CZ300636B6 - Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický prípravek obsahující interferon-beta - Google Patents

Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický prípravek obsahující interferon-beta Download PDF

Info

Publication number
CZ300636B6
CZ300636B6 CZ0228299A CZ228299A CZ300636B6 CZ 300636 B6 CZ300636 B6 CZ 300636B6 CZ 0228299 A CZ0228299 A CZ 0228299A CZ 228299 A CZ228299 A CZ 228299A CZ 300636 B6 CZ300636 B6 CZ 300636B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
interferon
beta
liquid
liquid formulation
packaged kit
Prior art date
Application number
CZ0228299A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ228299A3 (cs
Inventor
D. Dibiasi@Mary
Staples@Mark
Chung@Wen-Li
Scharin@Eric
Original Assignee
Biogen, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=21875893&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ300636(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biogen, Inc. filed Critical Biogen, Inc.
Publication of CZ228299A3 publication Critical patent/CZ228299A3/cs
Publication of CZ300636B6 publication Critical patent/CZ300636B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/215—IFN-beta
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta. Souprava obsahuje injekcní stríkacku predem naplnenou kapalným prípravkem obsahujícím interferon-beta a stabilizující cinidlo v množství mezi 0,3 a 5 % (hmotn./obj.). Stabilizujícím cinidlem je aminokyselina vybraná ze skupiny obsahující kyselé aminokyseliny, arginin a glycin. Pokud je treba, pridá se sul pro dosažení dostatecné iontové síly. Kapalný prípravek nebyl predtím lyofilizován ani kavitován. Prípravek je výhodne obsažen v nádobce, která má alespon jeden povrch, který je v kontaktu s kapalinou, potažený materiálem inertním k adsorpci interferonu-beta. Dále se vynález týká zpusobu stabilizace kapalného interferonového prípravku.

