ES2325653T3

ES2325653T3 - Composicion liquida de polipeptidos del factor vii.

Info

Publication number: ES2325653T3
Application number: ES02787470T
Authority: ES
Inventors: Birthe Lykkegaard Hansen; Michael Bech Jensen; Troels Kornfelt
Original assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Current assignee: Novo Nordisk Health Care AG
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2009-09-11
Anticipated expiration: 2022-12-20
Also published as: WO2003055512A1; RU2357751C2; HUP0402315A2; CN1607958A; PL370652A1; HUP0402315A3; BR0215216A; EP1458408B1; US20040037893A1; CA2470511C; US8461116B2; JP2005530683A; IL162239A0; US20120004176A1; CA2470511A1; AU2002351756A1; RU2004122398A; DE60232017D1; ATE428439T1; US8022031B2

Abstract

Composición líquida, acuosa que comprende (i) Un polipéptido del Factor VII (ii) Un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0; (iii) Un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas, donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM; y (vii) Un antioxidante.

Description

Composición líquida de polipéptidos del Factor VII.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones líquidas acuosas que contienen polipéptidos del factor VII, y a métodos para la realización y uso de composiciones de este tipo. Más particularmente, esta invención se refiere a composiciones líquidas estabilizadas contra la degradación química y/o física.

Antecedentes de la invención

Una variedad de factores implicados en el proceso de coagulación de la sangre ha sido identificada, incluyendo el factor VII (FVII), una glicoproteína plasmática. La hemostasis es iniciada por la formación de un complejo entre el factor tisular (TF) que se expone a la sangre circulante después de una herida en la pared del vaso, y el FVIIa está presente en la circulación en una cantidad correspondiente a aproximadamente el 1% de la masa proteica del FVII total. El FVII existe en el plasma principalmente como un zimógeno monocatenario, que es dividido por FXa en su forma activada bicatenaria, FVIIa. El factor recombinante VIIa activado (rFVIIa) ha sido desarrollado como un agente prohemostático. La administración de rFVIIa ofrece una respuesta prohemostática rápida y altamente eficaz en sujetos hemofílicos con hemorragias que no pueden ser tratados con otros productos de factor de coagulación debido a la formación de anticuerpos. También el sangrado en sujetos con deficiencia del factor VII o sujetos que tengan un sistema de coagulación normal pero que experimenten un sangrado excesivo puede ser tratado exitosamente con FVIIa.

Es deseable tener formas de administración del factor VIIa adecuadas tanto para el almacenamiento como la administración. Idealmente, el medicamento es almacenado y administrado como un líquido. De forma alternativa, el producto es liofilizado, es decir, criosecado, y después reconstruido añadiendo un diluyente adecuado justo antes del uso por el paciente. Idealmente, el medicamento tiene estabilidad suficiente para tenerlo almacenado durante un plazo largo, es decir, más de seis meses.

La decisión de o bien mantener el medicamento final como un líquido o criosecarlo se basa normalmente en la estabilidad del medicamento proteico en aquellas formas. La estabilidad de la proteína puede ser afectada inter alia por factores tales como fuerza iónica, pH, temperatura, ciclos repetidos de congelación/descongelación, y exposiciones a fuerzas de cizallamiento. La proteína activa puede perderse como resultado de inestabilidades físicas, incluyendo la desnaturalización y agregación (formación de agregado tanto soluble como insoluble), al igual que inestabilidades químicas, incluyendo, por ejemplo, hidrólisis, desamidación y oxidación, por nombrar solamente unos pocos. Para un examen general sobre la estabilidad de fármacos proteicos, véase, por ejemplo, Manning, et al., Pharmaceutical Research 6:903-918 (1989).

Mientras la incidencia posible de inestabilidades proteicas es muy apreciada, es imposible predecir los problemas de inestabilidad particulares de una proteína particular. Cualquiera de estas inestabilidades puede causar la formación de un subproducto proteico, o derivado, que tenga una menor actividad, mayor toxicidad, y/o mayor inmunogenicidad. De hecho, la precipitación de proteínas puede producir trombosis, no homogeneidad en la forma y cantidad de dosificación así como obstrucción de jeringas. Además, modificaciones postraduccionales tales como por ejemplo, la gamma-carboxilación de determinados residuos de ácido glutámico en el N-terminal y la adición de cadenas laterales de carbohidrato proporcionan sitios potenciales que pueden ser susceptibles de modificación después del almacenamiento. También, específico para el factor VIIa, al ser una serina proteasa, puede ocurrir una fragmentación debido a una autocatálisis (degradación enzimática). Así, la seguridad y eficacia de cualquier composición de una proteína está directamente relacionada con su estabilidad. El mantenimiento de la estabilidad en una forma líquida es generalmente diferente de una forma liofilizada debido al potencial inmensamente aumentado del movimiento molecular y en consecuencia la mayor probabilidad de interacciones moleculares. El mantenimiento de la estabilidad en una forma concen-
trada es también diferente por la propensión a la formación de agregado ante mayores concentraciones de proteína.

Al realizar una composición líquida se tienen en cuenta muchos factores. A corto plazo, es decir, menos de seis meses, la estabilidad líquida depende generalmente de evitar grandes cambios estructurales, tales como la desnaturalización y agregación. Estos procesos son descritos en la bibliografía para varias proteínas, y existen muchos ejemplos de agentes estabilizantes. Es bien conocido que un agente eficaz para estabilizar una proteína en realidad actúa para desestabilizar otra. Una vez que la proteína ha sido estabilizada contra grandes cambios estructurales, el desarrollo de una composición líquida con una estabilidad a largo plazo (por ej., más de seis meses) depende de estabilizar además la proteína a partir de tipos de degradación específicos para esa proteína. Los tipos más específicos de degradación pueden incluir, por ejemplo, enlace disulfúrico en aleatorización, oxidación de determinados residuos, desamidación, ciclización. Aunque no siempre es posible precisar los tipos de degradación individual, se han realizado ensayos para controlar los cambios sutiles para controlar la capacidad de los excipientes específicos para únicamente estabilizar la proteína de interés.

Además de tener en cuenta la estabilidad, se seleccionan generalmente excipientes que están aprobados por varias agencias reguladoras médicas mundiales. Es deseable que el pH de la composición esté en un rango fisiológicamente adecuado en el momento de la inyección/infusión, de lo contrario puede producir dolor y molestias al paciente.

Para un examen general sobre composiciones proteicas, véase, por ejemplo, Cleland et al.: The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10(4): 307-377; y Wang et al., Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology 1988 (Supplement), 42 (2S).

Otras publicaciones de interés respecto a la estabilización de proteínas son las siguientes: U.S. 20010031721 A1 (productos nacionales americanos) se refiere a composiciones altamente concentradas, liofilizadas, y del factor líquido IX. U.S. 5,770,700 (Genetics Institute) se refiere a composiciones del factor líquido IX. WO 97/19687 (Cruz Roja Americana) se refiere a composiciones líquidas de proteínas plasmáticas, en particular factor VIII y factor IX. U.S. 4,297,344 describe la estabilización de factores de coagulación II y VIII, antitrombina III, y plasminógeno contra el calor añadiendo aminoácidos seleccionados tales como glicina, alanina, hidroxiprolina, glutamina, y ácido aminobutirico, y un carbohidrato tal como un monosacárido, un oligosacárido, o un alcohol de azúcar.

El factor VIIa pasa por diferentes vías degradativas, especialmente agregación (dimerisación), oxidación y sección autolítica (recortando la estructura peptídica). Además, puede ocurrir la precipitación. Muchas de estas reacciones pueden ser retardadas significativamente eliminando el agua de la proteína. No obstante, el desarrollo de una composición acuosa para el factor VIIa tiene las ventajas de eliminar errores de reconstitución, aumentando de ese modo la exactitud de dosificación, así como simplificando el uso del producto clínicamente, aumentando de ese modo la adaptabilidad al paciente. Idealmente, las composiciones del factor VIIa deberían ser estables durante más de 6 meses sobre una gama amplia de concentraciones de proteínas. Esto permite una flexibilidad en los métodos de administración. Generalmente, las formas más altamente concentradas permiten la administración de volúmenes inferiores, lo que es altamente deseable desde el punto de vista del paciente. Las composiciones líquidas pueden tener muchas ventajas sobre productos criosecados en lo que se refiere a facilitar la administración y el uso.

