CZ228299A3 - Stabilizovaný kapalný přípravek obsahující interferon - Google Patents

Description

Stabilizovaný kapalný přípravek obsahující interferon

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobů stabilizace lidského interferonu-beta a stabilizovaných kapalných přípravků obsahujících interferon-beta.

Dosavadní stav techniky

Interferony jsou proteiny mající řadu biologických účinků, z nichž některé jsou antivirové, imunomodulační a antiproliferativní. Jsou to relativně malé, druhově specifické, jednořetězcové polypeptidy, které se vytvářejí v savčí buňce jako odpověď na expozici k mnohým induktorum jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny a další. Interferony ochraňují tkáně a buňky savce proti napadení vírem a představují důležitý obranný mechanismus hostitele. Ve většině případů interferony poskytují lepší ochranu buňkám a tkáním, ze kterých pocházejí, než jiným typům buněk a tkání, což ukazuje na to, že interferony lidského původu by měly být mnohem účinnější při léčení lidských nemocí než interferony z jiných druhů.

Existuje několik rozdílných typů lidských ínterferonú, obecně klasifikovaných jako leukocytový (interferon-alfa), fibroblastový (interferon-beta) a imunitní (interferon-gama), a velký počet jejich variant. Obecnou diskusi o interferonech lze najít v mnohých učebnicích a monografiích jako např. The Interferon Systém (W. E. Stewart, II, Springer-Verlag, N.Y. 1979) a Interferon Therapy (World Health Organization • ·

M »t · II 44 • * · · 4 · · 44·· • · · · · · · 4 44 4

4 4444 4 ·

4 4 4 4 4 » 4 44 44 44

Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneva 1982), na které se tímto odkazujeme.

Způsob podávání interferonu je důležitým faktorem v klinické aplikaci tohoto důležitého terapeutického agens. Systémové podávání interferonu buďto intravenózní nebo intramuskulární či subkutánni injekcí bylo nejčastěji užíváno do jisté míry s léčebným úspěchem u nemocí jako leukémie z vlasatých buněk (leukemická retikulc-endotelióza), syndrom získané imunodeficience (AIDS) a související Kaposiho sarkom. Avšak je známo, že proteiny ve své purifikované podobě jsou zvláště náchylné k degradaci. Pro interferon-beta je primárním mechanismem degradace v roztoku agregace a deamidace. Nedostatečná stabilita interferonu v roztoku i jeho dalších produktů výrazně omezuje možností využití.

Farmaceutické interfercnové přípravky pro klinické použití obvykle obsahují interferor.v v lyofilizované (tj. mrazově dehydratované) podobě ve spojení se složitými organickými excipientv i pomocnými laťkami) a staoii izatory, jako jsou např. neiontová povrchově aktivní činidla (tj. surfaktanty), různé cukry, organické poiyoly a/nebo lidský sérový albumin. Nevýhodou lyofilizovaných preparátů je to, že vyžadují složité balení, neboť je třeba odděleně dodávat sterilní vodu pro injekce. Kromě toho lyofilizované preparáty vyžadují značnou manipulaci před vlastním použitím, což zvyšuje riziko nechtěného píchnutí se jehlou či upadnutí některé složky na zem, což je zejména problematické u té části pacientů, která jeví svalovou ochablost a špatnou koordinaci, jako jsou např. lidé s roztroušenou πιο z komisní sklerózou (MS). Pacienti s MS by si mohli sami podávat interferon, takže dostupnost takové lékové formy, která by se podávala mnohem snadněji než současné lyofilizované • · * · • · · · · · · · · · · * * * · ·· »· «««··« • · ···« · «

0······ « · * · · · C· přípravky, je velmi potřebná, aby nebyla nutná rekonstituce, která je nezbytná, když se používá lyofilizovaný preparát.

Kapalné, nelyofilízované přípravky obsahující interferony mohou také obsahovat komplexní nosiče jako je lidský sérový albumin, polyoly, cukry a aniontová povrchově aktivní stabilizující činidla. Viz např. WO 89/10756 (Hara et al., obsahující polyol a p-hydroxybenzoát).

Shrnutí vynálezu

Předkládaný vynález řeší výše uvedený problém tím, že zjistil, že lidský interferon-beta se může stabilizovat, když se umístí do pufrovaného roztoku s pH mezi 4 a 7,2, přičemž roztok obsahuje aminokyseliny jako a v některých případech také sůl neobsahuje nabitý postranní řetězec lyofilizován, ale jakmile se jednou připraví způsobem odborníkovi známým, stane se přímo součástí přípravku podle předkládaného vynálezu.

stabilizující činidla (pokud aminokyselina Interferon-beta není

Tudíž prvním aspektem předkládaného vynálezu je kapalný přípravek obsahující interferon a stabilizující činidlo· v množství mezi 0, 3Í a 0,5* (hmot,), což je aminokyselina vybraná ze skupiny obsahující kyselé aminokyseliny, arainin a glycm. Kapalný přípravek se před tím nelyofilizoval. Avšak je výhodné, když kapalný přípravek je obsažen (uzavřen) v nádobce jako je např. injekční stříkačka, přičemž tato nádobka má povrch, který je v kontaktu s kapalným přípravkem, potažený materiálem, který je inertní k interferonu jako je např. silikon nebo polytetrafluoretylen. Výhodný přípravek obsahuje interferonbeta, nebo r e koráb i n ant ně připravený interferon, v pufru, který má pH mezi 4, o a 7/2. K dalším přípravkům podle předkládaného vynálezu patři:

• · • t • «

1) 20 mM acetátový pufr s pH 5,0, který nebyl předtím lyofilizován a který obsahuje interferon-beta a další složky vybrané z a) 150 mM arginin-HCl, b) 100 mM chlorid sodný a 70 mM glycin, c) 150 mM arginin-HCl a 15 mg/ml lidský sérový albumin, d) 150 mM arginin-HCl a 0,1 % Pluronic F-68, e) 140 mM chlorid sodný, f) 140 mM chlorid sodný a 15 mg/ml lidský sérový albumin, a g) 140 mM chlorid sodný a 0, 1¾ Pluronic F6 8,

2) Kapalina s pH 5,0 obsahující interferon-beta, 170 mM L-glutamovou kyselinu a 150 mM hydroxid sodný, která nebyla předtím lyofilizována,

3) 20 mM fosfátový pufr s pH 7,2, který nebyl předtím lyofilizován, a který obsahuje .interferon-beta a složky vybrané z a) 140 mM arginir.-HCl·, b) 15 100 rr,M chlorid sodný a 70 mM glycin.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je souprava pro parenterální podávání přípravku. Souprava obsahuje přípravek pH mez i 4 a 0, farmaceutickv účinné množství před zim lyofilizován, a kapalného interferonového nádobku obsahující kapalný přičemž kapalina obsahuje interfercnu-beta, který nebyl aminokyselinové stabilizující činidlo v množsť ;hmot.) nebo méně, a návod k použití.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je kapalný farmaceutický přípravek vhodný pro parenterální podávání savci, obsahující v podstatě účinné množství interferonubeta, který nebyl před tím lyofilizován, v pufru udržujícím pH v rozmezí 4,0 a ž 6,0, a aminokyselinové stabilizující činidlo ve vhodné iontové síle. Přípravek je obsažen v zásobní nádobce jako je např. injekční stříkačka. Výhodně zásobní nádobka postrádá rozhraní kapaliny a prostředí obsahujícího kyslík (zj. interferonový roztok není vystaven působení plynu obsahujícího kyslík v průběhu přípravy • · • · a ti · · ti · · ti • til « ti » a skladování). Interferon-beta si v podstatě uchovává antivirovou účinnost během skladování při teplotě mezi 2 °C a 25 °C po dobu nejméně 3 měsíců.

Způsob podle předkládaného vynálezu pro stabilizaci interferonu-beta v kapalném farmaceutickém přípravku, takže si v podstatě uchovává fyzickou stabilitu během skladování při teplotě mezi 2 °C po dobu alespoň 3 měsíců spočívá v tom, že se smíchá: a) účinné množství interferonubeta, b) pufr udržující hodnotu pH v rozmezí 4,0 až 7,2 při vhodné iontové síle, a c) aminokyselinové stabilizující činidlo, přičemž kapalina nebyla předtím lyofilizována a nebyla vystavena plynu obsahujícímu kyslík v průběhu přípravy a skladování.

Kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu mají ve srovnání s lyofilizcvanými přípravky mnoho výhod. K těmto výhodám patří: I) menší injekční objem nutný pro kapalný přípravek způsobí menší nepohodlí než velký objem,

II) náhrada komplexních excipientú j ednoduchými aminokyselinami umožňuje lépe monitorovat kvalitu konečných produktů, III) balení je velmi zjednodueno díky eliminaci potřeby oddělené zásoby vody pro injekci (WFI) a samostatnou stříkačku a viálku, IV) dávkovači přesnost se muže zlepšit díky tomu, že se kapalina přenáší v méně krocích, a V) bezpečnost produktu je zlepšena, protože jednodušší podávání snižuje riziko popíchání jehlou a upuštění součástí při přípravě injekce.

Tudíž předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout biologicky účinný stabilní interferonový přípravek pro injekční použití.

Další předmět předkládaného vynálezu poskytuje přípravek, který nevyžaduje předchozí lyofilizaci léčiva obsahujícího interferon-beta.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je zabránit ztrátě účinnosti kapalného přípravku s interferonem-beta tím, že se a) zabrání kavitací a/nebo vytvoření prostoru nad přípravkem v průběhu přípravy kapalného přípravku, nebo b) uskladní kapalný přípravek a prostorem nad přípravkem, který obsahuje inertní plyn jako je argon nebo dusík.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout kapalný přípravek, který umožňuje uskladnění po dlouhou dobu v kapalném stavu usnadňujícím skladování a přepravu před podáním.

Další předmět vynálezu poskytuje kapalný přípravek, který se snadno připravuje a podává, neboť se eliminuje krok jeho lyofilizace a rekonstituce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití jednoduchých aminokyselin pro jako alternativních stabilizátorů vedle všeobecně užívaného sérového albuminu, což usnadňuje monitorování kvality produktu.

A ještě další předmět vynálezu poskytuje farmaceutický přídavek, který obsahuje nelvořilizovený inter reron—beta, a který je možné vyrábět s menšími náklady.

Další výhody předkládaného vynálezu jsou uvedeny v podrobném popisu vynálezu v následujícím textu nebo budou poznány v při praktickém provádění vynálezu. Doprovodné obrázky, které jsou přiloženy, tvoří součást popisu vynálezu a společně s popisem slouží k vysvětlení principu vynálezu.

Stručný popis obrázků

Obr. 1. je graf ukazující procento monomerů ínterferonu-beta, které zůstane v kapalině volně vystavené jako funkce procenta v kapalině rozpuštěného kyslíku.

4 • 4 4« • « 4 · « · * ««•••««4 44 44 «· 4«

Obr. 2 je graf ukazující koncentraci proteinu v procentech normalizovanou vzhledem k výchozímu materiálu v závislosti na čase pro kapalný přípravek BG9589-1. Vzorky označené 4°C (plné čtverečky) byly inkubovány při teplotě mezi 2 a 8 °C. Ostatní vzorky byly inkubovány při 25 °C (plné kroužky), 33 °C (plné trojúhelníky) a 40 ^QC (plné kosočtverce).

Obr. 3 je graf ukazující koncentraci proteinu v procentech normalizovanou vzhledem k výchozímu materiálu v závislosti na čase pro kapalný přípravek BG9589-3. Vzorky označené 4°C (plné čtverečky) byly inkubovány při teplotě mezi 2 a 8 °C. Ostatní vzorky byly inkubovány při 25 °C (plné kroužky), 33 °C (plné trojúhelníky) a 40 °C (plné kosočtverce).