Description

Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický přípravek obsahující interferon-beta
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká balené soupravy pro parenterální podávání interferonu-beta, stabilizovaných kapalných přípravků obsahujících interferon-beta a způsobů stabilizace lidského interferonu-beta.
Dosavadní stav techniky
Interferony jsou proteiny mající řadu biologických účinků, z nichž některé jsou antivirové, imunomodulační a antiproliferativní. Jsou to relativně malé, druhově specifické, jednořetězcové polypeptidy, které se vytvářejí v savčí buňce jako odpověď na expozici k mnohým induktorům jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny a další. Interferony ochraňují tkáně a buňky savce proti napadení virem a představují důležitý obranný mechanismus hostitele. Ve většině případů interferony poskytují lepší ochranu buňkám a tkáním, ze kterých pocházejí, než jiným typům buněk a tkání, což ukazuje na to, že interferony lidského původu by měly být mnohem účinnější při léčení lidských nemocí než interferony z jiných druhů.
Existuje několik rozdílných typů lidských interferonů, obecně klasifikovaných jako leukocytový (interferon—alfa), fibroblastový (interferon-beta) a imunitní (interferon-gama), a velký počet jejich variant. Obecnou diskusi o interferonech lze najít v mnohých učebnicích a monografiích jako např. „The Interferon System“ (W. E. Stewart, II, Springer-Verlag, N. Y. 1979) a „Interferon Therapy“ (World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva 1982), na které se tímto odkazujeme.
Způsob podávání interferonů je důležitým faktorem v klinické aplikaci tohoto důležitého terapeutického agens. Systémové podávání interferonů buďto intravenózní nebo intramuskulární či subkutánní injekcí bylo nej častěji užíváno do jisté míry s léčebným úspěchem u nemocí jako leukémie z vlasatých buněk (leukemická retikuloendotelióza), syndrom získané imunodeficience (AIDS) a související Kaposiho sarkom. Avšak je známo, že proteiny ve své purifi kované podobě jsou zvláště náchylné k degradaci. Pro interferon-beta je primárním mechanismem degradace v roztoku agregace a deamidace. Nedostatečná stabilita interferonů v roztoku i jeho dalších produktů výrazně omezuje možností využití.
Farmaceutické interferonové přípravky pro klinické použití obvykle obsahují interferon v lyofilizované (tj. mrazově dehydratované) podobě ve spojení se složitými organickými excipienty (pomocnými látkami) a stabilizátory, jako jsou např. neiontová povrchově aktivní činidla (tj. surfaktanty), různé cukry, organické polyoly a/nebo lidský sérový albumin. Nevýhodou lyofílizovaných preparátů je to, že vyžadují složité balení, neboť je třeba odděleně dodávat sterilní vodu pro injekce. Kromě toho lyofilizované preparáty vyžadují značnou manipulaci před vlastním použitím, což zvyšuje riziko nechtěného píchnutí se jehlou či upadnutí některé složky na zem, což je zejména problematické u té části pacientů, která jeví svalovou ochablost a špatnou koordinaci, jako jsou např. lidé s roztroušenou mozkomíšní sklerózou (MS). Pacienti s MS by si mohli sami podávat interferon, takže dostupnost takové lékové formy, která by se podávala mnohem snadněji než současné lyofilizované přípravky, je velmi potřebná, aby nebyla nutná rekonstituce, která je nezbytná, když se používá lyofllizovaný preparát.
Kapalné, nelyofílizované přípravky obsahující interferony mohou také obsahovat komplexní nosiče jako je lidský sérový albumin, polyoly, cukry a aniontová povrchově aktivní stabilizující činidla. Viz např. WO 89/10756 (Hara et al., obsahující polyol a p-hyd roxy benzoát).
- 1 CZ 300636 B6
Shrnutí vynálezu
Předkládaný vynález řeší výše uvedený problém tím, že zjistil, že lidský interferon-beta se může stabilizovat, když se umístí do pufrovaného roztoku s pH mezi 4 a 7,2, přičemž roztok obsahuje aminokyseliny jako stabilizující činidla a v některých případech také sůl (pokud aminokyselina neobsahuje nabitý postranní řetězec. Interferon-beta není lyofilizován, ale jakmile se jednou připraví způsobem odborníkovi známým, stane se přímo součástí přípravku podle předkládaného vynálezu.
Tudíž prvním aspektem předkládaného vynálezu je kapalný přípravek obsahující interferon a stabilizující činidlo v množství mezí 0,3 a 0,5 % (hmotn.), což je aminokyselina vybraná ze skupiny obsahující kyselé aminokyseliny, arginin a glycin. Kapalný přípravek se před tím nelyofilizoval. Avšak je výhodné, když kapalný přípravek je obsažen (uzavřen) v nádobce jako je např. injekční stříkačka, přičemž tato nádobka má povrch, který je v kontaktu s kapalným přípravkem, potažený materiálem, který je inertní k interferonu jako je např. silikon nebo polytetrafluoretylen. Výhodný přípravek obsahuje interferon-beta, nebo rekombinantně připravený interferon, v pufru, který má pH mezi 4,0 a 7,2. K dalším přípravkům podle předkládaného vynálezu patří:
1) 20mM acetátový pufr spH5,0, který nebyl předtím lyofilizován a který obsahuje interferon-beta a další složky vybrané za) 150mM arginin-HCl, b) lOOmM chlorid sodný a 70mM glycin, c) 150mM arginin-HCl a 15 mg/ml lidský sérový albumin, d) 150mM arginin-HCl a 0,1% Pluronic F-68, e) 140mM chlorid sodný, f) 140mM chlorid sodný a 15 mg/ml lidský sérový albumin, ag) 140mM chlorid sodný a 0,1% Pluronic F-68,
2) Kapalina s pH 5,0 obsahující interferon-beta, 170mM L-glutamovou kyselinu a 150mM hydroxid sodný, která nebyla předtím lyofilizována,
3) 20mM fosfátový pufr s pH 7,2, který nebyl předtím lyofilizován, a který obsahuje interferon-beta a složky vybrané za) 140mM arginin-HCl, b) 15 lOOmM chlorid sodný a 70mM glycin.
Dalším provedením předkládaného vynálezu je souprava pro parenterální podávání kapalného interferonového přípravku. Souprava obsahuje nádobku obsahující kapalný přípravek pH mezi 4 a 6, přičemž kapalina obsahuje farmaceuticky účinné množství interferonu-beta, který nebyl před tím lyofilizován, a aminokyselinové stabilizující činidlo v množství 5 % (hmot.) nebo méně, a návod k použití.
Dalším provedením předkládaného vynálezu je kapalný farmaceutický přípravek vhodný pro parenterální podávání savci, obsahující v podstatě účinné množství interferonu-beta, který nebyl před tím lyofilizován, v pufru udržujícím pH v rozmezí 4,0 až 6,0, a aminokyselinové stabilizující činidlo vc vhodné iontové síle. Přípravek je obsažen v zásobní nádobce jako jc např. injekční stříkačka. Výhodně zásobní nádobka postrádá rozhraní kapaliny a prostředí obsahujícího kyslík (tj. interferonový roztok není vystaven působení plynu obsahujícího kyslík v průběhu přípravy a skladování). Intcrfcron-beta si v podstatě uchovává antivirovou účinnost během skladování při teplotě mezi 2 a 25 °C po dobu nejméně 3 měsíců.
Způsob podle předkládaného vynálezu pro stabilizaci interferonu-beta v kapalném farmaceutickém přípravku, takže si v podstatě uchovává fyzickou stabilitu během skladování při teplotě mezi 2 a 25 °C po dobu alespoň 3 měsíců spočívá v tom, že se smíchá: a) účinné množství interferonubeta, b) pufr udržující hodnotu pH v rozmezí 4,0 až 7,2 při vhodné iontové síle, a c) aminokyselinové stabilizující Činidlo, přičemž kapalina nebyla předtím lyofilizována a nebyla vystavena plynu obsahujícímu kyslík v průběhu přípravy a skladování.
Kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu mají ve srovnání s lyofilizovanými přípravky mnoho výhod. K těmto výhodám patří: Ϊ) menší injekční objem nutný pro kapalný přípravek způ-2CZ 300636 B6 sobí menší nepohodlí než velký objem, II) náhrada komplexních excipientů jednoduchými aminokyselinami umožňuje lépe monitorovat kvalitu konečných produktů, III) balení je velmi zjednodušeno díky eliminaci potřeby oddělené zásoby vody pro injekci (WFI) a samostatnou stříkačku a viálku, IV) dávkovači přesnost se může zlepšit díky tomu, že se kapalina přenáší v méně krocích, a V) bezpečnost produktu je zlepšena, protože jednodušší podávání snižuje riziko popíchání jehlou a upuštění součástí při přípravě injekce.
Tudíž předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout biologicky účinný stabilní interferonový přípravek pro injekční použití.
Další předmět předkládaného vynálezu poskytuje přípravek, který nevyžaduje předchozí lyofilizaci léčiva obsahujícího interferon-beta.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je zabránit ztrátě účinnosti kapalného přípravku s interferonem-beta tím, že se a) zabrání kavitaci a/nebo vytvoření prostoru nad přípravkem v průběhu přípravy kapalného přípravku, nebo b) uskladní kapalný přípravek a prostorem nad přípravkem, který obsahuje inertní plyn jako je argon nebo dusík.
Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout kapalný přípravek, který umožňuje uskladnění po dlouhou dobu v kapalném stavu usnadňujícím skladování a přepravu před podáním.
Další předmět vynálezu poskytuje kapalný přípravek, který se snadno připravuje a podává, neboť se eliminuje krok jeho lyofilizace a rekonstituce.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití jednoduchých aminokyselin jako alternativních stabilizátorů vedle všeobecně užívaného sérového albuminu, což usnadňuje monitorování kvality produktu.
A ještě další předmět vynálezu poskytuje farmaceutický přípravek, který obsahuje nelyofilizova30 ný interferon-beta, a kterýje možné vyrábět s menšími náklady.
Další výhody předkládaného vynálezu jsou uvedeny v podrobném popisu vynálezu v následujícím textu nebo budou poznány při praktickém provádění vynálezu. Doprovodné obrázky, které jsou přiloženy, tvoří součást popisu vynálezu a společně s popisem slouží k vysvětlení principu vynálezu.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1. je graf ukazující procento monomerů interferonu-beta, které zůstane v kapalině volně vystavené jako funkce procenta v kapalině rozpuštěného kyslíku.
Obr. 2 je graf ukazující koncentraci proteinu v procentech normalizovanou vzhledem k výchozímu materiálu v závislosti na čase pro kapalný přípravek BG9589-1. Vzorky označené „4 °C“ (plné čtverečky) byly inkubovány při teplotě mezi 2 a 8 °C. Ostatní vzorky byly inkubovány při 25 °C (plné kroužky), 33 °C (plné trojúhelníky) a 40 °C (plné kosočtverce).
Obr. 3 je graf ukazující koncentraci proteinu v procentech normalizovanou vzhledem k výchozímu materiálu v závislosti na čase pro kapalný přípravek BG9589-3. Vzorky označené „4 °C“ (plné čtverečky) byly inkubovány při teplotě mezi 2 a 8 °C. Ostatní vzorky byly inkubovány při 25 °C (plné kroužky), 33 °C (plné trojúhelníky) a 40 °C (plné kosočtverce).
-3 CZ 300636 Bó
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález překonává problémy a spojené se současnými strategiemi a projekty ajednoduchý způsob stabilizace interferonu a interferonový přípravek se zvýšenou skladovací Vynález je založen zčásti na našich zjištěních, že:
a) interferon-beta je zvláště nestabilní a agreguje, pokud přijde do kontaktu s kyslíkem buďto aktivně probublávaným kapalinou, nebo při statickém kontaktu, když je kyslík v prostoru nad přípravkem (čelním prostoru) v nádobě,
b) kapalné přípravky s interferonem-beta postrádající nosič jako je lidský sérový albumin jsou zvláště náchylné k adsorpci (tj. buďto chemickou reakcí, nebo fyzikální vazbou) k povrchu skla,
c) ínterferon—beta agreguje při nízké iontové síle, pro stabilitu v kapalné fázi vyžaduje iontové prostředí.
Vynález se proto týká způsobu stabilizace lidského interferonu-beta, kterým se zabrání uvedeným nevýhodám, a výsledného kapalného přípravku stabilizovaného interferonu-beta.
A. Definice
Termín „pufr“ označuje roztoky slabých kyselin a solí obsahující anionty kyseliny, nebo roztoků slabých bází ajejich solí. Termín „aeetát“ konkrétně použitý v této souvislosti v tomto popisu (viz také tabulka 1) se týká pufrovacího systému výhodně obsahujícího aeetát sodný a kyselinu octovou a termín „fosfát“ se týká pufrovacího systému výhodně obsahujícího heptahydrát hydrogenfosforečnanu sodného a monohydrát díhydrogenfosoforečnanu sodného. Avšak roztoky v tabulce 11 obsahující aminokyseliny, ačkoliv konvenčně nejsou považovány za pufry ve smyslu, jak je tento termín v oboru užíván, v tomto popisu patří dle definice do pojmu pufr.
Termín „excipient“ se týká jakékoliv sloučeniny přidané v průběhu zpracování a/nebo skladování ke kapalnému přípravku za účelem změny celkových vlastností, zlepšení stability a/nebo upravení osmolality.
Termín „stabilizující činidlo“ se týká jakéhokoliv excipientů, který zlepšuje nebo nějak zvyšuje stabilitu.
Termín „stabilita“ má nutně funkční definici a znamená relativní časovou stálost antivirové účinnosti interferonu a/nebo stálost jeho struktury.
Termín „kavitovaný“ se týká jakéhokoliv interferonového přípravku, který v důsledku změn tlaku nebo třepání umožnil kontakt s bublinami obsahujícím kyslík (např. vzduch) přinejmenším po dobu přípravy nebo skladování. Termín kavítace také znamená, že rozhraní kyslík obsahující plyn/kapalina se vytvořilo v určitém bodě v průběhu přípravy, skladování nebo použití u kapalného interferonového přípravku. Termín „kavitovaný“ také znamená, že hladina rozpuštěného kyslíku v kapalném interferonovém přípravku přesahuje přibližně 10% hodnoty atmosférické rovnováhy při teplotě která je typická v průběhu přípravy a skladování.
Termín „parenterální“ zde zahrnuje způsoby podávání subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intrasternální, intraperitoneální, oftal mickou nebo intraspinální injekcí nebo in fúzemi.
Termín „farmaceuticky přijatelná sůl“ znamená jakoukoli v organickou nebo anorganickou adiční sůl, která je relativně netoxická a neškodná pro pacienta v odpovídajících účinných koncentracích, při kterých vedlejší účinky soli neruší prospěšné účinky interferonu.
-4CZ 300636 B6 „Účinné množství“ sloučeniny je takové množství, které poskytuje výsledek nebo překonává vliv určitých podmínek, které jsou léčeny. „Účinné množství“ také znamená množství, které vede k pozitivnímu výsledku (tj. vykazuje antivirový účinek) v testu CPE na antivirovou aktivitu.
Termín „farmaceuticky účinné množství“ se zde užívá k označení procentuální koncentrace ve farmakologii a lékařství známo, v léčení určitých nemocí.
„Isotonický s krví“ (nebo zkráceně jen „isotonický“) interferonu, o které je že je bezpečná a účinná znamená takový kapalný interferonový přípravek, který má dostatečnou koncentraci složek k tomu, aby jeho osmotícké chování bylo v podstatě identické s krví, tzn. že buňky při kontaktu s přípravkem si uchovají svůj tvar a nedochází u nich v podstatě k žádnému přenosu vody v důsledku rozdílů osmotického tlaku.
Termín „póly iontový“ (nebo také „po lye lektro lyt ový“) se užívá k označení látky s vysokou molekulovou hmotností, která je elektrolyt a, pokud se užije v přípravku podle předkládaného vynálezu, maximalizuje iontovou sílu pro danou osmolalitu. Tato definice je založena na našem zjištění, že interferon-beta je stabilizován vysokou iontovou sílou, ale přitom je celková iontová síla omezena nutným požadavkem, aby roztok byl isotonický s krví (viz příklad 7). Výhodný způsob, jak maximalizovat iontovou sílu při dané osmolalitě, je použít excipient póly iontového druhu.
Materiál, který je „inertní k interferonu“ znamená takový materiál, který má alespoň takové vlastnosti, že fyzikálně ani chemicky nereaguje s interferonem.
B, Příprava interferonů
Předkládaný vynález je všeobecně využitelný pro všechny typy interferonu včetně přirozeného interferonu, interferonu připraveného technologií rekombinantní DNA a interferonu připraveného chemickou syntézou nebo modifikací. Vynález lze využít s hrubým extraktem, interferonem semipurifikovaným nebo plně purifikovaným z fibroblastů, leukocytů, lymfocytů nebo jakékoliv tkáně produkující interferon člověka nebo jiného vhodného druhu. Nejvýhodnější je podle předkládaného vynálezu použití lidského interferonu z fibroblastů (tj. interferon-beta).
Nej výhodnější interferon-beta je rekombinantní forma. Metody rekombinantní DNA pro přípravu různých proteinů včetně interferonu jsou v oboru známé a žádným způsobem neomezují předkládaný vynález. Viz např. patenty US 4 399 216, US 5 149 636, US 5 179 017 (Axel et al.) a US 4 470 461 (Kaufman). Rekombinantní formy interferonu již byly připraveny, viz např. Evropský patent 0 41313 (Fiers, exprese interferonu-beta), patent US 4 966 843 (McMormick et al., exprese interferonu v buňkách CHO), patent US 5 326 859 (Sugano etal. (DNA kódující interferon-beta). Interferon-beta může být také modifikován, buďto rekombinantními technikami. nebo chemicky, a může se připravovat v médiu obsahujícím sérum nebo v médiu bez séra. K formám interferonu-beta patří varianty jako např. mutanta ochuzená o cystein (patenty US 4 588 585 a US 4 737 462, Mark et al.) a mutanta ochuzená o methionin (EP 260 350, Wang et al.). Primární aminokyselinová sekvence proteinu může být rozšířena der i vat izac í pomocí cukerných skupin (gly kosy lácí) nebo dalšími doplňujícími molekulami. Další modifikace se mohou uskutečnit prostřednictvím posttranslačního systému v hostitelské buňce. Jednotlivé aminokyselinové zbytky v řetězci mohou být dále modifikovány oxidací, redukcí nebo jinou derivatizací, a nebo protein může být štěpen, aby se získal aktivní fragment. Přesná chemická struktura konkrétní rekombinantní formy interferonu-beta bude proto záviset na mnoha faktorech a neomezuje nijak předmět předkládaného vynálezu. Všechny takové proteiny interferon-beta v přípravcích podle předkládaného vynálezu si uchovají svou biologickou účinnost, když budou ve vhodném prostředí.
