy a BG9589-1 végtermék 3 hónapig stabil 2-8 °C-on „égetett szilikonos” fecskendőkben és 6 hónapig 2-8 °C-on „porlasztott szilikonos” fecskendőkben.

Elvégeztük a BG9589-1 és BG9589-2 készítményformákkal (lásd az 1. táblázatot) az antivirális CPE assay-t, miután a fecskendőket aszeptikusán letöltöttük. Mind a BG9589-1-re, mind a BG9589-2-re közölt aktivitás értéke 12,0 MIU/ml. Az antivirális CPE assay-t a minták 2-8 °C-on 3 hónapig való tárolása után meg ismételtük. BG9589-1-re közölt aktivitás értéke

HU 224 222 Β1

11,6 MIU/ml (n=8), 10,2-13,3 MIU/ml 95%-os konfidenciaintervallummal.

Az 5 hónapig 2-8 °C-on és 6 hónapig -70 °C-on tartott BG9589-1 búik köztitermék stabilitását is mértük. Kísérleti diaszürési vizsgálatokból származó BG9589-1 mintákat analizáltunk az 1. példában leírt módszerekkel. Az eddigi eredmények azt mutatták, hogy a BG9589-1 gyártásközi anyaga 2-8 °C-on 5 hónapig és -70 °C-on 6 hónapig stabil.

Ezen speciális kísérlet időtartama alatt nem mutattunk ki oldható aggregátumokat. Nem észleltünk szignifikáns változásokat a dezamidáció százalékában és a szénhidrátprofilban. (A dezamidáció százalékában kapott különbségek az assay variabilitásán belül voltak.) A mintákban nem észleltünk változásokat redukáló SDS-PAGE/Western-blot és lEF/Western-blot módszerrel végzett analízis szerint. A proteinkoncentrációban csekély csökkenés jelentkezett. A -70 °C-nál kapott proteinkoncentráció csökkenésének az lehet az oka, hogy a minta egy lefagyasztás/felolvasztás cikluson ment át. A proteinkoncentráció csökkenés a kezdőkoncentráció 15%-án belül volt.

8. példa

Preklinikai vizsgálatok

Egyetlen intramuszkuláris (IM) dózis helyi tűrhetőségét vizsgáltuk nyulakon. Ezzel értékeltük az interferon lokális toxicitását, amikor több készítményformában alkalmaztuk. A jelenlegi folyékony készítményforma alkalmazásának vagy a liofilizált és feloldott interferonkészítmény-formák alkalmazásának tulajdonítható helyi injekciós reakciók a normál-konyhasóoldat alkalmazását követően megnyilvánuló reakciókhoz voltak hasonlóak.

1. Négy béta-interferonkészitmény-forma egyetlen IM-dózisban való alkalmazását követő irritációs/biológiai alkalmassági vizsgálat nyúlon

Húsz hím újzélandi fehér nyulat használtunk. Mindegyik nyúl egyetlen 30 gg la-béta-interferontartalmú intramuszkuláris (IM) injekciót kapott a következő öt készítményforma egyikéből: BG9589-1 (pH 5,0; acetátpuffer; glicin/NACI stabilizátor, 0,5 ml/dózis); BG9589-2 (pH 5,0; acetátpuffer; argininstabilizátor; 0,5 ml/dózis); BG9589-3 (pH 7,2; foszfátpuffer; argininstabilizátor; 0,5 ml/dózis); BG9589-4 (pH 7,2; foszfátpuffer, glicin/NaCI stabilizátor; 0,5 ml/dózis); és egy liofilizált béta-interferonkészítmény-formából (pH 7,2; 1,5% HSA; 1,0 ml/dózis) (Jacobs et al.; lásd fentebb).

Négy állat minden kezelést megkapott. Azok az állatok, amelyek a BG9589-1-et vagy a liofilizált készítményformát kapták, azonos mennyiségű normál-konyhasóinjekciót kaptak ugyanazon az oldalon, negatív kontrollként. Az injekció után 72 óra múlva vérmintákat vettünk a szérumok béta-interferonaktivitásának analíziséhez. Az injekció után 6, 12, 24, 48 és 72 óra múlva makroszkóposán vizsgáltuk a bőrteritéma és heg képződésére. Az injekció utáni 72. órás vérvétel után az állatokat leöltük, az injekciók helyét makroszkóposán ellenőriztük szövetkárosodás jeleire, majd 10%-os, semlegesre pufferolt formaiinban fixáltuk. Az izommintákat (injekcióhelyenként hármat) mikroszkóposán vizsgáltuk gyulladásra, elhalásra, bevérzésre és léziókra.