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález překonává problémy a nevýhody spojené se současnými strategiemi a projekty a poskytuje jednoduchý způsob stabilizace interferonu a jednoduchý interferonový přípravek se zvýšenou skladovací kapacitou. Vynález je založen zčásti r.a našich zjištěních, že:

a) interferon-beta je zvláště nestabilní a agreguje, pokud přijde do kontaktu s kyslíkem buďto aktivně probublávaným kapalinou nebo při statickém kontaktu, když je kyslík v prostoru nad přípravkem (čelním prostoru) v nádobě,

b) kapalné přípravky s interferonem-beta postrádající nosič jako je lidský sérový albumin jsou zvláště náchylné k absorpci (tj. buďto chemickou reakcí nebo fyzikální vazbou) k povrchu skla,

c) interferon-beta agreguje při nízké iontové síle, pro stabilitu v kapalné fázi vyžaduje iontové prostředí.

· * · a · · 0 · a 0« » * · a· ·« 0 · e a · ·

0 a a a 0 · a

0000 »000 00 00 0« >*

Vynález se proto týká způsobu stabilizace lidského interferonu-beta, kterým se zabrání uvedeným nevýhodám, a výsledného kapalného přípravku stabilizovaného interferonubeta.

A. Definice

Termín pufr označuje roztoky slabých kyselin a solí obsahující anionty kyseliny, nebo roztoků slabých baží a jejich solí. Termín acetát konkrétně použitý v této souvislosti v tomto popisu (viz také tabulka 1) se týká pufrovacího systému výhodně obsahujícího acetát sodný a kyselinu octovou a terrrbn fosfát se týká pufrovacího systému výhodně obsahujícího heptahydrát hydrogenfosforečnanu sodného a monohydrát díhydrogenfosoforečnanu sodného. Avšak roztoky v tabulce II obsahující aminokyseliny, ačkoliv konvenčně nejsou považovány za pufry ve smyslu, jak je tento

termín v oboru užíván, v tomto popisu	patří dle definice do
pojmu pufr.
Termín excipient se týká	jakékoliv slouc β πin y
přidané v průběhů zpracování a/nebo s	kiadování ke kapalnému
přípravku za účelem zněny celkových	vlastností, zlepšení
stability a/nebo upravení osmoiality.
Termín stabilizující činidlo”	se týká jakéhokoliv

excipientu, který zlepšuje nebo nějak zvyšuje stabilitu.

Termín stabilita má nutně funkční definici a znamená relativní časovou stálost antivirové účinnosti inerferonu a/nebo stálost jeho struktury.

Termín kavitovaný se týká jakéhokoliv interferonového přípravku, který v důsledku změn tlaku nebo třepání umožnil kontakt s bublinami obsahujícím kyslík (např. vzduch) přinejmenším po dobu přípravy nebo skladování. Termín kavitace také znamená, že rozhraní kyslík obsahující plyn/kapalina se vytvořilo v určitém bodě v průběhu přípravy, skladování nebo použiti u kapalného ínterřeronového přípravku. Termín kavitovaný také znamená, že hladina rozpuštěného kyslíku v kapalném interferonovém přípravku přesahuje přibližně 10 * hodnoty atmosférické rovnováhy při teplotě která je typická v průběhu přípravy a skladování.

Termín parenterální zde zahrnuje způsoby podáváni subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intrasternální, intraperiotoneální, oftalmickou nebo intraspinální injekcí nebo infúzemi.

Temín farmaceuticky přijatelná sul znamená jakoukoliv organickou nebo organickou adiční sůl, která je relativně netoxická a neškodná pro pacienta v odpovídajících účinných koncentracích, při kterých vedlejší účinky soli neruší prospěšné účinky interferonu.

Účinné množství sloučeniny je takové množství, které poskytuje výsledek nebo překonává vliv určitých podmínek, které jsou léčeny. Účinné množství také znamená množství, které vede k pozitivnímu výsledku (tj. vykazuje antivirový účinek) v testu CPE na antivirovou aktivitu.

Termín farmaceuticky účinné množství se zde užívá k označení procentuální koncentrace interferonu, o které je ve farmakologii a lékařství známo, že je bezpečná a účinná v léčení určitých nemocí.

isotonický s krví (nebo zkráceně jen isotonický) znamená takový kapalný interferonový přípravek, který má dostatečnou koncentraci složek k tomu, aby jeho osmotické chování bylo v podstatě identické s krví, tzn. že buňky při kontaktu s přípravkem si uchovají svůj tvar a nedochází u nich v podstatě k žádnému přenosu vody v důsledku rozdílů osmotického tlaku.

•· ·· ·· ··

Termín polyíontový (nebo také polyelektrolytový) se užívá k označení látky s vysokou molekulovou hmotností, která je elektrolyt a, pokud se užije v přípravku podle předkládaného vynálezu, maximalizuje iontovou sílu pro danou osmolalitu. Tato definice je založena na našem zjištění, že interferon-beta je stabilizován vysokou iontovou sílou, ale přitom je celková iontová síla omezena nutným požadavkem, aby roztok byl isotonický s krví (viz příklad 7). Výhodný způsob, jak maximalizovat iontovou sílu při dané osmolalitě, je použít excipient polyiontového druhu.

Materiál, který je inertní k mterferonu znamená takový materiál, který má alespoň takové vlastnosti, že fyzikálně ani chemicky nereaguje s interferonem.

B. Příprava mterferonu

Předkládaný vynález je všeobecně využitelný pro všechny typy interferonú včetně přirozeného mterferonu, mterferonu připraveného technologií rekombinantní DNA a interferonú připraveného chemickou syntézou nebo modifikací. Vynález lze využít s hrubým extraktem, senupuri f i kovaným nebo plně puntíkovaným interferonem z fibroblastú, leukocytů, lymfocyru nebo jakékoliv tkáně produkující interferon člověka nebo jiného vhodného druhu. Nejvýhodnější je podle předkládaného vynálezu použití lidského mterferonu z fibroblastú (ij. interferon-beta).

Nej výhodnější interferon-beta je rekombinantní forma. Metody rekombinantní DNA pro přípravu různých proteinů včetně interferonú jsou v oboru známé a žádným způsobem neomezují předkládaný vynález. Viz např. patenty U.S. 4 399 216, 5 149 636, 5 179 017 (Axel et al.) a 4 470 461 (Kaufman). Rekombinantní formy interferonú již byly připraveny, viz např. Evropský patent 0 41313 (Fiers, exprese interferonú4 « « • * « » 4 •

4 4 · • 4· · 4444 beta), patent U.S. 4 966 843 (McMormick et al., exprese interferonu v buňkách CHOj , patent U.S. 5 326 859 (Sugano et al. (DNA kódující interfercn-beta) . Interferon-beta může být také modifikován, buďto rekombinantními technikami nebo chemicky, muže připravovat v médiu obsahujícím sérum patří séra. K formám interferonu-beta varianty jako např. mutanta ochuzená o cystein (patenty U.S.

a et aminokyselinová sekvence proteinu může derivatizací pomocí cukerných skupin dalšími doplňujícími molekulami uskutečnit prostřednictvím v hostitelské buňce. Jednotlivé aminokyselinové zbytky v řetězci mohou byt dále modifikovány oxidací, redukcí nebo jinou derivatizací, a nebo protein může být štěpen, aby se získal aktivní fragment. Přesná chemická struktura konkrétní rekombinantní formy interferonu-beta bude proto záviset na neomezuje nijak předmět předkládaného takové proteiny interferon-beta v přípravcích podle předkládaného vynálezu si uchovají svou biologickou účinnost, když budou ve vhodném prostředí.

Jednou z metod, jak připravit rekombinantní interferon-beta, je kultivovat ovariální buňky čínského křečka (CHO) transfekované genem lidského interferonu-beta. Rekombinantní interferon-beta je vylučován buňkami CHO kultivovanými v dávkových suspenzních buněčných kulturách, které obsahují fetální hovězí sérum. Buňky kultivovat v rotačních kultivačních lahvích v inkubátoru s CO- (5% CO?) a teplotou 35 °C. Obsah z několika takových lahví se pak může sloučit a přenést do fermentoru větší velikosti, pokud je třeba kultivace ve větším měřítku.

nebo v médiu bez

588 535 a 4 737 462, Mark et al.) a mutanta ochuzená o methionin (EP íoí,

260

350, Wang al.). Primární být rozšířena (glykosyiací) nebo

Další modifikace se mohou posttranslačního systému mnoha faktorech a vynálezu. Všechny se mohou umístěných * φ · · » · «· ·»·»«« • · φ · · *|>| 1111 φ φ φ» · · φ Φ

Kultivace ve fermentoru pak probíhá asi šest dní a během této doby se aktivní produkt, ti. interferon-beta, akumuluje v kultivačním médiu. Kultura se pak může sklidit a buňky se odstraní z média, které obsahuje produkt, např. tangenciální průtokovou filtraci.

C. Purifikace interferonů

Purifikační postupy pro interferony jsou již dobře známy a pro odborníky dostupné. K těmto metodám patří jednokrokové nebo vícekrokové postupy zahrnující chromatografické separační kroky, viz např. patenty U.S. 5 015 730 (Friesen et al., afinitní chromatografie a HPLC), 4 541 952 (Hosoi et al., chelatační chrcmatografie) .

Jeden ze způsobů např. zahrnuje využití neobvykle hydrofobní a relativně bazické povahy molekul mterferonubeta společně s jeho silnou afinitou pro vazbu kovových iontů, viz např. publikace Knight a Faney, Human Fibrobiast Interferon, an Improved Purificatíon, J. Biol. Chem., 256: 3609-3611, 1981 a Edy et al., Purificatíon of Human

Fibrobiast Interferon by Zinc Chelate Chromatography, J. Biol. Chem., 232: 5934-5935, 1981, na které se tímto odkazuj eme.

Stručně řečeno, kroky zachyceni a purifikace zahrnují navázání interferonu-beta na sérii kolon s náplní sefarózy (Sepharose®, Pharmacia Biotech) a pak eluci se solemi a polyolem. Jakmile se jednou konečný eluát ze sefarózy naředí a sníží se pH, interferon-beta se naváže na SP sefarózu (SP Sepharose®, Pharmacia Biotech) . Většina proteinů v navážce na kolonu je povahy více bazické než je monomerní interferon-beta a proto se váže těsněji v koloně než interferon. Na této koloně se také od interferonu-beta a a a a · a a··» a aa * aa aa aaa aaa aaa a a aa · · ta aa oddělí DNA a virové částice. Kolona se pak proplachuje sérií pufrů obsahujících chlorid sodný.

Interferonový produkt se naváže na kolonu s chelatující sefarózou (Sepharose®, Pharmacia Biotech) předem nabitou zinkem (víz výše uvedená citace Edy et al.). Tato kolona se provozuje v atmosféře bez kyslíku, stejně jako všechny následující kroky, aby sp nebránily volné sulfhydrylové skupiny v molekule. Purifikovaný interferon se okyselí a uchovává se při nízkém pH, aby se inaktivovaly všechny zbylé viry. Po neutralizaci se interferon koncentruje průtokovou filtrací a pak se vymění pufr za neutrální puřrovací roztok. Proces výměny pufru redukuje koncentraci zinku a organických sloučenin. Poté se surový interferon uchovává při -70 °C, než se začne zpracovávat do přípravku.

D. Formulace interf eror.ových přípravků

V ukázkovém příkladu purifikace popsaném výše a po první výměně pufru se zahájí stejný druhý krok výměny pufru, kromě toho, že se neutrální pufrovacím roztokem s pH 4 stabilizující činidlo, popsané přípravek obsahující interferon pufrovací až 7,2, podrobněji se nazvvá roztok nahradí který obsahuje dále. Výsledný meziprodukt a lze ho zamražený uchovávat. Viz také příklad 7.

Pokud se uchovává ve zmrzlém stavu (v atmosféře inertního plynu jako je argon nebo dusík), nechá se roztát a pumpuje se přes 0,22pm filtr do tárovaných nádob, výhodně z nerezové oceli, kde se meziprodukt smíchá s předem filtrací sterilizovaným rozpouštědlem, dokud se nedosáhne požadované hmotnosti výsledného produktu. Rozpouštědlo je v podstatě stejný pufr, který byl použít ve druhém kroku výměny pufru. Výsledný kapalný produkt se pak sterilizuje filtrací za aseptických podmínek např. pomocí dvou 0,22pm v ··* • · · * · · • *··· · · « * « « · · ··· • · » · * • * ·» · * filtru v sérii, a rozdělí do těsně uzavřených nádobek, výhodně z nerezové oceli, které jsou opatřeny vstupem pro inertní plyn, kombinaci odvzdušňovacího ventilu a filtru a přítokovou ponornou tubičku. Konečný produkt se pumpuje ponornou trubičkou do uzavřené nádoby. Pomocí inertního plynu jako je dusík je konečný produkt tlakem přenesen do pumpovací hlavv zařízení schopného asep>ticky plnit sterilní stříkačky.