Jednou z metod, jak připravit rekombinantní interferon-beta, je kultivovat ovariální buňky čínského křečka (CHO) transfekované genem lidského interferonu-beta. Rekombinantní interferon-5CZ 300636 B6 beta je vylučován buňkami CHO kultivovanými v dávkových suspenzních buněčných kulturách, které obsahují fetální hovězí sérum. Buňky se mohou kultivovat v rotačních kultivačních lahvích umístěných v inkubátoru s CO2 (5% CO2) a teplotou 35 °C. Obsah z několika takových lahví se pak může sloučit a přenést do fermentoru větší velikosti, pokud je třeba kultivace ve větším měřítku. Kultivace ve fermentoru pak probíhá asi šest dní a během této doby se aktivní produkt, tj. interferon-beta, akumuluje v kultivačním médiu. Kultura se pak může sklidit a buňky se odstraní z média, které obsahuje produkt, např. tangenciální průtokovou filtrací.
C. Purifikace interferonů
Purifikační postupy pro interferony jsou již dobře známy a pro odborníky dostupné. K těmto metodám patří jednokrokové nebo vícekrokové postupy zahrnující chromatografícké separační kroky, viz např. patenty US 5 015 730 (Friesen etal., afinitní ehromatografie a HPLC), US 4 541 952 (Hosoi et al., chelatační ehromatografie).
Jeden ze způsobů např. zahrnuje využití neobvykle hydrofobní a relativně bazické povahy molekul interferonu—beta společně s jeho silnou afinitou pro vazbu kovových iontů, viz např. publikace Knight a Fahey, Human Fibroblast Interferon, an Improved Purification, J. Biol. Chem., 256: 3 609-3 611, 1981 a Edy etal., Purification of Human Fibroblast Interferon by Zinc Chelate Chromatography, J. Biol. Chem., 232: 5 934-5 935, 1981, na které se tímto odkazujeme.
Stručně řečeno, kroky zachycení a purifikace zahrnují navázání interferonu-beta na sérii kolon s náplní sefarózy (Sepharose®, Pharmacia Biotech) a pak eluei se solemi a polyolem. Jakmile se jednou konečný eluát ze sefarózy naředí a sníží se pH, interferon-beta se naváže na SP sefarózu (SP Sepharose®, Pharmacia Biotech). Většina proteinů v navážce na kolonu je povahy více bazické než je monomerní interferon-beta a proto se váže těsněji v koloně než interferon. Na této koloně se také od interferonu-beta oddělí DNA a virové částice. Kolona se pak proplachuje sérií pufrů obsahujících chlorid sodný.
Interferonový produkt se naváže na kolonu schelatující sefarózou (Sepharose®, Pharmacia Biotech) předem „nabitou“ zinkem (viz výše uvedená citace Edy etal.). Tato kolona se provozuje v atmosféře bez kyslíku, stejně jako všechny následující kroky, aby se ochránily volné sulfhydrylové skupiny v molekule. Purífikovaný interferon se okyselí a uchovává se při nízkém pH, aby se inaktivovaly všechny zbylé viry. Po neutralizaci se interferon koncentruje průtokovou filtrací a pak se vymění pufr za neutrální pufrovací roztok. Proces výměny pufru redukuje koncentraci zinku a organických sloučenin. Poté se surový interferon uchovává při —70 °C, než se začne zpracovávat do přípravku.
D. Formulace interferonových přípravků
V ukázkovém příkladu purifikace popsaném výše a po první výměně pufru se zahájí stejný druhý krok výměny pufru, kromě toho, že se neutrální pufrovací roztok nahradí pufrovacím roztokem s pH 4 až 7,2, který obsahuje stabilizující činidlo, popsané podrobněji dále. Výsledný přípravek obsahující interferon se nazývá „ meziprodukt“ a lze ho zamražený uchovávat. Viz také příklad 7.
Pokud se uchovává ve zmrzlém stavu (v atmosféře inertního plynu jako je argon nebo dusík), nechá se roztát a pumpuje se přes 0,22pm filtr do tárovaných nádob, výhodně z nerezové ocelí, kde se „meziprodukt“ smíchá s předem filtrací sterilizovaným rozpouštědlem, dokud se nedosáhne požadované hmotnosti výsledného produktu. Rozpouštědlo je v podstatě stejný pufr, který byl použit ve druhém kroku výměny pufru. Výsledný kapalný produkt se pak sterilizuje filtrací za aseptických podmínek např. pomocí dvou 0,22pm filtrů v sérii, a rozdělí do těsně uzavřených nádobek, výhodně z nerezové oceli, které jsou opatřeny vstupem pro inertní plyn, kombinaci odvzdušňovacího ventilu a filtru a přítokovou ponornou trubičku. Konečný produkt se pumpuje ponornou trubičkou do uzavřené nádoby. Pomocí inertního plynu jako je dusík je konečný produkt tlakem přenesen do pumpovací hlavy zařízení schopného asepticky plnit sterilní stříkačky.
-6CZ 300636 B6
Pro aseptické plnění sterilních injekčních stříkaček je dostupných několik metod a konkrétní použitá metoda vynález nikterak neomezuje. Ve způsobu, který zde uvádíme jako příklad, se užívá plnička injekčních stříkaček HYPAK® (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems, Fanklin Lakes, NJ), kterou lze sterilizovat autoklávem. Stříkačky je možné autoklávovat se špičkami opatřenými čepičkami. Obecně takové zařízení obsahuje vakuovou komoru obsahující stříkačky, které mají být naplněny interferonovým přípravkem. Komora je umístěna v aseptickém prostředí. Každá stříkačka je umístěna v komoře vertikálně s otevřeným koncem, do kterého je vsunut plunžr, který je upraven tak, aby pasoval do otevřeného konce válce stříkačky. Plunžr je upraven tak, aby vytvořil ve válci stříkačky zátku, aby se kapalný přípravek zachytil uvnitř. Po naplnění/vložení je ve stříkačce ponechán malý prostor. Komora je pak evakuována a propláchnuta několikrát inertním plynem bez kyslíku (např. argonem, dusíkem) a jakmile se dosáhne konečného vakua, plunžry se mechanicky vsunou malý kousek do otevřených válců stříkaček a zátky se automaticky vloží do stříkaček. Komora je pak ventilována filtrovaným vzduchem, aby se tlak v komoře vyrovnal s vnějším atmosférickým tlakem. Míra vakua je určující pro objem volného prostoru ve stříkačce obsahujícího inertní plyn.
V konkrétním zařízení, které jsme použili, byly stříkačky umístěny vertikálně a upevněny v otvorech v rotujícím kotouči. Nejdříve se stříkačky dostanou pod jehlu, která se vsune do stříkačky. Jehla pak propláchne vnitřek stříkačky inertním plynem (např. argonem nebo dusíkem). Pak se jehla stáhne zpět ze stříkačky. Pak se stříkačka nastaví pod druhou jehlu, která se vsune do stříkačky, tato jehla je připojena k pumpě, která dávkuje produkt do stříkaček. Pak se druhájehla stáhne zpátky ze stříkačky. Pak se stříkačka nastaví pod třetí jehlu, která se vsune do stříkačky. Plunžr (předem autoklávovaný) je proudem vtlačen do stříkačky s inertním plynem (např. dusíkem nebo argonem), pak se jehla stáhne zpět ze stříkačky a plunžr zůstane umístěn tak, že ponechává ve stříkačce prostor inertního plynu mezi vrchem kapaliny a dnem plunžru.
1. Excipierit
Excipient je výhodně látka polyiontového druhu, aby se maximalizovala iontová síla při dané osmolalitě, jako je tomu např. v případě polyelektrolytu, který obsahuje heparin nebo jinou polymerní látku. Jak je diskutováno v příkladu 4, interferon-beta je stabilizován vysokou iontovou sílou, ale celková iontová sílaje omezena potřebou, aby roztok byl isotonický s krví. Výhodný způsob, jak maximalizovat iontovou sílu při dané osmolalitě, je proto použít polyiontovou látku. Roztoky interferonu-beta podle předkládaného vynálezu jsou isotonické s krví (přibližně 290 miliosmol/kg).
Nej výhodnějším stabilizujícím činidlem podle předkládaného vynálezu je aminokyselina, a sice některá z následujících: jakákoliv kyselá aminokyselina (např. kyselina glutamová, asparagová) nebo aminokyselina vybraná z argininu a glycinu. Nejvýhodnější aminokyselinové stabilizující činidlo je arginin, který jev roztocích s pH 5,0 ve své kyselé formě (arginin-HCl). Výhodná kyselá aminokyselina je kyselina L-glutamová. Aniž bychom se přísně drželi teorie, skutečnost, že polyiontové excipienty jsou výhodné, je důvod, proč arginin a lysin (se 3 nabitými skupinami) stabilizují interferon lépe než glycin (2 nabité skupiny), který zase stabilizuje lépe než kterákoliv z nenabitých sloučenin, které byly testovány.
Pokud je excipientem arginin-HCl, jeho koncentrace je v rozmezí od 0,5 % (hmotnost/objem) do 5 % a nejvýhodněji je 3,13 (což je ekvivalent 150mM arginin-HCl). Pokud je excipientem glycin, jeho koncentrace je v rozmezí od 0,5 % (hmotnost/objem) do 2 % a nej výhodnčj i je 0,52 % (což je ekvivalentní 66,7mM až 266,4mM a nejvýhodněji 70mM). Pokud je excipientem kyselina glutamová, jeho koncentrace je v rozmezí od lOOmM až 200mM a nejvýhodněji 170mM (což je ekvivalent 1,47 do 2,94 % a nejvýhodněji 2,5 %, všechna % hmotnost/objem).
Různé excipienty jako stabilizující činidla pro kapalný interferonový přípravek byly analyzovány pomocí pufrovacího systému obsahujícího 50mM octan sodný a ledovou kyselinu octovou spo-7CZ 300636 B6 léčně se lOOmM chloridem sodným o pH 5,0. Vzorky kapalného interferonového přípravku jsou testovány tepelným stresem tak, žc se inkubují ve 37 °C po dobu 1 až 3 týdnů nebo mechanickým stresem, kdy se umístí na 1 až 3 dny na rotátor. Takto „stresované“ vzorky se pak hodnotily na stabilitu Ínterferonu způsobem popsaným v příkladu 1. Jak je podrobněji popsáno v příkladu 7, přípravky obsahující pufr s hodnotou pH 5,0 s octanem sodným a aminokyselinovým excipientem (a případně ještě obsahující chlorid sodný) prokazovaly nej lepší stabilitu.
2. Interferon io Výhodný interferon je fibroblastový interferon-beta nej výhodnější je lidský rekombinantní interferon-beta produkovaný v savčích buňkách. Lidský rekombinantní interferon-beta může obsahovat volnou sulfhydrylovou skupinu a alespoň jednu disulfidovou vazbu. Zvláště výhodná molekula obsahuje jednu volnou sulfhydrylovou skupinu v poloze 17 a jednu disulfidovou vazbu mezi polohami 31 a 141 v každé molekule. Jak je to známo v případě přirozeného lidského
IFN-beta, N-glykosylace se očekává v místě Asn-80. Rozmezí koncentrace v kapalném přípravku podle předkládaného vynálezu je asi od 30 do 250 pg/ml. Výhodné rozmezí koncentrace je 48 až 78 pg/ml a nejvýhodnější koncentrace je 60 pg/ml. Ve smyslu Mezinárodních standardů byl stanoven vnitřní standard firmy Biogen vzhledem ke stanardu WHO pro interferon Natural Gb23-902-531, takže rozmezí koncentrací v IU (pro objem injekce 0,5 ml) je od 6 IMU do 50 IMU a nej výhodnější koncentrace je 12 IMU.
3. Pufr
Pufrovací roztoky organických kyselin nebo fosfátové pufry, které se mohou použít podle před25 kládaného vynálezu, pro udržení hodnoty pH v rozmezí od 4,0 do 7,2 a výhodně od 4,5 do 5,5, nejvýhodněji pH 5,0, mohou být obvyklé pufry organických kyselin ajejich solí jako jsou např. pufry citrátové (obsahující např. směs monosodné a disodné soli kyseliny citrónové, směs kyseliny citrónové a její trisodné soli, směs kyseliny citrónové a její monosodné soli apod.), pufry sukcinátové (např. směs kyseliny jantarové a její monosodné soli, směs kyseliny jantarové a hydro30 xidu sodného, směs kyseliny jantarové a její disodné soli apod.), pufry tartarátové (např. směs kyseliny vinné a její sodné solí, směs kyseliny vinné a její draselné soli, směs kyseliny vinné a hydroxidu sodného apod.), fumarátové pufry (např. směs kyseliny fumarové a její monosodné soli, směs kyseliny fumarové a její disodné soli, směs monosodné a disodné soli kyseliny fumarové apod.), glukonátové pufry (např. směs kyseliny glukonové a její sodné soli, směs kyseliny glukonové a hydroxidu sodného, směs kyseliny glukonové a její draselné soli apod.), oxalátové pufry (např. směs kyseliny šťavelové a její sodné soli, směs kyseliny šťavelové a hydroxidu sodného, směs kyseliny šťavelové a její draselné soli apod.), laktátové pufry (např. směs kyseliny mléčné a její sodné soli, směs kyseliny mléčné a hydroxidu sodného, smčs kyseliny mléčné a její draselné soli apod.), fosfátové pufry (hydrogenfosforečnan sodný/dihydrogenfosofroerčnan sodný) a acetátové pufry (např. směs kyseliny octové a její sodné soli, kyseliny octové a hydroxidu sodného apod.).
V následujících příkladech byly pro výběr nej vhodnějšího pufru použity pufry různých koncentrací a s různou hodnotou pH, a sice jednalo se o pufry obsahující fosforečnan sodný, citronan sodný, jantaran sodný, uhličitan sodný nebo octan sodný. Vzorky interferonu-beta byly umístěny buďto ve 37 °C na dobu 6 dnů až 2 týdnů, nebo byly umístěny v rotátoru po 7 až 9 hodin, aby se urychlil degradační proces. Pak byly stanoveny chemické vlastnosti vzorků. Vzorky byly analyzovány měřením optické hustoty, peptidovým mapováním, vylučovací HPLC, redukující a nered ukuj ící SDS-PAGE/westernový přenos a isoelektrickým fokusováním (IEF)/westernový přenos, jak je podrobněji popsáno v příkladu 1. Všechny pokusné vzorky interferonu-beta byly srovnávány s výchozím materiálem nebo se vzorky interferonu-beta, které byly uchovávány při 2 až 8 °C. Údaje ukazují, že pH je hlavním faktorem, který určuje stabilitu vzorků interferonu-beta, a že vzorky s pH mezi 4,0 a 5,0 byly stabilnější než vzorky s pH 7,0 nebo vyšším, viz příklad 2. Přesto jsme vyvinuli několik interferonových přípravků s fyziologickou hodnotou pH (pH 7,2), viz příklad 6.
-8CZ 300636 B6
4. Kavitace
Většina sulfhydrylových skupin v interferonu-beta je oxidována při vysokém pH (pH>8,0), tj. pH kdy se přestavují disulfidové vazby. Zjistili jsme určitou agregaci interferonu-beta v meziproduktu pomocí analýzy vylučovací chromatografií, neredukující SDS-PAGE a analýzou rozptylu laserového světla. Poté jsme zjistili, že vytváření agregátů interferonu-beta je závislé na množství rozpuštěného kyslíku. Vypracovali jsme následující kritéria pro postup, kterým je zajištěno, že kapalný přípravek interferonu-beta není kavitován: a) nemělo by být žádné rozhraní io plynu obsahujícího kyslík s kapalinou v průběhu přípravy a skladování, pokud je to možné, b) v průběhu přípravy a skladování by se neměly tvořit žádné bubliny, a c) hladina rozpuštěného kyslíku v přípravku by se měla udržovat pod 10% atmosférické rovnovážné koncentrace při teplotě přípravy a skladování (viz příklad 3).
5. Adsorpce interferonu na povrchy
Zjistili jsme také, že interferon se adsorbuje na určité povrchy a jeho skladování ve skleněných nádobách vyžaduje, aby alespoň jeden povrch nádoby, který je v kontaktu s interferonem, byl potažen materiálem, který zabrání nebo podstatně omezí adsorpci. Takový povrch může být chemicky nebo fyzikálně inertní k adsorpci. Příklady vhodných materiálů jsou odborníkovi známy a patří k nim např. nastřikovaný nebo vypalovaný silikon, polypropylen nebo polytetrafluoretylén (PTFE). Použili jsme výhodné kapalné přípravky s koncentrací 60 gg/ml (BG9589-1, 2, 3 a 4, přehledně uvedené v tab. 1) a naplnili jimi skleněné injekční stříkačky typu I o objemu 1 ml potažené nastříkaným silikonem (Becton Dickinson) a skleněné lahvičky typu I o objemu
0,75 ml. Vzorky pak byly analyzovány HPLC s reverzní fází (rpHPLC) a byla určena koncentrace proteinu. Údaje ukazují, že ve vzorcích naplněných do skleněných lahviček bylo méně proteinu v roztoku než ve stříkačkách potažených silikonem (viz příklad 5).
6. Výhodné přípravky
Byla provedena kinetická analýza stability proteinů u čtyř kapalných přípravků, které obsahovaly 60 mg/ml interferonu-beta, a jejichž výsledná koncentrace je uvedena v následující tabulce 1. Další alternativní přípravky, z nichž některé obsahují surfaktanty jako je Pluronic F-68 (od firmy BASF), jsou uvedeny v tabulce 2.
Tabulka 1: Výhodné přípravky
Systém pH Excipient Výsledné pH
20 mM acetát 150 mM arginin-HCl 5.0 ( ”BG9589-1)
20 mM acetát 70 mM glycin 100 mM chlorid sodný 5.0 (8G9589-2)
20 raM fosfát 140 mM arginin-HCl 7.2 (BG9539-3)
20 mM fosfát 70 mM- glycin 100 mM chlorid sodný 7.2 (BG9589-4)
Všechny složky uvedených přípravků odpovídají Lékopisu USA. 40
Konkrétní složení jednotlivých přípravků je následující:
-9CZ 300636 B6
BG9589-1
Složka (jako surovina)
Arginin-HCl (podle Lékopisu USA, USP) ledová kyselina octová, USP octan sodný, trihydrát, USP
Interferon-beta
Voda pro injekce, USP
BG9589-2
Složka (jako surovina)
Glyein (podle Lékopisu USA, USP) Ledová kyselina octová, USP Octan sodný, trihydrát, USP Interferon-beta la Voda pro injekce, USP Chlorid sodný
BG9589-3
Složka (jako surovina)
Arginin-HCl (podle Lékopisu USA, USP) Hydrogenfosforečnan sodný-7H2O Dihydrogenfosforečnan sodný-lH2O Interferon-beta la
Voda pro injekce, USP
BG9589—4
Složka (jako surovina)
Hydrogenfosforečnan sodný-7H2O Dihydrogenfosforečnan sodný-1 H2O Interferon-beta la
Glyein
Chlorid sodný
Voda pro injekce, USP
Množství
15,8 mg 0,167 mg 0,972 mg 30 pg 0,5 ml
Množství
2,62 mg 0,185 mg 0,932 mg 30 pg 0,5 ml 2,922 mg
Množství 14,725 mg 2,332 mg 0,359 mg 30 pg 0,5 ml
Množství
1,984 mg 0,359 mg 30 pg 2.628 mg 2.922 mg 0,5 ml
- 10 CZ 300636 B6
Tabulka 2: Alternativní přípravky
Systém pH Excipient Výsledné pH
20 mM acetát ISO mM arginin-HCl IS mg/ml lidský sérový albumin 5,0
20 mM acetát 150 mM arginin-HCl 0,1% Pluronic F-68 5,0
20 mM acetát 140 mM chlorid sodný 5,0
20 mM acetát 15 mg/ml lidský sérový albumin 140 mM chlorid sodný 5,0
20 mM acetát 0,1% Pluronic F-68 140 mM chlorid sodný 5,0
170 mM kyselina L-glutamová 150 mM hydroxid sodný 15 mg/ml lidský sérový albumin 5,0
170 mM kyselina L-glutamová 150 mM hydroxid sodný 0,1% Pluronic F-68 5,0
Součástí přípravků podle předkládaného vynálezu mohou být i jiné materiály. K nim patří konzervační látky (všechny údaje o výhodné koncentraci se týkají procent hmotnost/objem): fenol (0,2%), metylparaben (0,08%), propylparaben (0,008%), m-kresol (0,1%), chlorobutanol (0,25 %), benzylalkohol (0,1 %) a thimerosal (0,1 %). Na základě analýz pro stanovení agregace proteinů a deamidace (údaje zde nejsou uvedeny) bylo zjištěno, že nejvýhodnější konzervační látkou je chlorbutanol a benzylalkohol.
io 7. Soupravy pro parenterální podávání
K výhodným provedením předkládaného vynálezu patří také zabalené soupravy pro parenterální podávání kapalných přípravků podle vynálezu. Souprava může obsahovat injekční stříkačky naplněné kapalným přípravkem podle předkládaného vynálezu, několik tamponů napuštěných alkoholem, alespoň jednu injekční jehlu, jednu nebo několik náplastí a návod k použití. Kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu lze také úspěšně využít v obvyklých bezjehlových injekčních systémech.
E. Použití interferonů
