NO327844B1 - Pakket sett for administrasjon av interferon beta, flytende sammensetning for slikt sett samt fremgangsmåte for fremstilling derav - Google Patents

Abstract

Flytende interferonsammensetningene som har en pH mellom 4,0 og 7,2 er beskrevet. Sammensetningene omfatter interferon-beta og et stabiliseringsmiddel ved mellom omkring 0,3 vekt% og 5 vekt% som er en aminosyre valgt fra gruppen omfattende sure aminosyrer, arginin og glysin. Om nødvendig blir salt tilsatt for å gi tilstrekkelig jodstyrke. Den flytende sammensetning har ikke på forhånd blitt fryse- tørket eller på forhånd blitt kavitert. Væsken er fortrinnsvis inneholdt i en beholder som har minst en over- flate i kontakt med væsken som er belagt med materiale som er inert overfor adsorpsjon av interferon-beta. Et sett for parenteral administrasjon av en flytende interferon-formulering samt en fremgangsmåte for å stabilisere flytende interferonsammensetningen er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår pakket sett for parenteral

administrasjon av interferon beta som angitt i krav 1, flytende farmasøytisk sammensetning omfattende interferon beta som angitt i krav 23 samt fremgangsmåte for fremstilling av pakket sett omfattende interferon beta som angitt i krav 32.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Interferoner er proteiner som har en mengde biologiske ak-tiviteter, hvorav enkelte er antivirale immunomodulerende og antiproliferative. De er relativt små, artsspesifikke, enkeltkjedede polypeptider fremstilt av pattedyrceller som respons på eksponering til en mengde indusere så som virus, polypeptider, mitogener og lignende. Interferoner beskytter animalsk vev og celler mot viralt angrep og er en viktig vertsforsvarsmekanisme. I de fleste tilfeller gir interferoner bedre beskyttelse for vev og celler av den type hvor-fra de har blitt dannet enn andre typer vev og celler, noe som indikerer at humanavledet interferon bør være mer effektiv til å behandle humane sykdommer enn interferoner fra andre arter.

Det finnes flere distinkte typer humane interferoner generelt klassifisert som leukocytt (interferon alfa), fibroblast (interferon beta) og immun (interferon gamma), og et stort antall varianter derav. Generelle beskrivelser av interferoner kan bli funnet i forskjellige tekstbøker og mo-nografer innbefattende: The Interferon System (W.E. Stewart,II,Springer-Verlag, N.Y.1979); og Interferon Therapy (World Health Organization Technical Reports Series 676, World Health Organization, Geneve 1982).

Fremgangsmåten for å administrere interferon er en viktig faktor i den kliniske anvendelse av dette viktige terapeu-tiske middel. Systemisk administrasjon av interferon med enten intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon har ofte blitt brukt med et visst hell i å behandle sykdommer så som hårcelleleukemi, ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) og relatert Kaposis sarkom. Det er imidlertid kjent at proteiner i sin rensede form er spesielt utsatt for ned-brytning. For interferon beta er hovedmekanismen(e) for in-terferonnedbrytning i oppløsning aggregering og deamidering. Mangelen på interferonstabilitet i oppløsninger og andre produkter har tidligere begrenset dets anvendbarhet.

Farmasøytiske interferonsammensetninger for klinisk bruk inneholder vanligvis interferon som et lyofilisert (dvs. frysetørket) preparat i kombinasjon med komplekse organiske eksipienter og stabilisatorer så som ikke-ioniske overflateaktive midler (dvs. surfaktanter), forskjellige sukkere, organiske polyoler og/eller human serumalbumin. Frysetør-kede preparater har ulempen av å kreve innviklet pakking, siden et separat forhold av sterilt vann for injeksjon er nødvendig. Videre krever frysetørkede preparater flere behandlinger før bruk, noe som således øker muligheten for nålestikk og mistede komponenter under forberedelse for injeksjon. Disse forberedelser er spesielt problematiske for pasientgrupper som oppviser muskelsvakhet og dårlig koordi-nasjon så som personer med multippel sklerose (MS). MS-pasienter kan selvadministrere interferoner slik at tilgjeng-eligheten av en doseringsform som er mye lettere å administrere enn foreliggende frysetørkede produkter represente-rer viktig tilleggsverdi for målpasientgruppen. Enkle flytende formuleringer av interferon er meget ønskelige for å unngå rekonstitueringen som er nødvendig når frysetørkede preparater blir brukt.

