JP2013121967A - 第ｖｉｉ因子ポリペプチドの液体組成物 - Google Patents

Abstract

【課題】化学的および／または物理的分解に対して安定した第ＶII因子ポリペプチドを含有する液体水性組成物、および該組成物の製造方法並びに使用方法の提供。
【解決手段】（ｉ）第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する液体水性組成物であって、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである組成物である。２乃至８℃において少なくても６ヶ月保管された場合に、化学的および／または物理的に安定である。
【選択図】なし

Description

本発明は、第ＶII因子ポリペプチドを含有する液体水性組成物、および該組成物の製造方法並びに使用に関する。より詳細には、本発明は、化学的および／または物理的分解に対して安定した液体組成物に関する。

血液凝固過程に関わる種々の因子（第ＶII因子（ＦＶII）を含む。）が血漿糖蛋白質として同定されてきた。止血は、血管壁への損傷により循環する血管に曝露される組織因子（ＴＦ）と全ＦＶII蛋白質質量の約１％に相当する量において循環中に存在するＦＶIIａとの
複合体の形成により開始される。ＦＶIIは、血漿中に主として一本鎖チモーゲンとして存在し、ＦＸａにより、活性形態である二本鎖ＦＶIIａに分離される。組換え活性化された第ＶII因子（ｒＦＶＩＩａ）は、プロ−止血剤として開発されてきた。ｒＦＶＩＩａの投与は、抗体形成のために凝固因子生成物により処理され得ない出血を有する血友病対象において急速且つ非常に効果的なプロ−止血応答を提供する。また、第ＶＩＩ因子欠失である対象における出血、または凝固システムは正常である対象における出血、並びに過度の出血は、ＦＶＩＩａを用いてうまく治療され得る。

保管および配達の双方に好適である第ＦＶＩＩａ因子の投与形態を有することが所望される。薬剤製品は液体として保管され投与されることが理想的である。あるいは、薬物製品を真空状態で凍結乾燥し、その後患者が使用する直前に好適な希釈剤を加えることにより元に戻す。薬剤製品は長期間（すなわち、６ヶ月以上）保存状態におかれることに対して安定性を有することが理想である。

完成した薬剤製品を液体として維持するか、あるいは凍結乾燥するか否かの決定は、これら形態における蛋白の安定性に基づく。蛋白安定性は、とりわけ、イオン強度、ｐＨ、温度、凍結／解凍の繰り返しサイクル、および剪断力に対するエクスポージャー等の因子による影響を受け得る。活性蛋白は、変性および凝集（溶解性および不溶性アグリゲート双方の形成）を含む物理的不安定性、並びに例えば、加水分解、アミド分解および酸化を含む化学的不安定性の結果として失われ得る。蛋白調合薬の安定性の一般的記事に関しては、例えば、マニング等、ファーマスーティカル・リサーチ６：９０３−９１８（１９８９）を参照のこと。

蛋白不安定性の発現し得る可能性については広く認識されているが、特定の蛋白に関する特定の不安定性に係る問題を予測することは不可能である。これら不安定性のいずれもが、活性が低く、毒性が増加し、および／または免疫原生の増加した蛋白副産物、または誘導体をもたらし得る。事実、蛋白の析出により、血栓症、投薬形態および量の非一様性、並びに注射器詰まりが生じ得る。更に、例えば、Ｎ−末端におけるあるグルタミン酸残基のガンマカルボキシル化および炭水化物側鎖の付加等、変質後の変異により、保存時に変異しやすいポテンシャル部位が提供される。また、セリンプロテアーゼとなる第ＶＩＩａ因子に特有な、自触反応による断片化が生じ得る（酵素的分解）。従って、すべての蛋白組成物の安全性および有効性は、その安定性に直接的に関与する。液体形態における安全性を維持することは、凍結乾燥された形態における場合とは、分子運動のポテンシャルがかなり増加し、故に分子間相互作用の蓋然性が増加するため、概して異なる。濃縮された形態において安全性を維持することもまた、増加した蛋白濃度においてアグリゲート形態となる傾向のため、異なる。

液体組成物を開発する場合においては、多くの因子が考慮される。短期間（すなわち、６ヶ月未満）における液体安定性は、概して、肉眼的構造変化（例えば、変性および凝集等）を避けることに依存する。これらの過程については、蛋白質に関する多くの文献に記載されており、安定化剤の多くの例が存在する。一種類の蛋白の安定化に有効である試薬が現に他の蛋白を不安定化させる作用を有することは周知である。一旦蛋白が肉眼的構造変化に対して安定化されると、長期間安定性（例えば、６ヶ月以上）に係る液体組成物の開発は、該蛋白に特有の分解型から蛋白を更に安定化することに帰着する。より具体的な分解型には、ジスルフィド結合のscrambling、ある残基の酸化、アミド分解、環化等が含まれ得る。個々の分解種を正確に指摘することは常に可能ではないが、関心ある蛋白を独自に安定化させるための特定の賦形剤の性能をモニターするように、わずかな変化をモニターするアッセイが開発されている。

安定性に関する考慮に加えて、一般的に、様々な世界中の医薬規制機関により認可されている賦形剤が選択される。組成物のｐＨは、注射／点滴時において生理的に好適な範囲であることが望ましく、そうでない場合には患者に痛みや不快感を与える場合がある。

蛋白組成物の一般的な記事に関しては、例えば、Cleland等：The development
of stable protein compositions: A closer look at protein aggregation, deamidation and oxidation, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 1993, 10 (4): 307-377; およびWang等、Parenteral compositions of proteins and peptides: Stability and stabilizers, Journal of Parenteral Science and Technology1988 (増刊), 42 (25)を参照されたい。

蛋白の安定に関して興味ある他の出版物は以下の通りである。

U.S. 20010031721 A1 (American Home Products)は、高濃度に濃縮され、凍結乾燥された、液体第ＩＸ因子組成物に関する。

U.S. 5,770,700 (Genetics Institute)は、液体第ＩＸ因子組成物に関する。

WO 97/19687 (American Red Cross)は、血漿蛋白の液体組成物、特に第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子に関する。

U.S. 4,297,344は、選択されるグリシン、アラニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン、およびアミノ酪酸等のアミノ酸、および単糖類、オリゴ糖、または糖アルコール等の炭水化物を添加することによる熱に対する凝固第ＩＩ因子および第ＶＩＩＩ因子、抗トロンビンＩＩＩ、およびプラスミノゲンの安定性について開示している。

第ＶＩＩａ因子はいくつかの分解経路、特に凝集（二量化）、酸化、および自己分解開裂（ペプチド主鎖の切り取り）を経る。更に、析出が生じ得る。これらの反応の多くは、蛋白から水を除去することにより有意に遅延され得る。しかしながら、第ＶＩＩａ因子に関する水性組成物の開発により、水を加えてもとに戻す場合のミスが排除されるという利点がもたらされ、これにより調薬の精度が増加すると共に、臨床的に生成物の使用が簡易となり、ゆえに患者の従順さが増加した。理想的には、第ＶＩＩａ因子の組成物は幅広い蛋白濃度に亘って６ヶ月以上安定であり得る。これにより、投与方法に柔軟性が生ずる。概して、より高濃度化された形態により、より少ない容積での投与が可能となり、これは患者の立場からさらに望ましいことである。液体組成物は、投与および使用の容易さに関しては凍結乾燥された生成物に対し多くの利点を有する。