Interferonové přípravky podle předkládaného vynálezu mají antivirovou účinnost (viz příklad 7). Pro klinické použití závisí množství interferonu použité v konkrétním případě, stejně jako frekvence, s jakou se podává, na mnoha faktorech jako na typu použitého interferonu, nemoci, která je léčena a pacientově reakci na léčení interferonem.
Výhodně se kapalné přípravky užívají pro léčení relapsující roztroušené sklerózy mozkomíšní (sclerosis multiplex). Lyofilizované (tj. rekonstituované) kapalné přípravky obsahující přirozený
-11 CZ 300636 B6 interferon-beta nebo rekombinantní interferon-beta byly podávány pacientům trpícím relapsující roztroušenou sklerózou mozkomíšní, viz Jacobs et al., Annals of Neurology 39: 285—294 (březen 1996) a Jacobs a Munschauer, „Treatment of multiple sclerosis with interferons“, v Treatment of multiple sclerosis: trial design, results and future perspectives, s. 223-250,
R.A. Rudnick et ak, (ed.), Springer London 1992. Použití kapalných přípravků podle vynálezu pro léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní probíhá podle stejných protokolů a bere do úvahy stejné primární proměnné jaké byly popsány ve výše citované publikaci Jacobse et al.
Jeden ze způsobů jak hodnotit užitečnost kapalných přípravků podle předkládaného vynálezu io provést toxikologickou studii a hodnotit podráždění tkánč, ke kterému dojde v důsledku podání kapalného přípravku. Provedli jsme toxikologickou studii přípravků podle předkládaného vynálezu na králících, viz příklad 8.
Následující příklady slouží k ilustraci některých provedení vynálezu a v žádném případě předmět vynálezu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Metody použité pro testy
Bylo použito několik dobře popsaných metod pro stanovení fyzikálně-chemických vlastností interferon-beta v kapalných přípravcích podle předkládaného vynálezu, tyto metody je možné využít i pro charakterizaci jiných interferonů. Přítomnost/nepřítomnost nerozpustných agregátů byla sledována měřením absorbance při 320 nm a transmitance při 580 nm. Koncentrace rozpustných proteinů byla stanoveny buďto měřením absorbance při 278 až 280 nm (s extinkčním koefl30 cientem 1,5). nebo kapalinovou chromatografiií (HPLC) s reverzní fází za použití známé koncentrace interferonu-beta, která byla přidána k přípravku jako standard. Před testem byly vzorky kapalných přípravků odstředěny. Procento rozpustných agregátů bylo stanoveno separací agregátů od monomerů interferonu-beta vylučovací chromatografií na koloně TSK-Gel® G2000SW (Toso Haas, Montgomeryville, PA). Vrchol byl monitorován při 280 nm a použit pro výpočet procenta rozpustných agregátů.
Stabilita peptidových koster byla potvrzena pomocí elektroforézy na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE). Interferon-beta byl redukován merkaptoethanolem v přítomnosti dodecyl sul fátu sodného předtím, než proběhla elektroforéza na 10 až
20% grád i ento vém gelu (MiniPlus Sepragel®, Integrated Separation Systems, Natick, MA). Proteiny pak byly elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu a detekovány imunochemickou metodou pomocí protilátek anti-interferon-beta a kozí anti-myší protilátky konjugované s křenovou peroxidázou. Viz např. publikace „Gel Electroghoresis of proteins, A Practical Approach. 2nd edition, B.D, Hames and D. Rickwood, IRL Press.
Změna povrchového náboje, způsobená deamidací a dalšími chemickými změnami, byla sledována pomocí isoelektríckého fokusování na polyakrylamidovém gelu (IEF 3-10 MiniPlus Sepragel®, Integrated Separation Systems), viz výše citovaná publikace „Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach“.
Oxidace methioninu, deamínace asparaginu a další možné chemické změny byly sledovány pomocí peptidového mapování. Interferon-beta byl naštěpen endoproteinázou Lys-C (Wako Pure Chemicals) v přítomnosti dithiotreítolu a vzniklé peptidové fragmenty byly separovány HPLC s reverzní fází. Obecné údaje viz Kalgahtgi, K„ a Horvath, C. „Rapid Peptide Mapping by
High Performance Liquid Chromatography“, J. Chromatography 443, 343-354, 1988.
- 12 CZ 300636 B6
Profil N-vázaných oligosacharidů byl stanoven pomocí elektroforézy sacharidů podporované fluoroforem (FACE®) firmy Glyko, Inc. (Novato, CA). Oligosacharidy navázané na asparagin (N-vázané oligosacharidy) byly uvolněny z glykoproteinů pomocí enzymu peptidové
N glykosylázy F, pak byly označeny fluoroforem na redukujícím konci metodou redukční aminace, pak separovány a nakonec kvantifikovány na polyakrylamidovém gelu.
Antivirová aktivita interferonu se stanovuje řadou metod jako např. těmi, které jsou podrobně popsány v publikaci W. E. Stewart II, „The Interferon Systém“, Springer-Verlag (2d Ed. 1981). io Zvláště užitečný test pro stanovení antivirové účinnosti interferonu je test inhibice cytopatického působení (CPE, Cytopathic Effeet Inhibition Assay). Výhodná metoda je popsána publikaci
WHO Technical Report Series No. 725, Annex 1, 1985), na kterou se tímto plně odkazujeme.
Stručně řečeno, metoda CPE začíná tím, že se připraví pracovní standardní roztok interferonu—beta, který byl předtím kalibrován proti referenčnímu standardu WHO. Tento roztok se připraví s koncentrací 10 000 jednotek (U) v médiu D-MEM+ obsahujícím 10% fetální bovinní sérum a 4 mM L-glutamin. V den testu se testované vzorky, standard a kontrolní vzorky naředí médiem D-MEM+ ve třech oddělených ředicích řadách: a) začínající od 32 U/ml a pokračující polovičním ředěním, b) začínající od I2U/mI a pokračující ředěním 1,5, a c) začínající od 6 U/ml a pokračující ředěním 1,2. Po 50 μΐ naředěného vzorku se pak nanese do sloupců na 96jamkové mikrodestičce, přičemž se jedna destička užije pro jedno ředění. Pak se do každé jamky přidá 50 μΙ buněk A549 (ATCC, katalogové ě. CCL-185, Rockville, MO) v ET-MEM+ v koncentraci 5x105 buněk/ml, což vede ke dvojnásobnému naředění jak buněk, tak interferonu-beta. Buňky s interferonem se pak inkubují ve 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu
15 až 20 hodin. Obsah destičky se vytřepe a do každé jamky se přidá 100 μΐ viru EMC (encefalomyokarditida) vhodně naředěného médiem. Buňky s virem se pak inkubují ve 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu 30 hodin. Obsah destičky se pak vytřepe a přidá se 0,75% barvivo krystalová violeť. Po 5 až 10 minutách se destičky opláchnou destilovanou vodou a nechají oschnout. Každá destička při tom obsahuje kontrolu buněčného růstu, kterou je jamka neobsahu30 jící ani interferon ani EMC, virovou kontrolu, kterou je jamka obsahující EMC a buňky, ale žádný interferon, a ředicí řadu interferonového standardu.
Destičky se vyhodnocují vizuálně, aby se určila poslední jamka v každém sloupci ještě s živými buňkami (>25 % konfluentní purpurové barvy). Detekční limit je určen jako nejnižší koncentrace standardu, která chrání před toxicitou viru. Ředění vzorků v poslední pozitivní jamce se násobí detekčním limitem, který byl určen pro standard, a faktorem ředění vzorků, a tím se získá hodnota koncentrace interferonu (MU/ml) , která je dostatečná k vyvolání antivirového účinku. Výsledky z každé destičky jsou převedeny na logaritmické hodnoty pro stanovení geometrického průměru a je vypočten 95% interval spolehlivosti.
Příklad 2
Výběr pufrovacího systému
Byly připraveny tři sady pufrů obsahující 9 až 10 různých složek v každé sadě. Sada I obsahovala sérii roztoků fosforečnanu sodného a lOOmM chloridu sodného s pH mezi 4,0 a 7,2. Sada II obsahovala další řadu pufrů obsahujících citronan sodný s pH mezi 4,0 a 7,0. Sada III obsahovala pufrovací roztoky obsahující jantaran sodný, octan sodný a uhličitan sodný, vždy v kombinaci se lOOmM chloridem sodným, s pH v rozmezí 4,0 až 7,2. Ve dvou dalších roztocích byl chlorid sodný nahrazen 50mM síranem sodným při pH 4,0 až 7,2.
Základní roztok interferonu-beta byl po roztátí přes noc dialyžován proti různým pufrům při 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak byl získaný roztok sterilizován filtrací. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbance při 278 nm (s extinkěpím koeficientem
-13CZ 300636 B6
1,5 mg“'ml cm“1) a všechny vzorky obsahovaly 140 pg/ml nebo 150 pg/ml interferonu-beta. Vzorky byly přefiltrovány, rozděleny na 4 sady do 2,2ml mikrozkumavek typu ependorf. Jedna sada byla umístěna do 2 až 8 °C, jedna sada byla umístěna do 37 °C na 6 dní až 2 týdny, jiná byla umístěna do rotátoru na 7 až 9 hodin a poslední sada byla užita jako kontrola v počátečním (nulovém) čase. Procentuální ztráty proteinu v důsledku vzniku nerozpustných agregátů byly vypočítány ze snížení koncentrace proteinu v průběhu různých zásahů dělené výchozí koncentrací.
Výsledky byly následující:
Procentuální ztráty proteinu v důsledku vzniku nerozpustných agregátů byly vypočítány ze snížení koncentrace proteinu v průběhu různých zásahů dělené výchozí koncentrací. Statická analýza všech získaných dat ukázala, že vzorky interferonu v pufrech s pH 4,0 až 5,0 měly menší procentuální ztrátu proteinů v důsledku agregace ve srovnání se vzorky s vyšším pH. Vzorky inter15 feronu inkubované při 37 °C a pH 4,0 až 5,0 ztratily asi 10 až 15 % v důsledku agregace. Při pH hodnotách vyšších než 6 rostly ztráty až na 40 až 50 %. Zjistili jsme také, že interferonové vzorky měly při pH vyšším než 6 více rozpustných agregátů. Avšak pomocí peptidového mapování jsme zjistili, že když se hodnota pH zvyšuje z 4,0 na 7,2, podstatně se lineárním způsobem zvyšuje množství interferonu, kteiý je deamidován, při pH 7,0 a vyšším více než
85 % interferonu bylo deamidováno v této studii. Měřili jsme také isoelektrický bod (pl) proteinových druhů ve vzorku (tj. pH při kterém protein nemigruje v elektrickém poli a celkový průměrný náboj proteinu je nulový) a lEF/westernový přenos ukázaly zvláštní pás pl vzorků v citrátovém pufru a změnily intenzitu pásů vzorků v sukcinátovém pufru. Fosfátový pufr nemá žádnou pufrovací kapacitu při pH 5,0. Pufr s octanem sodným a chloridem sodným s pH 5,0 nejevil žádné změny ve vzorci pásů ani v intenzitě pásů.
Příklad 3
Působení kavitace
Během experimentů, kdy se testovala vhodná hodnota pH, popsaných v příkladu 2, jsme zjistili, že prostor nad přípravkem ve skladovacích zkumavkách je kritický pro ztrátu proteinu u některých vzorků. Když byl vzorek o objemu 1,5 ml umístěn ve 2,2ml zkumavce, nebyly pozo35 rovány žádné ztráty proteinu. Naopak ve vzorku 1,2 ml výrazně vzrostla tvorba agregátů. To je v souladu s pozorováním, že tvorba agregátů interferonu-beta v průběhu kroku purifíkace, kdy se inaktivuje virus, závisí na hladině rozpuštěného kyslíku v průběhu tohoto kroku.
Ve stručnosti, krok inaktivace viru zahrnuje nastavení pH chelatujícícho sefarózového eluátu (viz sekce C) z hodnoty 7,85 ± 0,25 na hodnotu mezi 2,5 až 3,5 pomocí 15% kyseliny fosforečné, pak se okyselený eluát ponechá 120 až 135 minut a pak se znovu upraví pH na 6,7 ± 0,7 pomocí 0,5N hydroxidu sodného. Všechny uvedené kroky se provádějí ve 2 až 8 °C. Navrhli jsme provedení studie, která by stanovila, zde existuje vztah mezi vytvářením agregátů interferonu-beta v tomto kroku a množstvím rozpuštěného kyslíku.
Materiál a metody
Eluát zchelatující sefarózové kolony byl rozdělen na 50 ml nebo 100 ml alikvotní části a přenesen po lOOml rotačních lahví. Do každé lahve se přidal 1 ml argonem probublané
15% kyseliny fosforečné, láhev se pak jemně promíchávala 2 minuty a pak se držela bez míchání hodiny ve 2 až 8 °C. Po této době se přidalo 6,5 ml argonem probublaného hydroxidu sodného a vzorky byly testovány vylučovací ehromatografií v různých časových intervalech. Kyslík rozpuštěný v kapalině byl měřen kontinuálně kyslíkovou sondou (Orion, Model 860) a zaznamenán v okamžiku přidání báze. U vzorků s hladinou kyslíku stejnou nebo nižší než 10 % byly prostory nad kapalinou v reakčních nádobkách promyty argonem.
- 14CZ 300636 B6
Výsledky: Data uvedená na obr. 1 jasně ukazují vztah mezi množstvím rozpuštěného kyslíku přítomného v okamžiku přidání hydroxidu sodného a výtěžkem monomeru interferonu-beta v průběhu kroku inaktivace viru. Hodnoty výtěžku získané při koncentraci kyslíku nižší nebo shodné s 10% jsou významně odlišné od všech ostatních koncentrací kyslíku. Také jsme charakterizovali agregáty (data zde nejsou uvedena) a zjistili jsme, že jejich specifická aktivita je snížena 30 až 40x ve srovnání se základním meziproduktem. Také jsme zjistili, že více než 90 % agregátů je rezistentních k denaturaci pomocí SDS za neredukujících podmínek, což vede k domněnce, že se jedná o zesítění kovalentními vazbami. Za redukujících podmínek io (2% beta—merkaptoetanol) se agregáty rozpadají na monomery, což vede k domněnce, že se jedná o disulfidové vazby.
Příklad 4
Výběr excipientů
Série přípravků s interferonem-beta (60 pg/ml) obsahující různé excipienty byla připravena s výhodným pufrem o pH 5,0 obsahujícím 50mM octan sodný a lOOmM chlorid sodný. Excipi20 enty byly glyein, arginin-HCl, sacharóza, glycerin, PEG3350, glutathion a Pluronic F-68. Meziprodukt interferonu-beta byl dialyzován do 50mM oetanu sodného a lOOmM chloridu sodného s pH 5,0 přes noc pri 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak ještě před použitím filtrován. Koncentrace interferonu-beta byla stanovena měřením absorbanee pří 278 nm s odeětem pozadí. Všechny vzorky byly naředěny tak, aby výsledná koncentrace interferonu-beta byla při25 bližně 60 g/ml. Všechny vzorky byly přefiltrovány, 2 ml byly přeneseny do 4ml skleněné lahvičky (nesilíkonizované), prostor nad kapalinou byl propláchnut argonem a lahvičky byly uzavřeny. Sady vzorků pak byly umístěny do 2 až 8 °C a do 37 °C na dobu až 2 týdnů. Další vzorky byly podrobeny mechanickému stresu tím, že rotovaly po dobu 3 dnů.
Vzorky byly analyzovány postupy popsanými v příkladu 1. Kromě toho procento rozpuštěného kyslíku v přípravku bylo měřeno analyzátorem krevních plynů Ciba-Coming Model 248. „Experimentální“ hodnota je parciální tlak kyslíku (v mm Hg) vzorku, od kterého se odečte parciální tlak v „blanku“, který byl probublán dusíkem, a „kontrolní“ hodnota je parciální tlak kyslíku v „blankovém“ pufru uloženém pri teplotě místnosti, od které se odečte parciální tlak kyslíku dusíkem probublaném pufru. Procento rozpuštěného kyslíku („experimentální“/„kontrolní“) bylo vždy nižší než 30 %.
Výsledky: Analýzy IEF/westemový přenos a SDS-PAGE/westernový přenos vzorků inkubovaných při 37 °C po dva týdny ukázal posun pásů a snížení jejich intenzity současně přítomnost multimerů interferonu ve vzorcích, které obsahovaly PEG3350 a glutathion. Po dalším týdnu ve 37 °C vzorek, kde byl jako excipient glycerin, ukázal po analýze jeden zvláštní pás. Tam, kde byla použita sacharóza jako excipient došlo ke ztrátě intenzity pásů. Toto počáteční testování umožnilo dále podrobněji zvažovat použití argíninu-HCl, glycinu, chloiridu sodného a manitolu v dalších studiích.
Příklad 5
Adsorpce interferonu
Interferonový meziprodukt byl po roztátí dialyzován do BG9589-1, 2, 3 a 4 (viz tabulka 1) přes noc v 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak před použitím filtrován. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbanee při 280 nm (s extinkčním koeficientem 1,5 mg“1 ml cm'1). Všechny vzorky byly naředěny tak, aby výsledná koncentrace interferonu-beta byla přibližně 60 pg/ml. Naředěné vzorky byly přeneseny ve třech opakováních
- 15 CZ 300636 B6 buďto do 0,5ml silikonizovaných stříkaček dlouhých 1 cm (sklo typu I), kde byl prostor nad kapalinou propláchnut dusíkem, nebo do 0,75ml lahviček ze skla typu I, kde byl volný prostor nad kapalinou propláchnut argonem. Koncentrace proteinu se stanovily pomocí HPLC s reverzní fází (viz příklad 1).
Následující tabulka 3 uvádí přehled koncentrací proteinů, které byly stanoveny HPLC s reverzní fází. Údaje ukazují, že bylo méně proteinu ve vzorcích, které byly naplněny do skleněných lahviček ve srovnání se stříkačkami potaženými silikonem. Takže pro kapalné přípravky s interferonem -beta byly vybrány silikonizované stříkačky.
Tabulka 3
Skleněná (pg/ml) lahvička (S.D. ) Silikonizované stříkačka
(pg/ml) (S.D.)
8G9589-1 59.3 (2.6) 63.3 (2.5)
BG9589-2 58.3 (0.7) 61.7 (0.1)
BG9589-3 56.4 (0.4) 58.8 (1-1)
8G9589-4 55.5 (0.7) 59.3 (0.5)
Příklad 6
Přípravky s fyziologickou hodnotou pH
Iontová síla/fosfát. Počáteční studie byly provedeny v pufrovacím systému fosfátového pufru s chloridem sodným s hodnotou pH 7,2 a s proměnlivou koncentrací jednotlivých složek, takže byla použita koncentrace fosfátu 10, 50 a 75 mM a iontová síla (definovaná jako I = Zc,Zj2, kde Cj a Zj jsou molární koncentrace a náboj příslušného iontu i) byla 0,2, 0,4 a 0,6 upravována pomocí chloridu sodného. Bylo využito faktoriální schéma experimentu, kde proměnnými byly koncentrace fosfátu (10, 50 a 75 mM) a iontová síla (0,2, 0,4 a 0,6). Obsahy fosforečnanu a hydrogenfosoforečnanu sodného a chloridu sodného v pufru (aby bylo dosaženo požadované iontové síly) se počítaly pomocí upraveného tabulkového kalkulátoru, který publikovali Elis a Morrison: Buffers of Constant Ionic Strenght for Studyíng pH—dependent Processes, Methods Enzymol. 87: 405-426, 1982. Rovnice dovolovaly stanovit požadované množství každé složky pufru pro určité pH, koncentraci fosfátu a iontovou sílu. Každý z devíti roztoků použitých v tomto multifaktoríálním experimentu byl připraven výměnou pufru v interferonovém meziproduktu pomocí odsolovací kolony Pharmacia PD-10. Hodnota pH všech výsledných roztoků byla 7,20 ± 0,15. Koncentrace byly stanoveny z hodnot absorbance měřené pří 280 nm a pak byl interferon-beta naředěn příslušným pufrem na koncentraci 150 pg/ml. Výsledné roztoky byly sterilizovány filtrací přes 0,22 pm filtr v argonové atmosféře byly po 1,3 ml uzavřeny do 5ml skleněných lahviček, kde byl prostor nad roztokem naplněn argonem. Vzorky byly ve třech opakováních inkubovány při 37 °C po 6 dnů. Vzorky se analyzovaly a byly charakterizovány procentem transmitance při 580 nm, procentem výtěžku proteinu a pomocí IEF—PAGE/westemový přenos.