Pro aseptické plnění sterilních injekčních stříkaček je dostupných několik metod a konkrétní použitá metoda vynález nikterak neomezuje. Ve způsobu, který zde uvádíme jako příklad, se užívá plnička injekčních stříkaček HYPAK® (Becton Dickinscn Pharmaceutical Systems, Panklin Lakes, NJ) , kterou lze sterilizovat autoklávem. Stříkačky je možné autoklávovat se špičkami opatřenými čepičkami. Obecně takové zařízení obsahuje vakuovou komoru obsahující stříkačky, které mají být naplněny interferonovým přípravkem. Komora je umístěna v aseptickém prostředí. Každá stříkačka je umístěna v komoře vertikálně s otevřenými koncem, do kterého je vsunut plunžr, který je upraven tak, aby pasoval do otevřeného konce válce stříkačky. Plunžr je upraven tak, aby vytvořil ve válci stříkačky zárku, aby se kapalný přípravek zachytil uvnitř. Po naplnění/vložení je ve stříkačce ponechán malý prostor. Komora je pak evakuována a propláchnuta několikrát inertním plynem bez kyslíku (např. argonem, dusíkem) a jakmile se dosáhne konečného vakua, plunžry se mechanicky vsunou malý kousek do otevřených válců stříkaček a zátky se automaticky vloží do stříkaček. Komora je pak ventilována filtrovaným vzduchem, aby se tlak v komoře vyrovnal s vnějším atmosférickým tlakem. Míra vakua je určující pro objem volného prostoru ve stříkačce obsahujícího inertní plyn.

V konkrétním zařízení, které jsme použili, byly stříkačky umístěny vertikálně a upevněny v otvorech se stříkačky dostanou pod

Jehla pak propláchne (např. argonem nebo

Pak se • · » 9 9 9« > 9 « 1

I · · <

9 9 9 v rotujícím kotouči. Nejdříve jehlu, která se vsune do stříkačky, vnitřek stříkačky inertním plynem dusíkem).

Pak se jehla stáhne zpět ze stříkačky, stříkačka nastaví pod druhou jehlu, která se vsune do stříkačky, tato jehla je připojena k pumpě, která dávkuje produkt do stříkaček. Pak se druhá jehla stáhne zpátky ze stříkačky. Pak se stříkačka nastaví pod třetí jehlu, která se vsune do stříkačky. Plunžr (předem autoklávovaný) je proudem vtlačen do stříkačky s inertním plynem (např. dusíkem nebo argonem), pak se jehla stáhne zpět ze stříkačky a plunžr zůszane umístěn tak, že ponechává ve stříkačce prostor inertního plynu mezi vrchem kapaliny a dnem plunžru.

1. Excipient

Excipient je výhodně látka polyiontového druhu, aby se maximalizovala iontová síla oři dané osmolalitě, jako je tomu např. v případě polyelektrolytu, který obsahuje heparin nebo jinou polymerní látku. Jak je diskutováno v příkladu 4, interferon-beta je stabilizován vysokou iontovou sílou, ale celková iontová síla je omezena potřebou, aby roztok byl isotonický s krví. Výhodný způsob, jak maximalizovat iontovou sílu při dané osmolalitě, je proto použít poíyiontovou látku. Roztoky interferonu-beta podle předkládaného vynálezu jsou isotonické s krví (přibližně 290 miliosmol/kg).

Nejvýhodnějším stabilizujícím činidlem podle předkládaného vynálezu je aminokyselina, a sice některá z následujících: jakákoliv kyselá aminokyselina (např. kyselina glutamová, asparagová) nebo aminokyselina vybraná z argininu a glycinu. Nejvýhodnější aminokyselinové stabilizující činidlo je arginin, který s pH 5,0 ve své kyselé formě (arginin-HCl) je v roztocích Výhodná kyselá • · ···« ·«*· aminokyselina je kyselina L-glutamová. Aniž bychom se přísně drželi teorie, skutečnost, že pólyiontové excipienty jsou výhodné, je důvod, proč arginin a lysin (se 3 nabitými skupinami) stabilizují interferon lépe než glycin (2 nabité skupiny), který zase stabilizuje lépe než kterákoliv z nenabitých sloučenin, které byly testovány.

Pokud je excipientem arginin-HCl, jeho koncentrace je v rozmezí od 0,5 % (hmotnost./ob j em) do 5 i a nejvýhodněji je 3,13 % (což je ekvivalent 150 mM arginin-HCl). Pokud je excipientem glycin, jeho koncentrace je v rozmezí od 0,5 % (hmotnost/obj em) do 2 i a nejvýhodněji je 0,52 ΐ (což je ekvivalentní 66,7 mM až 266,4 mM a nejvýhodněji 70 mM) . Pokud je excipientem kyselina glutamová, jeho koncentrace je v rozmezí od 100 mM az 2C0 mM a nejvýhodněji 170 mM (což je ekvivalent 1,47 i dc 2,94 ·· a nej výhodněj i 2,5 ?, všechna - hmotnost/objem).

Různé excipienty jako stabilizující činidla pro kapalný interferonový přípravek byly analyzovány pomoci pufrovacího systému obsahujícího 50 inM octan sodný a ledovou kyselinu octovou společně se 100 mM chloridem sodným o pH 5,0. Vzorky kapalného interferonového přípravku jsou testovány tepelným stresem tak, že se inkubují ve 37 °c po dobu 1 až 3 týdnů nebo mechanickým stresem, kdy se umístí na 1 až 3 dny na rotátor. Takto stresované vzorky se pak hodnotily na stabilitu interřeronu způsobem popsaným v příkladu 1. Jak je podrobněji popsáno v příkladu 7, přípravky obsahující pufr s hodnotou pH 5,0 s octanem sodným a aminokyselinovým excipientem (a případně ještě obsahující chlorid sodný) prokazovaly nejlepší stabilitu.

• * · * 0 0 · 0 0 0 · 0 0 · 0··· 0 0 0 · • 0 · · «0 0 · «00000 • · 0 β 0 0

000 0 0 000 00 · 0· 00 . Interferon

Výhodný interferon je fibroblastový interferon-beta nejvýhodnějši je lidský rekombinantní interferon-beta produkovaný v savčích buňkách. Lidský rekombinantní interferon-beta múze obsahovat volnou sulfhydrylovou skupinu a alespoň jednu disulfidovou vazbu. Zvláště výhodná molekula obsahuje jednu volnou sulfhydrylovou skupinu v poloze 17 a jednu disulfidovou vazbu mezi polohami 31 a 141 v každé molekule. Jak je to známo v případě přirozeného lidského IFNbeta, N-glykosylace se očekává v místě Asn-80. Rozmezí koncentrace v kapalném přípravku podle předkládaného vynálezu je asi od 30 pg/ml do 250 pg/ml. Výhodné rozmezí koncentrace je 48 až 78 gg/ml a nejvýhodnější koncentrace je 60 pg/ml. Ve smyslu Mezinárodních standardů byl stanoven vnitřní standard firmy Biogen vzhledem ke stanardu WHO pro interferon Natural

Gb-23-902-531, takže rozmezí koncentrací v IU (pro objem injekce 0,5 ml) je od 6 IMU do 50 IMU a nejvýhodnějši koncentrace je 12 IMU.

3. Pufr

Pufrovací roztoky organických kyselin nebo fosfátové pufry, které se mohou použít podle předkládaného vynálezu, pro udržení hodnoty pH v rozmezí od 4,0 do 7,2 a výhodně od 4,5 do 5,5, ne j výhodně j i pH 5,0, mohou být obvyklé pufry organických kyselin a jejich solí jako jsou např. pufry citratové (obsahující např. směs monosodné a disodné soli kyseliny citrónové, směs kyseliny citrónové a její tnsodné soli, směs kyseliny citrónové a její monosodné soli apod.), pufry sukcinátové (např. směs kyseliny jantarové a její monosodné soli, směs kyseliny jantarové a hydroxidu sodného, směs kyseliny jantarové a její disodné soli apod.), pufry tartarátové (např. směs kyseliny vinné a její sodné solí, • 9 • 9 *1 *9 • 9 9 9 • « • 9 • 9

9··· 9· ·* ·· 9 9 9*99 • 9 9*

9 9

9 · »*· 999 ·

9 9 9 směs kyseliny vinné a její draselné soli, směs kyseliny vinné a hydroxidu sodného apod.), fumarátové pufry (např. směs kyseliny fumarové a její monosodné soli, směs kyseliny fumarové a její disodné soli, směs monosodné a disodné soli kyseliny fumarové apod.), glukonátové pufry (např. směs kyseliny glukonové a její sodné soli, směs kyseliny glukonové a hydroxidu sodného, směs kyseliny glukonové a její draselné solí apod.), oxalátové pufry (např. směs kyseliny šťavelové a její sodné soli, směs kyseliny šťavelové a hydroxidu sodného, směs kyseliny šťavelové a její draselné soli apod.), laktátové pufry (např. směs kyseliny mléčné a její sodné soli, směs kyseliny mléčné a hydroxidu sodného, směs kyseliny mléčné a její draselné soli apod.), fosfátové pufry (hydrogenfosforečnan sodný/dihydrogenfosofroerčnan sodný) a acetátové pufry (např. směs kyseliny octové a její sodné soli, kyseliny octové a hydroxidu sodného apod.}.

V následujících příkladech byly pro výběr nejvhodnějsího pufru použity pufry různých koncetrací a s různou hodnotou pH, a sice jednalo se o pufry obsahující fosforečnan sodný, citrcnan sodný, jantaran sodný, uhličitan sodný nebo octan sodný. Vzorky interferonu-beta byly umístěny buďto ve 37 °C na dc-bu 6 dnu až 2 týdnů nebo byly umístěny v rotátoru po 7 až 9 hodin, aby se urychlil degradačni proces. Pak byly stanoveny chemické vlastnosti vzorků. Vzorky byly analyzovány měřením optické hustoty, peptidovým mapováním, vylučovací HPLC, redukující a neredukující SDS-PAGE/westernový přenos a isoelektrickým fokusováním (IEF)/westernový přenos, jak je podrobněji popsáno v příkladu 1. Všechny pokusné vzorky interferonu-beta byly srovnávány s výchozím materiálem nebo se vzorky interferonubeta, které byly uchovávány při 2 až 8 °C. Údaje ukazují, že pH je hlavním faktorem, který určuje stabilitu vzorků ··«· 4 · * * ·« ·· • 4

4 4··

I 4 4 « i « · a • · · 4 interferonu-beta, a že vzorky s pH mezi 4,0 a 5,0 byly stabilnější než vzorky s pH 7,0 nebo vyšším, viz příklad 2. Přesto jsme vyvinuli několik interferonových přípravků s fyziologickou hodnotou pH (pH 7,2), viz příklad 6.

4. Kavitace

Většina sulfhydrylových skupin v interferonu-beta je oxidována při vysokém pH (pH>8,0), tj. pH kdy se přestavují, disulfidové vazby. Zjistili jsme určitou agregaci interferonu-beta v meziproduktu pomocí analýzy vylučovací chromatografií, neredukující SDS-PAGE a analýzou rozptylu laserového světla. Poté jsme zjistili, že vytváření agregátu

interferonu-beta je závis.	le na množství rozpuštěného kyslíku.
Vypracovali	jsme následuj	ící kritéria pro postup, kterým je
zajištěno,	že kapalný	přípravek interferonu-beta není
kavi tován:	a) nemělo b	y být žádné rozhraní plynu
obsahuj ícího	kyslík	s kapalinou v průběhů přípravy

a skladování, pokud je to možné, b) v průběhů přípravy a skladovaní by se neměiy tvořit zádně bubliny, a c) hladina rozpuštěného kyslíku v přípravku by se měla udržovat pod 10 i atmosférické rovnovážné koncentrace při teplotě přípravy a skladování (viz příklad 3).

