EA002754B1 - Устойчивые жидкие составы интерферона - Google Patents

Abstract

Описываются жидкие композиции интерферона, имеющие рН 4,0-7,2. Композиции включают бета-интерферон и стабилизирующий агент в количестве около 0,3-5 мас.%, представляющий собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из кислых аминокислот, аргинина и глицина. При необходимости добавляют соль для обеспечения достаточной ионной силы. Жидкую композицию не подвергают предварительной лиофилизации или образованию полостей. Жидкость предпочтительно содержат в емкости, имеющей, по меньшей мере, одну поверхность в контакте с жидкостью, покрытую материалом, инертным к адсорбции бета-интерферона. Также описывается набор для парентерального введения жидкого состава интерферона и способ стабилизации жидких составов интерферона.

Description

Настоящее изобретение относится к способам стабилизации человеческого бетаинтерферона и к устойчивым жидким составам бета-интерферона.

Интерфероны - это белки, оказывающие различные виды биологического действия, такого как антивирусное, иммуномодулирующее и антипролиферирующее. Они представляют собой сравнительно небольшие, видоспецифические, одноцепочечные полипептиды, продуцируемые клетками млекопитающих в ответ на действие различных индукторов, таких как вирусы, полипептиды, митогены и т.п. Интерфероны защищают ткани и клетки животных от вирусной атаки и являются важным механизмом защиты хозяина. В большинстве случаев интерфероны обеспечивают лучшую защиту тканей и клеток того вида, из которого они были продуцированы, чем других видов тканей и клеток, показывая тем самым, что интерферон, полученный от человека, должен быть более эффективен при лечении заболеваний людей, чем интерфероны, полученные от других видов.

Существует несколько различных видов человеческих интерферонов, обычно классифицируемых как лейкоцит, (альфа-интерферон), фибробласт (бета-интерферон) и иммунный интерферон (гамма-интерферон), а также большое количество их вариантов. Общие описания интерферонов могут быть найдены в различных работах и монографиях, включая ТНс 1п1сгГсгоп 8у51еш8 (^.Е. 81с\\аг1. II, 8ргшдсг-Усг1ад, Ν.Υ. 1979) и 1п1сгГсгои Тйстару (\Уог1б Нса11й Отдашζαΐίοπ Тссйшса1 ВсротЦ 8спс5 676, \Уог1б НсаИй ОгдашхаОоп, Осисуа, 1982), приводимых в данном описании в качестве ссылки.

Способ введения интерферона является важным фактором в клиническом применении этого важного терапевтического вещества. Систематическое введение интерферона путем внутривенных, внутримышечных или подкожных инъекций наиболее часто используется с некоторым успехом для лечения расстройств, таких как волосато-клеточный лейкоз, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и связанной с ним саркомы Капоши. Однако известно, что белки в очищенном виде особенно восприимчивы к деградации. В случае с бетаинтерфероном первичными механизмами деградации интерферона в растворе являются агрегация и деамидирование. Отсутствие стабильности интерферона в растворах и других продуктах ограничивало его применение до настоящего времени.

Фармацевтические композиции интерферона для клинического применения обычно содержат интерферон в виде лиофилизированного (т. е. высушенного в вакууме) препарата в сочетании со сложными органическими наполнителями и стабилизаторами, такими как неионные поверхностно-активные вещества, различные сахара, органические полиолы и/или альбумин сыворотки человека. Недостаток лиофилизированных препаратов заключается в том, что они требуют сложной упаковки, поскольку для инъекции необходима отдельная порция стерильной воды. Более того, лиофилизированные препараты перед использованием требуют проведения некоторых манипуляций, увеличивая таким образом вероятность проколов иглами и падения капель компонентов на пол во время приготовления инъекции. Такие манипуляции представляют особую проблему для пациентов с мышечной слабостью и плохой координацией движений, например, для больных с рассеянным склерозом. Пациенты с рассеянным склерозом могут сами вводить себе интерфероны, поэтому наличие лекарственной формы, которую намного легче вводить, чем существующие в настоящее время лиофилизированные продукты, представляет собой дополнительное удобство для указанной группы пациентов. Существует насущная потребность в простых жидких составах интерферона во избежание восстановления, необходимого при использовании лиофилизированных препаратов.

Жидкие, нелиофилизированные составы, содержащие интерфероны, могут также включать сложные носители, такие как альбумин сыворотки человека, полиолы, сахара и анионные поверхностно-активные стабилизирующие агенты. См., например, \УО 89/10756 (Нага с! а1. - Содержание полиола и р-гидроксибензоата).

Данное изобретение решает вышеуказанные проблемы, используя тот факт, что человеческий бета-интерферон может быть стабилизирован при добавлении к забуференным растворам, имеющим рН около 4-7,2, при этом указанные растворы содержат аминокислоту в качестве стабилизирующего агента и, в некоторых случаях, соль (если аминокислота не содержит заряженную боковую цепь). Бета-интерферон не лиофилизируют, а после получения из источников с применением способов, известных рядовому специалисту в данной области, включают прямо в состав в соответствии с данным изобретением.

С этой целью один из аспектов данного изобретения предусматривает жидкую композицию, включающую интерферон и стабилизирующий агент в количестве около 0,3-5 мас.%, который представляет собой аминокислоту, выбранную из группы, включающей кислые аминокислоты, аргинин и глицин. Жидкую композицию не подвергают предварительной лиофилизации. Более того, предпочтительно, чтобы жидкая композиция содержалась в емкости, такой как шприц, при этом поверхность емкости, контактирующая с жидкостью, покрыта материалом, инертным к интерферону, таким как силикон или политетрафторэтилен. Предпочтительные композиции включают бетаинтерферон или интерферон, полученный рекомбинантным способом, в буфере, имеющем рН около 4,0-7,2. Другие составы в соответствии с данным изобретением включают (1) 20-мМ ацетатный буфер, имеющий рН 5,0, не подвергнутый предварительной лиофилизации, в которой буфер включает бетаинтерферон плюс ингредиенты, выбранные из (а) 150 мМ аргинина-НС1; (Ь) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина: (с) 150 мМ аргининаНС1 и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека;

(б) 150 мМ аргинина-НС1 и 0,1% Р1игоше Е-68; (е)140 мМ хлорида натрия; (ί) 140 мМ хлорида натрия и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека; и (д) 140 мМ хлорида натрия и 0,1% Р1игоше Е-68;

(2) жидкость, имеющую рН 5,0, содержащую бета-интерферон, 170 мМ Ь-глутаминовой кислоты и 150 мМ гидроокиси натрия, при этом жидкость не подвергают предварительной лиофилизации;

(3) 20-мМ фосфатный буфер, имеющий рН 7,2, не подвергнутый предварительной лиофилизации, в которых буфер включает бетаинтерферон плюс ингредиенты, выбранные из: (а) 140 мМ аргинина-НС1; и (Ь) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина.

Другой вариант осуществления данного изобретения представляет собой набор для парентерального введения жидкого состава интерферона. Набор включает емкость, содержащую жидкий состав, имеющий рН 4-6, при этом жидкость содержит фармацевтически эффективное количество бета-интерферона, не подвергавшегося предварительной лиофилизации, и аминокислотный стабилизирующий агент в количестве 5 мас.% или менее; а также инструкцию для применения.

Далее данное изобретение предусматривает жидкую фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения млекопитающим, состоящую, по существу, из эффективного количества бета-интерферона, не подвергавшегося предварительной лиофилизации, в буфере, поддерживающем рН в интервале 4,0-6,0, и аминокислотного стабилизирующего агента при соответствующей ионной силе. Композиция содержится в емкости для хранения, такой как шприц. Емкость для хранения предпочтительно не подвергают контакту с кислородосодержащим или жидким веществом (т. е. раствор интерферона не контактирует с кислородосодержащим газом во время получения и хранения). Бета-интерферон, по существу, сохраняет свою антивирусную активность во время хранения при температуре около 2-25°С в течение, по меньшей мере, 3 месяцев.

В соответствии с данным изобретением способ стабилизации бета-интерферона в жидких фармацевтических композициях такой, что он, по существу, сохраняет свою физическую стабильность во время хранения при температуре около 2-25°С в течение, по меньшей мере, 3 месяцев, включает смешивание а) эффективного количества бета-интерферона; Ь) буфера, поддерживающего рН в интервале 4,0-7,2 при соответствующей ионной силе; и с) аминокислотного стабилизирующего агента, в котором жидкость не подвергают предварительной лиофилизации и контакту с кислородсодержащим газом во время получения и хранения.

Жидкие составы в соответствии с данным изобретением имеют много преимуществ перед лиофилизированными составами. Эти преимущества включают (ί) меньший объем инъекции, необходимый для жидкого состава, вызывает меньше беспокойства, чем больший объем; (ίί) замена сложных наполнителей простыми аминокислотами обеспечивает более точную оценку качества готового продукта; (ш) в значительной степени упрощается упаковка, благодаря отсутствию необходимости использования воды для инъекций, а также отдельного шприца и ампулы; (ίν) точность дозировки может быть улучшена благодаря меньшему количеству перемещения жидкости; и (ν) улучшается безопасность продукта, поскольку более простое введение снижает вероятность проколов иглой и потери капель компонентов во время приготовления инъекции.

Следовательно, задачей настоящего изобретения является разработка биологически активного, устойчивого жидкого состава бетаинтерферона, применяемого для инъекций.

Другой задачей данного изобретения является разработка состава, не требующего предварительной лиофилизации композиции бетаинтерферона.

Следующей задачей данного изобретения является предупреждение потери стабильности жидкого состава бета-интерферона во время получения жидкой композиции путем а) избежания образования полостей и/или верхнего пространства во время получения жидкой композиции, или Ь) хранения жидкого состава с верхним пространством, состоящим из инертного газа, такого как аргон или азот.

Следующей задачей данного изобретения является разработка жидкого состава, обеспечивающего хранение в течение длительного периода времени в жидком состоянии, облегчая его хранение и получение перед введением. Очередной задачей данного изобретения является разработка легко изготавливаемого и вводимого жидкого состава, исключая стадии лиофилизации и восстановления.

Дальнейшей задачей данного изобретения является применение простых аминокислот в качестве альтернативных стабилизаторов помимо обычно используемого сывороточного альбумина, что облегчает контроль за качеством продукта.

Очередной задачей данного изобретения является разработка фармацевтической композиции, содержащей нелиофилизированный бе5 та-интерферон, который может быть получен более дешевым способом.

Другие преимущества данного изобретения частично раскрываются в дальнейшем описании, частично раскрывающем их очевидность, или же могут быть установлены в результате осуществления настоящего изобретения. Прилагаемые чертежи, составляющие часть данного описания, иллюстрируют и вместе с описанием служат для объяснения принципов настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - графическое изображение, показывающее процентную величину мономера бета-интерферона, остающегося в жидкости, получаемой валовым процессом, в виде функции процентной величины растворенного в ней кислорода.