Hoy, la única composición polipeptídica FVII comercialmente disponible hecha de recombinación es un producto del factor FVIIa criosecado que es reconstituido antes del uso; contiene una concentración del factor VIIa relativamente baja, por ej., aproximadamente 0,6 mg/ml. Un vial (1,2 mg) de NovoSeven® (Novo Nordisk A/S, Dinamarca) contiene 1,2 mg del factor VIIa humano recombinante, 5,84 mg de NaCl, 2,94 mg de CaCl_{2}, 2 H_{2}O, 2,64 mg de GlyGly, 0,14 mg de polisorbato 80, y 60,0 mg de manitol; es reconstruido a pH 5.5 por 2,0 ml de agua para inyección (WFI). Una vez reconstituida, la solución de proteínas es estable para el uso durante 24 horas. Por tanto, actualmente no hay productos líquidos preparados para el uso o productos concentrados del factor VII comercialmente disponibles.

Por consiguiente hay una necesidad en la técnica de métodos para mejorar la estabilidad de los polipéptidos del factor VII, incluyendo el factor humano VIIa (estabilidad química y/o física), aumentando la concentración, manteniendo los niveles de actividad, y suministrando composiciones líquidas adecuadas para el almacenamiento. Así, es un objeto de esta invención proporcionar una composición acuosa polipeptídica del factor VII que proporcione un control aceptable de los productos de degradación química y/o física tales como la degradación enzimática o productos de autocatálisis.

Resumen de la invención

Los presentes inventores han descubierto que el factor VII o análogos del mismo ("polipéptidos del factor VII"), cuando son formulados en una solución acuosa junto con un agente tamponador, un antioxidante y una sal cálcica o sal magnésica o mezcla de las mismas a una concentración de al menos 15 mM, son estables en el rango de pH desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 8.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición líquida acuosa que comprende (i) un polipéptido del factor VII, (ii) un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0 y (iii) un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas; donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM, y un antioxidante.

En formas de realización diferentes, el agente (iii) está presente en una concentración de al menos aproximadamente 25 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 900 mM, o al menos 1000 mM.

En otra forma de realización, la composición comprende además (iv) un agente modificador de fuerza iónica.

En formas de realización diferentes el agente modificador de fuerza iónica es seleccionado de la lista de: una sal neutra, por ej., cloruro sódico; un aminoácido; o un pequeño péptido, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes modificantes. En una forma de realización preferida, el agente modificador de fuerza iónica es cloruro sódico.

En formas de realización diferentes, el agente (iv) está presente en una concentración de al menos aproximadamente 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 1000 mM, 1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o al menos 2200 mM.

En una serie de formas de realización, el agente (iii) (sal cálcica y/o magnésica) está presente en una concentración de desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 1000 mM, tal como desde aproximadamente
25 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1000 mM, desde aproximadamente 700 mM hasta aproximadamente 1000 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 800 mM, desde aproximadamente 500 mM hasta aproximadamente 800 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 600 mM, desde aproximadamente 300 mM hasta aproximadamente 600 mM; desde aproximadamente 15 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 400 mM, o desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 400 mM.

En una serie de formas de realización el agente (iv) (agente modificador de fuerza iónica) está presente en una concentración de desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 2200 mM, tal como desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2200 mM, desde aproximadamente 1800 mM hasta aproximadamente 2200 mM, o desde aproximadamente 2000 mM hasta aproximadamente 2200 mM; desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 1800 mM, desde aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 1800 mM; desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1400 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1500 mM, desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1500 mM; desde aproximadamente 5 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 25 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1200 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1200 mM, o desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1200 mM.

En una forma de realización preferida, la concentración total de agentes (iii) y (iv) es desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2500 mM, tal como desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2500 mM, desde aproximadamente 1800 mM hasta aproximadamente 2500 mM, o desde aproximadamente 2000 mM hasta aproximadamente 2500 mM; desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 2000 mM, desde aproximadamente 1400 mM hasta aproximadamente 2000 mM, o desde aproximadamente 1600 mM hasta aproximadamente 2000 mM; desde aproximadamente 50 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 100 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 200 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 400 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 600 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 800 mM hasta aproximadamente 1600 mM, desde aproximadamente 1000 mM hasta aproximadamente 1600 mM, o desde aproximadamente 1200 mM hasta aproximadamente 1600 mM.

En una forma de realización, los agentes (iii) y (iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente 600 hasta aproximadamente 800 mM de (iii) y desde 0 hasta aproximadamente 5 mM de (iv); en otra forma de realización, los agentes (iii) y (iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente 300 hasta aproximadamente 500 mM de (iii) y desde aproximadamente 1100 hasta aproximadamente 1300 mM de (iv); en otra forma de realización, los agentes (iii) y (iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 300 mM de (iii) y desde aproximadamente 1500 hasta aproximadamente 1900 mM de (iv); en aún otra forma de realización, los agentes (iii) y (iv) están presentes en concentraciones de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 150 mM de (iii) y desde aproximadamente 1800 aproximadamente 2300 mM de (iv).

En formas de realización diferentes, la fuerza iónica de la composición es al menos 50, tal como al menos 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000, 1200, 1600, 2000, 2400, 2800, o al menos 3200.

En formas de realización diferentes la sal cálcica es seleccionada de la lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, gluconato cálcico y levulinato cálcico. En formas de realización diferentes, la sal magnésica es seleccionada de la lista de: cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico, gluconato magnésico, levulinato magnésico y sales de ácidos fuertes.

En formas de realización preferidas, el agente (iii) es seleccionado de la lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico, o una mezcla de los mismos; y el agente modificador de fuerza iónica (iv) es cloruro sódico.

En otra forma de realización la composición comprende además (v) un agente modificador de tonicidad.

En formas de realización diferentes, el agente modificador de tonicidad (v) es seleccionado de la lista de: una sal neutra; un mono-, di- o polisacárido; un alcohol de azúcar; un aminoácido; o un péptido pequeño, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes modificadores.

En una forma de realización, el agente modificador de tonicidad (v) está presente en una concentración de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM; desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 300 mM; desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 mM; o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 150 mM.

En otra forma de realización, la composición comprende además (vi) un surfactante no iónico.

En una forma de realización, el surfactante no iónico está presente en una cantidad de desde aproximadamente 0,005 hasta aproximadamente 2,0% en peso.

En formas de realización diferentes, el surfactante no iónico es un polisorbato o un poloxámero o un éter polioxietileno alquilo; preferiblemente poloxámero 188 o poloxámero 407, o polisorbato 20 o polisorbato 80, o polioxi 23 lauril éter.

En otra forma de realización la composición comprende además (vii) un antioxidante. En diferentes formas de realización, el antioxidante es D- o L-metionina; un análogo de metionina; un péptido con metionina; ácido ascórbico; cisteína; un homólogo de metionina, por ej., homocisteina; glutationa,. En una forma de realización preferida, el antioxidante es L-metionina. En una forma de realización, el antioxidante está presente en una concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5,0 mg/ml.

En una forma de realización el pH de la composición es mantenido desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0; tal como desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0; desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0; desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0; o desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0.

En una forma de realización, el agente adecuado para tener pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0 es un agente tamponador seleccionado de la lista de ácidos y sales de: citrato, acetato, histidina, malato, fosfato, ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES, Imidazol, TRIS, lactato, glicilglicina, PIPES, glicina, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes tamponadores.

En una forma de realización, la concentración del agente tamponador es desde aproximadamente 1 mM hasta 100 mM; desde 1 mM hasta aproximadamente 50 mM; desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 25 mM; desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 20 mM; o aproximadamente 10 mM.

En otra forma de realización la composición comprende además (viii) un conservante. En una forma de realización el conservante es seleccionado de la lista de fenol, alcohol bencílico, orto-cresol, meta-cresol, para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro de benzalconio y cloruro de benzatonio.