今日において、唯一商業的に入手可能な、組換えＦＶＩＩポリペプチド組成物は、使用前に水を加えて戻す凍結乾燥されたＦＶＩＩａ製品であり、ＶＩＩａ濃度は比較的低く、例えば約０．６ｍｇ/ｍｌである。ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ、デンマーク）の小瓶（１．２ｍｇ）には、組換えヒト第ＶＩＩａ因子：１．２ｍｇ、ＮａＣｌ：５．８４ｍｇ、ＣａＣｌ_２：２．９４ｍｇ、Ｈ_２Ｏ：２、ＧｌｙＧｌｙ：２．６４ｍｇ、ポリソルベイト８０：０．１４ｍｇ、マニトール：６０．０ｍｇが含まれており、注射（ＷＦＩ）のためにｐＨ５．５になるまで２．０ｍｌまでの水を加えて戻す。戻された場合、蛋白溶液は２４時間使用に関して安定である。したがって、非液体仕様または濃縮された第ＶＩＩ因子製品が現時点において商業的に入手することができる。

したがって、当該分野においては、ヒト第ＶＩＩａ因子を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチドの安定性（化学的および／または物理的安定性）を改良し、濃度を増加し、活性レベルを維持し、保管に適した液体組成物を提供する方法が必要とされている。ゆえに、本発明は、酵素的分解または自触反応生成物のような化学的および／または物理的分解の満足できる調整を可能とする水性第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物を提供することを目的とする。

２−８℃において３ヶ月保管後におけるＦＶＩＩアグリゲートおよびＦＶＩＩフラグメントの含有量を示す図。

本発明により、第ＶＩＩ因子またはその類延体（「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」）が、緩衝剤、およびカルシウムまたはマグネシウム塩もしくはこれらの混合物と共に少なくとも１５ｍＭの濃度において水溶液中に調製される場合、ｐＨが約４乃至約８の範囲において安定であることが見出された。

一態様において、本発明は、（ｉ）第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有し、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである液体水性組成物を提供する。

異なる態様において、前記試薬（ｉｉｉ）は少なくとも約２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、または少なくとも１０００ｍＭの濃度において存在する。

他の態様において、本組成物は更に（ｉｖ）イオン強度調整剤を含有する。

異なる態様において、前記イオン強度調整剤は、中性塩（例えば、塩化ナトリウム；アミノ酸；または小ペプチド、もしくはこれら試薬の少なくとも２種の混合物からなる群から選択される。

異なる態様において、前記試薬（ｉｖ）は、少なくとも約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭ、１５００ｍＭ、１８００ｍＭ、２０００ｍＭ、または少なくとも２２００ｍＭの濃度において存在する。

一連の態様において、前記試薬（ｉｉｉ）（カルシウムおよび／またはマグネシウム塩）は、約１５ｍＭ乃至約１０００ｍＭの濃度において存在し、例えば、約２５ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約３００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約５００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ、約７００ｍＭ乃至約１０００ｍＭ；約１５ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約３００ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約８００ｍＭ、約５００ｍＭ乃至約８００ｍＭ；約１５ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約１５ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約６００ｍＭ、約３００ｍＭ乃至約６００ｍＭ；約１５ｍＭ乃至約４００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約４００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約４００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約４００ｍＭの濃度において存在する。

一連の態様において、前記試薬(ｉｖ)（イオン強度調整剤）は、約５ｍＭ乃至約２２００ｍＭの濃度において存在し、例えば、約２５ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１４００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１６００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約１８００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ、約２０００ｍＭ乃至約２２００ｍＭ；約５ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約５ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約１４００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ、約１６００ｍＭ乃至約１８００ｍＭ；約５ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約１４００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約１５００ｍＭ；約５ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約２５ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約１２００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約１２００ｍＭの濃度において存在する。

好ましい一態様において、試薬（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の合計濃度は約５０ｍＭ乃至約２５００ｍＭであり、例えば、約１００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約１４００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約１６００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約１８００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ、約２０００ｍＭ乃至約２５００ｍＭ；約５０ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約１４００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ、約１６００ｍＭ乃至約２０００ｍＭ；約５０ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約５０ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約１００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約２００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約４００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約６００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約８００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約１０００ｍＭ乃至約１６００ｍＭ、約１２００ｍＭ乃至約１６００ｍＭである。

一態様において、試薬（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、（ｉｉｉ）が約６００ｍＭ乃至約８００ｍＭ、（ｉｖ）が０ｍＭ乃至約５ｍＭの濃度において存在し；他の態様において、試薬（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、（ｉｉｉ）が約３００ｍＭ乃至約５００ｍＭ、（ｉｖ）が約１１００ｍＭ乃至約１３００ｍＭの濃度において存在し；他の態様において、試薬（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、（ｉｉｉ）が約１００ｍＭ乃至約３００ｍＭ、（ｉｖ）が約１５００ｍＭ乃至約１９００ｍＭの濃度において存在し；更に他の態様において、試薬（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、（ｉｉｉ）が約５０ｍＭ乃至約１５０ｍＭ、（ｉｖ）が約１８００ｍＭ乃至約２３００ｍＭの濃度において存在する。

異なる態様において、本組成物のイオン強度は、少なくとも５０であり、例えば、少なくとも７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００、６５０、８００、１０００、１２００、１６００、２０００、２４００、２８００、または少なくとも３２００である。

異なる態様において、カルシウム塩は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、およびレブリン酸カルシウムからなる群から選択される。異なる態様において、マグネシウム塩は、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、レブリン酸マグネシウム、および強酸の塩からなる群から選択される。

好ましい態様において、試薬（ｉｉｉ）は、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、またはこれらの混合物からなる群から選択され、イオン強度調整剤は（ｉｖ）は、塩化ナトリウムである。

更なる態様において、本組成物は更に（ｖ）張度調整剤を含有する。

異なる態様において、（ｖ）張度調整剤は、中性塩；単糖、二糖、多糖；糖アルコール；アミノ酸；または小ペプチドからなる群から選択され、もしくはこれら調整剤の少なくとも２種の混合物である。

一態様において、張度調整剤（ｖ）は、約１ｍＭ乃至約５００ｍＭ、約１ｍＭ乃至約３００ｍＭ、約１０ｍＭ乃至約２００ｍＭ、または約２０ｍＭ乃至約１５０ｍＭの濃度において存在する。

更なる態様において、本組成物は更に（ｖｉ）非イオン性表面活性剤を含有する。

一態様において、該非イオン性表面活性剤は約０．００５乃至約２．０質量％の量において存在する。

異なる態様において、非イオン性表面活性剤は、ポリソルベートまたはポロキサマー（poloxamer）またはポリオキシエチレンアルキルえーてるであり、好ましくはポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはポリオキシ２３ラウリルエーテルである。

異なる態様において、本組成物は更に（ｖｉｉ）酸化防止剤を含有する。異なる態様において、酸化防止剤（ｖｉｉ）は、Ｄ−またはＬ−メチオニン、メチオニン類縁体、メチオニン含有ペプチド、アスコルビン酸、システイン、例えばホモシステイン等のメチオニン−相同体、グルタチオンである。好ましい態様において、酸化防止剤はＬ−メチオニンである。一態様において、酸化防止剤は、約０．１乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する。

一態様において、本組成物のｐＨは約４．０乃至約７．０の範囲に維持され、例えば、約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．５乃至約７．０、または約６．０乃至約７．０の範囲に維持される。

一態様において、ｐＨを約４．０乃至約７．０の範囲に維持するのに好適な緩衝剤は、くえん酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該緩衝剤の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩の群から選択される。