Фиг. 2 - графическое изображение, показывающее процентную величину концентрации белка, нормализованной против концентрации исходного материала относительно времени, для жидкотю состава ВО9589-1. Образцы, помеченные 4°С (закрашенные квадратики), инкубируют при температуре 2-8°С. Другие образцы инкубируют при температуре 25°С (закрашенные кружочки), 33°С (закрашенные треугольники) и 40°С (закрашенные ромбы).

Фиг. 3 - графическое изображение, показывающее процентную величину концентрации белка, нормализованной против концентрации исходного материала относительно времени для жидкого состава ВО9589-3. Образцы, помеченные 4°С, инкубируют при температуре 2-8°С. Другие образцы инкубируют при температуре 25°С (закрашенные кружочки), 33°С (закрашенные треугольники) и 40°С (закрашенные ромбы).

Настоящее изобретение устраняет проблемы и недостатки, связанные с современными способами и схемами, предусматривая простой способ стабилизации интерферона и простой состав интерферона с повышенной стабильностью при хранении. Данное изобретение частично основано на том, что

a) бета-интерферон особенно неустойчив и агрегируется при контакте с кислородом, либо активно пропускаемом через жидкость, либо статистически присутствующем в верхнем пространстве;

b) жидкие составы бета-интерферона, не включающие носителя, особенно такие как альбумин сыворотки человека, особенно подвержены абсорбции (т.е. химической реакции или физическому связыванию) стеклянными поверхностями; и

c) бета-интерферон агрегируется при низкой ионной силе, требуя ионной среды для обеспечения стабильности в жидком виде.

Поэтому данное изобретение относится к способам стабилизации человеческого бетаинтерферона, разрешающим эти проблемы, а также к получению с их помощью жидких составов стабилизированного бета-интерферона.

А. Определения

Термин буфер означает растворы слабой кислоты и соли, содержащие анион кислоты, или растворы слабого основания и его соли. В частности, термин ацетат в данном описании (см. также табл. 1 ниже) означает буферную систему, предпочтительно содержащую ацетат натрия и уксусную кислоту, а термин фосфат означает буферную систему, предпочтительно содержащую двухосновный и одноосновный натрий фосфат гепта- и моногидрат, соответственно. Более того, растворы в табл. 2 (ниже), содержащие кислую аминокислоту в сочетании с гидроокисью натрия, хотя обычно и не считаются буферами в том смысле, в котором этот термин известен в данной области, тем не менее подпадают под данное определение.

Термин наполнитель означает любое соединение, добавляемое во время обработки и/или хранения жидкого состава с целью изменения наливных свойств, улучшая стабильность и/или осмоляльность.

Термин стабилизирующий агент означает наполнитель, улучшающий или каким-либо другим образом увеличивающий стабильность.

Термин стабильность при необходимости имеет функциональное определение и означает относительное темпоральное постоянство активности интерферона, такой как антивирусная активность, и/или структуры интерферона.

Термин с полостями означает любой жидкий состав интерферона, по причине изменений давления или физического взбалтывания имевший контакт с кислородосодержащими пузырьками (например, воздухом), по меньшей мере, во время его получения и хранения. Термин образование полостей также означает, что в какой-то точке образуется область, включающая кислородосодержащий газ/жидкость во время получения, хранения и применения жидкого состава интерферона. Термин с полостями также означает, что уровень растворенного кислорода в жидких составах интерферона приблизительно на 10% процентов превышает величину атмосферного равновесия при температуре, обычно используемой, по меньшей мере, во время получения и хранения.

Термин парентеральный в данном описании означает подкожную, внутривенную, внутримышечную, интрастернальную, интраперитонеальную, офтальмологическую или интраспинальную инъекцию или вливание.

Выражение фармацевтически приемлемая соль означает любую органическую или неорганическую соль присоединения, сравнительно нетоксичную и безвредную для пациентов при концентрации, соответствующей эффективной активности, таким образом, чтобы побочное действие соли не нанесло вреда полезному действию интерферона.

Эффективное количество соединения это такое количество, которое обеспечивает результат или влияет на конкретное состояние, подвергаемое лечению. Эффективное количество также означает количество, обеспечивающее положительный результат (т.е. оказывает антивирусное действие) при цитопатогенном (СРЕ) анализе на антивирусную активность.

Фармацевтически эффективное количество интерферона означает процентную величину концентрации агента, известного в медицине и фармацевтике как безопасное и эффективное средство для лечения определенного состояния.

Изотонический по отношению к крови (равно как и изототония) означает жидкую композицию интерферона, имеющую достаточную концентрацию компонентов таким образом, чтобы ее осмотические свойства были, по существу, идентичны крови, т.е. клетки в контакте с составом, по существу, сохраняют свою форму и, по существу, не подвергаются чистому переносу воды в результате осмотического давления.

Полиионный вид (равно как и полиэлектролитический вид) означает вещество с высокой молекулярной массой, представляющее собой электролит, которое при использовании в составах в соответствии с данным изобретением максимизирует ионную силу для данной осмоляльности. Это определение основано на нашем открытии, заключающемся в том, что бетаинтерферон стабилизируется высокой ионной силой, однако общая ионная концентрация ограничивается тем, что раствор должен быть изотоничен по отношению к крови (см. пример 7). Предпочтительным способом максимизации ионной силы для данной осмоляльности является применение наполнителя, представляющего собой полиионное вещество.

Материал, инертный к интерферону, означает материал, обладающий, по меньшей мере, свойством физически и/или химически не реагировать с интерфероном.

В. Получение интерферонов

Данное изобретение в целом применимо ко всем видам интерферона, включая натуральный интерферон; интерферон, полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК, а также интерферон, полученный в результате химического синтеза или модификации. В данном изобретении также может быть использован сырой, полуочищенный и очищенный интерферон из фибробластов, лейкоцитов, лимфоцитов или любых других содержащих или продуцирующих интерферон тканей людей или любых других подходящих видов. Более предпочтительно данное изобретение применимо к фибробласту интерферона человека (бетаинтерферон).

Наиболее предпочтительным интерфероном-бета является рекомбинантная форма, при этом известны способы рекомбинантной ДНК получения белков, включающих различные интерфероны, которые никоим образом не ограничивают данное изобретение. См., например, патенты США 4 399 216, 5 149 636, 5 179 017 (Ахе1 е! а1); 4 470 461 (КаиГтап). Были получены рекомбинантные формы бета-интерферона. См., например, Европейский патент 0 41313 (Είетк - Экспрессия бета-интерферона); патент США 4 966 843 (МсМотткк е! а1. - Экспрессия интерферона в клетках яичника китайского хомячка (СНО)); патент США 5 326 859 (Бидапо е! а1. - ДНК, кодирующая бета-интерферон). Бетаинтерферон может также быть модифицирован рекомбинантным или химическим способом и может быть продуцирован в среде, содержащей сыворотку или без нее. Виды бета-интерферона могут включать варианты, такие как мутанты с истощенным цистеином (патенты США 4 588 585 и 4 737 462, Магк е! а1.) и мутанты с истощенным метионином (ЕР 260 350, \Уапд е! а1.). Первичные аминокислотные последовательности белка могут быть усилены путем дериватизации с применением остатков сахара (гликозилирование) или с помощью других дополнительных молекул. Другие модификации могут быть осуществлены через посттрансляционные процессирующие системы клетки-хозяина. Отдельные аминокислотные остатки в цепи могут быть далее модифицированы путем окисления, восстановления или других видов дериватизации, а белок может быть расщеплен для получения активных фрагментов. Следовательно, точная химическая структура конкретного рекомбинантного бета-интерферона зависит от нескольких факторов и не ограничивает объем данного изобретения. Все белки бетаинтерферона, включенные в описываемые в данном описании составы, сохраняют свою биоактивность при попадании в подходящие условия окружающей среды.

Одним из способов продуцирования рекомбинантного бета-интерферона является культивирование клеток яичника китайского хомячка (сно), трансфецированных геном бетаинтерферона человека. Рекомбинантный бетаинтерферон секретируется клетками яичника китайского хомячка, выращенными в производственной суспензионной культуре, содержащей фетальную бычью сыворотку. Клетки могут быть выращены во вращающихся колбах, помещенных в инкубатор с СО₂, (5% СО₂) при температуре 35°С. Содержимое нескольких вращающихся колб может быть соединено вместе и инокулировано в ферментерах большего размера, если требуется большое количество клеток. Выращивание в таком ферментере продолжается около шести дней, в течение этого времени активный продукт бета-интерферона аккумулируется в культуральной среде. Затем культуру можно собрать, а клетки удалить из содержащей продукт среды, например, проточной фильтрацией вдоль потока.

С. Очистка интерферонов

Схемы очистки интерферонов хорошо описаны и доступны рядовым специалистам в данной области. Такие способы включают одноили многоступенчатые процедуры, состоящие из различных стадий хроматографического разделения. См., например, патенты США 5 015 730 (Епекеп е! а1.- Аффинная хроматография и ЖХВД); 4 541 952 (Ηοδοί е! а1. - Хелатирующая хроматография).

Иллюстрируемый способ включает использование необычной гидрофобной и сравнительно основной природы молекулы бетаинтерферона, а также ее высокую аффинность к связыванию ионов металлов. См., например. Κηί^Ηΐ апб Еайеу, «Нитап ИЬтоЫак! 1п1егГегоп. ап 1тртоуеб РипПсаОоп». ТВю1.С11ет.. 256: 3609-3611 (1981) апб Ебу е! а1.. «РипГюа!юп оГ Нитап ИЬтоЫак! 1п1егГегоп Ьу Ζίπο Сйе1а!е СЬтотаЮдгарйу». 1.Вю1.Сйет., 232: 5934-5935 (1981). приводимых в данном описании в качестве ссылок.

Вкратце, стадии захвата и очистки включают связывание бета-интерферона в серии колонок с 8ерйаго8е^к (выпускаемых Рйаттае1а Вю1ее11). а также элюирование солями и полиолом.

После разбавления и регулирования конечного сефарозного элюата путем снижения рН, бета-интерферон в нем связывается с 8Р 8ер11аго5е (Рйатшас1а Вю!есй). Большая часть из остающихся белков, находящихся в колонке, по своей природе более основны, чем мономерный бета-интерферон, и связываются с колонкой более тесно, чем интерферон. В этой колонке ДНК и вирусы отделяются от бетаинтерферона. Затем колонку промывают серией буферных растворов, содержащих хлорид натрия.