En una forma de realización, la composición es isotónica; en otra, es hipertónica. En una forma de realización, la composición es formulada para la administración farmacéutica. En una forma de realización, la composición es estable y/o estabilizada durante al menos 6 meses a 2-8ºC.

En diferentes formas de realización, el polipéptido del factor VII es el factor humano VIIa; factor humano recombinante VIIa; un polipéptido relacionado con el factor VII; una variante de la secuencia del factor VII; o un polipéptido del factor VII donde la actividad del polipéptido del factor VII y la actividad del Factor VIIa humano nativo (tipo salvaje FVIIa) es de al menos aproximadamente 1,25, preferiblemente al menos aproximadamente 2,0, o 4,0, de la forma más preferida al menos aproximadamente 8,0, cuando se evalúa en el "ensayo de proteolisis in vitro" como se describe en la presente descripción. En una forma de realización, el polipéptido del factor VII tiene una glicosilación diferente del factor VII humano tipo salvaje.

En formas de realización diferentes, el polipéptido del factor VII está presente en una concentración de desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml; desde aproximadamente 0,5 mg/ml hasta aproximadamente 5,0 mg/ml; desde aproximadamente 0,6 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/ml; desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/mi; desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 5 mg/ml; desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/ml; desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 2 mg/ml; o desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 1,5 mg/ml.

En otro aspecto, la invención también proporciona un método para preparar una composición líquida acuosa de un polipéptido del factor VII, que comprende la fase de suministrar el polipéptido del factor VII en una solución que comprende (i) un polipéptido del factor VII; (ii) un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0, (iii) un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas; donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM, y un antioxidante.

En otro aspecto, la invención también se refiere al uso de la composición para la preparación de un medicamento para tratar alteraciones hemorrágicas.

En formas de realización diferentes, el trastorno de sangrado es seleccionado del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia b, deficiencia del Factor XI. La deficiencia del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, presencia de un inhibidor del factor de coagulación, cirugía, hemorragia intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.

Descripción detallada de la invención

La presente invención es como se define en las reivindicaciones.

Las composiciones según la presente invención son útiles como composiciones estables preferiblemente listas para el uso de polipéptidos del factor VII. Las composiciones son estables durante al menos seis meses, y preferiblemente hasta 36 meses; cuando son almacenadas a temperaturas que varían de 2º a 8ºC. Las composiciones son química y/o físicamente estables, en particular químicamente estables, cuando son almacenadas durante al menos 6 meses a desde 2º hasta 8ºC.

Por "Estables" se entiende que la composición, después del almacenamiento durante 6 meses a desde 2 hasta 8ºC retiene al menos el 50% de su actividad biológica inicial medida por un ensayo de coágulo de primera etapa esencialmente como se describe en WO 92/15686 (Ejemplo II). En resumidas cuentas, la muestra que debe evaluarse es diluida en 50 mM Tris (pH 7.5), 0,1% BSA y 100 \mul son incubados con 100 \mul de plasma deficiente en factor VII y 200 \mul de tromboplastina C que contiene 10 mM Ca^{2+}. Los tiempos de coagulación son medidos y comparados con una curva estándar que usa un estándar de referencia o una agrupación de plasma humano normal citrado en dilución en serie.

Preferiblemente, la composición estable retiene al menos el 80% de su actividad inicial después del almacenamiento durante 6 meses de 2 a 8ºC.

El término "estabilizado", que puede ser usado de forma intercambiable con "relativamente estable", significa que la composición, después del almacenamiento durante al menos 6 meses de 2 a 8ºC, contiene una cantidad inferior de al menos uno de los siguientes productos de degradación: (i) productos de degradación enzimática, (ii) agregados (dimeros, oligómeros, polímeros), (iii) formas oxidadas, (iv) formas desamidadas, en relación a la cantidad de producto(s)
de degradación correspondiente(s) contenida en una solución del producto reconstruido NovoSeven®, que ha sido almacenado bajo condiciones similares durante un periodo de tiempo similar.

El término "físicamente estable" designa una composición que permanece visualmente clara. La estabilidad física de las composiciones es evaluada mediante inspección visual y la turbiedad después del almacenamiento de la composición a temperaturas diferentes durante varios períodos de tiempo. La inspección visual de las composiciones es realizada en una luz finamente focalizada con un fondo oscuro. Una composición es clasificada como físicamente inestable cuando muestra turbiedad visual.

El término "estabilidad física" de polipéptidos del factor VII se refiere a la formación de agregados insolubles y/o solubles de formas diméricas oligoméricas y poliméricas de polipéptidos del factor VII al igual que cualquier deformación estructural y desnaturalización de la molécula.

El término "químicamente estable" está destinado a designar una composición que retenga al menos el 50% de su actividad biológica inicial después del almacenamiento durante 6 meses a desde 2 a 8ºC, medido por un ensayo de coágulo de un solo paso esencialmente como se describe en WO 92/15686.

El término "estabilidad química" se refiere a la formación de cualquier cambio químico en los polipéptidos del Factor VII en el momento del almacenamiento en solución a condiciones aceleradas. Por ejemplo, están la hidrólisis, desamidación y oxidación al igual que la degradación enzimática que producen la formación de fragmentos de polipéptidos del factor VII, en particular, los aminoácidos que contienen azufre son propensos a la oxidación con la formación de los correspondientes sulfóxidos.

Las composiciones comprenden polipéptidos del factor VII, iones de calcio y/o magnesio, agentes tamponadores, y, opcionalmente, otros excipientes, que además estabilizan los polipéptidos del factor VII, incluyendo los agentes modificadores de fuerza iónica y modificadores de tonicidad. La concentración de polipéptidos del factor VII varia desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 mg/ml.

Como se utiliza en este caso, el término "agente modificador de fuerza iónica" incluye agentes que contribuyen a la fuerza iónica de la solución. Los agentes incluyen, pero no se limitan a, sales neutras, p. ej., cloruro sódico o cloruro de potasio; aminoácidos; péptidos pequeños (por ej., que tienen de 2 a 5 residuos aminoácidos tales como por ej., la glicilglicina), o una mezcla de al menos dos de dichos agentes modificadores. Un agente preferido es cloruro sódico. Los agentes modificadores de fuerza iónica están presentes en una concentración de al menos aproximadamente 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 1000 mM, 1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o al menos 2200 mM.

Como se utiliza en este caso, el término "modificador de tonicidad" incluye agentes que contribuyen a la osmolalidad de la solución. Los modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos; péptidos pequeños (por ej., que tienen de 2 a 5 residuos de aminoácido); sales neutras; mono- o disacáridos; polisacáridos; alcoholes de azúcar, o una mezcla de al menos dos de dichos modificadores. Ejemplos de modificadores de tonicidad incluyen, pero no se limitan a, cloruro sódico, cloruro potásico, citrato sódico, sacarosa, glucosa, glicilglicina y manitol. Normalmente los modificadores están presentes en una concentración de desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 500 mM; desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 300 mM; desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 200 mM; o desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 150 mM, dependiendo de los otros ingredientes presentes. Se pueden usar sales neutras tales como p. ej., cloruro sódico o cloruro potásico.

Por "sal neutra" se entiende una sal que no es ni un ácido ni una base cuando es disuelta en una solución acuosa.

El término "agente adecuado para mantener el pH en el rango de aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0" comprende aquellos agentes que mantienen el pH de la solución en un rango aceptable desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0, tal como desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 6.0, desde aproximadamente 6.4 hasta aproximadamente 6.6, o aproximadamente 6.5, desde aproximadamente 5.2 hasta aproximadamente 5.7, o aproximadamente 5.5. El término pueden ser usado de forma intercambiable con "agente tamponador". Estos pueden incluir, pero no se limitan a ácidos y sales de: citrato (sodio o potasio), acetato (amonio, sodio o calcio), histidina (L-histidina), malato, fosfato (sodio o potasio), ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES, imidazol, TRIS, lactato, glutamato, glicilglicina, PIPE, glicina, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes tamponadores. El rango de concentración de tampón es elegida para mantener el pH preferido de la solución. El agente tamponador puede también ser una mezcla de al menos dos agentes tamponadores donde la mezcla sea capaz de proporcionar un valor del pH en el rango definido. En formas de realización alternativas, la concentración de tampón está en el rango de aproximadamente 1 mM hasta 100 mM; desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM; desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 25 mM; desde aproximadamente 2 mM hasta aproximadamente 20 mM; o aproximadamente 10 mM.