一態様において、緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ乃至１００ｍＭ、１ｍＭ乃至約５０ｍＭ、約１ｍＭ乃至約２５ｍＭ、約２ｍＭ乃至２０ｍＭ、または約１０ｍＭである。

更なる対応において、本組成物は更に（ｖｉｉｉ）防腐薬を含有する。一態様において、該防腐薬は、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン（methyl paraben）、プロピルパラベン（propyl paraben）、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムからなる群から選択される。

一態様において本組成物は等張性であり、他の態様において高張性である。一態様において、本組成物は薬剤投与のために調合される。一態様において、本組成物は２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間安定しており、および／または安定化されている。

異なる態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子、組換えヒト第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、第ＶＩＩ因子配列変異体、または第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比が、本願明細書に記載された「インヴィトロ蛋白分解アッセイ」において試験される場合、少なくとも約１．２５であり、好ましくは少なくとも約２．０もしくは４．０であり、特に好ましくは少なくとも約８．０である第ＶＩＩ因子ポリペプチド、である。一態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子とは異なる糖化を有する。

異なる態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約１０ｍｇ/ｍｌの濃度において存在し、例えば約０．５ｍｇ/ｍｌ乃至約５．０ｍｇ/ｍｌ、約０．６ｍｇ/ｍｌ乃至約４．０ｍｇ/ｍｌ、または約１．０ｍｇ/ｍｌ乃至約４．０ｍｇ/ｍｌ、約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約５．０ｍｇ/ｍｌ、約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約４．０ｍｇ/ｍｌ、約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約２．０ｍｇ/ｍｌ、または約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約１．５ｍｇ/ｍｌの濃度において存在する。

更なる態様において、本発明はまた、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性組成物の製造方法であって、（ｉ）第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬、を含有する溶液中、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供する工程を有し、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである方法を提供する。

また、更なる態様において、本発明はまた第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療用薬剤の製造のための本組成物の使用に関する。

更なる態様において、本発明は、第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療方法であって、出欠が減少する条件下または血液凝固が増加する条件下において、（ｉ）第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有し、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである水性液体組成物の有効量を、第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療を必要とする対象に投与することを含む方法に関する。

異なる態様において、該症候群は、血友病Ａ、血友病Ｂ、第ＸＩ因子欠損、第ＶＩＩ因子欠損、血小板減少症、ヴォン・ヴィレブランド病、凝固阻害因子の存在、外科的手術、脳内出血、傷害、および抗凝固療法からなる群から選択される。

発明の詳細な説明
本発明に係る組成物は、安定性において有用であり、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用態様の組成物として好ましい。本組成物は、２乃至８℃の範囲の温度において保管された場合に、少なくとも６ヶ月間は安定であり、好ましくは３６ヶ月まで安定である。本組成物は、２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間保管された場合に、化学的および／または物理的において安定であり、特に化学的に安定である。

「安定」とは、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後、ＷＯ９２／１５６８６（例ＩＩ）に実質的に記載されている一段階凝固アッセイにより測定したその当初の生物学的活性の少なくとも５０％が保たれていることを意味する。つまり、試験されるサンプルは５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡに希釈され、１００μｌが１００μｌの第ＶＩＩ因子欠損血漿および１０ｍＭのＣａ^２＋を含有する２００μｌのトロンボプラスチンＣでインキュベートされる。凝固時間が測定され、参照標準または連続希釈物中のクエン酸塩正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較される。

安定な組成物は、好ましくは、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後において、その当初活性の少なくとも８０％を保つ。

「安定化された」という用語（「比較的安定な」と交換的に使用され得る。）、２乃至８℃における少なくとも６ヶ月間の保管後において、組成物が以下に示す分解生成物、すなわち、（ｉ）酵素的分解生成物、（ｉｉ）凝集体）（二量体、オリゴマー、ポリマー）、（ｉｉｉ）酸化形態、（ｉｖ）アミド分解形態の少なくとも一種を、同様の期間、同様の条件下において保管され、水を加えて元に戻されたＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（登録商標）の溶液中に含有される対応する分解生成物の量との比較において、より少ない量において保持することをいう。

「物理的に安定」という用語は、視覚的に透明性を維持する組成物を示すことが意図される。本組成物の物理的安定性は、様々な期間、異なる温度において組成物を保管した後における視覚検査および濁りを評価する手段により行われる。組成物は、視覚的に濁りが観察されると物理的に不安定であるとして分類される。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「物理的安定性」という用語は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの二量体、オリゴマーおよびポリマー形態、並びに分子の構造的変形および変性体すべての形態における不溶性および／または溶解性アグリゲートの形成に関する。

「化学的に安定」という用語は、２乃至８℃における６ヶ月間の保管後において、ＷＯ９２／１５６８６に実質的に記載されている一段階凝固アッセイにより測定したその当初の生物学的活性の少なくとも５０％が保たれていることを意味する。

「化学的安定性」という用語は、早められた条件下において、溶液中での保管時に、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおけるすべての化学的変化の形成に関するものであることが意図される。例えば、加水分解、アミド分解、および酸化、並びに第ＶＩＩ因子ポリペプチドのフラグメントの形成をもたらす酵素的分解であり、特に、硫黄含有アミノ酸は、対応するスルフォキシドの形成で酸化される傾向がある。

本組成物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、カルシウムおよび／またはマグネシウムイオン、緩衝剤を含有し、任意に、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを更に安定化させるイオン強度調整剤および張度調整剤を含む他の添加剤を含有する。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は、約０．１乃至約１０ｍｇ／ｍＬの範囲である。

ここで使用される「イオン強度調整剤」という用語には、溶液のイオン強度の一因となる試薬が含まれる。該試薬には、限定するものではないが、中性塩（塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）；アミノ酸；小ペプチド（例えば、２乃至５個のアミノ酸残基を有する。例えば、グリシルグリシン）、またはこれら調整剤の少なくとも２種の混合物が含まれる。好ましい試薬は、塩化ナトリウムである。イオン強度調整剤は、少なくとも約５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭ、１５００ｍＭ、１８００ｍＭ、２０００ｍＭ、または少なくとも２２００ｍＭの濃度において存在する。

ここで使用される「張度調整剤」という用語には、溶液の重量オスモル濃度の一因となる試薬が含まれる。張度調整剤には、限定するものではないが、アミノ酸；小ペプチド（例えば、２乃至５個のアミノ酸残基を有する。）；中性塩；単糖類または二糖類；多糖類；糖アルコール、またはこれら調整剤の少なくとも二種の混合物が含まれる。張度調整剤の例としては、限定するものではないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、スクロース、グルコース、グリシルグリシンおよびマニトールが挙げられる。存在する他の成分に依存するが、張度調整剤は、通常、約１乃至約５００ｍＭ、約１乃至約３００ｍＭ、約１０乃至約２００ｍＭ、または約２０乃至約１５０ｍＭの濃度において存在する。中性塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）が使用され得る。