После этого полученный интерферон связывается в колонке, ранее набитой цинком, с хелатирующей 8ерйато8е^к (Рйатшас1а Вю!есй). См. Ебу е! а1., ниже. Эта колонка работает в атмосфере, свободной от кислорода для того, чтобы защитить свободную сульфгидрильную группу в молекуле, равно как и на всех последующих стадиях. Очищенный интерферон окисляют и его рН поддерживают на низком уровне для того, чтобы инактивировать любые оставшиеся вирусы. После нейтрализации интерферон концентрируют, применяя проточную фильтрацию, а затем буфер заменяют нейтральным буферным раствором. Процесс замены буфера снижает концентрацию цинка и органических соединений. После этого интерферон можно хранить в емкости при температуре -70°С до стадии приготовления лекарственного средства.

Ό. Технология приготовления интерферонов

В иллюстративном способе очистки, описанном выше, и после первой замены буфера осуществляют вторую замену буфера, за исключением того, что нейтральный буферный раствор заменяют буферным раствором, имеющим рН 4-7,2 и содержащим стабилизирующий агент, подробно описываемый ниже. Полученный состав, содержащий интерферон, называют промежуточным соединением процесса, которое может быть заморожено при хранении. См. также пример 7.

После хранения в замороженном состоянии (в атмосфере инертного газа, такого как аргон или азот) он может быть разморожен и прокачан через 0,22-микронный фильтр в тарированную емкость, предпочтительно из нержавеющей стали, при этом к промежуточному соединению добавляют предварительно стерилизованный фильтрацией разбавитель до желаемой массы конечного продукта. Разбавитель представляет собой такой же буфер, который был использован во втором процессе замены буфера. Затем конечный жидкий продукт стерилизуют с помощью фильтра с применением асептических процедур и, например, двух 0.22микронных фильтров, расположенных один за другим, и помещают в закупориваемую емкость, предпочтительно из нержавеющей стали, имеющую входное отверстие с инертным газом, дегазирующую систему, включающую клапан/фильтр, и погружную трубу для загрузки/выгрузки. Конечный продукт перекачивают через погружную трубу в закупоренную емкость. Используя инертный газ, такой как азот, конечный продукт перемещают с помощью давления в верхнюю часть насоса устройства, асептически наполняющего стерильные шприцы.

Известно несколько способов асептического наполнения стерильных шприцов, и используемый способ не служит для ограничения объема настоящего изобретения. В иллюстрируемом способе используют наполнитель для шприцев НУРАК@, пригодный для обработки в автоклаве (Вес!оп Э|ск|п8оп рйаттасеи!1са1 8ук1ет5. ЕгапИт Ьакек, N1). Шприцы обрабатывают в автоклаве с насаженными наконечниками. В общем, устройства такого типа включают вакуумную камеру для размещения шприцев, наполняемых составом интерферона. Камера находится в асептической среде. Каждый шприц расположен в камере вертикально, при этом в его открытый конец вставлен штифт плунжера, соответствующий открытому концу цилиндра шприца. Штифт предназначен для введения пробки в цилиндр с целью удержания в нем жидкости. После введения в верхней части шприца остается небольшое пространство. Камеру эвакуируют и несколько раз продувают обратным потоком инертного, не содержащего кислорода, газа (например, аргон, азот); после установления окончательного вакуума штифты механически продвигают на небольшое расстояние в открытые цилиндры шприцев, а пробки автоматически вставляют в соответствующие шприцы. Затем камеру вентилируют профильтрованным воздухом для того, чтобы вновь довести давление внутри камеры до атмосферного уровня. Количество вакуума определяет размер пространства в верхней части шприца, содержащего инертный газ.

В системе, используемой в данном случае, шприцы ориентированы вертикально и удерживаются на месте звездочкой на вращающемся диске. Шприцы вначале помещают под иглой, которая в них вставляется. Игла продувает внутреннюю часть шприца инертным газом (например, азот, аргон). Затем иглу извлекают из шприца. После этого шприц помещают под второй иглой, которую вставляют в него. Иглу прикрепляют к насосу, закачивающему продукт в шприц. Затем вторую иглу извлекают из шприца. После этого шприц перемещают под третью иглу, вставляемую в него. Плунжер (предварительно подвергнутый автоклавированию) вдувают в шприц инертным газом, не содержащим кислорода (например, азот, аргон), затем иглу извлекают из шприца. Плунжер вставляют таким образом, чтобы оставить в верхней части шприца пространство, наполненное инертным газом (между верхней частью жидкости и нижней частью плунжера).

1. Наполнитель.

Наполнитель предпочтительно представляет собой полиионное вещество, максимизирующее ионную силу для данной осмоляльности, такое как, например, полиэлектролит, который может включать гепарин или другое полимерное вещество. Как указано в примере 4, бета-интерферон стабилизируют высокой ионной силой, однако общая ионная сила ограничена тем, что раствор должен быть изотоничен по отношению к крови. Предпочтительным способом соответствующим образом максимизировать ионную силу для данной осмоляльности является применение полиионных веществ. Растворы бета-интерферона в соответствии с данным изобретением изотоничны по отношению к крови (около 290 миллиосмолей/кг).

Наиболее предпочтительным стабилизирующим агентом для настоящего изобретения является аминокислота, которая может включать одну из следующих кислот: любую кислую аминокислоту (например, глютаминовая кислота, аспарагиновая кислота) или аминокислоту, выбранную из аргинина и глицина. Наиболее предпочтительным аминокислотным стабилизирующим агентом является аргицин, добавляемый к растворам с рН 5,0 в кислой форме (аргинин-НС1). Предпочтительной кислой аминокислотой является Ь-глютаминовая кислота. Тот факт, что полиионные наполнители являются предпочтительными, вероятно, объясняется тем, что аргинин и лизин (с тремя заряженными группами) стабилизируют интерферон лучше, чем глицин (с двумя заряженными группами), который в свою очередь стабилизирует лучше, чем любое из испытанных незаряженных веществ.

Если наполнителем является аргинин-НС1, то его концентрация составляет 0,5-5% (мас./об.), наиболее предпочтительно - 3,13% (что эквивалентно 150 мМ аргинина-НС1). Если наполнителем является глицин, то его концентрация составляет 0,50-2,0%(мас./об.), наиболее предпочтительно - 0,52% (что эквивалентно 66,7-266,4 мМ, наиболее предпочтительно, 70 мМ). Если наполнителем является глютаминовая кислота, то ее концентрация составляет 100200 мМ, наиболее предпочтительно, 170 мМ (что эквивалентно процентной величине мас./об., равной 1,47-2,94%, наиболее предпочтительно, 2,5%).

Проанализировав различные наполнители, в качестве агента, стабилизирующего жидкие составы бета-интерферона, с применением рНбуферной системы, включающей 50 мМ ацетата натрия и ледяной уксусной кислоты в сочетании со 100 мМ хлорида натрия, рН 5,0. Образцы жидкого интерферона подвергают либо термическому воздействию путем инкубирования при 37°С в течение 1-3 недель, либо помещают на ротатор на 1-3 дня для механического воздействия. Стабильность бета-интерферона обработанных образцов определяют способами, описанными в примере 1. Как описано подробно в примере 7, составы, забуференные при рН 5,0 ацетатом натрия и содержащие аминокислотный наполнитель (а также, необязательно, хлорид натрия), демонстрируют наилучшую стабильность.

2. Интерферон.

Предпочтительным интерфероном является фибробластный бета-интерферон, наиболее предпочтительно, рекомбинантный бетаинтерферон человека, получаемый из клеток млекопитающих. Рекомбинантный бетаинтерферон человека может содержать свободный сульфгидрил и, по меньшей мере, одну дисульфидную связь. Особо предпочтительная молекула содержит один свободный сульфгидрил в положении 17 и одну дисульфидную связь между положениями 31 и 141 на молекулу. Как известно из случая с природным бетаинтерфероном человека, при Акп-80 ожидается Ν-гликозилирование. Концентрация жидких составов в соответствии с данным изобретением составляет 30-250 мкг/мл. Предпочтительная концентрация составляет 48-78 мкг/мл, а наиболее предпочтительная концентрация - около 60 мкг/мл. Величины внутреннего стандарта Βίοдеп были переведены в единицы Международного стандарта ВОЗ для интерферона, натуральный #06-23-902-531, таким образом, концентрация в Международных единицах (для объема инъекции, составляющего 0,5 мл) составляет около 6-50 1Ми, а наиболее предпочтительная концентрация составляет 12 1МИ.

3. Буфер.

Органическая кислота и фосфатные буферы, используемые в соответствии с данным изо13 бретением для поддержания рН на уровне приблизительно 4,0-7,2, предпочтительно, 4,5-5,5, и наиболее предпочтительно, 5,0, могут включать известные буферы органических кислот и их солей, такие как цитратные буферы (например, смесь мононатрий цитрата-динатрий цитрата, смесь лимонной кислоты-тринатрий цитрата, смесь лимонной кислоты-мононатрий цитрата и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты-мононатрий сукцината, смесь янтарной кислоты-гидроокиси натрия, смесь янтарной кислоты-динатрий сукцината и т.д.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты-натрий тартрата, смесь винной кислоты-калий тартрата, смесь винной кислотыгидроокиси натрия и т.д.), фумаратные буферы (например, смесь фумаровой кислотымононатрий фумарата, смесь фумаровой кислоты-динатрий фумарата, смесь мононатрий фумарата-динатрий фумарата и т.д.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислотынатрий глюконата, смесь глюконовой кислотыгидроокиси натрия, смесь глюконовой кислотыглюконата калия и т.д.), оксалатные буферы (например, смесь щавелевой кислоты-натрий оксалата, смесь щавелевой кислоты-гидроокиси натрия, смесь щавелевой кислоты-калий оксалата и т.д.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты-натрий лактата, смесь молочной кислоты-гидроокиси натрия, смесь молочной кислоты-калий лактата и т.д.), фосфатные буферы (натрий фосфат одноосновный/натрий фосфат двухосновный) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислотынатрий ацетата, смесь уксусной кислотыгидроокиси натрия и т. д.).

В описываемых ниже примерах используются различные концентрации буферов и различные величины рН натрий фосфата, натрий цитрата, натрий сукцината, натрий карбоната и натрий ацетата для определения наиболее подходящего буфера. Образцы бета-интерферона либо подвергают воздействию при 37°С в течение периода времени от 6 дней до 2 недель, либо помещают на ротатор на 7-9 ч для ускорения разрушительных процессов. Затем определяют химические свойства образцов. Образцы анализируют с применением оптической плотности, пептидного картирования, жидкостной гельхроматографии высокого разрешения, восстанавливающего или невосстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия и вестернблоттинга, а также изоэлектрического фокусирования/вестерн-блоттинга, описываемых ниже в примере 1. Все экспериментальные образцы бета-интерферона сравнивают с исходным материалом бета-интерферона или с образцами бета-интерферона, подвергнутыми воздействию 2-8°С. Наши данные показывают, что рН является основным фактором, определяющим стабильность наших образцов бета-интерферона, и что образцы, имеющие рН 4,0-5,0, более стабильны, чем образцы, имеющие рН 7,0 и выше, см. пример 2. Тем не менее, разработаны несколько составов бета-интерферона при физиологическом рН (7,2), см. пример 6.