Opcionalmente, las composiciones pueden también contener un surfactante o detergente. Los "surfactantes" o "detergentes" generalmente incluyen aquellos agentes que protegen la proteína de tensiones inducidas por la interfaz de aire/solución y tensiones inducidas por la solución/superficie (por ej., dando como resultado la agregación de la proteína). El detergente es preferiblemente un detergente no iónico incluyendo, pero no limitado a polisorbatos (por ej. Tween4), tales como polisorbato 20 u 80; éteres de polioxietileno alquilo o poloxámeros, tales como poloxámero 188 o 407, (por ej., polioles Pluronic®) y otros polímeros en bloque de etileno/polipropileno, o polietilenoglicol (PEG) tales como PEG8000. La cantidad de surfactante presente varía desde aproximadamente 0,005 hasta aproximadamente 2,0%.

Opcionalmente, la composición puede incluir un antioxidante. Los antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, ácido ascórbico, cisteína, homocisteina, cistina, cisstationina, metionina, glutationa y otros péptidos que contienen cisteína o metionina, en particular péptidos con 2 a 5 residuos aminoácidos donde al menos uno de los residuos es una metionina o residuo de cisteína; metionina, en particular se prefiere L-metionina. El antioxidante es incluido en una concentración de 0,1 a 5 mg/ml, tal como 0,1 a 4, 0,1 a 3, 0,1 a 2, o 0,5 a 2 mg/ml.

También se puede incluir un conservante en la composición para retardar el crecimiento microbiano y permitir de ese modo el paquete de "uso múltiple" de polipéptidos FVII. Los conservantes incluyen fenol, alcohol bencílico, orto-cresol, meta-cresol, para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro de benzalconio y cloruro de bencetonio. El conservante es habitualmente incluido a una concentración de 0,1 a 20 mg/ml dependiendo del rango de pH y tipo de conservante. Opcionalmente, la composición también puede incluir un agente capaz de inhibir la desamidación.

Como se utiliza en este caso, las cantidades especificas son entendidas como de aproximadamente el 10%, por ej., aproximadamente 50 mM incluyen 50 \pm 5 mM; por ej., el 4% incluye el 4% \pm 0,4%, etc.

Los porcentajes son (peso/peso) ambos cuando se refieren a sólidos disueltos en solución y líquidos mezclados en soluciones. Por ejemplo, para Tween, es el peso del 100% de materia prima/peso de la solución.

El término "fuerza iónica" es la fuerza iónica de la solución (\mu) Esto es definido por la ecuación:

\mu = ½ \sum ([i](Zi^{2})),

donde \mu es la fuerza iónica, [i] es la concentración molar de un ión, y Z_{i} es la carga (+ o -) de este ión (James Fritz and George Schenk: Quantitative Analytical Chemistry, 1979).

En diferentes formas de realización de la invención, la fuerza iónica de la composición es al menos 50, tal como al menos 75, 100, 150, 200, 250, 400, 500, 650, 800, 1000, 1200, 1600, 2000, 2400, 2800, o al menos 3200.

El término "isotónico" significa "isotónico con suero", es decir, aproximadamente 300 \pm 50 milliosmol/kg. La tonicidad se entiende como una medida de osmolalidad de la solución antes de la administración. El término "hipertónico" designa niveles de osmolalidad sobre el nivel fisiológico del suero, tales como niveles por encima de 300 \pm 50 milliosmol/kg.

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" es la dosis eficaz por ser determinada por un profesional cualificado, que pueda valorar las dosificaciones para conseguir la respuesta deseada. Los factores para considerar la dosis incluirán fuerza, biodisponibilidad, perfiles farmacocinéticos/farmacodinámicos deseados, condición de tratamiento, factores relacionados con el paciente (por ej. peso, salud, edad, etc.), presencia de medicaciones coadministradas (por ej., anticoagulantes), tiempo de administración, u otros factores conocidos por un profesional médico.

El término "tratamiento" es definido como la gestión y cuidado de un sujeto, por ej. un mamífero, en particular un humano, con el propósito de combatir la enfermedad, condición, o trastorno e incluye la administración de un polipéptido del factor VII para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones, o aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar la enfermedad, condición, o trastorno. Las composiciones farmacéuticas según la presente invención que contienen un polipéptido del factor VII pueden ser administradas parenteralmente a sujetos en necesidad de tal tratamiento. La administración parenteral puede ser realizada por inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa mediante una jeringa, opcionalmente una jeringa tipo pluma. De forma alternativa, la administración parenteral pueden ser realizada mediante una bomba de infusión.

La concentración del factor VIIa es expresada convenientemente como mg/mL o como UI/mL, con 1 mg representando habitualmente 43000-56000 UI o más.

Métodos de uso

Las preparaciones de la presente invención pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome sensible al Factor VII, tales como por ej., alteraciones hemorrágicas, incluyendo, sin limitación, aquellos provocados por deficiencias del factor de coagulación (p. ej., hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII); por trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand o por inhibidores del factor de coagulación o sangrado excesivo por cualquier causa. Las preparaciones pueden también ser administradas a pacientes en asociación con cirugía u otro traumatismo o a pacientes que reciban terapia anticoagulante.

Polipéptidos del factor VII para ser formulados según la presente invención

Los términos "factor humano VII" o "FVII" indican factor humano VII producido por métodos que incluyen la extracción de la fuente natural y purificación, y por sistemas de cultivo celular recombinante. Su secuencia y características son expuestas, por ejemplo, en el documento US nº. 4,784,950. Los términos cubren asimismo equivalentes del factor VII biológicamente activos, que difieren por ej., en uno o más aminoácido(s) en la secuencia global. Además, los términos usados en esta solicitud están destinados a incluir sustitución, eliminación e inserción de variantes de aminoácido del factor VII o modificaciones postraduccionales. Como se utiliza en este caso, "polipéptido del Factor VII" comprende sin limitación el Factor VII así como polipéptidos relacionados con el Factor VII. Los polipéptidos relacionados con el Factor VII incluyen, sin limitación, polipéptidos del Factor VII que han sido o bien químicamente modificados respecto al Factor humano VII y/o contengan una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos respecto al Factor humano VII (es decir, variantes del Factor VII), y/o contengan secuencias de aminoácidos truncadas respecto al Factor humano VII (es decir, fragmentos del Factor VII). Dicho polipéptido relacionado con el Factor VII puede mostrar propiedades diferentes respecto al Factor humano VII, incluyendo estabilidad, unión de fosfolípidos, actividad específica alterada, y similares.

Se entiende que el término "Factor VII" comprende polipéptidos del Factor VII en su forma no dividida (zimógena), al igual que aquellos que han sido procesados proteolíticamente para producir sus respectivas formas bioactivas, que pueden ser designadas Factor VIIa. Normalmente el factor VII es dividido entre los residuos 152 y 153 para producir el Factor VIIa. El término "Factor VII" está también destinado a comprender, sin limitación, polipéptidos que tengan la secuencia de aminoácidos 1-406 del Factor humano VII de tipo salvaje (como se describe en U.S. nº. 4,784,950), al igual que el Factor VII de tipo salvaje derivado de otras especies, tal como por ej., el Factor VII bovino, porcino, canino, murino, y de salmón. Comprende además variaciones naturales alélicas del factor VII que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. También, el grado y ubicación de la glicosilación u otras modificaciones de post-traducción pueden variar dependiendo de las células huésped elegidas y la naturaleza del medio celular del huésped.

Como se utiliza en este caso, "polipéptidos relacionados con el Factor VII" comprenden sin limitación, polipéptidos que muestran sustancialmente la misma o actividad biológica mejorada respecto al Factor VII humano tipo salvaje. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, Factor VII o Factor VIIa que ha sido químicamente modificado y variantes del Factor VII donde hayan sido introducidas alteraciones específicas de secuencia de aminoácidos que modifiquen o disgreguen la bioactividad del polipéptido.