Flytende ikke-frysetørkede formuleringer inneholdende interferoner kan også inneholde komplekse bærematerialer så som human serumalbumin, polyoler, sukkere og anioniske overflateaktive stabiliserende midler. Se for eksempel WO 89/10756 (Hara et al.-inneholdende polyol og p-hydroksy-benzoat).

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse har løst de ovennevnte problemer med oppdagelsen at human interferon beta kan bli stabilisert når den plasseres i buffrede oppløsninger som har en pH mellom omkring 4 og 7,2, hvor oppløsningene inneholder en aminosyre som et stabiliserende middel og i enkelte tilfeller et salt (dersom aminosyren ikke inneholder en ladet sidekjede). Interferon beta er ikke frysetørket, men blir når den er fremstilt fra kilder ved å bruke metoder som er kjent for fagmannen, inkludert direkte i formuleringen i følge foreliggende oppfinnelse.

Følgelig er et aspekt av oppfinnelsen en flytende sammensetning omfattende (a) interferon beta (b) en acetatbuffer og (c) arginin med en pH på mellom 4,0 og 7,2 samt serum albumin. Sammensetningen kan inneholde et stabiliserende middel med mellom omkring 0,3 vekt% og 5 vekt% som er arginin. Den flytende sammensetning har ikke på forhånd blitt frysetørket. Videre er det foretrukket at den flytende sammensetning er innhold i en beholder, så som en sprøyte, hvor beholderen har en overflate i kontakt med væsken som er belagt med et materiale som er inert overfor interferon, så som silikon eller polytetrafluoretylen. Foretrukne sammensetninger innbefatter interferon beta, eller et rekombinant fremstilt interferon, i en buffer som har en pH mellom 4,0 og 6,0. Andre formuleringer i følge oppfinnelsen innbefatter : (1) en 20 mM acetatbuffer ved pH 5,0 hvor bufferen ikke på forhånd har blitt frysetørket, hvor bufferen innbefatter interferon beta pluss ingredienser valgt fra (a) 150 mM arginin-HCl; (b) 100 mM natriumklorid og 70 mM glysin; (c) 150 mM arginin-HCl og 15 mg/ml human serumalbumin; (d) 150 mM arginin-HCl og 0,1% pluronic F-68; (e) 140 mM natriumklorid (f) 140 mM natriumklorid og 15 mg/ml human serumalbumin; og (g) 140 mM natriumklorid og 0,1 % pluronic F-68; (2) en 20mM fosfatbuffer ved pH 7,2 hvor bufferen ikke på forhånd har vært frysetørket, hvor bufferen innbefatter interferon beta pluss ingredienser valgt fra punkt (a) 140 mM arginin-HCl; og punkt (b) 100 mM natriumklorid og 70 mM glysin.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen er et sett for parenteral administrasjon av en flytende interferonformulering som angitt i krav 1. Settet omfatter et kammer inneholdende en flytende formulering ved en pH på mellom 4 og 6, hvor væsken omfatter en farmasøytisk effektiv mengde av interferon beta som ikke på forhånd har blitt frysetørket og et aminosyrestabiliserende middel omkring 5 vekt% eller mindre, samt bruksanvisning.

Enda en annen utførelsesform av oppfinnelsen er en flytende farmasøytisk sammensetning som er egnet for parenteral administrasjon til pattedyr, omfattende i hovedsak en effektiv mengde av interferon beta, som ikke på forhånd har blitt frysetørket, i en buffer som opprettholder pH innen området 4,0 til 6,0, en acetatbuffer og arginin og hvor sammensetningen ikke inneholder serum albumin. Sammensetningen er inneholdt i en lagringsbeholder så som en sprøy-te. Fortrinnsvis mangler lagringsbeholderen en oksygeninneholdende/væskeinterfase (dvs. interferonoppløsningen er ikke utsatt for oksygeninneholdende gass under fremstilling og lagring). Interferon betaen opprettholder i hovedsak sin antivirale aktivitet i løpet av lagring ved en temperatur på mellom omkring 2°C og omkring 25°C over en periode på minst 3 måneder.