4. Образование полостей.

Большая часть сульфгидрильных остатков в бета-интерфероне подвергается окислению при высоком рН (> 8,0), т.е. рН, при котором дисульфидные связи подвергаются реаранжировке. Обнаружена некоторая агрегация бетаинтерферона в общей массе промежуточного соединения, применяя гель-хроматографию, невосстанавливающий электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия и лазерное рассеивание света. Затем обнаружено, что образование агрегированного бета-интерферона может зависеть от уровня растворенного кислорода. Разработанные критерии для предотвращения образования полостей в жидком бета-интерфероне включают следующее: (а) по возможности, во время получения и хранения следует избегать контакта кислородосодержащего газа с поверхностью жидкости, и/или (Ь) во время получения и хранения следует избегать образования пузырьков; и/или (с) при температуре получения и хранения уровень растворенного кислорода в составе должен быть на 10% ниже атмосферного равновесия, см. пример 3.

5. Адсорбция интерферона поверхностями.

Определено, что интерферон поглощается различными поверхностями, и его хранение в стеклянной емкости требует, чтобы, по меньшей мере, одна из ее поверхностей, находящаяся в контакте с интерфероном, была покрыта или каким-либо другим способом обложена материалом, предотвращающим или, по существу, устраняющим адсорбцию. Эта поверхность может быть химически или физически инертна к адсорбции. Иллюстративные материалы для этой цели известны рядовым специалистам в данной области и могут включать, например, распыленный или спеченный силикон, полипропилен или политетрафторэтилен. Предпочтительные 60 мкг/мл жидкие составы (ВО95891,2,3 и 4: суммировано в табл. 1 ниже), помещают в стеклянные шприцы. Тип I, емкостью 1 мл, покрытые напиленным силиконом (Веской Эюкшкоп), и в стеклянные пробирки, тип I, емкостью 0,75 мл. Затем образцы анализируют с помощью жидкостной высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой на концентрацию белков. Данные показывают, что в растворе образцов, находящихся в стеклянных пробирках, меньше белков по сравнению с содержимым шприцев, покрытых силиконом, см. пример 5.

6. Предпочтительные составы.

Проведен кинетический анализ стабильности белков в четырех жидких составах, конечная концентрация которых указана ниже в табл. 1, при этом каждый состав содержит 60 мкг/мл бета-интерферона. Альтернативные составы, некоторые из которых содержат поверхностноактивные вещества, такие как Р1игошс Р68 (выпускаемые ВА8Г), приведены в табл. 2.

Таблица 1. Предпочтительные составы

Система рН	Наполнитель	Конечная рН
20 мМ ацетата	150 мМ аргинина-НС1	5,0 (ВС9589-2)
20 мМ ацетата	70 мМ глицина 100 мМ хлорида натрия	5,0 (ВС9589-1]
20 мМ фосфата	140 ММ1. аргинина-НС1	7,2 (ВС9589-3)
20 мМ фосфата	70 мМ глицина 100 мМ хлорида натрия	7,2 (ВС9589-4)

Все ингредиенты составов соответствуют Фармакопее США.

ВС-9589-1

Ингредиент (в виде сырьевых материалов) Количество Аргинин-НС1, Ф США 15,8 мг

Ледяная уксусная кислота, Ф США 0,167 мг

Натрий ацетат тригидрат, Ф США 0,972 мг

Бета-интерферон 30 мкг

Вода для инъекций, Ф США 0,5 мл

ВС9589-2

Ингредиент (в виде сырьевых материалов) Количество Глицин, Ф США 2,628 мг

Ледяная уксусная кислота, Ф США 0,185 мг

Натрий ацетат тригидрат, Ф США 0,932 мг

Бета-интерферон 1а 30 мкг

Вода для инъекций, Ф США 0,5 мл

Натрий хлорид 2,922 мг

ВС9589-3

Ингредиент (в виде сырьевых материалов) Количество Аргинин-НС1, Ф США 14,725 мг

Натрий фосфат двухосновный-7Н20 2,332 мг

Натрий фосфат одноосновный-1 Н20 0,359 мг

Бета-интерферон 1а 30 мкг

Вода для инъекций, Ф США 0,5 мл

ВС9589-4

Ингредиент (в виде сырьевых материалов) Количество

Натрий фосфат двухосновный-7Н20 1,984 мг

Натрий фосфат одноосновный- 1 Н20 0,359 мг

Бета-интерферон 1а 30 мкг

Глицин 2,628 мг

Натрий хлорид 2,922 мг

Вода для инъекций, Ф США 0,5 мл

Таблица 2. Альтернативные составы

Система рН	Наполнитель	Конечная рН
20 мМ ацетата	150 мМ аргинина-НС1 и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека	5,0
20 мМ ацетата	150 мМ аргинина-НС1 и 0,1% Р1игошс Р-68	5,0
20 мМ ацетата	140 мМ натрий хлорида	5,0
20 мМ ацетата	15 мг/мл альбумина сыворотки человека 140 мМ натрий хлорида	5,0
20 мМ ацетата	0,1% Р1игоп1с Р-68 140 мМ натрий хлорида	5,0
170 мМ Е-глутаминовой кислоты, 150 мМ гидроокиси натрия	15 мг/мл альбумина сыворотки человека	5,0
170 мМ Е-глутами- новой кислоты, 150 мМ гидроокиси натрия	0,1% Р1игошс Р-68	5,0

В составы в соответствии с настоящим изобретением могут быть также включены другие материалы, такие как следующие консерванты, в которых все предпочтительные процентные величины указаны в мас./об.: фенол (около 0,2%), метилпарабен (0,08%), м-крезол (0,1%), хлорбутанол (0,25%), бензиловый спирт (0,01%) и тимеросал (0,01%). Исходя из анализов по определению агрегации и деамидирования белков (данные не приведены), наиболее предпочтительными консервантами являются хлорбутанол и бензиловый спирт.

7. Наборы для парентерального введения.

Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения включают заранее упакованный набор для парентерального введения заявляемых жидких составов. Набор может включать шприцы, заранее наполненные жидкими составами в соответствии с данным изобретением, несколько спиртовых тампонов, по меньшей мере, одну иглу, одну или несколько наклеиваемых повязок и инструкцию по использованию. Жидкие составы в соответствии с данным изобретением также могут быть введены с помощью известных систем для инъекций без применения игл.

Е. Применение интерферонов

Составы интерферонов в соответствии с настоящим изобретением обладают антивирусной активностью, см. пример 7. В случае клинического применения количество интерферона, вводимого в каждом конкретном случае, а также частота его введения зависят от таких факторов, как вид используемого интерферона, заболевания, подвергаемого лечению и реакции пациента на лечение интерфероном.

Жидкие композиции в соответствии с данным изобретением могут быть предпочтительно использованы для лечения рецидивирующего рассеянного склероза. Лиофилизированные (т.е. восстановленные) жидкие составы природного бета-интерферона и рекомбинантного бетаинтерферона вводились пациентам, страдающим от рецидивирующего рассеянного склероза, см. 1асоЬк е! а1., Аппа1к оГ №иго1оду 39: 285294 (март 1996 г.) и приводимые в данном описании ссылки, а также 1асоЬк апб Мипксйаиег, Тгеа1шеп1 оГ шиШр1е кс1его818 \νίΐ1ι шкгГегопк (стр. 223-250) ш Тгеа1шеп1 оГ шиШр1е кс1его818: !па1 бекщп, гекийк апб Ги1иге регкресбуек (В.А. Вибшск е! а1., ебк), Ьопбоп: 8ргшдег, 1992.

Применение жидких составов, описываемых в данной спецификации, для лечения рассеянного склероза осуществляется в соответствии с протоколами и первичными переменными результатами, приведенными в работе 1асоЬк е! а1, ниже.

Одним из способов оценки полезности заявляемых жидких составов являются токсикологические исследования и определение раздражения ткани, связанного с введением жидкого состава. Проведено токсикологическое исследо17 вание заявляемых жидких составов на кроликах, см. пример 8.

Следующие примеры предназначены для иллюстрации вариантов осуществления данного изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.

Пример 1. Способы исследования.

Для определения физико-химических свойств бета-интерферона в наших жидких составах применяется несколько хорошо описанных способов, которые также могут быть использованы для контроля свойств других интерферонов.

Присутствие/отсутствие нерастворимых агрегатов определяют путем измерения поглощения при 320 нм и прозрачности при 580 нм. Концентрацию растворимого белка определяют либо путем измерения поглощения при 278-280 нм (коэффициент затухания - 1,5), либо с помощью жидкостной высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой, используя в качестве стандартов пики известных концентраций бета-интерферона в буфере состава. Перед исследованием образцы жидкого состава подвергают центрифугированию. Процентную величину растворимых агрегатов определяют путем их отделения от мономера бета-интерферона при помощи гель-хроматографии на колонке Т8КСе1^К С20008^ХЬ (Токо Наак, МойдотетууШе, РА). Величину площади пиков, наблюдаемую при 280 нм, используют для подсчета процентной величины растворимых агрегатов.

Стабильность пептидного скелета подтверждают электрофорезом в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (δΌδ-РАСЕ). Бета-интерферон восстанавливают меркаптоэтанолом в присутствии додецилсульфата натрия перед его обработкой электрофорезом на 10-20% градиентном геле (Мш1Р1ик 8ертаде1^К, 1п1еща1еб 8ерата!юп 8ук!етк, ΝηΙίοΕ. МА). Затем с помощью электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют посредством иммунологического анализа с применением антитела антибета-интерферона и козьего антимышиного антитела вместе с пероксидазой хрена, см., например. Се1 Е1ес1гор1югек1к оГ Рто!ешк, А Ртасйса1 Арртоасй, 2пб ебйюп, Β.Ό. Натек апб Ό. Ктск^ооб, 1КБ Ргекк.

Изменение суммарного поверхностного заряда, вызываемое деамидированием и другими химическими изменениями, определяют путем изоэлектрического фокусирования на полиакриламидиом геле (1ЕЕ 3-10 М1п1Р1ик 8ертаде1^К 1п1еща1еб Бератабоп Бук!етк), см. Се1 Е1ес1торйотебк оГ Рто!ешк, А Ртасбса1 Арртоасй, 1б.