S.Adsorpce interferonu na povrchy

Zjistili jsme také, že interferon se adsorbuje na určité povrchy a jeho skladování ve skleněných nádobách vyžaduje, aby alespoň jeden povrch nádoby, který je v kontaktu s interferonem, byl potažen materiálem, který zabrání nebo podstatně omezí adsorpci. Takový povrch může být chemicky nebo fyzikálně inertní k adsorpci. příklady vhodných materiálů jsou odborníkovi známy a patří k nim např. nastřikovaný nebo vypalovaný silikon, polypropylen nebo « « · * · « ·· · · kil «4« « · · · · * ·

»«««·«·* ·· *0 20	• ·
polytetrafluoretylén (PTFE). Použili jsme výhodné	kapalné
přípravky s koncentrací 60 pg/ml (BG9589-1, 2,	3 a 4,
přehledně uvedené v tab. 1) a naplnili jimi skleněné	inj ekční

stříkačky typu I o objemu 1 ml potažené nastříkaným silikonem (Becton Dickinson) a skleněné lahvičky typu I o objemu 0,75 ml. Vzorky pak byly analyzovány HPLC s reverzní fází (rpHPLC) a byla určena koncentrace proteinu. Údaje ukazují, že ve vzorcích naplněných do skleněných lahviček bylo méně proteinu v roztoku než ve stříkačkách potažených silikonem (viz příklad 5).

6. Výhodné přípravky

Byla provedena kinetická analýza stability proteinů u čtyř kapalných přípravku, které obsahovaly 60 mg/ml interferonu-beta, a jejichž výsledná koncentrace je uvedena v následující tabulce 1. Další alternativní přípravky, z nichž některé obsahují surfaktanty jako je Pluronic F-68 (od firmy BASF), jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 1: Výhodné přípravky

Systém pH	Excipient	Výsledné pH
20 mM acetát	150 mM arginín-HCl	5.0	(BG9589-1)
2 0 mM acetát	70 mM glycin 100 mM chlorid sodný	5.0	(8G9589-2)
20 mM fosfát	140 mM argmin-HCl	7 . 2	(BG9589-3)
20 mM fosfát	70 mM glycin 100 mM chlorid sodný	7.2	(BG9589-4)

Všechny složky uvedených přípravků odpovídají Lékopisu

USA.

*4 «4 ·« 4«

4 4 4 « 4 * • 4 4 4 4 « 4

444 44 *4

4 4*44

4*444*44 »4 4 4 «· 44 * 4 • 4 ·

4*4 4*4 • · * « 4 «

Konkrétní složení jednotlivých přípravků je následuj ící:

BG9589-1

Složka (jako surovina)	Množství
Arginin-HCl(podle Lékopisu USA, USP)	15,8 mg
ledová kyselina octová, USP	0,167 mg
octan sodný, trihydrát, USP	0,972 mg
Interferon-beta	3 0 μς
Voda pro injekce, USP	0,5 ml

BG9589-2 Složka (jako surovina)	Množství
Glycin (podle Lékopisu	USA, USP)	2,62 mg
L e ci o v á kyselina octová,	USP	0,135 mg
Octan sodný, trihydrát,	USP	0,932 mg
Interferon-beta la		30 μ g
Voda pro injekce, USP		0, 5 ml
Chlorid sodný		2,922 mg

BG9589-3

Složka (jako surovina,'

Arginin-HCl(podle Lékopisu USA, USP) Hydrogenfosforečnan sodný-7H_:. 0 Dihydrogenfosforečnan sodný-1H_:O Interferon-beta la

Voda pro injekce, USP

Množství 14,725 mg 2,332 mg 0,359 mg 30 ug 0, 5 ml »· · ·· »« «> »«

Λ V · * « « · ·*« • · · · · · * « · « · * · * * · · * » 99*99· • « « * » « · ·1·« »··* ·· · »«

BG9589-4

Složka (jako surovina) Množství

Hydrogenfosforečnan sodný-7H:0	1,984 mg
Dihydrogenřosforečnan soáný-lH;Q	0,359 mg
Interferon-beta la	30 μg
Glycin	2.623 mg
Chlorid sodný	2.922 mg
Voda pro injekce, USP	0, 5 ml

Tabulka 2: Alternativní přípravky

Systém pH	E x o i p i e n t	Výsledné pH
20 mM acetát	150 mM arginin-HCl 15 mg/ml lidský sérový albumin	5,0
20 mM acetát	150 mM arginin-HCl 0,1c Plurcnic F-68	r Pi - - f '-J
20 mtl acetát	14 0 itM chlorid s o dny	5, 0
20 mM acetát	15 mg/ml lidský sérový albumin 140 mM chlorid sodný	5, 0
20 mM acetát	0,1« PÍuroňic F-68 140 mM chlorid sodný	5, 0
'170 mM kyselina L-glutamová 150 mM hydroxid sodný	15 mg/ml lidský sérový albumin	5, 0
170 mM kyselina L-glutamová 150 mM hydroxid sodný	0,15 Pluronic F-68	5, 0

• ti ti* ·· ·· ti* *ti • ti · ti ti ti ti ti ti ti • tititi tititi ti ti · ti ti ti titi titi titi ti·*··· • ti · ti ti ti ti lttiti tititi ti titi ti* titi til

Součástí přípravků podle předkládaného vynálezu mohou být i jiné materiály. K nim patří konzervační látky (všechny údaje o výhodné konentraci se týkají procent hmotnost/objem): fenol (0,2%), metylparaben (0,08%), propylparaben (0,008%), m-kresol (0,1%), chlorobutanol (0.25%), benzylalkohol (0,1 %·) a thimerosal (0,1 %). Na základě analýz pro stanovení áyicydLC piutciriú cl dé ainidaCe ί íidaj Θ ~ zjištěno, že nej výhodnější konzervační látkou je chlorbutanol a benzylalkohol.

7. Soupravy pro parenterální podávání

K výhodným provedením předkládaného vynálezu patří také zabalené soupravy pro parenterální podávání kapalných přípravku podle vynálezu. Souprava muže obsahovat injekční stříkačky naplněné kapalným přípravkem podle předkládaného vynálezu, několik tamponu napuštěných alkoholem, alespoň jednu injekční jehlu, jednu nebo několik náplastí a návod k použití, kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu lze také úspěšně využít v obvyklých bezjehlových injekčních systémech.

E. Použití interferonú

Interřeronové přípravky podle předkládaného vynálezu mají antivirovou účinnost (viz příklad 7). Pro klinické použití závisí množství interferonú použité v konkrétním případě, stejně jako frekvence,s jakou se podává, na mnoha faktorech jako na typu použitého interferonú, nemoci, která je léčena a pacientově reakci na léčení interferc-nem.

Výhodně se kapalné přípravky užívají pro léčení relapsující roztroušené sklerózy mozkomišní (sclerosis

Lyofyilzované (tj. rekonstituované) kapalné obsahující přirozený interferon-beta nebo multiplex).

přípravky

0 0 0 · · · 0 · · « 0 « · Φ · » · · * • · 0« 00 00 000 0 » 0 0 0 0 · · ·«·»··· · 0 ·· * 0 ·· rekombinantní interferon-betabyly podávány pacientům trpícím relapsující roztroušenou sklerózou mozkomíšní, viz Jaccbs et al·., Annals of Neurology 39: 235-294 (březen 1996) a Jacobs a Munschauer, Treatment of multiple sclerosis with interferons, v Treatment of multiple sclerosis: trial design, results and future perspectives, s. 223-250, R.A. Rudnick et al.(ed.), Springer London 1992. Použití kapalných přípravků podle vynálezu pro léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní probíhá podle stejných protokolů a bere do úvahy stejné primární proměnné jaké byly popsány ve výše citované publikaci Jacobse et al.

Jeden ze způsobů jak hodnotit užitečnost kapalných přípravku podle předkládaného vynálezu je provést toxikolcgickou studii a hodnotit podráždění tkáně, ke kterému dojde v důsledku podání kapalného přípravku. Provedli jsme toxikolcgickou studii přípravků podle předkládaného vynálezu na králících, viz příklad 3.

Následující příklady slouží k ilustraci některých provedení vynálezu a v žádném případě předmět vynálezu neomezuj í.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Metody použité pro testy

Bylo použito několik dobře popsaných metod pro stanovení fyzikálně-chemických vlastností interferon-beta v kapalných přípravcích podle předkládaného vynálezu, tyto metody je možné využít i pro charakterizaci jiných interferonu. Přitomnost/nepřítomnost nerozpustných agregátů •··« · ft « · « · · · · * * • * · · * · · · · • · · « V» · · · · · * • ft · « · · byla sledována měřením absorbance při 320 nm a transmitance při 580 nm. Koncentrace rozpustných proteinu byla stanoveny buďto měřením absorbance při 238 až 280 nm (s extir.kčním koeficientem 1,5) nebo kapalinovou chromatografiii (HPLC) s reverzní fází za použití známé koncentrace interferonubeta, která byla přidána k přípravku jako standard. Před b o c b ο τη W 1 ' r 1 7 -T o V ’ ’ V o ' ; 1 n /i r. li v-1 v η v-. >--, τ r 1n'i r' ú r b ' ϋ i . y i á y i. ± jv· x u v ; \ u u u o U .

rozpustných agregátů bylo stanoveno separací agregátů od monomerů interferonu-beta vylučovací chromatografií na koloně TSK-Gel ® G2000SW (Toso Haas, Montgomeryville, PA). Vrchol byl monitorován při 280 nm a použit pro výpočet procenta rozpustných agregátů.

byla potvrzena pomocí gelu s dodecylsulfátem b e t a b y 1 r e d u ková n

Stabilita peptidových koster elektroforézy na polyakrylamidcvém sodným (SDS-PAGE). Interferonmerkaptoetnolem v přítomnosti dodecylsu.1 fátu sodného předtím, než proběhla elektroforéza na 10 až 20? gradientovém gelu (MiniPlus Sepragel.5, Integrated Separation Systems,

Natick, MA). Proteiny pak byly elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózovou membránu a detekovány imunochemickou metodou pomocí protilátek anti-interferon-beta a kozí anti-myší protilátky konjugované s křenovou peroxidá2ou. Viz např. publikace Gel Electroghoresis of Proteins, A Practical Approach, 2nd editicn, B.D. Hames and D. Rickwood, IRL Press.

Změna povrchového náboje, způsobená deamidací a dalšími chemickými změnami, byla sledována pomocí isoelektríckého fokusování na polyakrylamidovém gelu (IEF 3-10 MiniPlus SepragelS, Integrated Separation Systems), viz výše citovaná publikace Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical A.pproach.

« · • · · · ··**

Oxidace methioninu, deaminace asparaginu a další možné chemické změny byly sledovány pomocí peptidového mapování. Interferon-beta byl naštěpen endoproteinázou Lys-C (Wako Pure Chemicals) v přítomnosti dithiotreitolu a vzniklé peptidové fragmenty byly separovány HPLC s reverzní fází. Obecné údaje viz Kalgahtgi, K., a Horvath, C. Rapid Peptide Mapping by

U ·! r Ό . t- 4- r~k V TVÍ —, >-> .—· ,—, Τ ί rei 1 ί rl P k v c-rri v c n. d ¹ ’ Τ Ch ť Γ·, . i J. i. 1 U 1 i. Ό 1 l.iU x i O O. .U -i. Lxl U. 'x. i 1 r U J IL U L· X « . i J / <-* » . i X >> i . ι'-Á x í . J

443, 343-354, 1988.

Profil N-vázaných oligosacharidů byl stanoven pomocí elektroforézy sacharidu podporované fluoroforem (FACE®) firmy Glyko, lne. (Novato, CA). Oligosacharidy navázané na asparagín (N-vázané oligosacharidy) byly uvolněny z glykoproteinu pomocí enzymu peptidové N glykosylázy F, pak byly označeny fluoroforem na redukujícím konci metodou redukční aminace, pak separovány a nakonec kvantifikovány na polyakrylamidovém gelu.