Výsledky: Analýza transmitance pro různé iontové síly ukázala trend zvyšování transmitance (tj. snižování množství nerozpustných proteinových agregátů) s rostoucí iontovou sílou. Procento výtěžku proteinu jevilo stejnou tendenci, ačkoliv IEF—PAGE/westernový přenos neukázaly žádný trend v deamidaci s měnící se iontovou sílou, takže všechny vzorky byly shodně deamidovány. Po uskladnění 6 dní ve 37 °C vzorky vykazovaly zmenšující se agregaci pro snižující se koncentraci fosfátu a zvyšující se iontovou sílu. Výsledky experimentu s procentuální transmitancí a pro- 16CZ 300636 B6 centem výtěžku v závislosti na měnící se koncentraci fosfátu (zde neuvedeny) ukazují slabý trend snižování % transmitabnce s rostoucí koncentrací fosfátu, ale analýza rozptylu neprokázala významný rozdíl v průměrných hodnotách vzorků s různými koncentracemi fosfátu. Procenta výtěžku jevily zlepšený výtěžek proteinu pro nižší koncentrace fosfátu (významný rozdíl pro 94% interval spolehlivosti). Analýzy IEF-PAGE/westemový přenos nejevily žádný zřetelný trend v deamidaci v závislosti na koncentraci fosfátu.
Poměr excipinet/sůl. Předběžné studie ukázaly (výsledky zde neuvedeny), že některé excipienty vyžadují sůl (např. chlorid sodný), aby se udržela vysoká iontová síla a bylo dosaženo stabilizujícího účinku při pH 7,2. Takže byl navržen multifaktoriální experiment kombinující excipienty (glyein, lysin, arginin, sacharóza a manitol) a frakce chloridu sodného přispívající k isotoničnosti roztoku (ťsll| = 0, 0,25, 0,75 a 1,0). Tato frakce se vypočítává podle vzorce fsůi = Osů]/ (Osúi + Oexcipient), kde Osu) a Oexcjpier], jsou osmolality vmOsm/kg chloridu sodného a excipientů v roztoku. Solná frakce umožňuje porovnávat účinek soli při různých excipientech. Všechny vzorky obsahovaly aditiva pro dosažení isotoničnosti, s proměnlivým poměrem excipient:sůl (definovaným pomocí fsůt).
Byly připraveny 10% (hmotnost/objem) zásobní roztoky každého excipientů ve 20mM fosfátovém pufru s pH 7,2, které byly odplyněny a probublány argonem. Byl také připraven roztoky 20mM chloridu sodného s 20mM fosfátem o pH 7,2, který byl odplyněn a probublán argonem. Výsledné roztoky byly testovány na koncentraci interferonu-beta měřením absorbance při 280 nm a pak naředěny fosfátovým pufrem a příslušným zásobním roztokem excipientů a soli tak, aby se získala koncentrace interferonu 60 pg/ml a požadovaný poměr soli a excipientů. Výsledné vzorky se sterilizovaly filrací (0,22 pm) a naplnily se do 1 ml silikonízovaných skleněných stříkaček (Becton Dickinson) typu I (naplnttelný objem 0,5 ml) s prostorem nad roztokem naplněným dusíkem. Vzorky byly uloženy při 40 °C.
V 6 dnech byly vzorky s argininem, glycinem a sacharózou analyzovány měřením absorbance při 320 a 280 nm, jak před, tak i po filtraci přes 0,22 pm filtr. Ve 2 týdnech byly podobně analyzovány vzorky obsahující arginin, lysin a manitol, které byly také podrobeny IEF-PAGE, redukující SDS-PAGE a neredukující SDS-PAGE. Kontrolní vzorky byly uloženy při teplotě 2 až 8 °C a obdobně analyzovány.
Výsledky: Výtěžek interferonu-beta la (vyjádřený jako procenta kontroly) rostl s rostoucí hodnotou fsů] pro sacharózu a manitol, maximální hodnoty dosáhl pro fsůi = 1 (130mM chlorid sodný). Pro arginin a lysin výtěžek klesal s rostoucí hodnotou fsů|. Maximálního výtěžku pro přípravky s glycinem při pH 7,2 bylo dosaženo při fsů] = 0,75.
Tento test excipientů s fosfátovým pufrem o pH 7,2 s různými excipienty jako glyein, lysin, arginin, manitol a sacharóza, doplněnými do izotonického roztoku, ukázal, že výtěžek byl nízký u všech excipientů bez náboje. Míra deamidace nebyla těmito aditivy ovlivněna. Tak např. redukující a neredukující SDS/PAGE ukázala, že došlo ke ztrátě neglykosylovaných druhů interferonu-beta ve všech typech přípravků a ke ztrátě těžších pásů monomerů v samotném isotonickém chloridu sodném a manitolu. Lze shrnout, že je zde silná korelace mezi iontovým charakterem excipientů a jeho schopností stabilizovat interferon-beta proti agregaci v těchto pufrovacích systémech při fyziologickém pH. Neiontová aditiva, jako je sacharóza nebo manitol, neposkytují, jak se zdá, žádnou ochranu, ve skutečnosti mohou i uspíšit ztrátu proteinu při fyziologickém pH. Chlorid sodný s jedním nábojem na rozpuštěnou částici, se chová lépe než manitol nebo sacharóza. Aminokyseliny obsahují dva náboje na molekulu při fyziologickém pH. V případě glycinu se zwitteriontová povaha této molekuly nezdá dostatečná k tomu, aby stabilizovala interferon-beta. Arginin a lysin obsahující po třech nábojích na molekulu stabilizují interferon-beta lépe než samotný chlorid sodný nebo přípravky obsahující glycin/chtorid sodný.
-17CZ 300636 B6
Příklad 7
Studie kinetiky a stability
Přípravky byly asepticky rozplneny v inertní atmosféře, stříkačky se inkubovaly v různých teplotách po různě dlouhou dobu a pak byl obsah stříkaček analyzován.
Interferonový meziprodukt byl po roztátí dialyzován do BG9589-1, 2, 3 a 4 přes noc v 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak před použitím filtrován. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbance při 280 nm (s extinkčním koeficientem 1,5 mg 1 ml cm '). Všechny vzorky byly naředěny tak, aby výsledná koncentrace interferonu-beta 1 a byla přibližně 60 gg/ml. čtyři interferonové přípravky podle tabulky 1 byly přefiltrovány a pak po 0,5 ml naplněny do dlouhých Iml stříkaček Becton Dickinson (BD), jejichž vnitřní povrch byl potažen nastříkaným nebo vypalovaným silikonem. Vzorky byly analyzovány měřením OD, vylučovací HPLC (SEC), elektroforézou s isoelektrickým fokusováním SDS-PAGE/westemový přenos, elektroforézou na redukujícím polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE)/westemovým přenosem, peptidovým mapováním, elektroforézou sacahridů podporovanou fluoroforem (FACE) a biotestem CPE. Plyn vyplňující prostor nad roztokem byl dusík. Stříkačky byly inkubovány ve 2 až 8 °C, 25, 33 a 40 °C po dobu až 90 dnů. Vzorky byly analyzovány postupy popsanými v příkladu 1.
Výsledky: Analyzovali jsme koncentrace v našich vzorcích, normalizované vzhledem k výchozímu materiálu po dobu 90 dnů při různých teplotách. Obrázek 2 ilustruje, že BG9589-1 vykazuje úplnou stabilitu proteinu (nedošlo k žádné ztrátě proteinu) po 3 měsících inkubace v teplotě od 2 až 8 °C (průměrně 4 °C) do 25 °C. Při teplotě skladování blížící se teplotě lidského těla (35 °C) bylo degradováno asi 18 % proteinu. Při teplotě skladování přesahující teplotu lidského těla (40 °C) bylo po 3 měsících degradováno asi 30 % proteinu. V podstatě shodné výsledky byly získány pro BG9598-2 (zde neuvedeny). Obrázek 3 ilustruje výsledky z testu, kdy se po 2 měsíce skladoval BG9589-3. Degradace proteinu byla minimální od 4 do 25 °C, ate při vyšších teplotách byla rychlá. Výsledky pro BG9589-4 jsou v podstatě shodné s výsledky uvedenými v tabulkách 2 a 3. Tyto údaje byly také potvrzeny pomocí SDS-PAGE/westernový přenos.
Ve „vypalovaných“ stříkačkách nebyly po dobu studie žádné detekovatelné rozpustné agregáty. Také nebyly pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů. Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDSPAGE)/westemovým přenosem ani lEF/westernovým přenosem. Došlo k určitému zvýšení procenta deamidace ve srovnání s výchozím bodem. Avšak výchozí materiál požitý k plnění stříkaček měl 37% deamidaci, což je více než 33,8 % které byly detekovány v materiálu po naplnění do stříkaček. To může být způsobeno variabilitou v testu. Ve stříkačkách s nástřikem silikonu nebyly po dobu studie také žádné detekovatelné rozpustné agregáty. Také nebyly pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů. Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDS-PAGE)/westernovým přenosem ani lEF/westernovým přenosem. Dosavadní výsledky lze stručně shrnout, že výsledný produkt BG9589 -1 je stabilní až 3 měsíce v 2 až 8 °C ve stříkačkách s „vypalovaným silikonem“ a až 6 měsíců ve 2 až 8 °C ve stříkačkách s „nastříkaným silikonem“.
Poté, co byly stříkačky asepticky naplněny, byl proveden antivirový test CPE s přípravky BG9589-1 a BG9589-2 (viz tabulka 1). Hodnoty koncentrace dostatečné k vyvolání antivirového účinku jak pro BG9589-1 tak i BG9589-2 byly 12,0 MU/ml. Antivirový test CPE se opakoval po uskladnění vzorků 3 měsíce v teplotě 2 až 8 °C. Zjištěná koncentrace dostatečná k vyvolání antivirového účinku pro BG9589-1 byla 11,6 MU/ml (n-8) s 95% intervalem spolehlivosti 10,2 až 13,3 MU/ml.
Měřili jsme také stabilitu hlavního meziproduktu BG9589-1 ve 2 až 8 °C po dobu 5 měsíců a v-70°C po dobu 6 měsíců. Vzorky BG9589-1 z pilotní diafiltrační studie byly analyzovány
- 18CZ 300636 B6 metodami popsanými v příkladu 1. Dosavadní výsledky ukázaly, že meziprodukt BG9589-1 je stabilní ve 2 až 8 °C po dobu 5 měsíců a v -70 °C po dobu 6 měsíců.
Po celou dobu této konkrétní studie nebyly detekovatelné žádné rozpustné agregáty. Také nebyly 5 pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů (rozdíly vdeamidaci spadají do šíře rozptylu testu). Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDS-PAGE)/westemovým přenosem ani lEF/westernovým přenosem. Došlo k mírnému snížení koncentrace proteinu. Ke snížení koncentrace proteinu u vzorků v -70 °C mohlo dojít v důsledku jednoho cyklu zamrazení/tání. Snížení koncentrace io proteinu však představuje nejvýše 15 % počáteční koncentrace.
Příklad 8
Preklinická studie
Byla provedena studie lokální snášenlivosti jediné intramusku lámí injekce na králících, která sloužila k hodnocení lokální toxicity interferonu podávaného v několika nových přípravcích. Reakce v místě injekce na podání kapalných přípravků podle předkládaného vynálezu nebo rekonstituovaných přípravků s lyofilizovaným interferonem byla srovnatelná s odpovědí na podání normálního fyziologického roztoku.
1. Studie Čtyř přípravků interferonu-beta sledováním podráždění a biologické dostupností po podání jedné 1M dávky králíkovi
Dvacet samců novozél and ských bílých králíků bylo intramusku láme (IM) injikováno 30 pg interferonu-beta la ve formě jednoho z pěti následujících přípravků: BG9589-1 (pH 5,0, acetátový pufr, arginin jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-2 (pH 5,0„ acetátový pufr, glycin/NaCI jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-3 (pH 5,0, fosfátový pufr, arginin jako stabili30 zátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-4 (pH 7,2, acetátový pufr, glycin/NaCl jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka) a lyofilizovaný přípravek interferonu-beta spH7,2 obsahující 1,5% HSA, 1,0 ml/dávka (viz výše citovaný Jacobs et al.).
Každé ošetření bylo aplikováno na 4 zvířata. Zvířata, která dostala BG9589-1 nebo lyofilizovaný přípravek, dostala také injekci stejného objemu fyziologického roztoku do kontralaterální poloviny těla jako negativní kontrolu. Mikroskopické dermální vyšetření na erytém, tvorbu jizev a edém bylo provedeno 6, 12, 24, 48 a 72 hodin po aplikaci dávky. Po odběru krve po 72 hodinách od aplikace dávky byla zvířata usmrcena a místa vpichu byla zhodnocena makroskopicky z hlediska poškození tkání a pak byla fixována 10% neutrálně pufrovaném formalínu. Vzorky svalové tkáně (tři na každé místo vpichu) byly mikroskopicky vyšetřeny na zánět, nekrózy, hemoragii a léze.
Výsledky: Když se použilo hodnocení podle škály indexu primárního podráždění (dermální klasifikační systém EPA), pak žádný z použitých přípravků nezpůsobil více než slabé podráždění kůže. Makroskopické vyšetření místa injekce přípravku BG9589—4 odhalilo u jednoho zvířete slabé podráždění (hemoragii), avšak mikroskopické vyšetření neukázalo žádné známky hemoragie a prokázalo, že se jednalo o artefakt. Stručně shrnuto, mikroskopická vyšetření ukázala, že reakce na podání testovaných kapalných přípravků v místě injekce byly konzistentně minimální až mírné a že žádná reakce nebyla silnější než reakce způsobená podáním lyofilizováného pří50 pravku nebo fyziologického roztoku.
Kromě toho podráždění kůže králíků po opakovaném IM podání kapalného přípravku se může snadno testovat pomocí několika skupin králíků, kteří budou dostávat intramuskulární injekce kapalného přípravku nebo fyziologického roztoku každý druhý den (celkem 5 dávek). Dávky se podávají do předem definovaného místa na hřbetě každého zvířete, aby se maximalizovala expo- 19CZ 300636 B6 zice k testované látce. Makroskopické dermální vyšetření se provádí 4 až 6 hodin po každém podání a 24 hodin po posledním podání v každé ošetřované skupině. Po 24 hodinách od podání poslední dávky po makroskopickém vyšetření se zvířata usmrtí a místa injekcí se podrobí vyšetření na přítomnost poškození tkání a tkáně se pak fixují v 10 % neutrálně pufrovaném formalínu. Fixovaná tkáň se pak vyšetřuje mikroskopicky na přítomnost zánětu, nekrózy, hemoragie a léze. Bezprostředně před prvním podáním testované látky a před usmrcením se odebírají vzorky krve pro hematolog!cké vyšetření a biochemické vyšetření séra.
Příklad 9
Klinická studie
Kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu se významně odlišují od dříve známých interferonových přípravků. Z hlediska klinické indikace zde existuje možnost, že se mění farmakokinetické a farmakodynamické chování interferonu po podání člověku. Naneštěstí jsou účinky interferonu-beta vysoce druhově specifické a většina pertinentních farmakologiekých informací pohází ze studií na kulturách lidských buněk, na lidech a v menší míře na opicích. Výhodným způsobem testu farmakologiekých změn je pokus lidské bioekvivalence.
Antivirovou hladinu interferonu-beta v séru je možné kvantifikovat pomocí biotestu cytopatického účinku (CPE), který byl popsán v příkladu 1. Studie lidské bioekvivalence může být provedena s jakýmkoliv počtem kapalných nebo lyofilizovaných interferon o vých přípravků. Analýzou séra, plochy pod křivkou (AUC) a Cmax je odborník schopen určit, zda jsou lyofilizované a kapalné přípravky bioekvivalentní. Jako jediný příklad studia bioekvivalence uvádíme zde stručně dvojnásobně slepou křížovou jednodávkovou studii, abychom demonstrovali bioekvivalenci kapalných přípravků podle předkládaného vynálezu s lyofilizovanými přípravky interferonu-beta na skupině zdravých dobrovolníků.
Návrh studie: Každý subjekt dostává stejnou dávku (např. 60 pg/12 MU) přípravku interferonu-beta ve dvojnásobně slepém pokuse křížově ve dvou okamžicích (viz tabulka 4). Subjekty jsou ve věku mezi 18 a 45 lety včetně a v 15% rozmezí normální tělní hmotnosti a výšky pro daný tělní typ. Bezprostředně před aplikací, a v různých časových intervalech po aplikaci každé dávky, až po 144 hodin po aplikaci se odebírají vzorky krve pro hematologické vyšetření, vyšetření biochemické, vyšetření aktivity interferonu-beta a vyšetření farmakodynamického profilu. Také se vyhodnocuje bolestivost při injekci a reakce v místě injekce.
Doprovodná opatření studie: každý subjekt dostává acetaminofen bezprostředně před a během období aplikace dávek jako profylaxi proti chřipkovému syndromu spojenému s interferonem.
Farmakokinetiká: Stanovení interferonu-beta v séru
Hladiny v séru se určují testem CPE jako jednotky interferonu dostatečné k vyvolání antivirového účinku. Antivirová hladina v séru se analyzuje na hodnoty AUC, Cmax a Tmax. Hodnoty AUC se vypočítávají z času od dávky po poslední detekovatelnou hladinu (AUC0 T) a pro 144 hodin po dávce (AUC0 144)· Standardní popisná analýza těchto experimentálních dat se provádí pomocí programového souboru SAS (verze 6.08, SAS Institute, Cary, North Carolina).
Tabulka 5: Schéma dávek v ukázkové studii
Skupina Způsob podání Dávka (MU) 1. termín podání 2.termín podání
1 IM 12 lyofilizovaný (60 meg) kapalný (60 meg)
2 IM 12 kapalný (60 megj lyofilizovaný (60 meg)
-20CZ 300636 B6
Farmakody nam i ka
Biologický markér neopterin, produkt interferonem indukovaného enzymu GTPcyklohydrolázy, který odráží aktivaci makrofágů a T-buněk (C. Huber et al., J. Exp. Med. 15, 1984, 160:
310-314; Septemter 20, 1996; D. Fuchs et al., Immunol. Today 9: 150-155; 1988) byl charakterizován, Jak v klinických, tak neklinických studiích rekombinantního lidského interferonu-beta koreluje indukce neopterinu s koncentrací interferonů v séru, která je dostatečná k vyvolání anti vírového účinku, po podání různých rekombinantních lidských interferonů.
ío Neopterin se měří standardním laboratorním postupem. Farmakodynamický profil interferonubeta se popíše kvantitativním způsobem výpočtem třech paramatrů neopterinu v krvi. První parametr, EAuc, je plocha pod křivkou závislosti neopterinu na čase normalizovaná k základní hladině. Druhý parametrje Emax, tento paramter je rozdílem mezi pozorovaným vrcholem neopterinu a základní hladinou neopterinu. Třetí parametrje indukční poměr, IR, tento parametr se počítá jako vrcholová hodnota hladiny neopterinu dělená základní hladinou neopterinu.
Statistika.
Pro stanovení ekvivalence na AUC bylo užito Wilcoxon-Mann-Whitneyova jednostranného a dvoustranného testu. Pro stanovení relativní biologické dostupnosti interferonů z kapalného přípravku relativně vzhledem k lyofilizovanému přípravku a 90% intervalu spolehlivosti byla provedena na AUC analýza rozptylu (ANOVA) po logaritmické transformaci. Pomocí rozptylu „mezi subjekty“ se oddělí vliv posloupnosti a pohlaví. Pomocí rozptylu „uvnitř subjektu“ se oddělí složky rozptylu způsobné obdobím a skupinou léčení.
Ekvivalenty
Odborníkovi jsou zřejmá další provedení vynálezu na základě popisu a příkladů provedení předkládaného vynálezu. Avšak jak popis tak příklady je třeba považovat za ukázková řešení předklá30 daného vynálezu, přičemž skutečný předmět a rozsah předkládaného vynálezu je vymezen následujícími nároky.