Окисление метионина, деамидирование аспарагина и другие возможные химические изменения также определяют путем пептидного картирования. Бета-интерферон гидролизуют эндопротеиназой Ьук-С (\Уако Риге Сйеткак) в присутствии дитиотреитола, а полученные пептидные фрагменты отделяют при помощи жидкостной высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой, см., в общем, Ка1да1ищ. К., & НотуаЛ, С. Кар1б Рерббе Марршд Ьу Нщ11 РегГогшапсе Ек|шб Сйтота!одгарЬу, 1. СйтотаЮ§гарЬу 443, 343-354 (1988).

Ν-Сшитый олигосахаридный профиль определяют с помощью углеводного электрофореза с применением фторофоров (ЕАСЕ^К куКет Ьу С1усо, 1пс. Щоуа!о, СА). Сшитые аспарагином (Ν-сшитые) олигосахариды выделяют из гликопротеина, используя фермент пептид Νгликозидаза Е, затем с помощью восстанавливающего аминирования помечают фторофором на восстанавливающих концах, разделяют и, наконец, проводят количественное определение на полиакриламидном геле.

Антивирусную активность интерферонов определяют многими способами, наиболее полно описанными в ^.Е. 81е\\ш1 II, Т1е 1п1етГетоп 8ук!ет, Брбпдет- Ует1ад (2б Еб., 1981). Исследование на ингибирование цитопатогенного действия (СРЕ) особенно подходит для определения антивирусной активности интерферона. Наш предпочтительный способ описан в Техническом докладе ВОЗ, серия № 725, Приложение 1 (1985), приводимом в данном описании в качестве ссылки. Вкратце, способ, основанный на цитопатогенном действии, осуществляют путем получения рабочего экземпляра стандарта бетаинтерферона, предварительно калиброванного против эталона ВОЗ. Этот исходный продукт получают в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла+, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 4 мМ Ь-глютамина в концентрации, составляющей 10 000 ед./мл. В день проведения исследования стандарт, контроль и образцы разбавляют в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла+ тремя отдельными сериями разбавления: а) начиная с 32 ед./мл с последующими двукратными разбавлениями; Ь) начиная с 12 ед./мл с последующими 1,5-кратными разбавлениями; и с) начиная с 6 ед./мл с последующими 1,2-кратными разбавлениями. 50 мкл разбавляющих составов добавляют колонками в лунки 96-луночных титрационных микропланшетов, по одному планшету на серию разбавлений. Затем клетки А549 (каталожный номер АТСС ССЬ-185, КоскуШе, МИ) в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла+ добавляют в каждую лунку в количестве 5 х 10⁵ клеток/мл, 50 мкл на лунку, осуществляя двукратное разбавление как клеток, так и бета-интерферона. Клетки и интерферон инкубируют при 37°С в 5% двуокиси углерода в течение 15-20 ч. Содержимое планшетов встряхивают в ковше с отбеливателем и в каждую лунку добавляют 100 мкл вируса энцефаломиокардита (ЕМС), соответствующим образом разбавленного в среде. Вирус и клетки инкубируют при 37°С и 5% двуокиси углерода в течение 30 ч. Содержимое планшетов встряхи19 вают в ковше с отбеливателем и в планшеты добавляют 0,75% кристаллического фиолетового красителя. Через 5-10 мин планшеты промывают дистиллированной водой и дают им возможность высохнуть. Каждый исследуемый планшет включает лунки для контроля над ростом клеток, не содержащие ни интерферона, ни энцефаломиокардита, лунки для контроля над вирусом, содержащие энцефаломиокардит и клетки, но не интерферон, а также серию разбавлений стандарта интерферона. Планшеты исследуют визуально для определения последней лунки в каждой колонке с жизнеспособными клетками (>25%, сливающейся фиолетовой окраски). Предел детектирования определяют как самую низкую концентрацию стандарта, защищающую от вирусной цитотоксичности. Для определения активности интерферона (Ми/мл) в образце разбавление образца в последней положительной лунке умножают на предел детектирования, определенный для стандарта, и коэффициент разбавления образца. Результаты, полученные после исследования каждого планшета, трансформируют в логарифмические единицы для определения среднего геометрического и подсчета 95% достоверного интервала.

Пример 7. Выбор буферной системы.

Приготовили три набора буферов, содержащих 9-10 различных компонентов в каждом наборе. Набор I содержит серию растворов фосфата натрия и/или 100 мМ хлорида натрия, имеющих рН 4,0-7,2. Набор II содержит дополнительную серию буферов с цитратом натрия, имеющих рН 4,0-7,0. Набор III содержит серию растворов буферов с сукцинатом, ацетатом и карбонатом натрия, каждый из которых смешан со 100 мМ хлористого натрия, имеющего рН 4,0-7,-2. В двух других растворах хлористый натрий заменяют 50 мМ сульфата натрия, имеющего рН 4,0-7,2.

Размороженную общую массу бетаинтерферона подвергают диализу в двух различных буферах в течение ночи при температуре 2-8°С, по меньшей мере, с двумя заменами буфера, а затем перед использованием подвергают стерилизующей фильтрации. Концентрацию белков определяют путем поглощения при 278 нм (коэффициент затухания составляет 1,5 мг^-1мл. см^-1), при этом все образцы содержат 140 мкг/мл или 150 мкг/мл бета-интерферона. Образцы фильтруют и разделяют на 4 части, частично наполняя 2,2-мл пробирки Эппендорфа. Одну часть выдерживают при температуре 28°С, другую - при 37°С в течение периода времени от шести дней до двух недель, третью часть помещают в ротатор на 7-9 ч, а последнюю часть используют в качестве контроля нуль-времени. Процентную величину потери белков из-за нерастворимых агрегатов подсчитывают как потерю концентрации белков во время различных обработок, разделенную на исходную концентрацию.

Результаты

Процентную величину потери белков нерастворимыми агрегатами подсчитывают как потерю концентрации белков, разделенную на исходную концентрацию белков. Статистический анализ всех данных показывает, что образцы интерферона в буферах, имеющих рН 4,05,0, имеют меньший процент потери белка из-за агрегации, чем в буферах, имеющих более высокий рН. Образцы интерферона, инкубируемые при 37°С и рН 4,0-5,0, из-за агрегации теряют 10-15%. При величине рН, превышающей 6,0, потери увеличиваются до 40-50%.

Определено, что образцы интерферона имеют более растворимые агрегаты в тех случаях, когда величина рН превышает 6,0. Более того, путем пептидного картирования определено, что по мере того, как рН увеличивается с 4,0 до 7,2, происходит, по существу, линейное увеличение количества деамидируемого интерферона; при рН, составляющей 7,0 и выше, более 85% интерферона подвергается деамидированию во время исследования. Измерена изоэлектрическая точка (р1) видов белков в образце (т.е. рН, при котором белок не мигрирует в электрическом поле и средний заряд белка равен нулю) с помощью изоэлектрического фокусирования/вестерн-блотов, при этом блоты показывают дополнительные полосы изоэлектрической точки образцов в цитрате натрия и сдвиг интенсивности полос образцов в сукцинате натрия. Фосфат не обладает буферной способностью при рН 5,0. Ацетат натрия с хлористым натрием при рН, равной 5,0, не вызывает изменений в рисунке связывания или интенсивности.

Пример 3. Эффект образования полостей.

Во время наших экспериментов по скринингу рН, описанных в примере 2, обнаружено что верхнее пространство пробирок для хранения имеет важное значение для потери белка некоторыми образцами. При помещении 1,5 мл образцов в пробирки объемом 2,2 мл потери белка не наблюдается. В 1,2 мл образца, напротив, обнаруживается существенное увеличение агрегатов. Это согласуется с нашими наблюдениями, заключающимися в том, что образование агрегированного бета-интерферона во время стадии вирусной инактивации процесса очистки зависит от уровня кислорода, растворенного во время этой стадии.

Вкратце, стадия вирусной инактивации включает доведение рН хелатирующего сефарозного элюата (см. раздел С) с 7,85+/-0,25 до 2,5-3,5 15% фосфорной кислотой, выдерживание подкисленного элюата в течение 120-135 мин, а затем повторное доведение рН до 6,7+/0,7 0,5 N гидроокисью натрия. Все стадии проводят при температуре 2-8°С. Данное исследование проводилось для того, чтобы определить, существует ли связь между образованием агре гатов бета-интерферона на данной стадии и количеством растворенного кислорода.

Материалы и способы

Элюат из хелатирующей сефарозной колонки разделяют на 50-мл или 100-мл аликвотные доли и помещают в 100-мл вращающиеся колбы. В каждую колбу добавляют по 1 мл барботированной аргоном фосфорной кислоты. Затем содержимое колбы осторожно перемешивают в течение около двух минут и выдерживают без перемешивания в течение около двух часов при температуре 2-8°С. После такого периода выдерживания добавляют 6,5 мл барботированной аргоном гидроокиси натрия, и образцы анализируют с помощью гельхроматографии в различное время. Кислород, растворенный в жидкости, измеряют постоянно с помощью кислородного зонда (Θτίοη, модель 860) и записывают во время добавления основания. Если уровень растворенного кислорода образцов равен или ниже 10%, то через верхнее пространство реактора продувают аргон.

Результаты

На фиг. 1 представлены данные, показывающие четкую связь между количеством растворенного кислорода, присутствующего во время добавления гидроокиси натрия, и получения мономера бета-интерферона в результате стадии инактивации вируса. Величина выхода, полученная при концентрации растворенного кислорода ниже или равной 10%, существенно отличается от всех других величин выходов при других концентрациях кислорода. Охарактеризован агрегат (данные отсутствуют в описании), и определили, что его удельная активность снижается в 30-40 раз по сравнению с общей массой промежуточного соединения. Определено, что свыше приблизительно 90% агрегата резистентно к денатурированию додецилсуль-фатом натрия при невосстанавливающих условиях, что дает возможность предположить наличие ковалентного поперечного сшивания.

При восстанавливающих условиях (2% бета-меркаптоэтанола) агрегат превращается в мономер, давая тем самым возможность предположить наличие поперечного сшивания, включающего дисульфидные связи.

Пример 4. Выбор наполнителя.

Серию составов бета-интерферона (60 мкг/мл), содержащих различные наполнители, получают в предпочтительном буфере, имеющем рН 5,0 и содержащем 50 мМ ацетата натрия и 100 мМ хлористого натрия. Наполнитель включает глицин, аргинин-НС1, лизин-НС1, сахарозу, глицерин, РЕО 3350, глютатион и Р1игошс Е-68. Общую массу промежуточного соединения бета-интерферона подвергают диализации в 50 мМ ацетата натрия и 100 мМ хлористого натрия при рН 5,0 в течение ночи и температуре 2-8°С, по меньшей мере, с двумя заменами буфера, а затем фильтруют перед использованием. Концентрацию бета-интерферона оп ределяют путем абсорбции при 278 нм за вычетом фона. Все образцы разбавляют до конечной концентрации интерферона, составляющей около 60 мкг/мл. Все приготовленные образцы фильтруют, 2 мл переносят в 4-мл стеклянные пробирки (не покрытые силиконом), верхнее пространство продувают аргоном и пробирки запечатывают. Наборы образцов держат при температуре 2-8 и 37°С до двух недель. Другие образцы подвергают механическому напряжению путем их вращения при комнатной температуре в течение трех дней.