Antivirová aktivita interferonu se stanovuje řadou metod jakonapř. těmi, které jsou podrobně popsány v publikaci W. E. Stewart II, The Interferon Systém, Springer-Verlag (2d Ed. 1981). Zvláště užitečný test pro stanovení antivirové účinnosti interferonu je test inhibice cytopatického působení (CPE, Cytopathic Effeet Inhibition Assay). Výhodná metoda je popsána publikaci WHO Technical Report Series No. 725, Annex 1, 1985), na kterou se tímto plně odkazujeme.

Stručně řečeno, metoda CPE začíná tím, že se připraví pracovní standardní roztok interferonu-beta, který byl předtím kalibrován proti referenčnímu standardu WHO. Tento roztok se připraví s koncentrací 10 000 jednotek (U) v médiu D-MEM+ obsahujícím 10 % fetální bovinní sérum a 4 mM

L-glutamin. V den testu se testované vzorky, standard a kontrolní vzorky naředí médiem D-MEM+ ve třech oddělených ředicích řadách: a) začínající od 32 U/ml a pokračující • 9 · 9 9 9 9

9 9 9 9 · *

99 *·· ··· («99 * · •4 1« »9 «9 polovičním ředěnín, b) začínající od 12 U/ml a pokračující ředěnín 1,5, a c) začínající od 6 U/ml a pokračující ředěním 1,2. Po 50 μΐ naředěného vzorku se pak nanese do sloupců na 96jamkové mikrodestičce, přičemž se jedna destička užije pro jedno ředění. Pak se do každé jamky přidá 50 μΐ buněk A549 (ATCC, katalogové č. CCL-1S5, Rockville, MD) v D-MEM+ ir νΏΡΓΏΓιΓΚΟΟ''! V 1 Π k m v, Π V / 1 • -L .λ — _ ·—· Í fc -k. U i 1 k. O. / i k L f naředění jak buněk tak interferonu-beta. Buňky s interferonem se pak inkubují ve 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu 15 až 20 hodin. Obsah destičky se vytřepe a do každé jamky se přidá 100 μΐ viru EMC (encefalomyokarditida) vhodné naředěného médiem. Buňky s virem se pak inkubují ve 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu 30 hodin. Obsah destičky se pak vytřepe a přidá se 0,75/ barvivo krystalová violeť. Po 5 až 10 minutách se destičky opláchnou destilovanou vodou a nechají oschnout. Každá destička přitom obsahuje kontrolu buněčného růstu, kterou je jamka neobsahující ani interfercn ani EMC, virovou kontrolu, kterou je jamka obsahující EMC a buňky, ale žádný interferon, a ředicí řadu interferonového standardu.

Destičky se vyhodnocují vizuálně, aby se určila poslední jamka v každém sloupci ještě s živými buňkami (>25 % konfluentní purpurové barvy). Detekční limit je určen jako nejnižší koncentrace standardu, která chrání před toxicitou viru. Ředění vzorků v poslední pozitivní jamce se násobí detekčním limitem, který byl určen pro standard, a faktorem ředění vzorků, a tím se získá hodnota aktivity interferonu ve vzorku (MU/ml). Výsledky z každé destičky jsou převedeny na logaritmické hodnoty pro stanovení geometrického průměru a je vypočten 95 % interval spolehlivosti.

0 • · «00« 0 0 0 · · *04

Příklad 2

Výběr pufrovacího systému

Byly připraveny tři sady pufru obsahující 9 až 10 různých složek v každé sadě. Sada I obsahovala sérii roztoků fosforečnanu sodného a 100 rrM chloridu sodného s pH mezí 4,0 a 7,2. Sada II obsahovala další řadu pufrú obsahujících citronan sodný s pH mezi 4,0 a 7,0. Sada III obsahovala pufrovací roztoky obsahující jantaran sodný, octan sodný a uhličitan sodný, vždy v kombinaci se 100 mM chloridem sodným, s pH v rozmezí 4,0 až 7,2. Ve dvou dalších roztocích byl chlorid sodný nahrazen 50mM síranem sodným při pH 4,0 až 7,2.

Základní roztok mterferonu-beta byl po roztátí přes noc dialyzován proti různým pufrúm při 2 až 8 “C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak byl získaný roztok sterilizován filtrací. Koncentrace proteinu byla stanovena merenim absorbance

1,5 mg’· mi cm'’} a všechny vzorky obsahovaly 140 pg/ml nebo 150 pg/ml interferonu-beta. Vzorky byly přefiltrovány, rozděleny na 4 sady do 2,2ml mikrozkumavek typu ependorf.

cr.

um !s extinkčním cel i cier.tem

Jedna sada byla	umístěna	do	2 až 8	°c,	jedna	sada byla
umístěna do 37 °C	na 6 dní	až	2 týdny,	j iná	byla	umístěna do
rotátoru na 7 až	9 hodin	a	poslední	sada	byla	užita jako

kontrola v počátečním (nulovém) čase. Procentuální ztráty proteinu v důsledku vzniku nerozpustných agregátů byla vypočítána ze snížení koncentrace proteinu v průběhu různých zásahů dělené výchozí koncentrací.

Výsledky byly následující:

Procentuální ztráty proteinu v důsledku vzniku nerozpustných agregátů byla vypočítána ze snížení koncentrace proteinu v průběhu různých zásahů dělené výchozí koncentrací.

• v t ·»·· · »··

Statická ananalýza všech získaných dat ukázala, že vzorky interferonú v pufrech s pH 4,0 až 5,0 měly menší procentální ztrátu proteinů v důsledku agregace ve srovnání se vzorky s vyšším pH. Vzorky interferonú inkubované při 37 °C a pH 4,0 až 5,0 ztratily asi 10 až 15 % v důsledku agregace. Při pH hodnotách vyšších než 6 rostly ztráty až na 40 až 50 *.

Zjistili isme také, že ínterferormvé vzorky r-U

^.1 wssím ne z více rozpustných agregátů.

AvsaK pomoci peptidového mapování jsme zjistili, že když se hodnota pH zvyšuje z 4,0 na 7,2, podstatně se lineárním způsobme zvyšuje množství interferonú, který je deamidován, při pH 7,0 a vyšším více než 85 ? interferonú bylo deaminováno v této studii. Měřili jsme také isoelektrický bod (pí) proteinových druhu ve vzorku (tj. pH při kterém protein nemigruje v elektrickém poli a celkový průměrný náboj proteinu je nulový) a lEF/westerncvý přenos ukázaly zvláštní pás pí vzorků v citrátovém pufru a změnily intenzitu pásu vzorku v sukcinátovém pufru. Fosfátový pufr r.emá žádnou pufrovací kapacitu při pH 5,0. Pufr s octanem sodným a chloridem sodným s pH 5,0 nejevil žádné změny ve vzorci pásu ani v intenzitě pásů.

Příklad 3

P u s o c e η - κ a v 11 a c e

Během experimentů, kdy se testovala vhodná hodnota pH, popsaných v příkladu 2, jsme zjistili, že prostor nad přípravkem ve skladovacích zkumavkách je kritický pro ztrátu proteinu u některých vzorků. Když byl vzorek o objemu 1,5 ml umístěn ve 2,2ml zkumavce, nebyly pozorovány žádné ztráty proteinu. Naopak ve vzorku 1,2 ml výrazně vzrostla tvorba agregátů. To je v souladu s pozorováním, že tvorba agregátů

4 interferonu-beta v průběhu kroku purifikace, kdy se inaktivuje virus, závisí na hladině rozpuštěného kyslíku v průběhu tohoto kroku.

Ve stručnosti, krok inaktivace viru zahrnuje nastavení pH chelatujícícho sefarózového eluátu (viz sekce C) z hodnoty 7,85 ± 0,25 na hodnotu mezi 2,5 až 3,5 pomocí 15¾ kyseliny fosforečné, pak se okyselený eluát ponechá 120 až 135 minut a pak se znovu upraví pH na 6,7 ± 0,7 pomoci 0, 5N hydroxidu sodného. Všechny uvedené kroky se provádějí ve 2 až 8 °C. Navrhli jsme provedení studie, která by stanovila, zde existuje vztah mezi vytvářením agregátů interferonu-beta v tomto kroku a množstvím rozpuštěného kyslíku.

Materiál a metody

Eluát z chelatující sefarczové kolony byl rozdělen na 50 ml nebo 100 ml alikvotní části a přenesen po 100 ml rotačních lahví. Do každé lahve se přidal 1 ml argonem probublané 15% kyseliny fosforečné, láhev se pak jemně promícháváia 2 minuty a pak se držela bez míchaní 2 hodiny ve 2 až 8 °C. Po této době se přidalo 6,5 ml argonem probublaného hydroxidu sodného a vzorky byly testovány vylučovací chromatografií v různých časovýchch intervalech. Kyslík rozpuštěný v kapalině byl měřen kontinuálně kyslíkovou sondou (Orion, Model 860) a zaznamenán v okamžiku přidání baze. U vzorků s hladinou kyslíku stejnou nebo nižší než 10 % byly prostory nad kapalinou v reakčních nádobkách promyty argonem.

Výsledky: Data uvedená na obr. 1 jasně ukazují vztah mezi množstvím rozpuštěného kyslíku přítomného v okamžiku přidání hydroxidu sodného a výtěžkem monomeru interferonubeta v průběhu kroku inaktivace viru. Hodnoty výtěžku získané při koncentraci kyslíku nižší nebo shodné s 10 i jsou

4 významně odlišné od všech ostatních koncentrací kyslíku. Také jsme charakterizovali agregáty (data zde nejsou uvedena) a zjistili jsme, že jejich specifická aktivita je snížena 30 až 40x ve srovnání se základním meziproduktem. Také jsme zjistili, že více než 90 i agregátů je rezistentních k denaturaci pomocí SDS za neredukujících podmínek, což vede

(.Ci kj z. c

KOVďiěi'i Liliím VdiíJdíUi. Ó3 redukujících podmínek (2* beta-merkaptoetanol) se agregáty rozpadají na monomery, což vede k domněnce, že se jedná o disulfidové vazby.

Příklad 4

Výběr excipientu

Série přípravku s interferonem-beta (60 pg/m.l ) obsahující různé excipienty byla připravena s výhodným pufrem o pH 5,0 obsahujícím 5CnM cctan sodný a 100 mM chlorid sodný. Excipienty byly glycin, argmin-HCl, sacharósa, glycerin, PEG3350, glutathion a Pluronic F-68. Meziprodukt interferonubeta byl dialyzován proti do 50mM octanu sodného a 100 mM chloridu sodného s pH 5,0 přes noc při 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak ještě před použitím filtrován. Koncentrace interferonu-beta byla stanovena měřením absorbance při 278 nm s odečtem pozadí. Všechny vzorky byly neředěny tak, aby výsledná koncentrace interferonu-beta byla přibližně 60 pg/ml. Všechny vzorky byly přefiltrovány, 2 ml byly přeneseny do 4ml skleněné lahvičky (nesilikonizované), prostor nad kapalinou byl propláchnut argonem a lahvičky byly uzavřeny. Sady vzorků pak byly umístěny do 2 až 8 ’C a do 37 °C na dobu až 2 týdnů. Další vzorky byly podrobeny mechanickému stresu tím, že rotovaly po dobu 3 dnů.

• 9 »· ♦ · »· · * ·* ··*· · · 9 · 9 · · • · · v 9 · · · · · · · 9 · 9 9 · ♦ 9 · · 9 4 9 • 9 · · 9 9 · · «9*9 9·«* »· · * ·· ··

Vzorky byly analyzovány v příkladu 1. Kromě toho procento postupy popsanými rozpuštěného kyslíku v přípravku bylo měřeno analyzátorem krevních plynů CibaCorning Model 248. Experimentální hodnota je parciální tlak kyslíku (v mm Hg) vzorku, od kterého se odečte parciální tlak v blanku, který byl prcbublán dusíkem, a kontrolní hodnota je parciální t.lak kyslíku v bl ankcvézin pufru uloženém při teplotě místnosti, cd které se odečte parciální tlak kyslíku dusíkem probublaném pufru. Procento rozpuštěného kyslíku (experimentální/kontrolní) bylo vždy nižší než 30 t.