「中性塩」は、水溶液中に溶解した時に賛成も塩基性も示さない塩を意味する。

「ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬」という語句には、溶液のｐＨが約４．０乃至約８．０の範囲となることを満たすように維持する試薬が含まれ、例えば、約４．０乃至約７．０、約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．０乃至約６．５、約５．５乃至約７．０、約５．５乃至約６．５、約６．０乃至約７．０、約５．０乃至約６．０、約６．４乃至約６．６または６．５、約５．２乃至約５．７または約５．５の範囲を満たすよう維持する試薬が含まれる。かかる語句は、「緩衝剤」と互換的に使用され得る。これら試薬には、限定するものではないが、くえん酸塩（例えば、ナトリウムまたはカリウム）、酢酸塩（例えば、アンモニウム、ナトリウムまたはカルシウム）、ヒスチジン（Ｌ−ヒスチジン）、リンゴ酸塩、リン酸塩（ナトリウムまたはカリウム）、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グルタミン酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該緩衝剤の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩を含み得る。緩衝剤の濃度範囲は、溶液のｐＨを好ましい範囲に維持するよう選択される。緩衝剤はまた、少なくとも２種の緩衝剤の混合物であり得、該混合物は特定範囲のｐＨを与えることができる。ある態様において、緩衝剤濃度は、約１ｍＭ乃至約１００ｍＭ、約１ｍＭ乃至約５０ｍＭ、約１ｍＭ乃至約２５ｍＭ、約２ｍＭ乃至約２０ｍＭ、または約１０ｍＭの範囲である。

本組成物はまた、任意に表面活性剤または洗剤を含有し得る。「表面活性剤」または「洗剤」には、一般的に、蛋白を空気／溶液界面誘発圧力および溶液／表面誘発圧力から保護する試薬が含まれる（例えば、蛋白凝集体が得られる。）。洗剤は、好ましくは、限定するものではないが、ポリソルベート２０または８０等のポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標））；ポロキサマー１８８または４０７等のポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはポロキサマー（poloxamer）（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオール）および他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマー、またはＰＥＧ８０００等のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む非イオン性洗剤である。表面活性剤は、約０．００５乃至約２．０％の範囲の量において存在する。

本組成物は、任意に酸化防止剤を含有し得る。酸化防止剤には、限定するものではないが、アスコルビン酸、システイン、シスタチオニン、メチオニン、グルタチオン、およびシステインまたはメチオニンを含む他のペプチド（特に、２乃至５個のアミノ酸残基（少なくとも１個の残基はメチオニンまたはシステイン残基である）を有するペプチド）が含まれ、メチオニン（特にＬ−メチオニン）が好ましい。酸化防止剤は、０．１乃至５ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば、０．１乃至４ｍｇ／ｍｌ、０．１乃至３ｍｇ／ｍｌ、０．１乃至２ｍｇ／ｍｌ、０．５乃至２ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する。

防腐薬もまた、微生物の増殖を阻止するために本組成物に含有され得、これにより第ＶＩＩ因子ポリペプチドの「複数回使用」包装が可能となる。防腐薬には、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン（methyl paraben）、プロピルパラベン（propyl paraben）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムが含まれる。ｐＨ範囲や防腐薬の種類にも依存するが、防腐薬は通常、０．１乃至２０ｍｇ／ｍｌの濃度において含まれる。組成物はまた、任意にアミド分解を阻止することができる試薬を含有し得る。

ここで特定される量は、±約１０％であることが理解される。例えば、約５０ｍＭは５０ｍＭ±５ｍＭを含み、また、４％は４％±０．４％を含む。

百分率は、溶液に溶解する固体および溶液中で混合される液体をいう場合の双方について、（質量／質量）を表す。例えば、Ｔｗｅｅｎについては、溶液の１００％ストック／質量の質量である。

「イオン強度」なる用語は、次式により規定される溶液のイオン強度（μ）である。

μ＝１／２Σ（［ｉ］Ｚｉ^２）
式中、μはイオン強度であり、［ｉ］はイオンのモル濃度であり、Ｚｉは該イオンの変化（＋または−）である（ジェームス・フリッツおよびジョージ・シェンク：クオーテーションアナリティカルケミストリー、１９７９）。

本発明の異なる態様において、本組成物のイオン強度は少なくとも５０であり、例えば、少なくとも７５、１００、１５０、２００、２５０、４００、５００，６５０、８００、１０００、１２００、１６００、２０００、２４００、２８００、または少なくとも３２００である。

「等張」なる用語は、「血清（serum）に関する等張」、すなわち、約３０００±５０ミリオスモル／ｋｇにおいてである。等張は、投与前の溶液の重量オスモル濃度の測定であることを意味する。用語「高張」は、血清の生理的レベルを超える重量オスモル濃度のレベル（例えば、３００±５０ミリオスモル／ｋｇを超えるレベル）を示すことを意味する。

「薬学的に有効な量」または「有効量」なる用語は、資格を有する専門家により決定される有効な投薬量であり、該専門家は所望される反応を得るために投与量を滴定し得る。投薬量を検討するための因子には、効能、バイオアベイラビリティ、所望される薬物動力学的／薬力学的プロフィル、治療条件、患者関連因子（例えば、体重、健康、年齢等）、同時に投与される薬物（例えば、抗凝固剤）、投与時間、または医薬専門家に公知の他の因子が含まれる。

「治療」なる用語は、疾患、体調不良、または障害に立ち向かう目的をもって対象（例えば哺乳類であり、特にヒトである。）を管理および介護することとして定義され、症候または合併症の攻撃を防止するため、または症候または合併症を軽くするため、もしくは疾患、体調不良または障害を除去するために第ＶＩＩ因子ポリペプチドを投与することを含む。第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する本発明に係る薬学的組成物は、その治療がひつような対象に非経口的に投与され得る。非経口的投与は、注射器（任意にペン様注射器であり得る。）を用い、皮下注射、筋肉注射、または静脈注射により行われ得る。あるいは、注入ポンプにより行われ得る。

第ＶＩＩａ因子の濃度は、従来より、ｍｇ／ｍＬまたはＩＵ／ｍＬとして表される（１ｍｇは一般に４３０００−５６０００ＩＵまたはそれ以上を表す。）。

使用方法：
本発明の調製物は、例えば、限定するものではないが、凝固因子欠損（例えば、血友病ＡおよびＢ、または凝固第ＸＩ因子または第ＶＩＩ因子欠損）；血小板減少症またはヴォン・ヴィレブランド病、または凝固因子インヒビターによるものを含め、出血障害等の第ＶＩＩ因子応答性症候群すべての治療のめに使用することができる。該調製物はまた、外科的治療または他の外傷に関連する患者、または抗凝血性治療を受けている患者に投与することができる。

本発明に従い調製される第ＶＩＩ因子ポリペプチド：
「ヒト第ＶＩＩ因子」または「ＦＶＩＩ」なる用語は、天然源抽出および精製を含む方法により製造されるヒト第ＶＩＩ因子、また組換え細胞培養システムにより製造されるヒト第ＶＩＩ因子を示す。その配列および特性は、例えば、ＵＳ特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。該用語は、同様に、生物学的に活性なヒト第ＶＩＩ因子等価物（例えば全配列において１またはそれ以上のアミノ酸（複数）が異なる）を含むものである。更に、ここで使用される用語は、第ＶＩＩ因子の置換、欠失、および挿入アミノ酸変異体または翻訳後の変異を含むものである。ここで使用される「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」は、限定するものではないが、第ＶＩＩ因子、並びに第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含む。第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、限定するものではないが、ヒト第ＶＩＩ因子に関して化学的に修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含み、および／または、ヒト第ＶＩＩ因子に関して１または複数のアミノ酸配列変更（すなわち、第ＶＩＩ因子変異体）を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチド、および／または、ヒト第ＶＩＩ因子に関して切断されたアミノ酸配列（すなわち、第ＶＩＩ因子フラグメント）を含む第ＶＩＩ因子ポリペプチドを包含する。かかる第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩ因子に関して、安定性、リン脂質結合、改変された比活性等を含む異なる特性を示し得る。