Comprende además polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, polipéptidos que tienen un extremo N-terminal modificado incluyendo deleciones o adiciones de aminoácidos en el N-terminal y/o polipéptidos que hayan sido químicamente modificados respecto al factor humano VIIa.

Los polipéptidos relacionados con el Factor VII, incluyendo las variantes del factor VII, que muestran sustancialmente la misma o mejor bioactividad que el Factor VII de tipo salvaje, incluyen, sin limitación, polipéptidos con una secuencia de aminoácidos que difieren de la secuencia del Factor VII de tipo salvaje por inserción, eliminación o sustitución de uno o más aminoácidos.

Los polipéptidos relacionados con el Factor VII, incluyendo variantes, que tengan sustancialmente la misma o actividad biológica mejorada respecto al Factor VIIa de tipo salvaje comprenden aquellos que muestran al menos aproximadamente el 25%, preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 110%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 120%, y de la forma más preferible al menos aproximadamente el 130% de la actividad específica del Factor VIIa de tipo salvaje que haya sido producido en el mismo tipo de célula, evaluado en uno o más de los ensayos de coagulación, ensayo de proteolisis, o ensayo de unión TF como se describe en la presente descripción.

Los polipéptidos relacionados con el Factor VII incluyen variantes particulares, donde la proporción entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la actividad del Factor VIIa humano nativo (FVIIa tipo salvaje) es al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "ensayo de hidrólisis in vitro" (véase "Ensayos", abajo); en otras formas de realización, la proporción es de al menos aproximadamente 2,0; en formas de realización adicionales, la proporción es de al menos aproximadamente 4,0. En algunas formas de realización de la invención, los polipéptidos del factor VII son equivalentes al Factor VII, en particular variantes donde la proporción entre la actividad de dicho polipéptido del Factor VII y la actividad de factor humano nativo VIIa (FVIIa tipo salvaje) es de al menos aproximadamente 1,25 evaluado en el "ensayo de proteolisis in vitro" (véase "Ensayos", abajo); en otras formas de realización, la proporción es de al menos aproximadamente 2,0; en formas de realización adicionales, la proporción es de al menos aproximadamente 4,0; en formas de realización adicionales, la proporción es de al menos aproximadamente 8,0.

En algunas formas de realización el polipéptido del Factor VII es el Factor humano VII, como se describe, por ej., en U.S. nº. 4,784,950 (Factor VII tipo salvaje). En algunas formas de realización, el polipéptido del Factor VII es el Factor VIIa humano. En una serie de formas de realización, los polipéptidos del Factor VII incluyen polipéptidos que muestran al menos aproximadamente el 90%, preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, preferiblemente al menos aproximadamente el 120%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 140%, y de la forma más preferible al menos aproximadamente el 160%, de la actividad biológica específica del Factor VIIa humano.

En algunas formas de realización, los polipéptidos del Factor VII tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del Factor VII tipo salvaje por inserción, eliminación, o sustitución de uno o más aminoácidos.

Los polipéptidos del Factor VII incluyen polipéptidos que muestran al menos aproximadamente el 70%, preferiblemente al menos aproximadamente el 80%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, y de la forma más preferible al menos aproximadamente el 95% de identidad con la secuencia del Factor VII de tipo salvaje como se describe en U.S. nº. 4,784,950. La homología/identidad de la secuencia de aminoácidos es convenientemente determinada a partir de secuencias alineadas, usando un programa de ordenador adecuado para el alineamiento de secuencias, tal como por ej., el programa ClustalW, versión 1.8, 1999 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680).

Ejemplos no limitativos de variantes del Factor VII que tienen sustancialmente la misma o actividad biológica mejorada como el Factor VII de tipo salvaje incluyen S52A-FVII, S60A-FVII (lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-
FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII, K337A- FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII, V158
D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q FVII, V158D/E296V-FVII, V158D/M298K-FVII, y S336G-FVII; variantes de FVIIa que muestran actividad aumentada TF-independiente como se describe en WO 01/83725 y WO 02/22776; variantes de FVIIa que muestran una mayor estabilidad proteolítica como se describe en U.S. nº. 5,580,560; el Factor VII que ha sido proteolíticamente dividido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); y formas oxidadas del Factor VIIa (Korn-felt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54: 1999).

Actividad biológica de polipéptidos del factor VII

La actividad biológica del Factor VII en la coagulación de sangre deriva de su capacidad para (i) unirse con el factor tisular (TF) y (ii) catalizar el seccionamiento proteolítico del Factor IX o Factor X para producir el Factor activado IX o X (Factor IXa o Xa, respectivamente).

Para los fines de la invención, la actividad biológica de los polipéptidos del Factor VII ("actividad biológica del factor VII") puede ser cuantificada midiendo la capacidad de una preparación para promover la coagulación de la sangre usando el plasma deficitario en factor VI y tromboplastina, como se describe, por ej., en U.S. nº. 5,997,864 o WO 92/15686. En este ensayo la actividad biológica es expresada como la reducción en el tiempo de coagulación respecto a una muestra de control y es convertida en "unidades del Factor VII" por comparación con un estándar de suero humano agrupado que contenga 1 unidad/ml de actividad del Factor VII. De forma alternativa, la actividad biológica del Factor VII puede ser cuantificada por

-: Medición de la capacidad de un polipéptido relacionado con el Factor VIIa o el Factor VII para producir el Factor X activado (Factor Xa) en un sistema que comprenda TF introducido en una membrana lipídica y el Factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924: 1997);

-: Medición de la hidrólisis del Factor X en un sistema acuoso ("ensayo de proteolisis in vitro", véase abajo);

-: Medición de la unión física del Factor VIIa o un polipéptido relacionado con el Factor VII a TF usando un instrumento basado en resonancia de plasmón de superficie (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997); y

-: Medición de la hidrólisis de un sustrato sintético por el Factor VIIa y/o un polipéptido relacionado con el Factor VII ("ensayo de proteolisis in vitro", véase abajo); y

-: Medición de la generación de trombina en un sistema in vitro TF-independiente.

Ensayos adecuados para determinar la actividad biológica de polipéptidos del Factor VII

Los polipéptidos del Factor VII útiles conforme a la presente invención pueden ser seleccionados por ensayos adecuados que pueden ser realizados como pruebas simples preliminares in vitro. Así, la presente descripción presenta una prueba simple (titulada "ensayo de hidrolisis in vitro") para la actividad de polipéptidos del Factor VII.

Ensayo de hidrolisis in vitro (ensayo 1)

El factor VIIa nativo (tipo salvaje) y el polipéptido del Factor VII (ambos designados de aquí en adelante "factor VIIa") pueden ser evaluados para actividades específicas. También pueden ser evaluados en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El sustrato cromogénico D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final 1 mM, es añadido al Factor VIIa (concentración final 100 nm) en 50 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0,1 m de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, USA). La absorbencia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de sustracción de la absorbencia en un pocillo para el blanco que no contiene enzima, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades de polipéptido del Factor VII y el Factor VIIa de tipo salvaje:

Proporción = (A405 nm polipéptido del Factor VII)/(A405 nm factor VIIa tipo salvaje)

Basados en esto se pueden identificar polipéptidos del Factor VII con una actividad inferior, comparable, o superior al factor nativo VIIa, tales como, por ejemplo, polipéptidos del Factor VII donde la proporción entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del factor nativo VII (FVII tipo salvaje) es aproximadamente, en contra de lo expuesto arriba, 1,0.

La actividad de los polipéptidos del Factor VII puede ser medida también usando un sustrato fisiológico tal como el factor X ("ensayo de proteólisis in vitro"), de manera adecuada a una concentración de 100-1000 nm, donde el Factor Xa generado es medido después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo, S-2765). Además, el ensayo de actividad puede ser ejecutado a temperatura fisiológica.