Výsledky: Analýzy IEF/westernový přenos a SDS-PAGE/ westernový přenos vzorků inkubovaných při 37 °C po dva týdny ukázal posun pásů a snížení jejich intenzity současně přítomnost multimerU interferonu ve vzorcích, které obsahovaly PEG3350 a glutathion. Po dalším týdnu ve 37 ^DC vzorek, kde byl jako excipient glycerin, ukázal po analýze jeden zvláštní pás. Tam, kde byla použita sacharóza jako excipient došlo ke ztrátě intenzity pásu. Toto počáteční testování umožnilo dále podrobněji zvažovat použití argininu-HCl, glycinu, chloíridu sodného a manitolu v dalších studiích.

Příklad 5

Adsorpce interferonu

Interferonový meziprodukt byl po roztátí dialyzován do BG9589-1, 2, 3 a 4 (viz tabulka 1) přes noc v 2 až 8 “C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak před použitím filtrován. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbance při 280 nm (s extinkčním koeficientem 1,5 mg¹ ml cm'¹). Všechny vzorky byly naředěny tak, aby výsledná koncentrace »4 ·· « » ·· ·· ···· · 9 · 9 · · • 9 · 4 · · · · · 9

V * ·«··«· 9· 99 99 99 interferonu-beta byla přibližně 60 μ5/ιη1. Naředěné vzorky byly přeneseny ve třech opakováních buďto do 0,5ml silikonizovaných stříkaček dlouhých 1 cm (sklo typu I), kde byl prostor nad kapalinou propláchnut dusíkem, nebo do 0,75ml lahviček ze skla typu I, kde byl volný prostor nad kapalinou propláchnut argonem. Koncentrace proteinu se stanovily pomocí HPLC s reverzní fází (viz příklad 1)

Následující tabulka 3 uvádí přehled koncentrací proteinů, které byly stanoveny HPLC s reverzní fází. Údaje ukazují, že bylo méně proteinu ve vzorcích, které byly naplněny do skleněných lahviček ve srovnání se stříkačkami potaženými silikonem. Takže pro kapalné přípravky s interferonem-beta byly vybrány silikonizované stříkačky.

Tabulka 3

	Skleněná lahvička	Silikonizované stříkačka
(μα/ml)		t pig/ml)	(S.D.)
3G9539-1	59.3	(2.6)	63.3	(2.5)
BG9589-2	58.3	(0.7)	61.7	(0.1)
BG9589-3	56.4	(0.4)	58.8	(1.1)
8G9589-4	55.5	(0.7)	59.3	(0.5)

Příklad 6

Přípravky s fyziologickou hodnotou pH

Iontová síla/fosfát. Počáteční studie byly provedeny v pufrovacím systému fosfátového pufru s chloridem sodným s hodnotou pH 7,2 a s proměnlivou koncentrací jednotlivých složek, takže byla použita koncentrace fosfátu 10, 50 a mM a iontová síla (definovaná jako I = 2c₁z3, kde c. a Z;

v « · · · «'·**«·* · · ·* »* «« · * • · · · « ·· «· jsou molární koncentrace a náboj příslušného iontu i) byla 0,2, 0,4 a 0,6 upravována pomocí chloridu sodného. Bylo využito řaktoriální schéma experimentu, kde proměnnými byly koncentrace fosfátu (10, 50 a 75 mM) a iontová síla (0,2, 0,4 a 0,6). Obsahy fosforečnanu a hydrogenfosoforečnanu sodného a chloridu sodného v pufru (aby bylo dosaženo požadované iontové sliv) se nočiťai·,/ nemocí upraveného kalkulátoru, který publikovali Elis a Morrison: Buffers of Constant Ionic Strenght for Studying pH-dependent Processes, Methods Enzymol. 87: 405-426, 1982. Rovnice dovolovaly stanovit požadované množství každé složky pufru pro určité pH, koncentraci fosfátu a iontovou sílu. Každý z devíti roztoku použitých v tomto· multifaktoriálním experimentu byl připraven výměnou pufru v interferonovém meziproduktu pomocí odsolovací kolony Pharmacia PD-10, Hodnota oH všech výsledných roztoku byla 7,20 ± 0,15. Koncentrace byly stanoveny z hodnot absorbar.ee měřené při 280 nm a pak byl interferon-beta neředěn příslušným pufrem na koncentraci 150 μα/ml. Výsledné roztoky byly sterilizovány filtrací přes 0,22 μπι filtr v argonové atmosféře byly po 1,3 ml uzavřeny do 5ml skleněných lahviček, kde byl prostor nad roztokem naplněn argonem. Vzorky byly ve třech opakováních inkubovány při 37 °C po 6 dnů. Vzorky se analyzovaly a byly charakterizovány procentem transmitance při 580 nm, procentem výtěžku proteinu a pomocí IEe-PAGE/westernovy přenos.

Výsledky: Analýza transmitance pro různé iontové síly ukázala trend zvyšování transmitance (tj . snižování množství nerozpustných proteinových agregátů) s rostoucí iontovou sílou. Procento výtěžku proteinu jevilo stejnou tendencí, ačkoliv IEF-PAGE/westernový přenos neukázaly žádný trend v deamidaci s měnící se iontovou sílou, takže všechny vzorky byly shodně deamidovány. Po uskladněni 6 dní ve 37 °C vzorky ···» · · Λ· ► · · < ·«* ··« ·« ·· vykazovaly zmenšující se agregaci pro snižující se koncentraci fosfátu a zvyšující se iontovou sílu. Výsledky experimentu s procentuální transmítanci a procentem výtěžku v závislosti na měnící se koncentraci fosfátu (zde neuvedeny) ukazují slabý trend snižování % transmitabnce s rostoucí koncentrací fosfátu, ale analýza rozptylu neprokázala \τ nrumcrn

ΩΠΓΊ ΓΊ koncentracemi fosfátu. Procenta výtěžku jevily zlepšený výtěžek proteinu pro nižší koncentrace fosfátu (významný rozdíl pro 94% interval spolehlivosti). Analýzy IEFPAGE/westernový přenos nejevily žádný zřetelný trend v deamidaci v závislosti na koncentraci fosfátu.

Poměr excipinet/sůl. Předběžné studie ukázaly (výsledky zde neuvedeny), že některé excipienty vyžadují sul (např. chlorid sodný), aby se udržela vysoká iontová síla a bylo dosaženo stabilizujícího účinku při pH 7,2. Takže byl navržen multifaktoriáiní experiment kombinující excipienty (glycin, lysin, arginin, sacharóza a manitol) sodného přispívající k isotoničnost chloridu a frakce roztoku (fvu = 0, 0,25, 0,75 a 1,0). Tato frakce se vypočítává podle vzorce f_s.v = CA,-, i/ (Chci

O_e kde O,,οι a o

X.-if Ί ·

J sou osmolality v mOsm/kg chloridu sodného a excipientu v roztoku. Solná frakce umožňuje porovnávat účinek soli při různých excipientech. Všechny vzorky obsahovaly aditiva pro dosažení isotoničností, s proměnlivým poměrem excipienc:sůl (definovaným pomoci f,on)·

Bylv připraveny 10% (hmotnost/objem) zásobní roztoky každého excipientu ve 20mM fosfátovém pufru s pH 7,2, které byly odplyněny a probublány argonem. Byl také připraven roztoky 20mM chloridu sodného s 20mM fosfátem o pH 7,2, který byl odplyněn a probublán argonem. Výsledné roztoky byly testovány na koncentraci interferonu-beta měřením absorbance • 4 4 · • · · 4 • 4 · ··· « 4 ·44· 4 * •«»44444 ·· «4 44 44 při 280 nm a pak naředěny fosfátovým pufrem a příslušným zásobním roztokem excipientu a soli tak, aby se získala koncentrace interferonu 60 pg/ml a požadovaný poměr soli a excipientu. Výsledné vzorky se sterilizovaly filrací (0,22 pm) a naplnily se do 1 ml silikon!zovaných skleněných stříkaček (Becton Dickinson) typu I (naplnitelný objem 0,5 ml) s piud-Uiem nad íoxLukem naplněným dusíkem. Vlulky byly uloženy při 40 °C.

V 6 dnech byly vzorky s argininem, glycinem a sacharózou analyzovány měřením absorbance při 320 a 280 nm, jak před tak i po filtraci přes 0,22 pm filtr. Ve 2 týdnech byly podobně analyzovány vzorky obsahující arginin, lysin a manítol, které byly také podrobeny IEE-PAGE, redukující SDS-PAGE a neredukující SDS-PAGE. Kontrolní vzorky byly uloženy při teplotě 2 až 8 ^cC a obdobně analyzovány.

Výsledky: Výtěžek interferonu-beta la (vyjádřený jako procenta kontroly) rostl s rostoucí hodnotou pro sachahrózu a manítol, maximální hodnoty dosáhl pro f.,_:_ = 1 (130 mM chlorid sodný). Pro arginin a lysin výtěžek klesal s rostoucí hodnotou f,·;. Maximálního výtěžku pro přípravky s glycinem při pH 7,2 bylo dosaženo při í ·. = 0,75.

Tento test excipientú s fosfátovým pufrem o pH 7,2 s různými excipienty jako glycin, lysin, arginin, manítol a sacharóza, doplněnými do izotonického roztoku, ukázal, že výtěžek byl nízký u všech excipientú bez náboje. Míra deamidace nebyla těmito aditivy ovlivněna. Tak např. redukující a neredukující SDS/PAGE ukázala, že došlo ke ztrátě neglykosylovaných druhu interferonu-beta ve všech typech přípravků a ke ztrátě těžších pásů monomerů v samotném isotonickém chloridu sodném a manitolu. Lze shrnout, že je zde silná korelace mezi iontovým charakterem excipientu a jeho schopností stabilizovat interferon-beta proti agregaci • 9 9 · ·

9 9 « 9 9 9 v těchto pufrovacích systémech při fyziologickém pH. Neiontová aditiva, jako je sacharóza nebo manitol, neposkytují, jak se zdá, žádnou ochranu, ve skutečnosti mohou i uspíšit ztrátu proteinu při fyziologickém pH. Chlorid sodný s jedním nábojem na rozpuštěnou částici, se chová lépe než manitol nebo sacharóza. Aminokyseliny obsahují dva náboje na molekulu při fyzio) ogi ckém pH. V případě olvcinu se zwitteriontová povaha této molekuly nezdá dostatečná k tomu, aby stabilizovala interferon-beta. Arginin a lysin obsahující po třech nábojích na molekulu stabilizují interferon-beta lépe než samotný chlorid sodný nebo přípravky obsahující glycin/chlorid sodný.

Příklad 7

Studie kinetiky a stability

Přípravky byly asepticky rozpínány v inertní atmosféře, stříkačky se inkubovaly v různých teplotách po ruzr.ě dlouhou dobu a pak byl obsah stříkaček analyzován.

Interferonový meziprodukt byl po roztátí dialyzován do BG9589-1, 2, 3 a 4 přes noc v 2 až 8 °C s alespoň dvěma výměnami pufru a pak před použitím filtrován. Koncentrace proteinu byla stanovena měřením absorbance při 280 nm (s extinkčním koeficientem 1,5 mg^_; ml cm-). Všechny vzorky byly naředény tak, aby výsledná koncentrace interferonu-beta la byla přibližně 60 pg/ml. Čtyři interferonové přípravky podle tabulky 1 byly přefiltrovány a pak po 0,5 ml naplněny do dlouhých lml stříkaček Becton Dickinson (BD) , jejichž vnitřní povrch byl potažen nastříkaným nebo vypalovaným silikonem. Vzorky byly analyzovány měřením OD, vylučovací HPLC (SEC), elektroforézou s isoelektrickým fokusováním SDSPAGE/westernový přenos, elektroforézou na redukujícím «000 *001 t 0 0 0 0 0 ( • · 0 0 0 0«

1*00 I

0 · » 0 0 polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE)/westernovým přenosem, peptidovým mapováním, elektroforézou sacahridů podporovanou fluoroforem (FACE) a bictestem CPE. Plyn vyplňující prostor nad roztokem byl dusík. Stříkačky byly inkubovány ve 2 až 8 °C, 25 °C, 33 °C a 40 °C po dobu až 90 dnů. Vzorky byly analyzovány postupy popsanými v příkladu 1.