Claims (57)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta, vyznačující se tím, 40 že obsahuje injekční stříkačku předem naplněnou kapalným přípravkem obsahujícím interferonbeta a aminokyselinové stabilizující činidlo vybrané ze skupiny sestávající z kyselých aminokyselin, argininu a glycinu, přičemž koncentrace aminokyselinového stabilizujícího činidla je mezi 0,3 a 5 % (hmotn./obj.), přičemž kapalný přípravek nebyl rekonstituován z lyofilizovaného interferonů, kapalný přípravek není dále lyofilizován, kapalný přípravek neobsahuje sérový
    45 albumin a injekční stříkačka má přední prostor naplněný inertním plynem.
  2. 2. Balená souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že alespoň jeden povrch injekční stříkačky v kontaktu s kapalným přípravkem je potažený materiálem inertním k interferonu.
  3. 3. Balená souprava podle nároku 1, vyznačuj ící se t í m , že interferon-beta je rekombinantně připravený interferon.
  4. 4. Balená souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalný přípravek má 55 hodnotu pH mezi 4,0 a 7,2.
    -21 CZ 300636 B6
  5. 5. Balená souprava podle nároku 4, vyznačující se tím, že kapalný přípravek má hodnotu pH mezi 4,8 a 5,2.
  6. 6. Balená souprava podle nároku 5, vyznačující se tím, že kapalný přípravek má hodnotu pH 5,0.
  7. 7. Balená souprava podle nároku 5, vyznačující se tím, že kyselá aminokyselina je kyselina glutamová.
  8. 8. Balená souprava podle nároku 1,vyznačující se tím, že arginin je arginin-HCl.
  9. 9. Balená souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalný přípravek má koncentraci interferonu mezi 6 a 50 IMU/ml.
  10. 10. Balená souprava podle nároku 2, v y z n a č u j í c í se t í m , že alespoň jeden povrch injekční stříkačky je potažen materiálem vybraným ze skupiny sestávající ze silikonu a po lytetrafl uorety lénu.
  11. 11. Balená souprava podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m , že kapalný přípravek dále obsahuje pufr s pH 5,0 a že aminokyselinové stabilizační činidlo je 170mM kyselina L-glutamová.
  12. 12. Balená souprava podle nároku 1,vyznačující se tím, že kapalný přípravek dále obsahuje sůl a aminokyselinové stabilizační činidlo je glycin.
  13. 13. Balená souprava podle nároku 11,vyznačující se tím, že kapalný přípravek dále obsahuje 0,1% (hmotn./obj.) Pluronic F-68.
  14. 14. Balená souprava podle nároku 1, vy znač u j í c í se t í m , že kapalný přípravek dále obsahuje 20mM fosfátový pufr s pH 7,2 a aminokyselinové stabilizační činidlo je vybrané ze skupiny sestávající z:(a) 140mM argininu, (b) lOOmM chloridu sodného kombinovaného se 70mM glycinem.
  15. 15. Balená souprava podle nároku 14, vyznačující se tím, že alespoň jeden povrch injekční stříkačky, který je v kontaktu s kapalným přípravkem, je potažen materiálem vybraným ze skupiny sestávající ze silikonu a po lytetrafl uorety lénu.
  16. 16. Balená souprava podle nároku 1, vyznačující se tím, že kapalný přípravek dále obsahuje pufr udržující pH v rozmezí 4,0 až 6,0.
  17. 17. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že alespoň jeden povrch injekční stříkačky, který jc v kontaktu s kapalným přípravkem, je potažen materiálem inertním vůči interferonu.
  18. 18. Balená souprava podle nároku 17, vyznačující se tím, že injekční stříkačka postrádá rozhraní prostředí obsahující kyslík/kapalina.
  19. 19. Balená souprava podle nároku 17, vyznačující se tím, že kapalný přípravek nebyl vystaven předchozí kavitaci.
  20. 20. Balená souprava podle nároku 16, vy znač uj íc í se t í m , že pufr je organický pufr vybraný ze skupiny sestávající z následujících pufrů: citrátový, sukcinátový, tartarátový, fumarátový, glukonátový, oxalátový, laktátový a acetátový pufr.
    -22 CZ 300636 B6
  21. 21. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se t í m , že pH kapalného přípravku je v rozmezí 4,5 až 5,5.
  22. 22. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se tím,žepH kapalného přípravku 5 je 5,0.
  23. 23. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že kapalný přípravek je sterilní.
    ío
  24. 24. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se tím, že kapalný přípravek je isotonický s krví.
  25. 25. Balená souprava podle nároku 16, vyznačující se t í m , že interferon-beta je lidský rekombínantní interferon-beta.
  26. 26. Balená souprava podle nároku 25, vyznačující se tím, že koncentrace lidského rekombinantního interferonu-beta je v rozmezí od 6 do 50 I MU/ml.
  27. 27. Balená souprava podle nároku 1,vyznačující se tím, že koncentrace stabil i zuj í20 čího činidla je v rozmezí 0,3 až 3,13 % (hmotn./obj.), přičemž kapalný přípravek je zmrazený.
  28. 28. Kapalný farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje: (a) interferonbeta, (b) acetátový pufr, (c) arginin, přičemž přípravek má pH mezi 4,0 a 6,0 a přípravek neobsahuje sérový albumin.
  29. 29. Kapalný farmaceutický přípravek podle nároku 28, vy znaČ u j ící se tím, že argin je argin-HCl.
  30. 30. Kapalný farmaceutický přípravek podle nároku 28, vyznačující se tím, že kon30 centrace interferonu je mezi 6 a 50 IMU/ml,
  31. 31. Kapalný farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30, vyznačující se t í m , že koncentrace acetátového pufru je 20mM.
    35
  32. 32. Kapalný farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 28 až 31,vyznačuj ící se t í m , že koncentrace argininu nebo arginin-HCI je mezi 0,3 až 5 % (hmotn./obj.).
  33. 33. Kapalný farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32, vyznačující se t í m , že dále obsahuje surfaktant.
  34. 34. Kapalný farmaceutický přípravek podle nároku 33,vyznačuj ící se tím, že surfaktant je 0,1% (hmotn./obj.) Pluronic F-68.
  35. 35. Kapalný farmaceutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 28 až 34, vyznačující 45 se tí m , že má hladinu rozpuštěného kyslíku, kteráje nižší než 30% atmosférické rovnovážné hodnoty.
  36. 36. Kapalný farmaceutický přípravek podle nároku 35, vy zn ač u j í c í se t í m , že má hladinu rozpuštěného kyslíku, kteráje nižší nebo rovna 10 % atmosférické rovnovážné hodnoty.
  37. 37. Způsob přípravy balené soupravy pro parenterální podávání interferonu-beta, přičemž souprava obsahuje injekční stříkačku předem naplněnou kapalným přípravkem obsahujícím interferon-beta, pufr mající pH mezi 4,0 a 7,2, a aminokyselinové stabilizující činidlo vybrané ze skupiny sestávající z kyselých aminokyselin, argininu a glycinu, přičemž koncentrace amino55 kyselinového stabilizujícího činidla je mezi 0,3 a 5 % (hmotn./obj.), přičemž kapalný přípravek
    -23CZ 300636 B6 nebyl rekonstituován z lyofilizovaného interferonu, kapalný přípravek není dále lyofílizován, kapalný přípravek neobsahuje sérový albumin, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se smíchá interferon-beta, pufr a aminokyselinové stabilizující činidlo, čímž vytvoří kapalný přípravek, a přípravkem se naplní injekční stříkačka tak, že stříkačka má přední prostor naplněný inertním plynem.
  38. 38* Způsob podle nároku 37, v y z n a č u j í c í se t í m , že alespoň jeden povrch injekční stříkačky, který je v kontaktu s kapalným přípravkem, je potažen materiálem inertním vůči interferonu.
  39. 39. Způsob podle nároku 37, vyznačující kavitaci.
  40. 40. Způsob podle nároku 37, vyznačující připravený interferon.
  41. 41. Způsob podle nároku 37, v y z n a č u j í c í
  42. 42* Způsob podle nároku 41, v y z n a č u j í c í
  43. 43. Způsob podle nároku 37, v y z n a č u j í c í
  44. 44. Způsob podle nároku 37, vyznačující
    6a50IMU/ml.
    se t í m , že kapalný přípravek nebyl vystaven se t í m , že interferon-beta je rekombinantně se t í m , že pufr má pH mezi 4,8 až 5,2. se t í m , že pufr má pH 5,0. se t í m , že arginin je arginin-HCl.
    se t í m , že koncentrace interferonu je mezi
  45. 45. Způsob podle nároku 38, v y z n a č u j í c í se t í m , že alespoň jeden povrch injekční stříkačky je potažen materiálem vybraným ze skupiny sestávající ze silikonu a polytetrafluoretylénu.
  46. 46* Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že kapalný přípravek dále obsahuje 20mM fosfátový pufr s pH 7,2 a aminokyselinové stabilizační činidlo je vybrané ze skupiny sestávající z: (a) 140mM argininu, (b) lOOmM chloridu sodného kombinovaného se 70mM glycinem.
  47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že alespoň jeden povrch injekční stříkačky, který jev kontaktu s kapalným přípravkem, je potažen materiálem vybraným ze skupiny sestávající ze silikonu a polytetrafluoretylénu.
  48. 48. Způsob stabilizace interferonu v kapalném farmaceutickém přípravku, vyznačující se tí m , že zahrnuje krok smíchání (a) interferonu-beta, (b) acetátového pufru, (c)argininu, přičemž přípravek má pl 1 mezi 4,0 a 6,0, a kapalný přípravek nebyl rekonstituován z lyofilizovaného interferonu, kapalný přípravek není dále lyofílizován, a kapalný přípravek neobsahuje sérový albumin.
  49. 49. Způsob podle nároku 48, v y z n a č u j í c í se t í m , že arginin je arginin-HCl.
  50. 50. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že koncentrace interferonu je mezi 6 a 50 IMU/ml.
  51. 51. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 48 až 50, v y z n a č u j í c í se t í m , že koncentrace acetátového pufru je 20mM.
  52. 52. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 48 až 51,vyznačující se tím, že koncentrace argininu nebo arginin-HCl je v rozmezí 0,3 až 5 % (hmotn./obj.).
    -24CZ 300636 B6
  53. 53. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 48 až 52, vyznačující se tím, že dále obsahuje přimíchání surfaktantu.
  54. 54. Způsob podle nároku 53, v y z n a č u j í c í se t í m , že surfaktant je 0,1 % (hmotn./obj.) 5 Pluronic F-68.
  55. 55. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 48 až 54, v y z n a č u j í c í se t í m , že nezahrnuje přimíchání sérového albuminu.
    io
  56. 56. Způsob podle kteréhokoliv znároků 48 až 55, v y z n a č u j í c í se tím, že kapalný přípravek nebyl vystaven kavitaci.
  57. 57. Způsob podle kteréhokoliv znároků 48 až 55, vyznač uj ící se t í m , že neexistuje kapalné rozhraní obsahující kyslík mezi kapalným farmaceutickým přípravkem a injekční stří15 kačkou.
CZ0228299A 1996-12-24 1997-12-23 Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický prípravek obsahující interferon-beta CZ300636B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3435396P 1996-12-24 1996-12-24