Образцы анализируют в соответствии с процедурами примера 1. Кроме того, процентную величину растворенного кислорода в составах измеряют с помощью анализатора кислотно-основного баланса крови СлЬа-Согшпд. модель 248. Экспериментальная величина представляет собой величину частичного давления кислорода (мм Нд) образцов минус величину продутого азотом буферного контроля, а контрольная величина представляет собой частичное давление кислорода в буферном контроле, хранящемся при комнатной температуре минус частичное давление кислорода продутого азотом буферного контроля. Процентная величина растворенного кислорода (экспериментальная/контрольная) всегда ниже 30%.

Результаты

Изоэлектрическое фокусирование/вестернблоты и электрофорез в полиакриламидном геле с применением додецилсульфата натрия/вестерн-блоты образцов, инкубированных при 37°С в течение двух недель, показывают сдвиг полосы и потерю интенсивности, а также присутствие мультимеров интерферона в образцах, содержащих РЕО3350 и глютатион. После выдерживания в течение еще одной недели при 37°С глицериновый наполнитель показывает в наших блотах одну дополнительную полосу. Сахарозный наполнитель показывает потерю интенсивности полосы. Эта первоначальная процедура скрининга позволила нам изучить более подробно аргинин-НС1, глицин, хлористый натрий и маннит для дальнейших исследований.

Пример 5. Адсорбция интерферона.

Размороженную общую массу бетаинтерферона подвергают диализации в ВО95891,2,3 и 4 (см. табл. 1) в течение ночи при температуре 2-8°С, по меньшей мере, с двумя заменами буфера, а затем перед использованием фильтруют. Концентрацию белков определяют путем поглощения при 280 нм (коэффициент затихания составляет 1,5 мг^- 'мл.см^-1). Все образцы разбавляют до конечной концентрации, составляющей приблизительно 60 мг/мл. Разбавленные образцы фильтруют и помещают в тройном экземпляре по 0,5 мл в шприцы длиной 1,0 мл с силиконовым покрытием ΒΌ (стекло типа I) и продутым азотом верхним пространством, или в тройном экземпляре по 0,75 мл в

0,75-мл стеклянные ампулы, тип I, с продутым аргоном верхним пространством. Концентрацию белка определяют с помощью жидкостной высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой (пример 1).

Результаты

Табл. 3, приведенная ниже, показывает концентрации белков, определенные с помощью жидкостной высокоэффективной хроматографии с обращенной фазой. Эти данные показывают, что в образцах, помещенных в стеклянные ампулы, содержится меньше белка по сравнению с предварительно наполненными шприцами с силиконовым покрытием. Таким образом, для жидкого состава бета-интерферона используют шприцы с силиконовым покрытием.

Таблица 3

	Стеклянная ампула (мкг/мл (стандартное отклонение)	Шприцы с силиконовым покрытием (мкг/ мл) (стандартное отклонение)
ВС9589-1	59,3 (2,6)	63,3 (2,5)
ВС9589-2	58,3 (0,7)	61,7 (0,1)
ВС9589-3	56,4 (0,4)	58,8 (1,1)
ВС9589-4	55,5 (0,7)	59,3 (0,5)

Пример 6. Составы с физиологической рН. Ионная сила/фосфат

Проведены первоначальные исследования в буферных системах, включающих фосфат/хлористый натрий, рН 7,2, с различными концентрациями буферного компонента, в которых концентрация фосфата находится в интервале между 10, 50 и 75 мМ, с ионной силой (определенной по уравнению I =Σ ί.’|Ζ|². где С₁ и Ζ₁ -молярная концентрация и валентный заряд видов ионов I, соответственно), составляющей 0,2, 0,4 и 0,6, регулируемой путем добавления хлористого натрия.

Использован полный факториальный расчет переменных концентраций фосфата (10, 50 и 75 мМ) и ионной силы (I = 0,2, 0,4 и 0,6). Составы одноосновного фосфата натрия, двухосновного фосфата натрия и хлористого натрия (для получения желаемой ионной силы) в буферах подсчитывают, используя разворот, представленный ЕШк апб Могпкоп в ВиГГегк οί Сопк1ап1 !оп1с 8(гепд(П Гог 81ибутд рН-берепбеп! Ргосеккек, Мебюбк Епхуто1. 37: 405-426 (1982). Уравнения позволяют определить количество каждого компонента буфера, необходимое для конкретной рН, концентрацию фосфата и ионную силу. Каждый из девяти растворов, используемых в факториальном эксперименте, получают путем обмена буфера общей массы промежуточного соединения бета-интерферона через обессоливающие колонки Рйатташа РИ-10. рН всех получаемых растворов составляют 7,20+/-0,15. Концентрации определяют путем поглощения при 280 нм, а затем разбавляют соответствующим буфером до 150 мкг/мл бетаинтерферона. Полученные растворы подвергают стерилизационной фильтрации в аргоне через

0,22-микронные фильтры, и аликвотные части, составляющие 1,3 мл, помещают в 5-мл стеклянные ампулы с верхним пространством из аргона. Образцы инкубируют при 37°С в течение 6 дней и обрабатывают трижды. Образцы анализируют путем определения процентной величины прозрачности при 580 нм, процентной величины восстановления белка и изоэлектрического фокусирования - электрофореза в полиакриламидном геле с применением додецилсульфата натрия/вестерн-блотов.

Результаты

Анализ процентной величины прозрачно сти с учетом различных ионных сил показывает тенденцию к увеличению прозрачности (т.е. снижение количества нерастворимых агрегатов белков) по мере повышения ионной силы. Процентная величина восстановления белка проявляет подобную тенденцию, несмотря на то, что вестерн-блоты изоэлектрического фокусирования-электрофореза в полиакриламидном геле с применением додецилсульфата натрия не проявляют тенденции к деамидированию при различных ионных силах, поэтому все образцы деамидированы в равной степени. Таким образом, после хранения в течение шести дней при температуре 37°С образцы подвержены агрегации в меньшей степени при снижении концентрации фосфата и повышении ионной силы. Результаты экспериментов по процентной величине прозрачности и восстановления в виде функции различных концентраций фосфата (не представлены в данном описании) показывают слабую тенденцию к понижению процентной величины прозрачности при повышении концентрации фосфата, однако анализ вариантности не показывает существенного различия в свойствах образцов с различными концентрациями фосфата. Данные по процентной величине восстановления показывают улучшенное восстановление белка при более низких концентрациях фосфата (существенное различие при уровне доверительности, составляющем 94%). Вестерн-блоты изоэлектрического фокусирования-электрофореза в полиакриламидном геле с применением додецилсульфата натрия не проявляют заметной тенденции к деамидированию при различных концентрациях фосфата.

Отношение наполнитель/соль

Предварительные исследования (не представлены) показывают, что некоторые наполнители могут требовать солей (например, хлористый натрий) для поддержания высокой ионной силы и обеспечения стабилизирующего действия при рН, равной 7,2. Проведено факториальное исследование с применением наполнителей (глицин, лизин, аргинин, сахароза и маннит) и дробной части хлористого натрия, обеспечивающего изотоничность (Г_соль = 0, 0,25, 0,75 и 1,0). Дробь получают, используя следующее ^{уравнение}· ^Гсоль ⁰соль^/(0соль ^{+ 0}наполнитель ), где 0_соль и 0_{наполнитель}- осмоляльности в мОсм/кг хло25 ристого натрия и наполнителя, соответственно, в растворе. Дробное количество соли обеспечивает возможность сравнения действия соли при использовании различных наполнителей. Все образцы содержат добавки для изотоничности при различных отношениях наполнитель:соль (определяемого при помощи £_соль).

Готовят 10%(мас./об.) основной раствор каждого наполнителя в 20 мМ фосфата, рН 7,2, дегазируют его и продувают аргоном. Готовят маточный раствор 250 мМ хлорида натрия, 20 мМ фосфата, рН 7,2, дегазируют его и продувают аргоном. Общую массу промежуточного соединения бета-интерферона подвергают экстенсивной диализации против 20 мМ продутого аргоном фосфата с буфером, имеющим рН 7,2. Полученный раствор исследуют на концентрацию бета-интерферона путем поглощения при 280 нм и разбавляют фосфатным буфером и соответствующими основными растворами наполнителя и соли, получая 60 мкг/мл бетаинтерферона и желаемые условия для конечной соли и наполнителя. Полученные образцы подвергают фильтрующей стерилизации (0,22 микрон) и помещают в 1,0-мл стеклянные шприцы, тип I, покрытые силиконом ВесЮп ΌίοΚίηδοη (объем наполнения 0,5 мл), верхнее пространство которых заполнено азотом. Образцы хранят при температуре 40°С.

Через 6 дней образцы аргинина, глицина и сахарозы анализируют путем абсорбции при 320 и 280 нм как до, так и после фильтрации через 0,22-микронные фильтры. Через две недели подобным образом анализируют аргинин, лизин и маннит с применением изоэлектрического фокусирования-электрофореза в полиакриламидном геле (ΙΕΡ-ΡΑΟΕ), восстанавливающего электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (8Ό8ΡΆΟΕ) и невосстанавливающего 8Ό8-ΡΑΟΕ. Контрольные образцы хранят при температуре 2-8°С и анализируют подобным образом.

Результаты

Восстановление бета-интерферона 1а (в виде процентной величины контроля) увеличивается с увеличением £_соль- для сахарозы и маннита, достигая максимального восстановления при £_соль= 1(130 мМ хлористого натрия). При использовании аргинина и лизина восстановление снижается при увеличении £_соль. Максимальное восстановление составов, включающих глицин, при рН = 7,2 достигают приблизительно при £_Соль = 0,75.

Это исследование по скринингу наполнителей с применением фосфатного буфера, имеющего рН 7,2, с различными наполнителями, такими как глицин, лизин, аргинин, маннит и сахароза, еще больше подтверждает изотоничность и показывает плохое восстановление всех незаряженных наполнителей. Эти добавки не влияют на объем деамидирования. Например, восстанавливающий и невосстанавливающий

8Ό8/ΡΆΟΕ показывают потерю негликозилированных видов бета-интерферона во всех составах и более тяжелые полосы мультимеров отдельно для изотонического хлористого натрия и маннита. В целом, таким образом существует сильная корреляция между ионным характером наполнителя и его способностью стабилизировать бета-интерферон против агрегации в этих буферных системах при физиологической рН. Неионные добавки, такие как сахароза и маннит, похоже, не оказывают защиты или же могут в действительности способствовать потере белка при физиологической рН. Хлористый натрий с единичным зарядом на растворимых фрагментах действует лучше, чем маннит или сахароза. Аминокислоты содержат два заряда на молекулу при физиологической рН. В случае использования глицина цвиттерионной природы самой молекулы оказывается недостаточно для стабилизации бета-интерферона. Аргинин и лизин, каждый из которых содержит три заряда на молекулу, стабилизируют бета-интерферон лучше, чем хлористый натрий отдельно или составы, включающие глицин/хлористый натрий.