Eredmények

A Primary Irritation Index pontjai (EPA Dermal Classification System) szerinti értékeléssel a fenti folyékony készítményformák csekély bőrirritáción kívül mást nem okoztak. A BG9589-4 injekció helyének makroszkópos ellenőrzése egyik állatnál csekély irritációt (bevérzést) mutatott, a mikroszkópos vizsgálat azonban semmi jelét nem mutatta bevérzésnek, és megállapítottuk, hogy a makroszkópos megfigyelés mesterséges elváltozást határozott meg. Röviden: a mikroszkópos vizsgálatok megállapították, hogy a folyékony készítményforma vizsgálati mintáinak injekciójával kapott helyi reakciók következetesen enyhék voltak, és hogy egyetlen reakció sem volt komolyabb azoknál, amelyeket a liofilizált készítményforma vagy a normálkonyhasó alkalmazása okozott.

Ezenkívül a folyékony készítményformák ismételt IM alkalmazása után a nyúl bőrének irritációja könnyen tesztelhető több nyúlcsoport használatával, amelyek minden másnap 8 napon át a folyékony készítményformákból vagy normál-konyhasóoldatból intramuszkuláris injekciókat (összesen öt adagot) kaptak. A adagokat az egyes állatok hátán egy előre meghatározott területen adtuk be, hogy a vizsgálati mintának való helyi expozíció maximális legyen. A bőr makroszkópos leolvasását mindegyik kezelt csoportban az alkalmazások után 4-6 óra múlva végeztük és az utolsó alkalmazás után 24 óra múlva. Naponta teljes megfigyelést végeztünk a bőrkiértékelések idején. Az utolsó dózis után 24 órával végzett makroszkópos vizsgálatot követően az állatokat leöltük, hogy az injekciók helyét szövetkárosodás jeleire ellenőrizhessük. A szöveteket semlegesre pufferolt 10%-os formaiinban fixáltuk. A konzervált szöveteket mikroszkóposán vizsgáltuk gyulladásra, nekrózisra, bevérzésre és léziókra. Vérmintákat is vettünk, közvetlenül az első vizsgálati minta beadása előtt és az állatok leölésének idejében, hematológiai vizsgálat és a szérum kémiai vizsgálata céljára.

9. példa

Klinikai vizsgálatok

A találmány szerinti folyékony készítményformák jelentősen különböznek az előző interferonkészítmény-formáktól. Bármelyik klinikai indikáció esetén fennáll annak lehetősége, hogy megváltozik az interferon farmakokinetikai és farmakodinamikai tulajdonsága, ha embereknél alkalmazzák. Sajnálatosan a béta-interferon hatásai nagymértékben fajspecifikusak, és helyes farmakológiai információk humán sejtek tenyészetein, embereken és - kisebb mértékben - Rhesus majmokon végzett vizsgálatokból származnak. Farmakológiai változások - ha egyáltalán vannak tesztelésének előnybe helyezett módja egy humán bioekvivalenciavizsgálat elvégzése.

A béta-interferon antivirális szintjét szérumban a citopátiás hatásra (CPE) irányuló bioassay-vel határozhatjuk meg, például az 1. példában leírt módon. A hu14

HU 224 222 Β1 mán bioekvivalenciavizsgálatot bármennyi folyékony és liofilizált interferonkészítmény-formán elvégezhetjük. Szérum analízisével a görbe alatti terület (area under the curve=AUC) és a C_max aktivitási paraméterekből bármely normáljártassággal rendelkező szakember meg tudja határozni, hogy vajon a liofilizált és a folyékony készítményformák bioekvivalensek-e. Egy bioekvivalenciavizsgálati protokollra példaképpen leírunk egy kettős-vakkal, egyetlen dózissal végzett cross-over vizsgálatot, hogy szemléltessük egy találmány szerinti folyékony készítményfomna és egy liofilizált béta-interferontermék bioekvivalenciáját egészséges önkénteseken.

Kivitel: A) készítményformákból minden személy azonos adagot (például 60 pg/12 MIU) kapott egy kettős-vak, kétperiódusú cross-over vizsgálatban (4. táblázat). A személyek kora 18 és 45 év között volt és magasságukra és testalkatukra nézve a normál-testtömegtartomány 15%-on belül volt. Hematológiai és kémiai vizsgálatra, valamint a szérum béta-interferonaktivitásának és farmakodinamikai profiljának meghatározásához vérmintákat vettünk közvetlenül a beadás előtt és különböző időpontokban a beadások után 144 órán át. Az injekció okozta fájdalmat és az injekció helyi reakcióit mindvégig figyelembe vettük.