En fremgangsmåte i følge oppfinnelsen for å stabilisere interferon beta i flytende farmasøytiske sammensetninger slik at den i hovedsak opprettholder sin fysiske stabilitet i løpet av lagring ved en temperatur på mellom omkring 2 og omkring 25°C over en periode på minst 3 måneder omfatter å blande: a) en effektiv mengde av interferon beta b) en buffer som opprettholder pH i området 4,0 til 7,2 ved en passende ionestyrke og c) et aminosyrestabiliserende middel hvor væsken på forhånd ikke har blitt frysetørket og ikke har blitt utsatt for oksygeninneholdende gass i løpet av fremstilling og lagring. Fremgangsmåten utføres for å fremstille et pakket sett for parenteral administrasjon av interferon beta og omfatter de trekk som går frem av krav 32.

Væskeformuleringene i følge oppfinnelsen kan ha mange fordeler i forhold til frysetørkede formuleringer. Fordelene innbefatter: (i) et mindre injeksjonsvolum som er nødvendig for en flytende formulering vil gi mindre ubehag enn et større volum (ii) erstatning av komplekse eksipienter med enkle aminosyrer gjør det mulig å overvåke den ferdige pro-duktkvalitet nøyere (iii) innpakning blir i stor grad for-enklet grunnet elimineringen av behovet av et separat vann-forråd for injeksjon (WFI) og en separat sprøyte og beholder (iiii) doseringsnøyaktighet kan bli forbedret grunnet færre væskeoverføringer og (v) produktsikkerhet blir forbedret fordi den enklere administrasjonen minker muligheten for nålestikk og mistede komponenter under forberedelse for injeksjon.

Følgelig er et mål ved foreliggende oppfinnelse å forbedre en biologisk aktiv stabil flytende formulering av interferon beta for bruk i injiserbare applikasjoner.

Et annet mål med foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en formulering som ikke krever tidligere frysetørking av en interferon betasammensetning.

Det er et ytterligere mål for foreliggende oppfinnelse å forhindre tap av stabilitet i en interferon beta flytende formulering ved: a) å unngå kavitering og/eller bobledan-nelse under fremstilling av en flytende sammensetning, eller b) å lagre den flytende formulering med en boble som består av inert gass så som argon eller nitrogen.

Enda et annet mål ved foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en flytende formulering som tillater lagring over en lang tidsperiode i flytende tilstand, noe som letter lagring og transport før administrasjon.

Et annet mål ved foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe en flytende formulering som lett blir dannet og administrert ved å ha eliminert frysetørking og rekonstituerings-trinn.

Enda et annet mål ved foreliggende oppfinnelse er å fremskaffe et pakket sett med en farmasøytisk sammensetning inneholdende ikke-frysetørket interferon beta som kan bli fremstilt billigere.

Andre fordeler ved oppfinnelsen er angitt i deler av be-skrivelsen som følger og vil delvis være innlysende fra denne beskrivelse eller kan bli funnet fra utføring av foreliggende oppfinnelse. De medfølgende tegninger som er innbefattet i og utgjør en del av foreliggende beskrivelse illustrerer og virker sammen med foreliggende beskrivelse til å forklare prinsippet i følge oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Figur 1 er en kurve som viser prosentdelen av interferon beta monomeer som er tilbake i bulkprosessvæske som en funksjon av prosentdelen oppløst oksygen i væsken. Figur 2 er en kurve som viser prosentdelen av proteinkonsentrasjonen normalisert mot den av utgangsmaterialet mot tiden for væskeformulering BG9589-1. Prøver merket "4°C"

(lukkede firkanter) blir inkubert ved mellom 2-8°C. Andre prøver blir inkubert ved 25°C (lukkede ringer) 33°C (lukkede trekanter) og 40°C (lukkede firkanter).

Figur 3 har en kurve som viser prosentdelen proteinkonsentrasjon normalisert mot den av utgangsmaterialet mot tid for væskeformulering BG9589-3. Prøver merket "4°C" blir inkubert ved mellom 2-8°C. Andre prøver blir inkubert ved 25°C (lukkede sirkler), 33°C (lukkede trekanter), og 40°C (lukkede firkanter).