Пример 7. Стабильность и кинетические исследования.

Составы асептически набирают в инертной атмосфере, шприцы инкубируют при различных температурах для различных периодов времени, и их содержимое подвергают анализу. Вкратце, размороженную общую массу бета-интерферона подвергают диализу до составов ВО9589-1, -2, 3 и -4 в течение ночи при температуре 2-8°С, по меньшей мере, с двукратной заменой буфера. Концентрации белка определяют путем поглощения при 280 нм с коэффициентом затухания, составляющим 1,5 мл/мг/см. Все образцы разбавляют до конечной концентрации бетаинтерферона 1а, составляющей около 60 мкг/мл. Четыре состава бета-интерферона 1а, указанных в табл. 1, фильтруют и по 0,5 мл набирают в 1,0мл длинные шприцы Вес1ои ΌχΚίηδοη (ΒΌ), внутренняя поверхность которых покрыта спеченным или напыленным силиконом. Образцы анализируют на оптическую плотность (ΟΌ), используя гель-хроматографию ЖХВР (8ΕΟ), гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (1БР)/вестерн-блот, восстанавливающий электрофорез в полиакриламидном геле с применением додецилсульфата натрия (8Ό8 ΡΑ^Ε)/вестерн-блот, пептидное картирование, углеводный электрофорез с применением фторофоров (ΡΑΟΕ) и биоанализ на цитопатическое действие (СРЕ). Верхнее пространство шприца наполнено азотом. Шприцы инкубируют при температурах 2-8, 25, 33 и 40°С в течение периода времени до 90 дней. Образцы анализируют в соответствии со способами, описанными в примере 1.

Результаты

Анализировали концентрации белков в наших образцах, соответствующих стандартам относительно концентрации исходного материала в течение периодов времени до 90 дней при различных температурах. Фиг. 2 показывает, что ВО9589-1 демонстрирует полную стабильность белка (отсутствие потери белка) после трех месяцев инкубирования при температуре от 2-8°С (средняя температура -4°С) до 25°С. При температуре хранения (33°С), приближающейся к температуре тела, разрушается около 18% белка. При температуре хранения (40°С), превышающей температуру тела, в конце 3-го месяца разрушается около 30% белка. По существу, идентичные результаты были получены относительно ВС9589-2 (не представлены). Фиг. 3 показывает результаты теста на двухмесячное хранение ВО9589-3. Распад белков является минимальным при температуре 425°С и быстрым при более высоких температурах. Результаты относительно ВС9589-4. по существу, идентичны результатам, представленным на фиг. 2 и 3. Эти данные подтверждаются восстанавливающим δΌδ-РАОЕ/вестернблотами.

На протяжении данного исследования в спеченных шприцах не наблюдается обнаруживаемых растворимых агрегатов. Также не наблюдается существенных изменений концентрации белка в анализе на цитопатическое действие (СРЕ), процентной величины окисленного АР6 и углеводных профилей. Отсутствуют также заметные изменения в образцах, подвергаемых восстанавливающему δΌδ-ΡΑΟΕ/вестернблоту и 1ЕЕ/вестерн-блоту. Наблюдается некоторое увеличение процентной величины деамидирования по сравнению с исходным временем. Однако общая масса промежуточного соединения, используемого для наполнения этих шприцев, имеет 37% деамидирования, что выше, чем величина 33,8% материала после набора в шприцы. Эта последняя низкая величина может объясняться вариабельностью анализа. На протяжении данного исследования в напы-ленных шприцах также не наблюдается обнаруживаемых растворимых агрегатов. Не наблюдается существенных изменений концентрации белка в анализе на цитопатическое действие (СРЕ), процентной величины деамидирования, процентной величины окисленного АР6 и углеводных профилей. Отсутствуют также заметные изменения в образцах, подвергаемых восстанавливающему δΌδ-РАОЕ/вестерн-блоту и

1ЕЕ/вестерн-блоту. Вкратце, таким образом, результаты показывают, что конечный продукт ВО9589-1 стабилен в течение периода до трех месяцев при температуре 2-8°С в шприцах со спеченным силиконом, и шести месяцев при температуре 2-8°С в шприцах с «напыленным силиконом».

Проводят антивирусный анализ на цитопатическое действие (СРЕ) соединений ВО9589-1 и ВО9589-2 (см. табл. 1) после асептического наполнения шприцев. Отмеченная величина активности как для В09589-1, так и для ВО9589-2, составляет 12,0 Μϋ/мл. Антивирусный анализ на цитопатическое действие (СРЕ) был повторен после хранения образцов в течение периода времени до трех месяцев при температуре 2-8°С. Отмеченная активность ВО9589-1 составляет 11,6 Μϋ/мл (п=8), при этом доверительный интервал 10,2-13,3Ми/мл составляет 95%.

Измеряли стабильность общей массы промежуточного материала ВО9589-1 при 2-8°С в течение 5 месяцев и -70°С в течение 6 месяцев. Образцы ВО9589-1 с пилотного исследования на диафильтрацию анализируют с применением способов примера 1. Полученные результаты показывают, что используемый в процессе материал ВО9589-1 сохраняет стабильность при температуре 2-8°С в течение 5 месяцев, а при 70°С - в течение 6 месяцев.

На протяжении данного исследования обнаруживаемых растворимых агрегатов не наблюдается. Не наблюдается также существенных изменений процентной величины деамидирования и углеводных профилей (различия процентной величины деамидирования укладываются в вариабельность анализа). Как показывает восстанавливающий δΌδ-РАОЕ/вестерн-блот и 1ЕЕ/вестерн-блот, отсутствуют также заметные изменения в образцах. Наблюдается небольшое снижение концентрации белка. Снижение концентрации белка после хранения при -70°С может объясняться тем, что образец проходит цикл замораживания/оттаивания. При этом снижение концентрации белка находится в пределах 15% от исходной концентрации.

Пример 8. Доклинические испытания.

Проводят испытания на местную переносимость одной внутримышечной (ΙΜ) дозы у кроликов, определяя местную токсичность интерферона, вводимого в нескольких новых составах. Реакции на месте инъекций после введения данного жидкого состава или лиофилизированных и восстановленных составов интерферона сравнимы с реакциями, наблюдаемыми после введения нормального физиологического раствора.

1. Испытание на раздражимость/биодоступность у кроликов после внутримышечного введения одной дозы четырех составов бета-интерферона.

Каждый из 20 самцов белых новозеландских кроликов получает по одной 30-мкг внутримышечной инъекции бета-интерферона 1А в виде одного из следующих пяти составов: ВО9589-1 (рН 5,0, ацетатный буфер, аргининовый стабилизатор, 0,5 мл/дозу); ВО589-2 (рН 5,0, ацетатный буфер, стабилизатор глицин/№1СТ 0,5 мл/дозу); ВО9589-3 (рН 7,2, фосфатный буфер, аргининовый стабилизатор,

0,5 мл/дозу); ВО9589-4 (рН 7,2, фосфатный бу29 фер, стабилизатор глицин/ЫаС1, 0,5 мл/дозу); и лиофилизированный состав бета-интерферона, имеющий рН 7,2 и содержащий 1,5% человеческого сывороточного альбумина, 1,0 мл/дозу (см. 1асоЬ§ е! а1., ниже).

Каждое из четырех животных получало лечение. Животные, получившие ВС9589-1 или лиофилизированный состав, также получили эквивалентную по объему инъекцию нормального физиологического раствора в контралатеральную точку в качестве отрицательного контроля. Через 72 ч после введения дозы берут образцы крови на анализ активности бетаинтерферона в сыворотке. Через 6, 12, 24, 48 и 72 ч после введения дозы проводят макроскопическое исследование кожи на эритему, образование шрамов и отек. Через 72 ч после взятия анализов крови животных умерщвляют, места инъекций исследуют макроскопически на наличие признаков повреждения тканей, а затем фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Образцы мышц (по три на место инъекции) исследуют под микроскопом на воспаление, некроз, кровоизлияние и поражения.

Результаты

При оценке по шкале индекса первичного раздражения (система классификации кожи Государственного бюро по охране окружающей среды США (ЕРА) ), ни один из вышеуказанных жидких составов не был определен выше, чем слабый раздражитель кожи. Макроскопическое исследование места инъекции ВС9589-4 у одного животного показало легкое раздражение (кровоизлияние), однако микроскопическое исследование не показало признаков кровоизлияния, поэтому макроскопическое наблюдение было признано артефактом. Вкратце, микроскопические исследования показывают, что реакции на месте введения жидкого состава испытуемого вещества постоянно оказывались минимальными или легкими и что ни одна из реакций не оказалась более тяжелой, чем реакции, вызванные введением лиофилизированного состава или нормального физиологического раствора.

Кроме того, раздражение кожи кроликов после повторного внутримышечного введения жидких составов может быть легко проверено в результате испытания нескольких групп кроликов, получающих внутримышечные инъекции жидких составов или нормального солевого раствора через день в течение восьми дней (в целом, пять доз). Дозы вводят в заранее намеченное место на спине каждого животного с целью максимального местного воздействия испытуемого состава. Макроскопическая оценка кожи проводится через 4-6 ч после каждого введения и через 24 ч после последнего введения в каждой испытуемой группе. Общие ежедневные наблюдения проводят во время каждого исследования кожи. Через 24 ч после макроскопического исследования животных умерщвляют, места инъекций исследуют на наличие признаков повреждения тканей и ткани фиксируют в 10% нейтральном забуференном формалине. Законсервированные ткани исследуют под микроскопом на воспаление, некроз, кровоизлияние и поражения. Образцы крови также берут непосредственно перед первоначальным введением испытуемого вещества и во время умерщвления на гематологичекий анализ и химический анализ сыворотки.

Пример 9. Клинические исследования.

Данные жидкие составы существенно отличаются от известных составов интерферона. При любом клиническом показании существует возможность изменения фармакокинетического и фармакодинамического поведения интерферона при введении людям. К сожалению, действие бета-интерферона в высшей степени видоспецифично, поэтому наиболее точную фармакологическую информацию получают в результате исследований клеток человека в культуре, на людях, и, в меньшей степени, на резусобезьянах. Предпочтительным способом исследования фармакологических изменений, если таковые имеются, является проведение биоэквивалентного испытания на человеке.