Intézkedés: Az interferonnal társult náthaszindróma elleni profilaxisként minden személy acetamidofént kapott közvetlenül az injekciózási periódusok előtt és alatt.

Farmakokinetika

Szérum-béta-interferonmeghatározások

A szérumszinteket antivirális egységekben mértük, CPE assay-vel. A szérum antivirális szinteket AUC, C_max értékekre analizáltuk és a T_max .AUC értékeket az adás idejéből számítottuk ki az utolsó kimutatható szintig (AUCO₀_t) és az adás után 144 órán át (AUCo_₁₄4). A kezelés adatainak standard leíróanalízisét SAS program használatával végeztük (version 6,08, SAS Institute, Cary, North Carolina).

4. táblázat

Adagolási séma a mintatanulmányhoz

Dózis- csoport	Adagolás módja	Dózis (MIU)	Kezelési periódus	Kezelési periódus
1	2
1	IM	12	Liofilizált (60 pg)	Folyékony (60 pg)
2	IM	12	Folyékony (60 pg)	Liofilizált (60 pg)

Farmakodinamika

Vizsgáltuk az interferon által indukált GTP ciklohidrolázenzim termékét, a neopterint. Ez a biológiai marker a makrofág- és T-sejt-aktiválást jelzi [C. Huber et al., J. Exp. Med., 160, 310-314 (1984); 1996, szeptember 20; D. Fuchs et al., Immunoi. Today, 9, 150-155 (1988)]. A rekombináns béta-interferonnak úgy a nem klinikai, mint klinikai vizsgálata azt mutatta, hogy a neopterin indukciója a különböző rekombináns humán béta-interferonkezelések alkalmazása után kapott szérumaktivitás-szintekkel van összefüggésben.

A neopterin standard laboratóriumi eljárásokkal mérhető. A béta-interferon farmakodinamikus profilja három szérumneopterin-paraméter kiszámításával kvantitatív módon leírható. Az első paraméter - E_AUC a neopterin vs időgörbe alatti terület alapvonalszintre korrigálva. A második paraméter az E_MAX; ez a paraméter a kapott neopterincsúcsszint és a neopterin-alapvonalszint közötti különbség; a harmadik paraméter az indukciós hányados: IR (induction ratio); ezt a paramétert úgy számítjuk ki, hogy a neopterincsúcsszintet elosztjuk a neopterin-alapvonalszinttel.

Statisztika

Két Wilcoxon-Mann-Whitney-féle egyoldaliteszt-eljárást használtunk az AUC-ra, hogy meghatározzuk az ekvivalenciát. Annak érdekében, hogy a folyékony készítményformából származó interferonnak a liofilizált készítményformából származó interferonhoz viszonyított relatív biológiai alkalmasságát és 90%-os konfidenciahatárait kiértékeljük, az AUC-t varianciaanalízisnek (ANOVA) vetettük alá logaritmusrendszerbe való transzformálás után. A „személyek közötti” („between-subject) variációból a szekvenciákat és a nemeket izoláltuk. A „személyeken belüli” („within-subject”) variációkból a periódusoknak és kezeléseknek tulajdonítható komponenseket izoláltuk.

Azok számára, akik a szakterületen gyakorlattal rendelkeznek nyilvánvaló, hogy a találmány itt előadott részletes leírását és gyakorlatát tekintetbe véve, a találmánynak más kiviteli alakjai és alkalmazásai lehetnek. A leírások és példák csupán a szemléltetést szolgálják, a találmány valódi oltalmi körét és szellemét a következő igénypontok tartalmazzák.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (69)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Folyékony készítmény, amely interferont és 0,3%-5% (t/tf) aminosav-stabilizálószert tartalmaz, melyet savas jellegű aminosavak, arginin és glicin közül választunk ki, ahol a folyékony készítmény nem egy liofilizált interferonból rekonstituált készítmény, és utólag sem kerül liofilizálásra.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az aminosav-stabilizálószer arginin vagy glicin, és a folyékony készítmény szérumalbumintól mentes.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, melyet egy olyan tartály tartalmaz, amelynek legalább az egyik felülete az interferonra nézve inért anyaggal van bevonva.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferon béta-interferon vagy rekombináns technikával előállított interferon.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelynek pH-ja 4,0-7,2.