Vvs 1 V v ·

-i „ _ -- - - J .

i n !

vzorcích, normalizované vzhledem k výchozímu materiálu po dobu 90 dnů při různých teplotách. Obrázek 2 ilustruje, že BG9589-1 vykazuje úplnou stabilitu proteinu (nedošlo k žádné ztrátě proteinu) po 3 měsících inkubace v teplotě od 2 až 8 °C (průměrně 4°C) do 25 °C, Při teplotě skladování blížící se teplotě lidského těla (35 °C) bylo degradováno asi 18 i proteinu. Při teplotě skladování přesahující teplotu lidského těla (40 ^C) bylo pc 3 měsících degradováno asi 30 * proteinu. V podstatě shodné výsledky byly získány pro BG959S-2 (zde neuvedeny). Obrázek 3 ilustruje výsledky z testu, kdy se po 2 měsíce skladoval BG9589-3. Degradace proteinu byla minimální od 4 do 25 °C, ale při vyšších teplotách byla rychlá. Výsledky pro BG9589-4 jsou v podstatě shodné s výsledky uvedenými v tabulkách 2 a 3. Tyto údaje byly také potvrzeny pomocí SDS-PAGE/westernový přenos.

Ve vypalovaných stříkačkách nebyly po dobu studie žádné detekovatelné rozpustné agregáty. Také nebyly pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů. Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDS-PAGE)/westernovým

Došlo k určitému s výchozím bodem.

přenosem ani IEF/westernovým přenosem zvýšení procenta deamidace ve srovnání Avšak výchozí materiál požitý k plnění stříkaček měl 37% deamidaci, což je více než 33,8 % které byly detekovány v materiálu po naplnění do stříkaček. To může být způsobeno • 0 • 0 0 0 0 00000000 ·* ·· variabilitou v testu. Ve stříkačkách s nástřikem silikonu nebyly po dobu studie také žádné detekovatelné rozpustné agregáty. Také nebyly pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů. Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDS-PAGE)/westernovým přenosem ani IEF/westernovým r-. r- m Pl í--ITT'·. /4 η -ί ττό c 1 V ír Ί *7 C t ΌΠ OO C C Vl· r ΐΊ η M t '7 0 i i 1 W JLi I L··· C l.¹ V U ''wt i 1 _ V V ¹ Λ. 1 A. A. f výsledný produkt BG9589-1 je stabilní až 3 měsíce v 2 až 3 °C ve stříkačkách s vypalovaným silikonem a až 6 měsíců ve 2 až 8 °C ve stříkačkách s nastříkaným silikonem.

Po té, co byly stříkačky asepticky naplněny, byl proveden antivirový test CPE s přípravky BG9589-1 a BG9589-2 (viz tabulka 1). Hodnoty aktivity jak pro BG9539-1 tak i BG9589-2 byly 12,0 MU/ml. Antivirový test CPE se opakoval po uskladnění vzorku 3 měsíce v teplotě 2 až 8 ’C. Zjištěná aktivita BG95S9-1 byla 11,6 MU/ml (n^3) s 952 intervalem spolehlivosti 10,2 13,3 MU/ml.

Měřili jsme také stabilitu hlavního meziproduktu BG9589-1 ve 2 až 3 °C po dobu 5 měsíců a v -70 °C po dobu 6 měsíců. Vzorky BG9589-1 z pilotní diafiltrační studie byly analyzovány metodami popsanými v příkladu 1 . Dosavadní výsledky ukázaly, že meziprodukt BG9589-1 je stabilní ve 2 až 3 °C po dobu 5 měsíců a v -70 °C po dobu 6 měsíců.

Po celou dobu této konkrétní studie nebyly detekovatelné žádné rozpustné agregáty. Také nebyly pozorovány žádné změny v koncentraci proteinu, v testu CPE, procentu oxidovaného AP6 a profilu sacharidů (rozdíly v deamidaci spadají do šíře rozptylu testu). Žádné změny vzorků nebyly detekovány ani redukující SDS-PAGE)/westernovým přenosem ani IEF/westernovým přenosem. Došlo k mírnému snížení koncentrace proteinu, ke snížení koncentrace proteinu u vzorků v -70 °C mohlo dojít v důsledku jednoho cyklu • 4 • 4 ·

4 4 · · · · *44 44 44

4 4 * 4 4 4

444444*4 44 44 44 zamrazení/tání. Snížení koncentrace proteinu však představuje nejvýše 15 i počáteční koncentrace.

Příklad 8

Preklinická studie

Ryla provedena studie 1 okální snášenlivostí jediné intramuskulární injekce na králících, která sloužila k hodnocení lokální toxicity interferonu podávaného v několika nových přípravcích. Reakce v místě injekce na podání kapalných přípravků podle předkládaného vynálezu nebo rekonstituovaných přípravků s lyofílizovaným ínterferonem byla srovnatelná s odpovědí na podáni normálního fyzιοίogického roztoku.

1. Studie čtyř přípravku interferonu-beta sledováním podráždění a biologické dostupnosti po podání jedné IM dávky králíkovi

Dvacet samců nevoze1andských bílých králíku bylo intramuskulárně (IM) injikováno 30 pg interferonu-beta la ve formě jednoho z pěti následujících přípravku: BG9589-1 (pH 5,0, acetátový pufr, arginin jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-2 (pH 5,0, acetátový pufr, glycin/NaCl jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-3 (pH 5,0, fosfátový pufr, arginin jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka), BG9589-4 (pH 7,2, acetátový pufr, glycin/NaCl jako stabilizátor, 0,5 ml/dávka)a lyofilizovaný přípravek interferonu-beta s pH 7,2 obsahující 1,5% H3A, 1,0 ml/dávka (viz výše citovaný Jacobs et al.).

Každé ošetření bylo aplikováno na 4 zvířata. Zvířata, která dostala BG9589-1 nebo lyofilizovaný přípravek, dostala také injekci stejného objemu fyziologického roztoku do » · kontralaterální poloviny těla jako negativní kontrolu. Mikroskopické dermální vyšetření na erytém, tvorbu jizev a edém bylo provedeno 6, 12, 24, 48 a 72 hodin po aplikaci dávky. Po odběru krve po 72 hodinách od aplikace dávky byla zvířata usmrcena a místa vpichu byla zhodnocena makroskopicky z hlediska poškození tkání a pak byla fixována 10 % neutrálně pufrovaném formalínu. v?orkv svalové tkáně (tři π 3 k S Ξ óó místo vpichu) byly mikroskopicky vyšetřeny na zánět, nekrózy, hemoragii a léze.

Výsledky: Když se použilo hodnocení podle škály indexu primárního podráždění (dermální klasifikační systém EPA), pak žádný z použitých přípravků nezpůsobil více než slabé podráždění přípravku podrážděni kůže. Makroskopické vyšetření místa injekce BG9589-4 odhalilo u jednoho zvířete slabé (hemoragii), avšak mikroskopické vyšetření neukázalo žádné známky hemoragie a prokázalo, že se jednalo o artefakt. Stručně shrnuto, mikroskopická vyšetření ukázala, že reakce na podání testovaných kapalných přípravků v místě injekce byly konzistentně minimální až mírné a že žádná reakce nebyla silnější než reakce způsobená podáním lyofilizováného přípravku nebo fyziologického roztoku.

Kromě toho podráždění kůže králíků po opakovaném IM podání kapalného přípravku se může snadno testovat pomocí několika skupin králíku, kteří budou dostávat intramuskulární injekce kapalného přípravku nebo ryzíoiogického roztoku každý druhý den (celkem 5 dávek). Dávky se podávají do předem definovaného místa na hřbetě každého zvířete, aby se maximalizovala expozice k testované látce. Makroskopické dermální vyšetřeni se provádí 4 až 6 hodin po každém podáni a 24 hodin po posledním podání v každé ošetřované skupině. Po 24 hodinách od podání poslední dávky po makroskopickém vyšetření se zvířata usmrtí a místa injekcí se podrobí

	42	4 * » 4 · · • · 4 4 · 4 ·	4 · · · • · 4 • 4 4 ««4 4 4 • 4 · ·
4 • · β 4 4 4 4 4 4 4	• 4 · 4 · · • · · 4 4 · 4 4
vyšeteření na	přítomnost poškození	tkání a	tkáně se	pak
fixují v 10 %	neutrálně pufrováném	formalínu.	Fixovaná	tkáň

se pak vyšetřuje mikroskopicky na přítomnost zánětu, nekrózy, hemoragie a leze. Bezprostředně před prvním podáním testované látky a před usmrcením se odebírají vzorky krve pro hematologické vyšetření a biochemické vyšetření séra.

Příklad 9

Klinická studie

Kapalné přípravky podle předkládaného vynálezu se významně odlišují od dříve známých interferonových přípravků. Z hlediska klinické indikace zde existuje možnost, že se mění farmakokinetické podání člověku, vvsoce druhově a farmakodynamické chování ínterferonú po

Naneštěstí jsou účinky interferonu-beta specifické a většina pertinentních :e studií na kulturách farmakologickych informací pohází zs lidských buněk, na lidech a v menší míře na opicích. Výhodným způsobem testu farmakologických změn je pokus lidské bioekvivalence.

Antivirovou hladinu interferonu-beta v séru je možné kvantifikovat pomocí biotestu cytopatického účinku (CPE), který byl popsán v příkladu 1. Studie lidské bioekvivalence muže být provedena s jakýmkoliv počtem kapalných nebo iyofi1izovaných interferonových přípravků. Analýzou séra, plochy pod křivkou (AUC) a je odborník schopen určit, zda jsou lyofilizované a kapalné přípravky bioekvivalentní. Jako jediný příklad studia bioekvivalence uvádíme zde stručně dvojnásobně slepou křížovou jednodávkovou studii, abychom demonstrovali bioekvivalenci kapalných přípravků podle předkládaného vynálezu s lyofilizovanými přípravky interferonu-beta na skupině zdravých dobrovolníků.

*«·» ««»·

Návrh studie: Každý subjekt dostává stejnou dávku (např. 60 pg/12 MU)přípravku interferonu-beta ve dvojnásobně slepém pokuse křížově ve dvou okamžicích (viz tabulka 4). Subjekty jsou ve věku mezi 18 a 45 lety včetně a v 151 rozmezí normální tělní hmotnosti a výšky pro daný tělní typ. Bezprostředně před aplikací, a v různých časových intervalech po aplikaci každé dávky, až pn 144 hodin po aplikaci se odebírají vzo rky krvp ve pro hematologické vyšetření, vyšetření biochemické, vyšetření aktivity interferonu-beta a vyšetření farmakodynamického profilu. Také se vyhodnocuje bolestivost při injekci a reakce v místě injekce.

Doprovodná opatření studie: každý subjekt dostává acetaminofen bezprostředně před a během období aplikace dávek jako profylaxi proti chřipkovému syndromu spojenému s mterferonem.

Farmakokmtika: Stanovení interferonu-beta v séru

Hladiny v séru se určují jako jednotky antivirové účinnosti testem CPE. Antivirová hladina v séru se analyzuje na hodnoty AUC, c_r,_3>: a T_T-,_:,. Hodnoty AUC se vypočítávají z času od dávky po poslední detekovatelnou hladinu (AUCo-·]·) a pro 144 hodin po dávce (AUC_c<-). Standardní popisná analýza těchto experimentálních dat se provádí pomocí programového souboru SAS (verze 6.08, SAS Institute, Cary, North Carolina) .