用語「第ＶＩＩ因子」とは、切断されていない（チモーゲン）形での第ＶＩＩ因子ポリペプチド、及び第ＶＩＩａ因子と呼ばれるそれらのそれぞれの生活性形を生成するよう、タンパク質加水分解的に処理されているそれらのペプチドを包含することを意図される。典型的には、第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩａを生成するために、残基１５２と１５３との間で切断される。用語「第ＶＩＩ因子」とはまた、限定するものではないが、野生型ヒト第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列１−４０６を有するポリペプチド（Ｕ．Ｓ．特許第４，７８４，９５０号明細書に記載されている。）、および他の種（例えば、ウシ、ブタ、イヌ、ネズミ、サケ第ＶＩＩ因子から誘導された野生型第ＶＩＩ因子を包含することを意図される。更に、第ＶＩＩ因子は、一個体から他の個体へ存在し且つ発現し得る第ＶＩＩ因子の天然対立因子変異体をも包含する。また、糖化または他の翻訳後の修飾の程度および位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存し変化し得る。

ここで使用される「第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」は、限定するものではないが、野生型ヒト第ＶＩＩ因子に関して実質的に同じか又は改良された生物学的活性を示すポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、限定するものではないが化学的に修飾された第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子、ポリペプチドの対生物活性を修飾しまたは破壊する、特定のアミノ酸配列変更が導入されている第ＶＩＩ因子変異体が包含される。

第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドにはまた、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが含有され、例えば、Ｎ−末端アミノ酸欠失又は付加を包含する修飾されたＮ−末端を有するポリペプチド、及び／又はヒト第ＶＩＩａ因子に関して化学的に修飾されているポリペプチドを包含する。

第ＶＩＩ因子の変異体を包含し、野生型第ＶＩＩ因子と同じかまたはそれよりも優れた生物活性を示す第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、限定するものではないが、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換により野生型第ＩＸ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。

変異体を包含し、野生型第ＶＩＩａ因子に関して改良された生物活性を実質的に有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、本明細書に記載のように、１または複数の凝固アッセイ、蛋白分解アッセイ、またはＴＦ結合アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１１０％、より好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。

ある態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド（特に変異体）であり、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は、本願明細書に記載された「インヴィトロ加水分解アッセイ」（以下に示す「アッセイ」を参照のこと。）において試験される場合、少なくとも約１．２５であり、他の態様において、該比は少なくとも約２．０であり、更なる態様において、該比は４．０である。本発明のある態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは第ＶＩＩ因子等価物（特に変異体）であり、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比は、本願明細書に記載された「インヴィトロ蛋白分解アッセイ」（以下に示す「アッセイ」を参照のこと。）において試験される場合、少なくとも約１．２５であり、他の態様において、該比は少なくとも約２．０であり、更なる態様において、該比は４．０であり、更なる態様において、該比は８．０である。

ある態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、例えば、Ｕ．Ｓ．４，７８４，９５０号明細書に記載されているように、ヒト第ＶＩＩ因子（野生型第ＶＩＩ因子）である。ある態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはヒト第ＶＩＩａ因子である。一連の態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子の比生物活性の少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも約１２０％、より好ましくは少なくとも約１４０％、特に好ましくは少なくとも約１６０％を示すポリペプチドを包含する。

ある態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、１または複数のアミノ酸の挿入、欠失、または置換により野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。

一連の態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、Ｕ．Ｓ．４，７８４，９５０号明細書に記載されているように、野生型第ＶＩＩ因子の同一性の少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、特に好ましくは少なくとも約９５％を示すポリペプチドを包含する。アミノ酸配列相同性／同一性は、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラム、バージョン１．８、１９９９（トンプソン等、１９９４、核酸リサーチ、２２：４６７３−４６８０）に記載されているシーケンス配列に関する好適なコンピュータプログラムを用い、整列された配列から便宜的に決定される。野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じか又は改良された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非制限的例は、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩ（Ｉｉｎｏ等、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｐｈｙｓ．３５２：１８２−１９２， １９９８）； Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ， Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＶＩＩ，Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；ＷＯ０１／８３７２５およびＷＯ０２／２２７７６に記載されているような増加したＴＦ−独立活性を示すＦＶＩＩａ変異体；Ｕ．Ｓ．特許第５，５８０，５６０号明細書に開示されるような増加した蛋白分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１との間、又は残基３１５と３１６との間で蛋白分解的に切断されている第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐ等， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８： ５０１−５０５， １９９５）； 及び第ＶＩＩａ因子の酸化形態（Ｋｏｒｎｆｅｌｔ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３： ４３−５４， １９９９）を包含する。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性：
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合し、（ｉｉ）活性化された第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ、第ＩＸａ又はＸａ因子）を生成するために第ＩＸは第Ｘ因子の蛋白分解的切断を触媒するその能力に由来する。

本発明の目的のために、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性（「第ＶＩＩ因子生物学的活性」）は、例えば、Ｕ．Ｓ．特許第５，９９７，８６４号明細書またはＷＯ９２／１５６８６に記載されているように、第ＶＩＩ因子欠失血漿及びトロンボプラスチンを用いて、血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量化され得る。このアッセイにおいては、生物学的活性は、対照サンプルに関して凝固時間の減少として表され、１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準との比較により“第ＶＩＩ因子単位”に転換される。

あるいは、第ＶＩＩａ因子生物学的活性は、
− 脂質膜に埋封されたＴＦ及び第Ｘ因子を含んで成るシステムにおける活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生成する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの能力を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １９９１９−１９９２４， １９９７）；
− 水性システムにおける第Ｘ因子加水分解を測定すること（以下に示す「インビトロ蛋白分解アッセイ」を参照のこと。）；
− 表面プラスチン共鳴に基づく装置を用いて第ＶＩＩａ因子又は第ＩＩ因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的結合を測定すること（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ４１３−３５９−３６３， １９９７）；
− 第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドにより合成基質の加水分解を測定すること（以下に示す「インビトロ加水分解アッセイ」を参照のこと。）；
− ＴＦ−独立インビトロシステムにおけるトロンビンの生成を測定すること、
によって定量化され得る。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性の決定に好適なアッセイ：
本発明に従い有用な第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、簡便な予備的インヴィトロ試験として行われ得る好適なアッセイにより選択され得る。従って、本明細書では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に関し、簡便な試験（表題の「インヴィトロ加水分解アッセイ」）を開示する。

インヴィトロ加水分解アッセイ（アッセイ１）
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子変異体（以下において、双方を「第ＶＩＩａ因子」と称する。）が、比活性についてアッセイされ得る。それらはまた、その比活性を直接的に比較するために並行してアッセイされ得る。アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。色原体基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８、Ｃｈｒａｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ；最終濃度１ｍＭ）が、０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の溶液中、第ＶＩＩａ因子（最終濃度１００ｎＭ）に添加される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^ＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。酵素を含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、２０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と野生型第ＶＩＩａ因子の活性との間の比を計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。

これに基づけば、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性との間の比が、約１．０を超える第ＶＩＩ因子ポリペプチドというように、生来の第ＶＩＩａ因子よりも低いか、相当するか、あるいはそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性はまた、適切には１００−１０００ｎＭの濃度で、生理学的基質、例えば第Ｘ因子を用いて測定され得（「インヴィトロ蛋白分解アッセイ」）、ここで生成される第Ｘａ因子は、適切な色原体基質（例えば、Ｓ−２７６５）の添加の後、測定される。さらに、活性アッセイは、生理学的温度で行われ得る。