   HU 224 222 Β1
6. 6. Az 5. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelynek pH-ja 4,8-5,2.
7. 7. A 6. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelynek pH-ja 5,0.
8. 8. A 6. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben a savas jellegű aminosav glutaminsav.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az arginin arginin.HCI.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferonkoncentráció 6 MIU-50 MIU.
11. 11. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferonkoncentráció 6 MIU-50 MlU/dózis.
12. 12. A 3. igénypont szerinti folyékony készítmény, ahol a tartálynak legalább az egyik felülete szilikonnal vagy poli(tetrafluor-etilén)-nel van bevonva.
13. 13. A 12. igénypont szerinti folyékony készítmény, ahol a tartály egy fecskendő.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferon béta-interferon, az aminosav-stabilizálószer 170 mM L-glutaminsav, és továbbá egy pH 5,0 értékű puffért tartalmaz.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amely aminosav-stabilizálószerként glicint, és továbbá egy sót tartalmaz.
16. 16. A 14. igénypont szerinti folyékony készítmény, amely továbbá 15 mg/mi humán szérumalbumint és/vagy 0,1 t/tf% Pluronic F-68-at tartalmaz.
17. 17. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferon béta-interferon, az aminosav-stabilizálószer (a) 140 mM arginin vagy (b) 70 mM glicinnel kombinált 100 mM nátrium-klorid, és amely továbbá 20 mM pH 7,2 értékű foszfátpuffert tartalmaz.
18. 18. A 17. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyet egy olyan tartály tartalmaz, melynek legalább a folyadékkal érintkező felülete szilikonnal vagy poli(tetrafluor-etilén)-nel van bevonva.
19. 19. A 18. igénypont szerinti készítmény, ahol a tartály egy fecskendő.
20. 20. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amely emlősöknél parenterális beadásra alkalmas, interferonként béta-interferont és továbbá a készítmény pH-ját 4,0-6,0 között tartó puffért tartalmaz.
21. 21. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, melyet egy olyan tartály tartalmaz, amelynek legalább az egyik felülete az interferonra nézve inért anyaggal van bevonva.
22. 22. A 21. igénypont szerinti folyékony készítmény, ahol a tárolótartályban a folyadék-határfelület oxigéntartalmú gáztól mentes.
23. 23. A 21. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben a béta-interferon sem a tartályban történő tárolás alatt, sem azt megelőzően nem lett kavitációnak alávetve.
24. 24. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben a puffer citrát-, szukcinát-, tartarát-, fumarát-, glukonát-, oxalát-, laktát- vagy acetátpuffer.
25. 25. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelynek pH-ja 4,5-5,5.
26. 26. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelynek pH-ja 5,0.
27. 27. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amely steril.
28. 28. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amely a vérrel izotóniás.
29. 29. A 20. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az interferon humán rekombináns béta-interferon.
30. 30. A 29. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben a humán rekombináns béta-interferon aktivitása 6-50 MIU.
31. 31. Az 1. igénypont szerinti folyékony készítmény, amelyben az aminosav-stabilizálószer 0,3%-3,13% (t/tf) mennyiségben van jelen, és a folyékony készítmény fagyasztott.
32. 32. Folyékony gyógyszerkészítmény, amely (a) interferont, (b) acetátpuffert és (c) arginin tartalmaz, a készítmény pH-ja 4,0-6,0, és a készítmény szérumalbumintól mentes.
33. 33. A 32. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amelyben az arginin arginin.HCI.
34. 34. A 32. vagy 33. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amelyben az interferon béta-interferon.
35. 35. A 34. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amely a béta-interferont 6-50 MIU-ban tartalmazza.
36. 36. A 34. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amely a béta-interferont dózisonként 6-50 MIU-ban tartalmazza.
37. 37. A 32-36. igénypontok bármelyike szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amely 20 mM acetátpuffert tartalmaz.
38. 38. A 32-37. igénypontok bármelyike szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amely 0,3%-5% (t/tf) arginint vagy arginin. HCI-ot tartalmaz.
39. 39. A 32-38. igénypontok bármelyike szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amely továbbá egy felületaktív anyagot tartalmaz.
40. 40. A 39. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amelyben a felületaktív anyag 0,1% (t/tf) Pluronic F-68.
41. 41. A 32-40. igénypontok bármelyike szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amelyben az oldott oxigén szintje alacsonyabb, mint a légköri egyensúlyi szintek 30%-a.
42. 42. A 41. igénypont szerinti folyékony gyógyszerkészítmény, amelyben az oldott oxigén szintje alacsonyabb vagy egyenlő a légköri egyensúlyi szintek 10%-ával.
43. 43. Eljárás interferon stabilizálására egy folyékony gyógyszerkészítményben, azzal jellemezve, hogy összekeverünk (a) egy interferont, (b) egy puffért és (c) 0,3%-5% (t/tf) mennyiségben egy aminosav-stabilizálószert, melyet savas jellegű aminosavak, arginin és glicin közül választunk ki, ahol a folyékony gyógyszerkészítményt nemliofilizált interferonból rekonstituáljuk, és a készítményt utólag sem liofilizáljuk.
44. 44. Az 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az aminosav-stabilizálószer arginin vagy gli16