Ensayo de proteólisis in vitro (ensayo 2)

El Factor VII nativo (tipo salvaje) y el polipéptido del Factor VII (ambos designados de aquí en adelante como "Factor VII") son evaluados en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El Factor VII (10 nm) y el Factor X (0,8 microM) en 100 microL 50 mM de Hepes, pH 7.4, conteniendo 0,1 m de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino, son incubados durante 15 min. El seccionamiento del Factor X es después detenido por la adición de 50 microL 50 mM de HEPES, pH 7.4, conteniendo 0,1 M de NaCl, 20 mM de EDTA y 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. La cantidad del Factor Xa generada es medida por adición del sustrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final 0,5 mM. La absorbencia a 405 nm es medida continuamente en un lector de placas SpectraMax^{TM} 340 (Molecular Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de sustracción de la absorbencia en un pocilllo para el blanco que no contiene FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades proteolíticas del polipéptido del Factor VII y el Factor VII de tipo salvaje:

Proporción = (A405 nm polipéptido del Factor VII)/(A405 nm de Factor VIIa tipo salvaje).

Basados en esto puede identificarse el polipéptido del Factor VII con una actividad inferior, comparable, o superior al factor VIIa nativo, tal como, por ejemplo, polipéptidos del Factor VII donde la proporción entre la actividad del polipéptido del Factor VII y la actividad del factor nativo VII (tipo salvaje FVII) es aproximadamente, en contra de lo señalado arriba, 1,0.

La capacidad del factor VIIa o de los polipéptidos del Factor VII para generar trombina puede también ser medida en un ensayo (ensayo 4) que comprende todos los factores relevantes de coagulación e inhibidores a concentraciones fisiológicas (menos el factor VIII al imitar las condiciones de hemofilia A) y plaquetas activadas (como se describe en la p. 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547, que se incorpora aquí como referencia).

La actividad de los polipéptidos del Factor VII puede también ser medida usando un ensayo de coagulación de un solo paso (ensayo 4) como se describe esencialmente en WO 92/15686 o US 5,997,864. Brevemente, la muestra que debe evaluarse es diluida en 50 mM Tris (pH 7.5), 0,1% BSA y 100 \mul son incubados con 100 \mul de plasma deficitario en Factor VII y 200 \mul de tromboplastina C conteniendo 10 mM Ca^{2+}. Los tiempos de coagulación son medidos y comparados con una curva estándar que usa un estándar de referencia o un volumen de plasma humano normal citrado en dilución en serie.

Preparación y purificación de polipéptidos del factor VII

El Factor humano purificado VII adecuado para el uso en la presente invención es preferiblemente hecho por tecnología de ADN recombinante, por ej. como describen Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2412-2416, 1986, o como se describe en la patente europea nº. 200.421 (ZymoGenetics, Inc.). El Factor VII puede ser producido también por los métodos descritos por Broze and Majerus, J. Biol. Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980 y Hedner and Kisiel, J. Clin. Invest. 71: 1836-1841, 1983. Estos métodos producen el Factor VII sin cantidades detectables de otros factores de coagulación sanguínea. Una preparación del Factor VII incluso más purificada puede ser obtenida mediante la inclusión de una filtración de gel adicional como fase de purificación final. El Factor VII es después convertido en el factor VIIa activado por medios conocidos, por ej. por varias proteínas diferentes plasmáticas, tales como el factor XIIa, IX a o Xa. De forma alternativa, como describen Bjoern et al. (Research Disclosure 269 September 1986 págs. 564-565), el factor VII puede ser activado pasándolo a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia fine Chemicals) o similares, o por autoactivación en la solución.

Los polipéptidos relacionados con el Factor VII pueden ser producidos por modificación del Factor VII de tipo salvaje o por tecnología recombinante. Los polipéptidos relacionados con el Factor VII con secuencia de aminoácidos alterada en comparación con el Factor VII de tipo salvaje pueden ser producidos modificando la secuencia de ácido nucleico que codifica el factor VII de tipo salvaje o bien alterando los codones de aminoácidos o por eliminación de algunos codones de aminoácidos en el ácido nucleico que codifica el factor natural VII por medios conocidos, por ej. por mutagénesis sitio-específica.

Será evidente para los expertos en la técnica que las sustituciones pueden ser hechas fuera de las regiones criticas a la función de la molécula del Factor VII y además suponen un polipéptido activo. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido del Factor VII y en consecuencia preferiblemente no sujetos a sustitución, pueden ser identificados según procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida o mutagénesis de escaneado de alanina (véase, p. ej., Cunningham and Wells 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas en cuanto a la actividad coagulante, respectivamente de reticulación, para identificar residuos aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. También se pueden determinar sitios de interacción de enzima-sustrato por análisis de la estructura tridimensional determinado por técnicas de este tipo como análisis de resonancia magnética nuclear, cristalografía o marcado por fotoafinidad (véase por ej., de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

La introducción de una mutación en la secuencia de ácido nucleico para intercambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis sitio-dirigida usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Particularmente útil es el procedimiento que utiliza un vector de ADN bicatenario muy enrollado, con un inserto de interés y dos cebadores sintéticos que contienen la mutación deseada. Los cebadores oligonucleótidos, cada uno complementario a cadenas opuestas del vector, se extienden durante la variación de la temperatura mediante polimerasa Pfu ADN. Al incorporar los cebadores se genera un plásmido mutado que contiene mellas ajustadas. Después de la variación de la temperatura el producto es tratado con Dpnl, que es específico para ADN metilado y semi-metilado para digerir el molde de ADN genitor y para seleccionar el ADN sintetizado que contiene la mutación. Pueden ser usados también otros procedimientos conocidos en la técnica para crear, identificar y aislar las variantes, tales como, por ejemplo, técnicas de transposición de genes o exposición fágica.

La separación de polipéptidos de su célula de origen puede ser conseguida por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de cultivo celular que contiene el producto deseado de un cultivo celular adherente; centrifugado o filtración para eliminar células no adherentes; y similares.

Opcionalmente, pueden ser purificados adicionalmente los polipéptidos del Factor VII. La purificación puede ser conseguida usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo sin limitación, cromatografía de afinidad, tal como por ej., en una columna de anticuerpos del anti-Factor VII (véase, p. ej., Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía por exclusión de tamaño; procedimientos electroforéticos (p. ej., isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p. ej., precipitación de sulfato amónico), o extracción y similares. Véase, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; y Protein Purification, J.C. Janson y Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989. Después de la purificación la preparación contiene preferiblemente menos de aproximadamente el 10% en peso, más preferiblemente menos de aproximadamente el 5% y de la forma más preferible menos de aproximadamente el 1% de polipéptidos de no-Factor VII derivados de la célula huésped.

Los polipéptidos del Factor VII pueden ser activados por seccionamiento proteolítico, usando el Factor XIIa u otras proteasas que tienen especificidad tipo tripsina, tales como p. ej., Factor IXa, calicreína, Factor Xa, y trombina. Véase, por ej., Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, patente U.S. nº. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983). De forma alternativa, los polipéptidos del Factor VII pueden ser activados pasándolos a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como la Mono Q® (Pharmacia) o similar, o por autoactivación en solución. El polipéptido del Factor VII activado resultante puede después ser formulado y administrado como se describe en la presente solicitud.

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Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el contenido de los agregados de FVII y fragmentos de FVII después de 3 meses de almacenamiento a 2-8ºC.

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la invención. Estos ejemplos son para fines ilustrativos sólo y no están destinados de ninguna manera a limitar el ámbito de la invención reivindicada.

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Ejemplos experimentales

Ejemplo 1

Métodos de ensayo

El contenido de los agregados es determinado por la exclusión de tamaño no desnaturalizante por HPLC. El contenido de formas oxidadas es determinado por RP-HPLC. El contenido de formas de degradación enzimática es determinado por RP-HPLC.

La cromatografía por exclusión de tamaño no desnauralizante fue llevada a cabo sobre una columna para Waters Protein Pak 300 SW, 7,5x300 mM usando 0,2 M de sulfato amónico, 5% de 2-propanol, pH 7.0, como fase móvil. Nivel de flujo: 0,5 ml/min. Detección: 215 nm. Carga: 25 \mug FVIIa.

Se realizó una HPLC en fase inversa sobre una columna propia de sílice enlazada con butilo de 4,5x250 mm con un tamaño de partícula de 5 \mum y tamaño de poro 300\ring{A}. Temperatura de columna: 70ºC. Tampón A: 0,1% v/v ácido trifluoracético. Tampón B: 0,09% v/v ácido trifluoracético, 80% v/v acetonitrilo. La columna fue eluida con un gradiente lineal desde X hasta (X+13) % B en 30 minutos. X es ajustado de modo que FVIIa eluya con un tiempo de retención de aproximadamente 26 minutos. Nivel de flujo: 1,0 ml/min. Detección: 214 nm. Carga: 25 \mug FVIIa.