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse overvinner problemene og ulempene assosiert med aktuelle strategier og metoder og gir en enkel fremgangsmåte for å stabilisere interferon samt en enkel interferonformulering med øket lagringsstabilitet. Oppfinnelsen er delvis basert på søkers oppdagelser at: a) interferon beta er spesielt ustabil og aggregerer når den settes i kontakt med oksygen som enten blir aktivt boblet gjennom væsken eller satt statisk i kontakt som en overliggende boble, b) interferon beta flytende preparater som mangler et bære-middel så som human serumalbumin er spesielt utsatt for absorpsjon (dvs. enten kjemisk reaksjon eller fysisk tilknytning) til glassoverflater, og c) interferon beta aggregerer ved lav ionestyrke, noe som krever et ionisk miljø for stabilitet i vannlig tilstand.

A. DEFINISJONER

Uttrykket "buffer" refererer til oppløsninger av en svak syre og et salt inneholdende anionet av syren eller opp-løsninger av en svak base og dets salt. Spesielt refererer uttrykket "acetat" når det brukes i foreliggende beskrivelse (se også Tabell 1, infra) til et buffersystem som fortrinnsvis inneholder natriumacetat og eddiksyre og uttrykket "fosfat" refererer til et buffersystem som fortrinnsvis inneholder henholdsvis dibasisk og monobasisk natriumfosfat-hepta- og monohydrat. Videre er de oppløsninger i Tabell II

( infra) inneholdende en sur aminosyre i kombinasjon med natriumhydroksid, selv om den ikke konvensjonelt er betrak-tet som å være buffere slik dette uttrykk er kjent innen faget, ikke desto mindre innbefattet i definisjonen heri.

Uttrykket "eksipient" refererer til enhver forbindelse som tilsettes i løpet av behandling og/eller lagring til en flytende formulering med det formål å endre bulkegenskap-ene, forbedre stabiliteten og/eller justere osmolaliteten.

Uttrykket "stabiliserende middel" refererer til en eksipient som forbedrer eller på annen måte øker stabiliteten.

Uttrykket "stabilitet" har ved nødvendighet en funksjonell definisjon og betyr den relative, tidsmessige konstans av interferonaktivitet så som antiviral aktivitet og/eller in-terf eronstruktur.

Uttrykket "kavitert" refererer til enhver flytende interferonformulering som på grunn av endringer i trykk eller fysisk agitering har hatt kontakt med oksygeninneholdende bobler (f.eks. luft) minst i løpet av dets fremstilling og lagring. Uttrykket "kavitering" betyr også at en oksygeninneholdende gass-/væskeinterfase har blitt dannet på ett eller annet punkt i fremstilling, lagring og i bruk av den flytende interferonformuleringen. Uttrykket "kavitert" betyr også at nivåene av oppløst oksygen i de flytende inter-feronformuleringene overskrider omkring 10% av atmosfæriske ekvilibriumsverdier ved temperaturer som typisk påtreffes minst i løpet av fremstilling og lagring.

Uttrykket "parenteral" som benyttes heri innbefatter subku-tane, intravenøse, intramuskulære, intrasternale, intrape-riontenale, optalmiske eller intraspinale injeksjons- eller infusj onsteknikker.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt salt" betyr ethvert or-ganisk eller uorganisk addisjonssalt som er relativt ikke-toksisk og uskadelig for en pasient ved konsentrasjoner som er konsistente med effektiv aktivitet slik at bieffektene som tilskrives saltet ikke skader de gunstige effekter av interferonet.

I en "effektiv mengde" av en forbindelse er den mengde som gir et resultat eller oppviser en påvirkning på den spesielle tilstand som blir behandlet. En "effektiv mengde" betyr også den mengden som gir et positivt resultat (dvs. oppviser en antiviral effekt) i CPE-testen for antiviral aktivitet.

Som brukt heri betyr en "farmasøytisk effektiv mengde" av interferon en prosentvis konsentrasjon av dette middel som er kjent innen det medisinske og farmasøytiske felt til å være sikker og effektiv ved å behandle en spesiell tilstand.

"Isotonisk for blod" (benyttet om hverandre med "isotonisitet") refererer til en flytende interferonsammensetning som har en tilstrekkelig konsentrasjon av komponenter slik at dens osmotiske oppførsel i hovedsak er identisk med blod, det vil si, celler i kontakt med formuleringen vil i hovedsak opprettholde sin form og undergå i hovedsak ingen net-tooverføring av vann ved osmotisk trykk.