インヴィトロ蛋白分解アッセイ（アッセイ２）
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド（以下において、双方とも「第ＶＩＩａ因子」と称する。）が、その比活性を直接的に比較するために並行してアッセイされる。アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ_２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含有する５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）の１００μＬ溶液中、第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）および第Ｘ因子（０．８μＭ）が１５分間インキュベートされる。生成する第Ｘ因子の量を、色原体基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５， Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ）（最終濃度０．５ｍＭ）を添加して測定する。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ^ＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。ＦＶＩＩａを含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、１０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、第ＶＩＩ因子ポリペプチドと野生型第ＶＩＩａ因子との間の蛋白分解活性の比を計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子ポリペプチド）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。

これに基づけば、例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型ＦＶＩＩ）の活性との間の比が、約１．０を超える第ＶＩＩ因子ポリペプチドというように、生来の第ＶＩＩａ因子よりも低いか、相当するか、あるいはそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩ因子ポリペプチドを同定することができる。

トロンビンを生成する第ＶＩＩａ因子または第ＶＩＩ因子ポリペプチドの能力はまた、すべての適切な凝固因子及び生理学的濃度でのインヒビター（血友病Ａ症状を擬態する場合のマイナス因子ＶＩＩＩ）、及び活性化された血小板を含有するアッセイ（アッセイ４）において測定され得る（参照によりその全内容が本明細書に組込まれる、Ｍｏｎｒｏｅ等，（１９９７） Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９９： ５４２−５４７の５４３ページに記載される）。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性はまた、ＷＯ９２／１５６８６またはＵＳ５，９９７，８６４号明細書に本質的に記載されている１段階凝固アッセイ（アッセイ４）を用いて測定され得る。手短に言及すれば、測定されるサンプルを５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１％ＢＳＡ中に希釈し、１００μｌを、１００μｌの第ＶＩＩ因子欠失血漿および１０ｍＭのＣａ^２＋を含有する２００μｌのトロンボプラスチンを用いてインキュベートする。凝固時間を測定し、参照標準または連続希釈物中のクエン酸塩正常ヒト血漿のプールを用いた標準曲線と比較する。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドの調製および精製：
本発明における使用に好適なヒト精製第ＶＩＩａ因子は、好ましくは、例えばＨａｇｅｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ２４１２−２４１６， １９８６， 又はヨーロッパ特許第２００，４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）に記載のようにして、ＤＮＡ組換え技法により製造される。第ＶＩＩ因子はまた、Ｂｒｏｚｅ及びＭａｊｅｒｕｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５ （４）： １２４２−１２４７， １９８０、および Ｈｅｄｎｅｒ及びＫｉｓｉｅｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６−１８４１， １９８３により開示された方法により製造され得る。これらの方法は、検出可能な量の他の血液凝固因子を伴うことなく第ＶＩＩ因子を生成する。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物であっても、最終精製段階として追加のゲル濾過を包含することによって得ることができ、次いで、第ＶＩＩ因子は既知の手段、例えばいくつかの異なった血漿蛋白（例えば、第ＸＩＩａ因子、ＩＸ因子、又はＸａ因子）により、活性化された第ＶＩＩａ因子に転換される。あるいは、Ｂｊｏｅｒｎ等，（リサーチ・ディスクロージャー、２６９、 １９８６年９月， ｐｐ．５６４−５６５） に開示されるように、第ＶＩＩ因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）等に通すこと、もしくは溶液中での自動活性化によって活性化され得る。

第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子の修飾により、又は組換え技法により生成され得る。野生型第ＶＩＩ因子に比較される場合、変更されたアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を、既知の手段、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸コドンを変更することにより、又は天然の第ＶＩＩ因子をコードする核酸におけるいくつかのアミノ酸コドンの除去により、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することによって生成され得る。

置換が第ＶＩＩａ因子分子の機能に対して臨界的な領域外で行われ得、なお活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性に必須であり、故に好ましくは置換されないアミノ酸残基は、当該分野で知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ および Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５を参照のこと。）。後者の技法において、突然変異は分子におけるあらゆる正に荷電された残基において導入され、得られる変異体分子が、分子の活性に対して臨界的であるアミノ酸残基を同定するために、それぞれ架橋する凝固活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性ラベリング等の技法により決定される３次元構造の分析により決定され得る（例えば、ｄｅ Ｖｏｓ等， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２； Ｓｍｉｔｈ等， １９９２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４４： ８９９−９０４； Ｗｌｏｄａｖｅｒ等， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０９： ５９−６４を参照のこと。）。

一方のヌクレオチドと他方のヌクレオチドとを交換するための核酸配列中への突然変異の導入が、当該分野において知られているいずれかの方法を用いて、特定部位の突然変異誘発により達成され得る。興味ある挿入体、及び所望する突然変異を含む２種の合成プライマーと共に、超らせん性二本鎖ＤＮＡベクターを使用する方法が特に有用である。ベクターの反対鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼによる温度循環の間、延長する。プライマーの導入時に、付着ニックを含む突然変異誘発されたプラスミドが生成される。温度循環に続いて、親ＤＮＡ鋳型を消化し、突然変異含有の合成されたＤＮＡについて選択するために、メチル化され、及び半メチル化されたＤＮＡに対して特異的である生成物がＤｐｎＩにより処理される。変異体を創造し、同定し、そして単離するために当該分野において知られている他の方法（例えば、遺伝子シャフリング又はファージ表示技法）もまた使用され得る。

ポリペプチドの、その起源細胞からの分離は、当該分野において知られているいずれかの方法により達成され得、例えば、限定するものではないが、付着細胞培養物からの所望する生成物を含む細胞培養培地の除去；非付着細胞を除去するための遠心分離又は濾過等が含まれる。

任意には、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製され得る。精製は当該分野において知られているいずれかの方法を用いて行うことができ、該方法には、限定するものではないが、例えば、親和性クロマトグラフィー（例えば、抗−第ＶＩＩ因子抗体カラム上（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： １１０９７， １９８６； 及びＴｈｉｍ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７： ７７８５， １９８８を参照のこと。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差的溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出等が含まれる。一般的には、Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２； 及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ および Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒｓ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと。精製後において、調製物は、好ましくは約１０質量％未満、より好ましくは約５質量％未満及び特に好ましくは約１質量％未満の宿主細胞由来の非ＶＩＩ因ポリペプチドを含む。

第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子、又はトリプトシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子及びトロンビンを用いて、蛋白分解的切断により活性化され得る。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１： ２８５３（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ、Ｕ．Ｓ．特許第４，４５６，５１１号明細書；及びＨｅｄｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６ （１９８３）を参照のこと。あるいは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーカラム（例えば、Ｍｏｎｏ Ｑ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等に通すことによって、もしくは溶液中における自動活性化により活性化され得る。次いで、得られた活性化第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、本願に記載されたようにして配合され、投与され得る。

以下に本発明の実施例を示す。これら実施例は例証としての目的のためのみであり、本発明の範囲を限定するものではない。

実験例
例１
アッセイ法
アグリゲートの含有量は、非変性のサイズ排除ＨＰＬＣにより決定する。酸化形態の含有量は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定する。酵素的分解形態の含有量は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定する。

非変性のサイズ排除クロマトグラフィーは、移動相として０．２Ｍ硫酸アンモニウム、５％２−プロパノール（ｐＨ７．０）を用い、Ｗａｔｅｒｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐａｋ ３００ ＳＷ カラム（７．５×３００ｍｍ）上で行った。流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ、ディテクション：２１５ｎｍ、負荷：２５μｇＦＶＩＩａ。