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ228299A3 CZ228299A3 (cs) 1999-12-15
CZ300636B6 true CZ300636B6 (cs) 2009-07-08

Family

ID=21875893

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0228299A CZ300636B6 (cs) 1996-12-24 1997-12-23 Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický prípravek obsahující interferon-beta

Country Status (27)

Country Link
EP (1) EP0948358B2 (cs)
JP (5) JP4878664B2 (cs)
KR (2) KR101042660B1 (cs)
CN (2) CN1222315C (cs)
AT (1) ATE270899T1 (cs)
AU (1) AU738362B2 (cs)
BG (2) BG65171B1 (cs)
BR (1) BR9714434A (cs)
CA (1) CA2275890C (cs)
CZ (1) CZ300636B6 (cs)
DE (1) DE69729880T3 (cs)
DK (1) DK0948358T4 (cs)
EA (1) EA002754B1 (cs)
EE (2) EE04266B1 (cs)
ES (1) ES2224290T5 (cs)
HU (1) HU224222B1 (cs)
IL (1) IL130524A (cs)
IS (1) IS2070B (cs)
MX (1) MX337876B (cs)
NO (1) NO327844B1 (cs)
NZ (2) NZ336548A (cs)
PL (1) PL193447B1 (cs)
PT (1) PT948358E (cs)
SI (1) SI0948358T2 (cs)
SK (1) SK284989B6 (cs)
TR (1) TR199901968T2 (cs)
WO (1) WO1998028007A1 (cs)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ305994B6 (cs) * 2001-04-09 2016-06-08 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. HSA - prosté prostředky s obsahem interferonu-beta