Tabulka 5: Schéma dávek v ukázkové studii

Skupina	Způsob podání	Dávka (MU)	1. termín podání	2.termín podání
1	IM	12	lyofilizovaný (60 mcg)	kapalný (60 mcg)
2	IM	12	kapalný (60 mcg)	lyofilizovaný (60 mcg)

• 444 » * · 4

Farmakodynamika

Biologický markér neopterin, produkt interferonem indukovaného enzymu GIPcyklohydrolázy, který odráží aktivaci makrofágú a T-buněk (C. Huber et al., J. Exp. Med. 15, 1984, 160: 310-314; September 20, 1996; D.Fuchs et al., Immunol. Today 9: 150-155; 1988) byl charakterizován. Jak v klinických tak ± j,ubntřiiu interferonu-beta koreluje indukce neopterinu s aktivitou v séru po podání různých rekombinantních lidských interferonů.

Neopterin se měří standardním laboratorním postupem. Farmakodynamický profil interferonu-beta se popíše kvantitativním způsobem výpočtem třech paramatrů neopterinu v krvi. První parametr, je plocha pod křivkou závislosti neopterinu na čase normalizovaná k základní hladině. Druhý parametr je E_!L=._:, tento paramter je rozdílem mezi pozorovaným vrcholem neopterinu adní hladinou neooterínu. Třetí parametr je indukční poměr, IP., tento parametr se počítá jako vrcholová hodnota hladiny neopterinu dělená základní hladinou neopterinu.

Statistika.

Pro stanovení ekvivalence na .AUC bylo užito WilcoxonMann-Whitneyova jednostranného a dvoustranného testu. Pro stanoveni relativní biologické dostupnosti mterferonu z kapalného přípravku relativně vzhledem k lyofolizovanému přípravku a 90% intervalu spolehlivosti byla provedena na AUC analýza rozptylu (ANOVA) po logaritmické transformaci. Pomocí rozptylu mezi subjekty se oddělí vliv posloupnosti a pohlaví. Pomocí rozptylu uvnitř subjektu se oddělí složky rozptylu způsobné obdobím a skupinou léčení.

* *·· ♦ fc · » • · · ···· · ·· · « · · · · · « # ·»··«· • · ···· · · «««··«* · · ♦ · ♦ · ·

Ekvivalenty

Odborníkovi jsou zřejmá další provedení vynálezu na základě popisu a příkladů provedení předkládaného vynálezu. .Avšak jak popis tak příklady je třeba považovat za ukázková řešení předkládaného vynálezu, přičemž skutečný předmět a rozsah předkládaného vynálezu je vymezen následujícími n ó r O k y ,

Claims (36)

1. Kapalný přípravek vyznačující se tím, že obsahuje interferon a stabilizující činidlo v množství mezi 0, 3 i a 5 % (hmot.), kteréžto činidlo je aminokyselina vyxvxTZiičx í_ O i k p -L i i _y k J 3 C m C :j i. 11 i i O j k y o j. x i . y ( u x -) ± n - i i a glycin, přičemž tento kapalný přípravek nebyl předtím lyofilizován.

2. Kapalný přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že nádobka, ve které je přípravek obsažen, má alespoň jeden povrch potažený materiálem inertním k interferonu.

3. Kapalný přípravek podle nároku 1 v y z π 3. u u j i c i l i Π1 / Z θ ΙΙΐΖβΖΖθΖΟϋ interferon-beta nebo rekombinantně připravený interferon.

4. Kapalný přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že má hodnotu pH mezi 4,0 a 7,2.

5, Kapalný přípravek podle nároku 4 vyznačující se tím, že má hodnotu pH mezi 4,8 a 5. 2 .

6. Kapalný přípravek podle nároku 5 vyznačující se tím, že má hodnotu pH 5,0.

9 * · * «9 ·» 9 9 V *

9 9 9 9 9 · · 9 9 9 9 • 9 9 9 4 9 9 9 99 9

9 9 99 99 9 · 9999··

9 9 9999 4 9

99999999 9 9 99 9 « 99

7. Kapalný přípravek podle nároku 5 vyznačující se tím, že kyselá aminokyselina je kyselina glutamová.

8. Kapalný přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že arginin je arginín-HCl.

9. Kapalný přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že koncentrace interferonu je mezi 6 IMU/ml a 50 IMU/ml.

10. Kapalný přípravek podle nároku 2 vyznačující se tím, že alespoň jeden povrch nádobky je potažen materiálem vybraným ze skupiny obsahující silikon a polytetraf luoretylé.n .

11. Kapalný přípravek podle nároku 10 v y z n a o u j i c z se Lim, ze n á oo b κ a je in j ekc ni stříkačka.

12. 20mM acetátový pufr spH5,0 vyznačující se tím, že obsahuje interferon-beta a stabilizující činidlo vybrané ze skupiny obsahující a) 150mM arginin, b) iOOmM chlorid sodný a '/OmM gíycin, c) 150mM arginin a 15mg/ml lidský sérový albumin, d) 15OmM arginin a surfaktant, e) 140mM chlorid sodný, f) 140mM chlorid sodný a 15mg/ml lidský sérový albumin, g) 140mM chlorid sodný a surfaktant, přičemž pufr nebyl předtím lyofilizován.

13. Pufr podle nároku 12 vyznačující se t í m, že surfaktant je 0,11 (hmot./obj.) Pluronic F-68.

4 4 49 4·«4

4 4 4 4 4 4 >44 »44 » 4 4 4 4 a 4 4 » 44 44 444 ·«

14. Pufr podle nároku 12 vyznačující se tím, že arginin je argmin-HCl.

15. Pufr podle nároku 12 vyznačující se tím, že nádobka, ve které je pufr obsažen, má alespoň jeden povrch, kLeiý je v koiilakLu s pilířem, pu Ldóeny materiálem vybraným ze a polytetrafluoretylén.

skupiny obsahující silikon

16. Pufr podle nároku 15 vyznačující se tím, že nádobka je injekční stříkačka.

17. Kapalný přípravek s pH 5,0 v y z n a č u j ící setím, že obsahuje interferon-beta a 17 0mM kyselinu L-glutamovou, přičemž přípravek nebyl předtím iyofilizcván.

18. Kapalný o řiρ r av ek vyznačující se tím, glycin, a že dále obsahuje sul.

pod) že obsahuje aminokyselinu

19. Kapalný přípravek podle nároku 17 vyznačující se tím, že dále obsahuje složky vybrané ze skupiny obsahující 15mg/'ml lidský sérový albumin a 0,1* (hmot./obj.) Pluronic F-68.

20. 20mM fosfátový pufr s pH 7,2 vyznačuj ící setím, že obsahuje ínterferon a stabilizující činidlo vybrané ze skupiny obsahující

14 OmM arginin,

b) lOOmM chlorid sodný se 70mM glvcinem, přičemž pufr nebyl předtím lyofilizován.

• ti ♦ ti ti* • ti • · ti · • t · ti 4 ti · · · • ti ti ti ti · ti ti • I *· ► · ti · i · e · • · · ··« ti · • · *

21. Kapalný přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že nádobka, ve které je pufr obsažen, má alespoň jeden povrch, který je v kontaktu s kapalinou, potažený materiálem vybraným ze skupiny obsahující silikon a polytetrafluoretylén.

22. Kapalný přípravek podle nároku 20 vyznačující se tím, že nádobka je injekční stříkačka.

23. Kapalný farmaceutický přípravek, obsažený v zásobní nádobce a vhodný pro parenterální podávání savcům, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství interferonu-beta, pufr udržující pK v rozmezí 4,0 až 6,0 a aminokyselinové stabilizující činidlo, přičemž inter feron-beta nebyl podroben předchozí .lyofilizaci a zásobní nádobka má alespoň jeden povrch, který je v kontaktu s kapalinou, potažený materiálem vybraným ze skupiny obsahující silikon a polytetrafluoretylén.

24. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačuj ící se t í m, že zásobní nádobka nemá t rozhraní prostředí obsahující kysli k/kapalma . 25. Kapalný přípravek podle nároku 23

vyznačující se tím, že interferon beta si v podstatě uchovává svou antivirovou účinnost během skladování při teplotě mezí 2 °C a 25 °C po dobu alespoň dvou měsíců.

• · ·· ·· ·· · · • ·· · » · * • · · · ·«· • ·*·«·· * · · * · · ····*·«« · * · * podle nároku

26. Kapalný přípravek vyznačující se tím, že ínteferon-beta nebyl vystaven předchozí kavitaci.

27. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačující se t í m, že pufr je organický pufr

V y kJ J- U 11 V Z_ V. ú Zi U M ± . i » U U C D1 i u , l U u M v _y / o u j . m u c o y tartarátový, fumarátový, glukonátový, oxaiátový, iaktátový a acetátový pufr.

28. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že aminokyselinové stabilizující činidlo je vybráno ze skupiny obsahující kyselé aminokyseliny, glycin a arginin.

29. Kapalný

V 7 Z i' i Či C u Ί 1 C 1 oriclžrio v množství. 3 podle nároku 28 se t í m, že aminokyselina je až 5,0 7 hmotnosti přípravku.

30. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že pH kapalného přípravku je v rozmezí 4,5 až 5,5.

3í. Kapalný přípravek podle nároku 30 vyznačující se tím, že pH kapalného přípravku je 5,0.

32. Kapalný přípravek podle nároku vyznačující se tím, že je sterilní.

33. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že je isotonický s krví.

34. Kapalný přípravek podle nároku 23 vyznačující se tím, že inerferon-beta je lidský rekorribinantní iner feron-beta .

35. Kapalný přípravek podle nároku 24 vyznačující se tím, že aktivita lidského rekombínantního inteferonu-beta je v rozmezí od 6 do 50 IMU/ml proteinu.

36. Zamražený kapalný přípravek vyznačuj ící setím, že obsahuje interferon a stabilizující činidlo v rozmezí 0,3 * až 3,13 (hmot. i, kteréžto činidlo je aminokyselina vybraná ze skupiny obsahující kyselé aminokyseliny, arginin a glycin, přičemž kapalný přípravek γϊ θ c y 1 p ř θ ci t i t. lyo^ilizc v A n.

37. Souprava pro parenterální podávání kapalného interferonového přípravku vyznačující se tím, že obsahuje a) nádobku obsahující kapalný přípravek s pH mezi 4 a 6, který obsahuje farmaceuticky účinné množství inteferonu-beta, a který nebyl předtím iyofi 1 izován, a aminokyselinové stabilizující činidlo v množství menším než 3,1 (hmot.), a b) návod k použití soupravy.

33, Souprava podle nároku 37 vyznačující se tím, že dále obsahuje c) alkoholový tampon, d) jehlu a alespoň jednu náplast.

• φ »ϊΙ Φ ·

Λ ·ΦΦ··Φφ * · φ · φ φ φ liti · Φ I Φ * · Φ « * φφ

39. Souprava podle nároku 37 vyznačující se tím, že nádobka je injekční stříkačka, která má alespoň jeden povrch, který je v kontaktu s kapalným přípravkem, potažený materiálem vybraným ze skupiny obsahující silikon a polytetrafluoretylén.

<4 γ\ι ΐΓι v a 7 7 αΟ',-Ήω r\ í v- V11 ^J ” · ’-'Χ- - - -- - - - — - - -- t i in, že nádobka je injekční obsažený uvnitř stříkačky nemá kyslik/kapalina.

^ΟτΤ’ΖΤΤΊίΐΓ'ΙΊ’Ι Ί Γ* 1 CO

J -- XX — — — J - ~ _ stříkačka a kapalný přípravek rozhraní prostředí obsahující

41. Způsob stabilizace interřeronu-beta v kapalném farmaceutickém přípravku, takže si v podstatě uchová svou antivirovou účinnost během skladování při teplotě 2 až 25 °C po dobu alespoň 3 měsíců, v y značující se tím, že se smíchá a} inueferon-beta, b) pufr udržující pH v rozmezí 4,0 až 7,2 a c.i aminokyselinové stabilizující činidlo, přičemž kapalina nebyla předtím 1yofi 1 izována ani nebvla kavitována.

42. Způsob podle nároku 42 v y z n a č u j i c í s e tím, že dále obsahuje krok, kdy se přimíchá SÚ1, aby se dosáhlo vhodné iontové síly. 43. Způsob podle nároku 42 vy z n a č u j í 0 i s e

tím, že sůl je chlorid sodný.