逆相ＨＰＬＣを、５μｍの粒子サイズおよび３００Ａの孔サイズを有する、登録商標権に係る４．５×２５０ｍｍブチル結合シリカカラム上で行った。カラム温度：７０℃。Ａ−緩衝剤：０．１％ ｖ／ｖトリフルオロ酢酸。Ｂ−緩衝剤：０．０９％ ｖ／ｖトリフルオロ酢酸、８０％ ｖ／ｖ アセトニトリル。カラムは３０分で線形勾配Ｘ−（Ｘ＋１３）％Ｂで溶離された。ＸはＦＶＩＩａを約２６分間の保持時間で溶離するために調整される。流速度：１．０ｍｌ／ｍｉｎ、ディテクション：２１４ｎｍ、負荷：２５μｇＦＶＩＩａ。

例２
組成物調製
概して、これら実験例における分析用の水性ＦＶＩＩａ組成物サンプルは、ゲル濾過カラム上での緩衝剤交換により精製されたバルク溶液から調製された。組成物の添加物は、その最終比率において溶離緩衝剤に含有されるか、または溶出液に添加された。得られた溶液は殺菌した膜フィルター（０．２ミクロン程度の孔サイズ）を用い無菌条件下において濾過し、無菌ガラス容器に入れ、ブチルゴム止め及びアルミニウムのフリップオフ型キャップでシール止めした。

例３
化学的／物理的安定性におけるｐＨの影響
１．４ｍｇのｒＦＶＩＩａ／ｍＬ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カルシウムおよび１０ｍＭのグリシルグリシン、酢酸塩、およびヒスチジンの混合物を含有し、ｐＨ３、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５および９．０に調整されたｒＦＶＩＩａ水性組成物のガラス瓶を、２乃至８℃のいずれかの温度においてインキュベートし、あるいは３０℃に保管温度を上げた中でインキュベートし、次いで様々な時間ポイントにおいて取り除いてｐＨ変化をアッセイし、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＧＰ−ＨＰＬＣにより化学的安定性を決定した。

２乃至８℃における３ヶ月の保管後において、水性組成物はｐＨに関して有意な変化を示した。２乃至８℃での３ヶ月の保管後におけるサンプルについて行った非変性のサイズ排除ＨＰＬＣにおいては、ｐＨ値≧５．５における薬剤生成物の有意な凝集は示されなかった（図１）。これらサンプルについて行ったＲＰ−ＨＰＬＣでは、４．５乃至５．５のｐＨ範囲においては、蛋白の断片化または酸化の有意な増加は示されなかった。

図１は、２乃至８℃における３ヶ月保管後のデータを示す。アグリゲートの当初含有量は約０．５％であり、フラグメントの当初含有量は約９％である。

例４
異なる緩衝剤の緩衝能力
１．０ｍｇのｒＦＶＩＩａ／ｍＬ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭの塩化カルシウムおよび緩衝剤として１０ｍＭの濃度においてグリシルグリシン、リンゴ酸、酢酸、ヒスチジン、グルタミン酸及びクエン酸のいずれか１種を含有するｒＦＶＩＩａ水性組成物のガラス瓶を、３ヶ月間２乃至８℃のいずれかの温度においてインキュベートし、あるいは３０℃に保管温度を上げた中でインキュベートした。時間ゼロにおけるｐＨを、分解生成物量が最も少ない５．５に調整した（図１）。グリシルグリシンを含有する組成物の測定において、保管中にｐＨが６．２までの上昇を示したが、他の組成物においては同様の期間中に５．５+/-０．１の安定な値を示した。

例５
種々の洗剤を含有する水性組成物の物理的安定性
１２種類の異なる組成物を調製した。該組成物は以下の通りである。

ｒＦＶＩＩａ ０．７５ｍｇ／ｍｌ
ＮａＣｌ ２．９２ｍｇ／ｍｌ
ＣａＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍｌ
グリシルグリシン １．３２ｍｇ／ｍｌ
洗剤／溶解剤 × ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ ５．５
試験した洗剤／溶解剤の濃度を以下の表に示す。

ｒＦＶＩＩａの液体バルク溶液から組成物を調製した。洗剤／溶解剤のストック溶液を、上記に示した濃度においてＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ、およびグリシルグリシンを含有するバッファー中で調製した。ｒＦＶＩＩａバルク体と洗剤溶液を混合し、溶液のｐＨを５．５に調整した。組成物を濾過し（０．２μｍ）、ガラス瓶に注入した（ガラス瓶１個当たり溶液２ｍｌ）。

組成物の様相を視覚検査により決定し、４００ｎｍにおける組成物の吸光度を決定した。続いて、ガラス瓶を室温において１９時間（８００／分）振り動かした。振り動かしが完了した後、様相および４００ｎｍにおける吸光度を決定した。結果を下表に示す。

結果から、参照用サンプル（いかなる洗剤／溶解剤も添加しない。）は振り動かした場合に視覚的に不透明となり、４００ｎｍにおける吸光度が有意に増加していることがわかる。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（＝ポリソルベート２０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０（＝ポリソルベート８０）、ポロキサマー（Poloxamer）１８８、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１２７（＝ポロキサマー４０７）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５（＝ポリオキシル２３ラウリルエーテル）、およびＬＰＣＭ（＝α−リゾホスファチジルコリンミリストリル）の添加により、殆ど完全に不透明性および吸光度の増加が防止され、一方、濁り度においてわずかな増加（参照用との比較において）がＭｙｒｊ（登録商標）５９（＝ポリオキシル１００ステアリン酸塩）およびＭｙｒｊ（登録商標）５２（＝ポリオキシル４０ステアリン酸塩）に関して観察された。グリセロール、ポリエチレングリコール４００またはポリエチレングリコール４０００は本実験において使用された濃度において濁り度の増加を防止することはできなかった。

例６
酸化防止剤としてメチオニンを含有する水性組成物の化学的安定性
３つの異なる組成物を調製した。該組成物は以下の通りである。

ｒＦＶＩＩａ ０．７５ｍｇ／ｍｌ
ＮａＣｌ ２．９２ｍｇ／ｍｌ
ＣａＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ １．４７ｍｇ／ｍｌ
グリシルグリシン １．３２ｍｇ／ｍｌ
メチオニン ０または０．２５または１．０ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ ６．５
ｒＦＶＩＩａの液体バルク溶液から組成物を調製した。上記に示した濃度においてＮａＣｌ、ＣａＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ、およびグリシルグリシンを含有するバッファー中にメチオニンを溶解した。ｒＦＶＩＩａバルク体とメチオニン溶液を混合し、溶液のｐＨを６．５に調整した。組成物を濾過し（０．２μｍ）、ガラス瓶に注入した（ガラス瓶１個当たり溶液１ｍｌ）。ガラス瓶を５℃、２５℃および４０℃において保管した。サンプルを、下表に示す時間ポイントにおいて取りだし、酸化形態の含有量を分析した（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。酸化形態の含有量を下表に示す（％）。