    HU 224 222 Β1 cin, és a folyékony gyógyszerkészítmény szérumalbumintól mentes.
45. 45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyékony gyógyszerkészítményt egy olyan tartályba helyezzük, amelynek legalább az egyik felülete az interferonra nézve inért anyaggal van bevonva.
46. 46. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyékony gyógyszerkészítményt egy tartályba helyezzük, és az interferont sem a tartályba helyezés során, sem azt megelőzően nem vetjük alá kavitációnak.
47. 47. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferonként béta-interferont vagy rekombináns technikával előállított interferont alkalmazunk.
48. 48. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 4,0-7,2 pH-jú puffért alkalmazunk.
49. 49. A 48. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a puffer pH-ja 4,8-5,2.
50. 50. A 49. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a puffer pH-ja 5,0.
51. 51. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aminosav-stabilizálószerként arginint, különösen arginin.HCI-ot alkalmazunk.
52. 52. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interferont 6 MIU-50 MIU koncentrációban alkalmazzuk.
53. 53. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tartálynak legalább az egyik felülete szilikonnal vagy poli(tetrafluor-etilén)-nel van bevonva.
54. 54. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tartály egy fecskendő.
55. 55. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferonként béta-interferont, pufferként 20 mM 7,2 pH-jú foszfátpuffert és aminosav-stabilizálószerként: (a) 140 mM arginint vagy (b) 100 mM nátrium-kloriddal egyesített 70 mM glicint alkalmazunk.
56. 56. Az 55. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyékony készítményt egy olyan tartályba helyezzük, melynek legalább egyik folyadékkal érintkező felülete szilikonnal vagy poli(tetrafluor-etilén)-nel van bevonva.
57. 57. Az 56. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tartály egy fecskendő.
58. 58. Eljárás interferon stabilizálására egy folyékony gyógyszerkészítményben, azzal jellemezve, hogy összekeverünk (a) egy interferont, melyet nemliofilizált interferonból rekonstituáltunk, (b) egy acetátpuffert és (c) arginint, és a folyékony gyógyszerkészítményt utólag sem liofilizáljuk.
59. 59. Az 58. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az argininként arginin.HCI-ot alkalmazunk.
60. 60. Az 58. vagy 59. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy interferonként béta-interferont alkalmazunk.
61. 61. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interferont 6-50 MIU koncentrációban alkalmazzuk.
62. 62. A 60. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az interferont dózisonként 6-50 MIU-ban alkalmazzuk.
63. 63. Az 58-62. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 20 mM acetátpuffert használunk.
64. 64. Az 58-63. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az arginint vagy arginin.HCI-ot 0,3%-5% (t/tf) mennyiségben alkalmazzuk.
65. 65. Az 58-64. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy felületaktív anyagot is keverünk a készítményhez.
66. 66. A 65. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagként 0,1% (t/tf) Pluronic F-68-at alkalmazunk.
67. 67. Az 58-66. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szérumalbumint nem adunk hozzá.
68. 68. Az 58-67. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyékony gyógyszerkészítményt egy tartályba helyezzük, és a béta-interferont sem a tartályban történő tárolás során, sem azt megelőzően nem vetjük alá kavitációnak.
69. 69. Az 58-67. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a folyékony gyógyszerkészítményt egy olyan tartályban tároljuk, ahol nincs oxigéntartalmú folyadék-határfelület a folyékony gyógyszerkészítmény és a tartály között.

    HU 224 222 Β1 Int. Cl.⁷: A 61 K 47/18

    KITERMELÉS A VIRÁLIS INAKTIVÁLÁSI LÉPÉS SORÁN AZ OLDOTT OXIGÉN % FÜGGVÉNYÉBEN

    KITERMELÉS (% MARADÉK MONOMER)

    OLDOTT OXIGÉN %

    1. ábra

    HU 224 222 Β1 Int. Cl.⁷: A 61 K 47/18 4’C • 25*C ▲ 33°C ♦ 40*C

    2. ábra

    HU 224 222 Β1 Int. Cl.⁷: A 61 K 47/18 4*C • 25*C a 33TC ♦ 40“C % PROTEIN