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Ejemplo 2

Preparación de la composición

En general, las muestras de composición acuosa de FVIIa para el análisis en estos ejemplos experimentales fueron preparadas a partir de una solución de volumen purificada por intercambio de tampón sobre una columna de filtración de gel. Los aditivos de la composición estaban o bien contenidos en el tampón de elución en sus proporciones finales o fueron añadidos al eluato. La solución resultante fue filtrada estéril usando un filtro de membrana esterilizado (0,2 micras de tamaño de poro o equivalente) y llenada en viales de cristal estériles, tapados y sellados con tapones de caucho butílico y tapas de aluminio abatibles.

Ejemplo 3

Efecto del pH en la estabilidad química/física

Los viales de la composición acuosa del rFVIIa conteniendo 1,4 mg de rFVIIa/ml, 50 mM de cloruro sódico, 10 mM de cloruro cálcico y una mezcla de 10 mM de glicilglicina, acetato e histidina ajustados a pH 3, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, y 9.0 fueron incubados a bien una temperatura de 2-8ºC, o a temperaturas de almacenamiento elevadas de 30ºC, y después retirados en varios puntos de tiempo y examinados en cuanto a cambios en el pH y la estabilidad química fue determinada por RP-HPLC y GP-HPLC.

Después del almacenamiento a 2-8ºC durante hasta tres meses las composiciones acuosas mostraron cambios insignificantes en el pH. La HPLC de exclusión por tamaño no desnaturalizante realizada en muestras almacenadas durante hasta tres meses a 2-8ºC no mostró agregación significativa del medicamento a valores de pH \geq 5.5 (Figura 1). La RP-HPLC realizada en estas muestras no mostró aumento significativo en la fragmentación u oxidación de la proteína en el rango de pH 4.5-5.5.

La Figura 1 muestra datos después de 3 meses de almacenamiento a 2-8 grados C. El contenido inicial de agregados es aproximadamente el 0,5% y el contenido inicial de fragmentos es de aproximadamente el 9%.

Ejemplo 4

La capacidad tamponadora de diferentes tampones

Los viales de la composición acuosa del rFVIIa conteniendo 1,0 mg de rFVIIa/mL 50 mM de cloruro sódico, 10 mM de cloruro cálcico y una de las siguientes sustancias tamponadoras en una concentración de 10 mM de glicilglicina, ácido málico, ácido acético, histidina, ácido glutámico y ácido cítrico fueron incubados a temperaturas de 2-8 grados C, o a temperaturas de almacenamiento elevadas a 30 grados C durante hasta 3 meses. El pH fue ajustado en el tiempo cero a 5.5, puesto que este dio la cantidad mínima de productos de degradación (Figura 1). La medición del pH en la composición que contiene glicilglicina mostró un aumento de hasta 6.2 durante el periodo de almacenamiento. Las otras composiciones mostraron en el mismo periodo valores estables de 5.5 +/- 0.1.

Ejemplo 5

Estabilidad Física de las Composiciones Acuosas que contienen varios detergentes

Doce composiciones diferentes fueron preparadas. Las composiciones eran:

1

Las concentraciones de los detergentes/solubilizadores evaluados están indicadas en la tabla abajo.

Las composiciones fueron preparadas a partir de una solución de volumen líquida de rFVIIa. Se prepararon soluciones concentradas de los detergentes/solubilizadores en tampones conteniendo NaCl, CaCl_{2}, 2 H_{2}O, y glicilglicina en las concentraciones declaradas arriba. El volumen del rFVIIa y las soluciones de detergente fueron mezclados, y el pH en las soluciones fue ajustado a 5.5. Las composiciones fueron filtradas (0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml de solución por vial).

La apariencia de las composiciones fue determinada por inspección visual y la absorbencia de la composición fue determinada a 400 nm. Posteriormente, los viales fueron agitados durante 19 horas (800/min) a la temperatura ambiente. Después de completar la agitación, la apariencia y la absorbencia fueron determinadas en 400 nm. Los resultados están relacionados en la tabla de abajo.

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2

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Los resultados muestran que la referencia (sin adición de ningún detergente/solubilizador) se vuelve visualmente turbio cuando se agita, observándose un aumento significativo en la absorbencia a 400 nm. La adición de Tween® 20 (= polisorbato 20), Tween® 80 (= polisorbato 80), Poloxámero 188, Pluronic® F127 (= poloxámero 407), Brij® 35 (= polioxil 23 lauril éter), y LPCM (= \alpha-lisofasfatidilcolina miristoil) casi evitó completamente el aumento de turbidez y absorbencia, mientras que se observó un ligero aumento de turbidez (en comparación con la referencia) para Myrj® 59 (= polioxil 100 estearato) y Myrj® 52 (= polioxil 40 estearato). El glicerol, polietilenoglicol 400 o polietilenoglicol 4000 no pudieron evitar el aumento de turbidez en las concentraciones usadas en este experimento.

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Ejemplo 6

Estabilidad química de composiciones acuosas conteniendo metionina como antioxidante

Tres composiciones diferentes fueron preparadas. Las composiciones fueron:

3

Las composiciones fueron preparadas a partir de una solución de volumen líquida de rFVIIa. La metionina fue disuelta en tampones conteniendo NaCl, CaCl_{2}, 2 H_{2}O, y glicilglicina en las concentraciones indicadas arriba. El volumen del rFVIIa y las soluciones de metionina fueron mezcladas, y el pH en las soluciones fue ajustado a 6.5. Las composiciones fueron filtradas (0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml solución por vial). Los viales fueron almacenados a 5ºC, 25ºC y 40ºC. Las muestras fueron retiradas y analizadas en cuanto al contenido de formas oxidadas (por RP-HPLC) en el momento indicado en la tabla de abajo. La tabla muestra el contenido de formas oxidadas (en %).

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4

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Los resultados muestran que la adición de metionina retarda el índice de oxidación en la composición.

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Ejemplo 7

Estabilidad química de composiciones acuosas conteniendo cloruro cálcico

Cuatro composiciones diferentes fueron preparadas. Las composiciones eran:

5

Las composiciones fueron preparadas a partir de una solución de volumen líquida de rFVIIa. El cloruro cálcico fue disuelto en tampones conteniendo NaCl y glicilglicina para dar como resultado las concentraciones indicadas arriba después de mezclar con el volumen del rFVIIa. Después de mezclar el pH en las soluciones fue ajustado a 7.0. Las composiciones fueron filtradas (0,2 \muM) y llenadas en viales (1 ml de solución por vial). Los viales fueron almacenados a 5ºC. La actividad del Factor VII (UI/ml) fue determinada por ensayo de coágulo.

6

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Patentes citadas en la descripción

\bullet US 20010031721 A1 [0009]: \bullet WO 0183725 A [0077]

\bullet US 5770700 A [0009]: \bullet WO 0222776 A [0077]

\bullet WO 9719687 A [0009]: \bullet US 5580560 A [0077]

\bullet US 4297344 A [0009]: \bullet US 5997864 A [0079] [0088]

\bullet WO 9215686 A [0044] [0049] [0079] [0088]: \bullet EP 200421 A [0089]

\bullet US 4784950 A [0067] [0068] [0074] [0076]: \bullet US 4456591 A [0095]

Bibliografía distinta de patentes citada en la descripción

\bulletMANNING et al. Pharmaceutical Research, 1989, vol. 6, 903-918 [0004]

\bulletCLELAND et al. The development of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1993, vol. 10, no. 4. 307-377 [0008]

\bulletWANG et al. Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers Journal of Parenteral Science and Technology, 1988, vol. 42, 2S- [0008]

\bullet JAMES FRITZ GEORGE SCHENK Quantitative Analytical Chemistry, 1979, [0061]

\bulletTHOMPSON et al. Nucleic Acid Research, 1994, vol. 22, 4673-4680 [0076]

\bulletLINO et al. Arch. Biochem. Biophys, 1998, vol. 352, 182-192 [0077]