該結果から、メチオニンの添加により組成物中の酸化率が低下することがわかる。

例７
塩化カルシウムを含有する水性組成物の化学的安定性
４つの異なる組成物を調製した。該組成物は以下の通りである。

ｒＦＶＩＩａ １．０ ｍｇ／ｍｌ
ＮａＣｌ ２．９２ｍｇ／ｍｌ
ＣａＣｌ_２、２Ｈ_２Ｏ 各々、１．４７ｍｇ／ｍｌ（１０ｍＭ）、２９．４ｍｇ／ｍｌ（２００ｍＭ）、５８．８ｍｇ／ｍｌ（４００ｍＭ）、および１１７．６ｍｇ／ｍｌ（８００ｍＭ）
グリシルグリシン １．３２ｍｇ／ｍｌ
ｐＨ ７．０
ｒＦＶＩＩａの液体バルク溶液から組成物を調製した。ＮａＣｌおよびグリシルグリシンを含有するバッファー中に塩化カルシウムを溶解し、ｒＦＶＩＩａバルク体と混合した後、上記に示した濃度とした。混合した後、溶液のｐＨを７．０に調整した。組成物を濾過し（０．２μｍ）、ガラス瓶に注入した（ガラス瓶１個当たり溶液１ｍｌ）。ガラス瓶を５℃において保管した。第ＶＩＩ因子の活性（ＩＵ／ｍｌ）を凝固アッセイにより決定した。

Claims (34)

1. （ｉ） 第ＶＩＩ因子ポリペプチド；
   （ｉｉ） ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；
   （ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩、またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬；
   を含有する液体水性組成物であって、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである組成物。
2. 更に、（ｉｖ）イオン強度調整剤を含有する、請求項１に記載の組成物。
3. イオン強度調整剤（ｉｖ）が、中性塩（例えば、塩化ナトリウム）；アミノ酸；または小ペプチド、もしくはこれら少なくとも２種の調整剤の混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
4. イオン強度調整剤（ｉｖ）が塩化ナトリウムである、請求項３に記載の組成物。
5. 試薬（ｉｉｉ）が少なくとも約２５ｍＭの濃度において存在し、例えば、少なくとも約５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、または少なくとも約８００ｍＭの濃度において存在する、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物。
6. 試薬（ｉｖ）が少なくとも約５ｍＭの濃度において存在し、例えば、少なくとも約１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭ、４００ｍＭ、８００ｍＭ、１０００ｍＭ、１２００ｍＭ、１５００ｍＭ、１８００ｍＭ、２０００ｍＭ、または少なくとも約２２００ｍＭの濃度において存在する、請求項２乃至５のいずれか１項に記載の組成物。
7. カルシウム塩が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、およびレブリン酸カルシウムからなる群から選択される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の組成物。
8. マグネシウム塩が、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、およびレブリン酸マグネシウムからなる群から選択される、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物。
9. 試薬（ｉｉｉ）が、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、またはこれらの混合物からなる群から選択され、イオン強度調整剤（ｉｖ）が塩化ナトリウムである、請求項６乃至８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 更に、（ｖ）張度調整剤を含有する、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の組成物。
11. 張度調整剤（ｖ）が中性塩；単糖、二糖、多糖；糖アルコール；アミノ酸；または小ペプチドからなる群から選択され、もしくはこれら調整剤の少なくとも２種の混合物である、請求項１０に記載の組成物。
12. 張度調整剤（ｖ）が１ｍＭ乃至５００ｍＭの濃度において存在する、請求項１０または１１に記載の組成物。
13. 濃度が１０乃至２５０ｍＭである、請求項１２に記載の組成物。
14. 更に、（ｖｉ）非イオン性表面活性剤を含有する、請求項１乃至１３のいずれか1項に記載の組成物。
15. 非イオン性表面活性剤が、ポロキサマー１８８、ポロキサマー４０７、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、またはポリオキシ２３ラウリルエーテル等のポリソルベートまたはポロキサマーまたはポリオキシエチレンアルキルエーテルである、請求項１４に記載の組成物。
16. 更に、（ｖｉｉ）酸化防止剤を含有する、請求項１５に記載の組成物。
17. 酸化防止剤（ｖｉｉ）がＬ−またはＤ−メチオニン、メチオニン類縁体、メチオニン含有ペプチド、メチオニン相同体、アスコルビン酸、システイン、ホモシステイン、グルタチオン、シスチン、およびシスタチオニンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
18. 酸化防止剤がＬ−メチオニンである、請求項１７に記載の組成物。
19. 酸化防止剤が約０．１乃至約５．０ｍｇ／ｍｌの濃度において存在し、例えば約０．１乃至約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１乃至約２ｍｇ／ｍｌ、または約０．５乃至約２ｍｇ／ｍｌの濃度において存在する、請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. ｐＨが約４．０乃至約７．０の範囲に維持され、例えば約４．５乃至約７．０、約５．０乃至約７．０、約５．５乃至約７．０、または約６．０乃至約７．０の範囲に維持される、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の組成物。
21. ｐＨを約４．０乃至約７．０の範囲に維持するために好適な試薬が、くえん酸塩、酢酸塩、ヒスチジン、リンゴ酸塩、リン酸塩、酒石酸、琥珀酸、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、イミダゾール、ＴＲＩＳ、乳酸塩、グリシルグリシン、ＰＩＰＥＳ、グリシン、または該試薬の少なくとも２種の混合物からなる酸および塩の群から選択される、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 試薬の濃度が約１ｍＭ乃至約５０ｍＭである、請求項２１に記載の組成物。
23. 緩衝剤の濃度が約１０ｍＭである、請求項２２に記載の組成物。
24. 更に、（ｖｉｉｉ）防腐薬（例えば、フェノール、ベンジルアルコール、オルト−クレゾール、メタ−クレゾール、パラ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム等）を含有する、請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の組成物。
25. 等張性である、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の組成物。
26. 薬剤投与のために調合される、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. ２乃至８℃において少なくとも６ヶ月間安定である、請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の組成物。
28. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、ヒト第ＶＩＩａ因子であり、好ましくは組換えヒト第ＶＩＩａ因子である、請求項１乃至２７のいずれか１項に記載の組成物。
29. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子配列変異体である、請求項１乃至２８のいずれか１項に記載の組成物。
30. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性と生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型ＦＶＩＩａ）の活性との間の比が、本願明細書に記載された「インヴィトロ蛋白分解アッセイ」において試験される場合、少なくとも約１．２５であり、好ましくは少なくとも約２．０もしくは４．０であり、特に好ましくは少なくとも約８．０である、請求項２９に記載の組成物。
31. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、約０．１ｍｇ/ｍｌ乃至約１０ｍｇ/ｍｌの濃度において存在し、例えば約０．５乃至約５．０ｍｇ/ｍｌ、約０．６乃至約４．０ｍｇ/ｍｌ、または約１．０ｍｇ/ｍｌ乃至約４．０ｍｇ/ｍｌの濃度において存在する、請求項１乃至３０のいずれか１項に記載の組成物。
32. 第ＶＩＩ因子ポリペプチドの液体水性組成物の製造方法であって、（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬、を含有する溶液中、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを提供する工程を有し、（ｉｉｉ）の濃度が少なくとも１５ｍＭである方法。
33. 第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療用薬剤の製造のための請求項１乃至３１のいずれか１項に記載の組成物の使用。
34. 第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療方法であって、（ｉ）第ＶＩＩ因子ポリペプチド；（ｉｉ）ｐＨを約４．０乃至約８．０の範囲に維持するのに好適な試薬；（ｉｉｉ）カルシウム塩、マグネシウム塩またはこれらの混合物からなる群から選択される試薬を含有する水性液体組成物の有効量を、第ＶＩＩ因子応答性症候群の治療を必要とする対象に投与することを含む方法。

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