Противовирусный уровень бетаинтерферона в сыворотке может быть определен с помощью биоанализа на цитопатическое действие, как, например, описано в примере 1. Биоэквивалентное испытание может быть проведено с любым количеством жидких и лиофилизированных составов интерферона. В результате анализа параметров сыворотки, площади под кривой (АИС) и активности С_мах. рядовой специалист может определить, являются ли лиофилизированные и жидкие составы биоэквивалентными. Во всех, кроме одного, примерах протокола исследования ни биовалентность вкратце описывается двойное слепое, включающее одну дозу, перекрестное исследование, чтобы продемонстрировать биоэквивалентность жидкого состава в соответствии с данным изобретением и лиофилизированного продукта бета-интерферона на здоровых пациентах.

Схема

Во время двойного слепого, двухступенчатого перекрестного испытания каждый участник получает одинаковую дозировку (например, 60 мкг/12 Ми) составов бета-интерферона (табл. 4). Возраст пациентов составляет 18-45 лет включительно, а масса их тел и рост не отклоняются от нормы более, чем на 15%. Образцы крови на гематологический, химический, фармакодинамический профиль, а также на активность бета-интерферона в сыворотке берут непосредственно перед и в различное время после введения каждой дозы на протяжении 144 ч. Оценивают также боль при инъекции и реакции на месте инъекции.

Проведение исследования

В качестве профилактики против интерферон-ассоциируемого синдрома гриппа все участники получают ацетоминофен непосредственно перед и во время периода действия составов. Фармакокинетика

Определение бета-интерферона в сыворотке

Уровень сыворотки измеряют в виде единиц антивирусной активности с помощью анализа на цитопатическое действие. Антивирусный уровень сыворотки анализируют на площадь под кривой, С_макс. и Т_макс.. Величины площади под кривой определяют, начиная со времени введения дозы до последней обнаруживаемой величины (ЛИС_0-т) и на протяжении 144 ч после введения дозы (АИС_0-1₄₄). Стандартный описательный анализ данных по лечению проводят с применением 8А8 (версия 6.08, Институт 8А8, Сагу, Ыог1Ь СагоНиа).

Таблица 5. Режим доз иллюстративного исследования

Группа дозы	Способ введения	Доза (ми)	Период иследования: 1	Период исследования: 2
1	Внутримышечно	12	Лиофилизированный (60 мкг)	Жидкий (60 мкг)
2	Внутримышечно	12	Жидкий (60 мкг)	Лиофилизированный (60 мкг)

Фармакодинамика

Был описан биологический маркер неоптерин, продукт индуцированной интерфероном циклогидролазы СТР (аламинаминотрансфераза) фермента, отражающей активирование макрофага и Т-клетки (С. ИиЬег с1 а1., ЕЕхр.Меб., 1984; 160: 310-314, 8ер1етЬег 20, 1996; Ό. ЕисЬк е! а1., 1ттипо1. Тобау 9: 150-155, 1988). Как в неклинических, так и в клинических испытаниях человеческого бетаинтерферона, индукция неоптерина коррелирует с уровнем активности сыворотки после введения различных рекомбинантных видов лечения человека бета-интерфероном.

Неоптерин измеряют с помощью стандартных лабораторных процедур. Фармакодинамический профиль бета-интерферона описывают количественным способом, определяя три параметра неоптерина в сыворотке. Первый параметр, Е_Аис, представляет собой площадь под неоптерином против кривой времени, нормализованной до уровня базисной линии. Вторым параметром является Емах; этот параметр представляет собой разницу между наблюдаемым уровнем пика неоптерина и уровнем пика неоптерина. Третьим параметром является отношение индукции, ΙΒ; этот параметр определяют как уровень пика неоптерина, разделенный на уровень неоптерина базисной линии.

Статистика

Для определения эквивалентности площадь под кривой подвергают процедуре одностороннего теста ^бсохоп-Мапп-^Ы1пеу 2. Для определения относительной биодоступности интерферона из жидкого состава относительно лиофилизированного состава и его 90% доверительного интервала площадь под кривой после логарифмического преобразования подвергают анализу на вариантность (АЫОУА).

Из межпредметной вариации выделяют последовательности и рода. Из внутрипредметной вариации выделяют компоненты, возникшие в результате периодов и видов лечения.

Эквиваленты

Другие варианты осуществления и применения данного изобретения становятся очевидными специалистам в данной области в результате изучения спецификации и осуществления описываемого изобретения. Предполагается, что описание и примеры служат только для иллюстрации, при этом истинный объем и сущность данного изобретения представлены следующей формулой изобретения.

Claims (30)

1. Жидкая композиция, включающая интерферон и стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из кислых аминокислот, аргинина или глицина и аргинина НС1, причем стабилизирующий агент находится в количестве 0,3-5% (мас./об.), а жидкая композиция не является восстановленной из лиофилизированного интерферона и жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

2. Жидкая композиция по п.1, отличающаяся тем, что интерферон представляет собой бета-интерферон или интерферон, полученный рекомбинантным способом.

3. Жидкая композиция по п.1, имеющая рН около 4,0-7,2.

4. Жидкая композиция по п.3, имеющая рН 4,8-5,2.

5. Жидкая композиция по п.4, имеющая рН 5,0.

6. Жидкая композиция по п.4, отличающаяся тем, что кислая аминокислота представляет собой глутаминовую кислоту.

7. Жидкая композиция по п.1, в которой стабилизирующий агент представляет собой аргинин-НС1.

8. Жидкая композиция по п.1, отличающаяся тем, что интерферон имеет концентрацию 6-50 ΙΜϋ/мл.

9. Жидкая композиция, включающая 20 мМ ацетатный буфер при рН около 4,5-5,5, бетаинтерферон и стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из (а) около 2,6% (мас./об.) аргинина, (Ь) 100 мМ хлористого натрия и около 0,5% (мас./об.) глицина, (с) около 2,6% (мас./об.) аргинина и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека, (б) около 2,6% (мас./об.) аргинина и поверхностно-активного вещества, (е) 140 мМ хлористого натрия, (1) 140 мМ хлористого натрия и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека и (д) 140 мМ хлористого натрия и поверхностно-активного вещества, 11) около 3,2% (мас./об.) аргинина-НС1, ί) около 3,2% (мас./об.) аргинина и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека, .)) около 3,2% (мас./об.) аргинина-НС1 и поверхностно-активного вещества, причем жидкая композиция не является восстановленной из лиофилизованного β-интерферона и жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

10. Жидкая композиция по п.9, в которой поверхностно-активное вещество представляет собой 0,1% (мас./об.) Р1игошс Р-68.

11. Жидкая композиция по п.9, в которой стабилизирующий агент представляет собой аргинин-НС1 в количестве около 3,2% (мас./об.).

12. Жидкая композиция, имеющая рН 5,0, включающая бета-интерферон и Ьглутаминовую кислоту в количестве около 2,5% (мас./об.), причем жидкая композиция не является восстановленной из лиофилизированного бета-интерферона и жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

13. Жидкая композиция по п. 1, включающая глицин и дополнительно включающая соль.

14. Жидкая композиция по п. 12, дополнительно включающая ингредиенты, выбранные из группы, состоящей из 15 мг/мл человеческого сывороточного альбумина и 0,1% (мас./об.) Р1игошс Р-68.

15. Жидкая композиция, включающая 20 мМ фосфатный буфер при рН 7,2, бетаинтерферон и стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из (а) около 2,4% (мас./об.) аргинина и (Ь) 100 мМ хлористого натрия, соединенного с около 0,5% (мас./об.) глицина, причем жидкая композиция не является восстановленной из лиофилизированного бета-интерферона и жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

16. Жидкая фармацевтическая композиция, содержащаяся в емкости для хранения и пригодная для парентерального введения млекопитающим и включающая а) эффективное количество бета-интерферона, Ь) буфер, поддерживающий рН на уровне 4,0-6,0, и с) аминокислотный стабилизирующий агент, выбранный из группы, состоящей из кислых аминокислот, аргинина, аргинина-НС1 и глицина, причем стабилизирующий агент находится в количестве около 0,3-5% (мас./об.), и бета-интерферон не является восстановленным из лиофилизированного интерферона, и жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

17. Жидкая композиция по п.16, в которой бета-интерферон, по существу, сохраняет свою противовирусную активность во время хранения при температуре около 2-25°С в течение, по меньшей мере, двух месяцев.

18. Жидкая композиция по п. 16, в которой бета-интерферон не подвергают предварительной кавитации и хранят в емкости.

19. Жидкая композиция по п. 16, в которой буфер представляет собой буфер органической кислоты, выбранной из группы, состоящей из нитратного, сукцинатного, тартратного, фумаратного, глюконатного, оксалатного, лактатного и ацетатного буфера.

20. Жидкая композиция по п. 16, в которой рН жидкой композиции находится в интервале 4,5-5,5.

21. Жидкая композиция по п. 20, в которой рН жидкой композиции составляет 5,0.

22. Жидкая композиция по п. 16, являющаяся стерильной.

23. Жидкая композиция по п. 16, которая является изотоничной по отношению к крови.

24. Жидкая композиция по п. 16, в которой бета-интерферон представляет собой человеческий рекомбинантный бета-интерферон.

25. Жидкая композиция по п.24, в которой активность человеческого рекомбинантного бета-интерферона находится в интервале 6-50 ΙΜυ/мл белка.

26. Замороженная жидкая композиция, включающая интерферон и стабилизирующий агент в количестве 0,3-3,13% (мас./об.), представляющий собой аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из кислых аминокислот, аргинина и глицина, причем замороженная жидкая композиция не является восстановленной из лиофилизированного интерферона и замороженная жидкая композиция не подвергается дальнейшей лиофилизации.

27. Набор для парентерального введения жидкого состава интерферона, включающий а) емкость, содержащую жидкий состав, имеющий рН 4-6, жидкость, содержащую фармацевтически эффективное количество бета-интерферона, который не лиофилизирован, и аминокислотный стабилизирующий агент в количестве, по крайней мере, около 3,1% (мас./об.), и Ь) инструкцию для его применения.

28. Набор по п.27, дополнительно включающий с) спиртовой тампон, б) иглу и, по меньшей мере, одну наклеиваемую повязку.

29. Набор по п.27, в котором емкость представляет собой шприц, по меньшей мере, одна поверхность которого находится в контакте с жидким составом, при этом поверхность покрыта материалом, выбранным из группы, состоящей из силикона и политетрафторэтилена.

30. Набор по п.27, в котором емкость представляет собой шприц, а жидкий состав, содержащийся в шприце, не имеет кислородсодержащей/жидкой области контакта.