\bulletMOLLERUP et al. Biotechnol. Bioeng., 1995, vol. 48, 501-505 [0077]

\bulletKORN-FELT et al. Arch. Biochem. Biophys., 1999, vol. 363, 43-54 [0077]

\bulletPERSSON et al. J. Biol. Chem., 1997, vol. 272, 19919-19924 [0079]

\bulletPERSSON FEBS Letts., 1997, vol. 413, 359-363 [0079]

\bulletMONROE et al. Brit. J. Haematol., 1997, vol. 99, 542-547 [0087]

\bulletHAGEN et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986, vol. 83, 2412-2416 [0089]

\bullet BROZE MAJERUS J. Biol. Chem., 1990, vol. 255, no. 4. 1242-1247 [0089]

\bullet HEDNER KISIEL J. Clin. Invest., 1983, vol. 71, 1836-1841 [0089]

\bulletBJOERN et al. Research Disclosure, 1986, vol. 269, 564-565 [0089]

\bullet CUNNINGHAM WELLS Science, 1989, vol. 244, 1081-1085 [0091]

\bullet DE VOS et al. Science, 1992, vol. 255, 306-312 [0091]

\bulletSMITH et al. Journal of Molecular Biology, 1992, vol. 224, 899-904 [0091]

\bulletWLODAVER et al. FEBS Letters, 1992, vol. 309, 59-64 [0091]

\bulletWAKABAYASHI et al. J. Biol. Chem., 1986, vol. 261, 11097- [0094]

\bulletTHIM et al. Biochem., 1988, vol. 27, 7785- [0094]

\bulletOSTERUD et al. Biochem., 1972, vol. 11, 2853- [0095]

\bulletHEDNER et al. J. Clin. Invest., 1983, vol. 71, 1836- [0095]

Claims

1. Composición líquida, acuosa que comprende

(i): Un polipéptido del Factor VII

(ii): Un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0;

(iii): Un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas, donde la concentración de (iii) es al menos 15 mM; y

(vii): Un antioxidante.

2. Composición según la reivindicación 1, que comprende además (iv) un agente modificador de fuerza iónica.

3. Composición según la reivindicación 2 donde el agente modificador de fuerza iónica (iv) es seleccionado de la lista de: una sal neutra, por ej., cloruro sódico; un aminoácido; o un péptido pequeño o una mezcla de al menos dos de dichos agentes modificadores.

4. Composición según la reivindicación 3 donde el agente modificador de fuerza iónica (iv) es cloruro sódico.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el agente (iii) está presente en una concentración de al menos aproximadamente 25 mM, tal como al menos aproximadamente 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, o al menos aproximadamente 800 mM.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde el agente (iv) está presente en una concentración de al menos aproximadamente 5 mM, tal como al menos aproximadamente 10 mM, 20 mM, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM, 800 mM, 1000 mM, 1200 mM, 1500 mM, 1800 mM, 2000 mM, o al menos aproximadamente 2200 mM.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la sal cálcica es seleccionada de la lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, gluconato cálcico, y levulinato cálcico.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la sal magnésica es seleccionada de la lista de: cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico, gluconato magnésico, y levulinato magnésico.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde el agente (iii) es seleccionado de la lista de: cloruro cálcico, acetato cálcico, cloruro magnésico, acetato magnésico, sulfato magnésico, o una mezcla de los mismos; y donde el agente modificador de fuerza iónica (iv) es cloruro sódico.

10. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además (v) un agente modificador de tonicidad.

11. Composición según la reivindicación 10, donde el agente modificador de tonicidad (v) es seleccionado de la lista de: una sal neutra; un mono-, di- o polisacárido; un alcohol de azúcar; un aminoácido; o un péptido pequeño o una mezcla de al menos dos de dichos agentes modificadores.

12. Composición según las reivindicaciones 10 u 11, donde el agente modificador de tonicidad (v) está presente en una concentración de desde 1 mM hasta 500 mM.

13. Composición según la reivindicación 12, donde la concentración es 10-250 mM.

14. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que comprende además (vi) un surfactante no iónico.

15. Composición según la reivindicación 14, donde el surfactante no iónico es un polisorbato o un poloxámero o un éter de polioxietileno alquilo tal como poloxámero 188, poloxámero 407, polisorbato 20, polisorbato 80, o polioxi 23 lauril éter.

16. Composición según la reivindicación 1, donde el antioxidante (vii) es seleccionado de la lista de: L- o D-metionina, un análogo de metionina, un péptido con metionina, un homólogo de metionina, ácido ascórbico, cisteína, homocisteina, glutationa, cistina, y cistationina.

17. Composición según la reivindicación 16 donde el antioxidante es metionina, preferiblemente L-metionina.

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18. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 16 a 17, donde el antioxidante está presente en una concentración de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, tal como desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 4 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 3 mg/ml, desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 2 mg/ml, o desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2 mg/ml.

19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el pH es mantenido en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0, tal como desde aproximadamente 4.5 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.0 hasta aproximadamente 7.0, desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 7.0, o desde aproximadamente 6.0 hasta aproximadamente 7.0.

20. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, donde el agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 7.0 es seleccionado de la lista de ácidos y sales de: citrato, acetato, histidina, malato, fosfato, ácido tartárico, ácido succínico, MES, HEPES, Imidazol, TRIS, lactato, glicilglicina, PIPES, glicina, o una mezcla de al menos dos de dichos agentes.

21. Composición según la reivindicación 20, donde la concentración del agente es desde aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM.

22. Composición según la reivindicación 2, donde la concentración del tampón es de aproximadamente 10 mM.

23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende además (viii) un conservante, tal como fenol, alcohol bencílico, orto-cresol, meta-cresol, para-cresol, metil paraben, propil paraben, cloruro de benzalconio, o cloruro de benzatonio.

24. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que es isotónica.

25. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que es formulada para administración farmacéutica.

26. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que es estable durante al menos 6 meses a 2-8ºC.

27. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde el polipéptido del Factor VII es el factor humano VIIa, preferiblemente el factor humano VIIa hecho de forma recombinante.

28. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 26, donde el polipéptido del factor VII es una variante de secuencia del factor VII.

29. Composición según la reivindicación 28, donde la proporción entre la actividad del polipéptido del factor VII y la actividad del Factor humano nativo VII (FVIIa tipo salvaje) es al menos aproximadamente 1,25, preferiblemente al menos aproximadamente 2,0, o 4,0, de la forma más preferida al menos aproximadamente 8,0, cuando es evaluada en el "ensayo de proteólisis in vitro" como se describe en la presente descripción.

30. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, donde el polipéptido del factor VII está presente en una concentración de desde aproximadamente 0,1 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, tal como desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 5,0 mg/ml, desde aproximadamente 0,6 hasta aproximadamente 4,0 mg/ml, o desde aproximadamente 1,0 mg/ml hasta aproximadamente 4,0 mg/ml.

31. Método para preparar una composición líquida acuosa de un polipéptido del factor VII que comprende la fase de suministrar polipéptido del factor VII a una solución que comprende (ii) un agente adecuado para mantener el pH en el rango de desde aproximadamente 4.0 hasta aproximadamente 8.0. (iii) un agente seleccionado de la lista de: una sal cálcica, una sal magnésica, o una mezcla de las mismas; donde la concentración de (iii) es de al menos 15 mM; y (vii) un antioxidante.

32. Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30 para la preparación de un medicamento para tratar alteraciones hemorrágicas.

33. Uso según la reivindicación 3, donde dicha alteración hemorrágica es seleccionada del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del Factor XI, deficiencia del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, presencia de inhibidores para factores de coagulación, cirugía, hemorragia intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.

34. Composición como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1- 30 para el uso en el tratamiento de alteraciones hemorrágicas.

35. Composición para el uso según la reivindicación 34, donde dicha alteración hemorrágica es seleccionada del grupo que consiste en hemofilia A, hemofilia B, deficiencia del Factor XI, deficiencia del Factor VII, trombocitopenia, enfermedad de von Willebrand, presencia de inhibidores de factores de coagulación, cirugía, hemorragia intracerebral, traumatismo y terapia anticoagulante.