Families Citing this family (70)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE270899T1 (de) * 1996-12-24 2004-07-15 Biogen Inc Stabile flüssige interferon-zubereitungen
US20030190307A1 (en) 1996-12-24 2003-10-09 Biogen, Inc. Stable liquid interferon formulations
CA2304808C (en) 1997-09-23 2011-03-22 Michael Tschope Liquid interferon-.beta. formulations
AU5103200A (en) * 1999-05-31 2000-12-18 Mitsubishi Chemical Corporation Freeze dried hgf preparations
UY27373A1 (es) * 2001-07-09 2003-02-28 Schering Ag Formulaciones de interferón beta-humano
ES2325653T3 (es) 2001-12-21 2009-09-11 Novo Nordisk Health Care Ag Composicion liquida de polipeptidos del factor vii.
WO2003061687A1 (en) * 2002-01-18 2003-07-31 Asahi Kasei Pharma Corporation High-concentration preparation of soluble thrombomodulin
KR20050013148A (ko) 2002-06-21 2005-02-02 노보 노르디스크 에이/에스 인자 ⅶ 폴리펩티드의 안정화된 고체 조성물
US7407955B2 (en) 2002-08-21 2008-08-05 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg 8-[3-amino-piperidin-1-yl]-xanthines, the preparation thereof and their use as pharmaceutical compositions
US7897734B2 (en) 2003-03-26 2011-03-01 Novo Nordisk Healthcare Ag Method for the production of proteins
TWI272948B (en) 2003-05-01 2007-02-11 Ares Trading Sa HSA-free stabilized interferon liquid formulations
AR044302A1 (es) * 2003-05-13 2005-09-07 Ares Trading Sa Formulaciones con proteinas liquidas estabilizadas en recipientes farmaceuticos
DE602004025100D1 (de) 2003-05-23 2010-03-04 Novo Nordisk Healthcare Ag Stabilisierung von proteinen in lösung
CN1318087C (zh) * 2003-06-06 2007-05-30 北京三诺佳邑生物技术有限责任公司 去白蛋白神经生长因子制剂
JP5653572B2 (ja) 2003-08-14 2015-01-14 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 第ｖｉｉ因子ポリペプチドの液状水性医薬組成物
EP1682012A4 (en) * 2003-11-13 2008-09-24 Alza Corp COMPOSITION AND APPARATUS FOR TRANSDERMAL DELIVERY
EP1532983A1 (en) * 2003-11-18 2005-05-25 ZLB Bioplasma AG Immunoglobulin preparations having increased stability
KR20130026498A (ko) 2003-12-19 2013-03-13 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드의 안정화된 조성물
EA012281B1 (ru) * 2004-06-01 2009-08-28 Арес Трейдинг С.А. Способ стабилизации белков
WO2006022301A1 (ja) * 2004-08-24 2006-03-02 Daiichi Asubio Pharma Co., Ltd. 生理活性ペプチド液状製剤
DE102004054054A1 (de) 2004-11-05 2006-05-11 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg Verfahren zur Herstellung chiraler 8-(3-Amino-piperidin-1-yl)-xanthine
ES2318575T3 (es) * 2004-11-10 2009-05-01 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Interferon beta desamidado.
CA2594894C (en) 2005-01-12 2015-11-03 Biogen Idec Ma Inc. Method for delivering interferon-.beta.
JP2008528509A (ja) * 2005-01-21 2008-07-31 アルザ コーポレイション 少なくとも１つの対イオンを含む、向上した安定性でマイクロニードルをコーティングするための治療用ペプチド製剤
JP5033798B2 (ja) 2005-07-02 2012-09-26 アレコー・リミテッド タンパク質を含む安定水系
DE102005035891A1 (de) 2005-07-30 2007-02-08 Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co. Kg 8-(3-Amino-piperidin-1-yl)-xanthine, deren Herstellung und deren Verwendung als Arzneimittel
PE20080251A1 (es) 2006-05-04 2008-04-25 Boehringer Ingelheim Int Usos de inhibidores de dpp iv
EP1852108A1 (en) 2006-05-04 2007-11-07 Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co.KG DPP IV inhibitor formulations
NZ573360A (en) 2006-05-04 2012-08-31 Boehringer Ingelheim Int Polymorphic forms of 1-[(4-methyl-quinazolin-2-yl)methyl]-3-methyl-7-(2-butyn-1-yl)-8-(3-(R)-amino-piperidin-1-yl)-xanthine
CA3123813A1 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Biogen Chesapeake Llc Improved glibenclamide formulations and methods for lyophilization thereof and lyophilates provided thereby
SI2234645T1 (sl) 2007-12-20 2012-07-31 Merck Serono Sa Formulacije peg interferon beta
PE20140960A1 (es) 2008-04-03 2014-08-15 Boehringer Ingelheim Int Formulaciones que comprenden un inhibidor de dpp4
JP2011519848A (ja) 2008-05-01 2011-07-14 アレコー リミテッド タンパク質製剤
EP2328607A1 (en) 2008-07-16 2011-06-08 Arecor Limited Stable formulation of a therapeutic protein
UY32030A (es) 2008-08-06 2010-03-26 Boehringer Ingelheim Int "tratamiento para diabetes en pacientes inapropiados para terapia con metformina"
KR20190016601A (ko) 2008-08-06 2019-02-18 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 메트포르민 요법이 부적합한 환자에서의 당뇨병 치료
WO2010029089A2 (en) 2008-09-10 2010-03-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for the treatment of diabetes and related conditions
DE102008051574A1 (de) 2008-10-14 2010-04-15 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur Herstellung von Interferon-beta und deren Varianten
US20200155558A1 (en) 2018-11-20 2020-05-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment for diabetes in patients with insufficient glycemic control despite therapy with an oral antidiabetic drug
CN102256976A (zh) 2008-12-23 2011-11-23 贝林格尔.英格海姆国际有限公司 有机化合物的盐形式
AR074990A1 (es) 2009-01-07 2011-03-02 Boehringer Ingelheim Int Tratamiento de diabetes en pacientes con un control glucemico inadecuado a pesar de la terapia con metformina
DE102009032179A1 (de) 2009-07-07 2011-01-13 Biogenerix Ag Verfahren zur Reinigung von Interferon beta
AU2010323068B2 (en) 2009-11-27 2015-09-03 Boehringer Ingelheim International Gmbh Treatment of genotyped diabetic patients with DPP-IV inhibitors such as linagliptin
ES2716088T3 (es) 2010-02-04 2019-06-10 Csl Behring Ag Preparado de inmunoglobulina
EP2361636A1 (en) 2010-02-26 2011-08-31 CSL Behring AG Immunoglobulin preparation and storage system for an immunoglobulin preparation
DE102010011430A1 (de) * 2010-03-15 2011-09-15 Kurt Koch Verfahren für den Bau des Nullenergiehauses in Schalenbauweise durch Ausschäumen aller Wände, Decken und Bedachung
JP6034781B2 (ja) 2010-05-05 2016-11-30 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 併用療法
AU2011268940B2 (en) 2010-06-24 2015-05-21 Boehringer Ingelheim International Gmbh Diabetes therapy
AR083878A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Boehringer Ingelheim Int Terapia antidiabetica vasoprotectora y cardioprotectora, linagliptina, metodo de tratamiento
KR20130132496A (ko) * 2010-12-09 2013-12-04 마루이시세이야쿠가부시키가이샤 아세트아미노펜의 안정화제
CA2846786C (en) 2011-03-15 2022-05-17 Biogen Idec Inc. Method for reducing flu-like symptoms associated with intramuscular administration of interferon using a fast titration escalating dosing regimen
EP3517539B1 (en) 2011-07-15 2022-12-14 Boehringer Ingelheim International GmbH Substituted dimeric quinazoline derivative, its preparation and its use in pharmaceutical compositions for the treatment of type i and ii diabetes
US9555001B2 (en) 2012-03-07 2017-01-31 Boehringer Ingelheim International Gmbh Pharmaceutical composition and uses thereof
CA2864740A1 (en) * 2012-04-19 2013-10-24 C.R. Bard, Inc. Infusates with enhanced ph stability under ethylene oxide sterilization
JP6218811B2 (ja) 2012-05-14 2017-10-25 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｓｉｒｓ及び／又は敗血症の治療に用いるｄｐｐ−４阻害薬としてのキサンチン誘導体
JP6224084B2 (ja) 2012-05-14 2017-11-01 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 糸球体上皮細胞関連障害及び／又はネフローゼ症候群の治療に用いるｄｐｐ−４阻害薬としてのキサンチン誘導体
WO2013174767A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh A xanthine derivative as dpp -4 inhibitor for use in modifying food intake and regulating food preference
ITMI20120913A1 (it) 2012-05-28 2013-11-29 Nicoletta Maxia Uso della n-acetil-5-metossitriptamina o suoi analoghi per favorire il meccanismo di impianto dell' embrione, e relative composizioni e mezzi di coltura
CN103143000B (zh) * 2013-03-07 2014-11-05 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种重组人干扰素α2b制剂
US9526728B2 (en) 2014-02-28 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Medical use of a DPP-4 inhibitor
JP2014208669A (ja) * 2014-06-17 2014-11-06 株式会社スリー・ディー・マトリックス タンパク質の凝集抑制剤
DK3763384T3 (da) 2014-12-03 2024-09-23 Csl Behring Ag Farmaceuitisk produkt med øget stabilitet, omfattende immunoglobuliner
EP4233840A3 (en) 2016-06-10 2023-10-18 Boehringer Ingelheim International GmbH Combinations of linagliptin and metformin
KR101943160B1 (ko) * 2016-10-06 2019-01-30 에이비온 주식회사 인터페론 베타 변이체의 안정화 제제
IL272773B2 (en) 2017-08-22 2024-06-01 Biogen Ma Inc Pharmaceutical compositions containing anti-beta amyloid antibodies
KR102731889B1 (ko) * 2019-07-18 2024-11-19 에이비온 주식회사 2당화된 인터페론-베타 단백질의 정제 방법
CN110714051B (zh) * 2019-11-20 2023-04-07 迈克生物股份有限公司 蛋白c活性测定试剂盒
MX2022013662A (es) * 2020-04-29 2023-02-01 Abion Inc Variante del interferon-beta humano con doble mutacion y metodo para mejorar la estabilidad de la variante del interferon-beta humano.
CN114177273B (zh) * 2021-11-29 2024-05-28 苏州人本药业有限公司 一种含有神经毒素的液体制剂及其制备方法
US20230210857A1 (en) * 2021-12-27 2023-07-06 Enalare Therapeutics Inc. Respiratory stimulant parenteral formulations

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496537A (en) * 1981-12-23 1985-01-29 Schering Corporation Biologically stable alpha-interferon formulations
EP0163111A2 (en) * 1984-04-28 1985-12-04 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for solubilization of interferon
EP0284249A1 (en) * 1987-03-13 1988-09-28 Interferon Sciences, Inc. Lyophilized lymphokine composition
WO1988009674A1 (en) * 1987-06-09 1988-12-15 Biogen, Inc. Stabilized formulations of gamma interferons
WO1995031213A1 (en) * 1994-05-16 1995-11-23 Applied Research Systems Ars Holding N.V. IFN-β LIQUID FORMULATIONS

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57175125A (en) * 1981-04-20 1982-10-28 Wakunaga Yakuhin Kk Preparation of beta-interferon
JPS63196268A (ja) * 1987-02-10 1988-08-15 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 無血清培地で継代増殖可能な形質転換細胞、その育種方法およびその細胞による蛋白質の生産方法
DE3729863A1 (de) * 1987-09-05 1989-03-16 Boehringer Mannheim Gmbh Stabilisierte erythropoietin-lyophilisate
JPH02124832A (ja) * 1988-07-08 1990-05-14 Toray Ind Inc インターヘェロンβ組成物
DE3939346A1 (de) * 1989-11-29 1991-06-06 Behringwerke Ag Arzneimitel zur subkutanen oder intramuskulaeren applikation enthaltend polypeptide
IL109350A (en) * 1993-05-12 2001-01-28 Genentech Inc Stable liquid compositions of gamma interferon
TW249202B (cs) * 1993-08-13 1995-06-11 Ciba Gerigy Corp
US5545723A (en) * 1994-03-15 1996-08-13 Biogen Inc. Muteins of IFN-β
EP0752880A4 (en) * 1994-04-08 2000-08-09 Brigham & Womens Hospital TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES BY ORAL TOLERATION AND / OR INTERFERON OF TYPE I
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
ATE270899T1 (de) * 1996-12-24 2004-07-15 Biogen Inc Stabile flüssige interferon-zubereitungen

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4496537A (en) * 1981-12-23 1985-01-29 Schering Corporation Biologically stable alpha-interferon formulations
EP0163111A2 (en) * 1984-04-28 1985-12-04 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for solubilization of interferon
EP0284249A1 (en) * 1987-03-13 1988-09-28 Interferon Sciences, Inc. Lyophilized lymphokine composition
WO1988009674A1 (en) * 1987-06-09 1988-12-15 Biogen, Inc. Stabilized formulations of gamma interferons
WO1995031213A1 (en) * 1994-05-16 1995-11-23 Applied Research Systems Ars Holding N.V. IFN-β LIQUID FORMULATIONS

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CZ305994B6 (cs) * 2001-04-09 2016-06-08 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. HSA - prosté prostředky s obsahem interferonu-beta

Also Published As

Publication number Publication date
IL130524A (en) 2005-08-31
JP2012006979A (ja) 2012-01-12
KR101042660B1 (ko) 2011-06-20
DK0948358T4 (da) 2012-03-19
EP0948358B1 (en) 2004-07-14
DE69729880D1 (de) 2004-08-19
PL334365A1 (en) 2000-02-28
SK284989B6 (sk) 2006-04-06
PL193447B1 (pl) 2007-02-28
BG103594A (en) 2000-04-28
BG65171B1 (bg) 2007-05-31
WO1998028007A1 (en) 1998-07-02
CN1222315C (zh) 2005-10-12
DE69729880T3 (de) 2012-05-10
PT948358E (pt) 2004-10-29
JP5851695B2 (ja) 2016-02-03
SI0948358T2 (sl) 2012-03-30
SI0948358T1 (en) 2005-04-30
CA2275890A1 (en) 1998-07-02
HK1025040A1 (en) 2000-11-03
MX337876B (es) 2016-03-22
EP0948358A1 (en) 1999-10-13
HU224222B1 (hu) 2005-06-28
SK85899A3 (en) 2000-01-18
JP4878664B2 (ja) 2012-02-15
KR20070052363A (ko) 2007-05-21
BG109523A (en) 2007-05-31
EA199900597A1 (ru) 2000-02-28
EE04266B1 (et) 2004-04-15
KR20000069664A (ko) 2000-11-25
TR199901968T2 (xx) 1999-12-21
CN1733296B (zh) 2010-05-26
DE69729880T2 (de) 2005-07-07
EE04223B1 (et) 2004-02-16
JP2011068694A (ja) 2011-04-07
CN1245434A (zh) 2000-02-23
BG65418B1 (bg) 2008-07-31
AU5619198A (en) 1998-07-17
NO993121L (no) 1999-08-24
JP2001519770A (ja) 2001-10-23
NZ512792A (en) 2002-11-26
BR9714434A (pt) 2000-05-02
NO993121D0 (no) 1999-06-23
ES2224290T3 (es) 2005-03-01
NO327844B1 (no) 2009-10-05
EE200300127A (et) 2003-06-16
CN1733296A (zh) 2006-02-15
EA002754B1 (ru) 2002-08-29
ATE270899T1 (de) 2004-07-15
HUP0000829A2 (en) 2000-07-28
IS2070B (is) 2005-12-15
NZ336548A (en) 2001-09-28
EP0948358B2 (en) 2011-11-23
CZ228299A3 (cs) 1999-12-15
HUP0000829A3 (en) 2002-01-28
AU738362B2 (en) 2001-09-13
EE9900313A (et) 2000-04-17
JP2014098029A (ja) 2014-05-29
IL130524A0 (en) 2000-06-01
CA2275890C (en) 2011-11-01
JP2007204501A (ja) 2007-08-16
HK1092048A1 (zh) 2007-02-02
IS5087A (is) 1999-06-21
ES2224290T5 (es) 2012-03-12
DK0948358T3 (da) 2004-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ300636B6 (cs) Balená souprava pro parenterální podávání interferonu-beta a kapalný farmaceutický prípravek obsahující interferon-beta
US9522174B2 (en) Stable liquid interferon beta formulations
US7731948B2 (en) Stabilized interferon liquid formulations
HK1025040B (en) Stable liquid interferon formulations
MXPA99005977A (en) Stable liquid interferon formulations
HK1092048B (en) Stable liquid interferon formulations

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20171223