"Polyionisk materiale" (benyttet om hverandre med "poly-elektrolytisk materiale") refererer til en substans med høy molekylvekt som er en elektrolytt og som når den brukes i formuleringene i følge foreliggende oppfinnelse maksimaliserer ionestyrke for en gitt osmolalitet. Denne definisjonen er basert på søkers funn at interferon beta blir stabilisert av høy ionestyrke, men at den totale ionestyrke er begrenset av nødvendigheten for oppløsningen å være isoton med blod (se Eksempel 7). En foretrukket måte å maksimalisere ionestyrke for en gitt osmolalitet på er å bruke en eksipient som er et polyionisk materiale.

Et materiale som er "inert overfor interferon" betyr et materiale som har minst egenskapen ikke-fysisk og/eller kjemisk og reagerer med interferon.

B. FREMSTILLING AV INTERFERONER

Foreliggende oppfinnelse kan generelt anvendes på alle typer interferon beta innbefattende naturlig interferon beta, interferon beta fremstilt ved rekombinant DNA-teknologi og interferon beta fremstilt ved kjemisk syntese eller modifi-kasjon. I tillegg kan oppfinnelsen bli brukt med grov, se-mirenset eller renset interferon beta fra fibroblaster eller ethvert annet interferon betainneholdende eller -pro-duserende vev fra mennesker eller en hver annen passende art.

Den mest foretrukne interferon beta er en rekombinant form, samt rekombinante DNA-metoder for å fremstille proteiner innbefattende de forskjellige interferon beta er kjent. Se for eksempel U.S.Patents 4,399,216, 5,149,636, 5,179 017 (Axtel et al); 4,470,461 (Kaufman). Rekombinante former av interferon beta har blitt fremstilt. Se for eksempel Euro-peisk Patent 041313 (Fiers-ekspresjon av interferon beta), U.S.Patent 4,966,843 (McMormick et al. - ekspresjon av interferon beta i CHO-celler), U.S.Patent 5,326,859 (Sugano et al. - DNA som kode for interferon beta). Interferon beta kan bli modifisert enten rekombinant eller kjemisk og kan bli fremstilt i serumsinneholdende eller serumsfrie medier. Former av interferon beta kan innbefatte varianter så som cysteinutarmede mutanter (U.S.Patent 4,588,585 og 4,737,462: Mark et al.) og metioninutarmede mutanter (EP 260 350 - Wang et al.). Den primære aminosyresekvens av proteinet kan bli forsterket ved derivatisering ved å bruke sukkerenheter (glukosilering) eller ved andre supplementære molekyler. Andre modifikasjoner kan finne sted gjennom de posttranslasjonelle prosesseringssystemer hos vertscellen. Individuelle aminosyreresiduer i kjeden kan bli ytterligere modifisert ved oksidering, reduksjon eller annen derivatisering og proteinet kan bli spaltet for å danne aktive fragmenter. Den nøyaktige kjemiske struktur av en spesiell rekombinant interferon beta vil følgelig avhenge av flere faktorer og er ikke ment å begrense omfanget av oppfinnelsen. Alle slike interferon beta proteiner innbefattet i formuleringene beskrevet heri vil opprettholde sin bioakti-vitet når de plasseres i egnede miljømessige betingelser.

En fremgangsmåte for å fremstille rekombinant interferon beta er å dyrke kinesiske hamsterovaria(CHO)celler trans-fektert med det humane interferon betagen. Rekombinant interferon beta blir utskilt av CHO-celler dyrket i batchsus-pensjonsceller inneholdende føtalt bovinserum. Celler kan bli dyrket i spinnerflasker oppbevart i en C02~inkubator (5% C02) ved omkring 35°C (heretter "C") . Flere spinnerflasker kan bli slått sammen og inokulert i fermentatorer av økende størrelse om oppskalering er ønsket. Vekst i en gitt fermentator blir utført i omkring seks dager ved hvilken tid det aktive interferon beta produkt akkumulerer i dyrkningsmediet. Kulturen kan så bli innhøstet og cellene fjernet fra det produktinneholdende medium ved, for eksempel, tangentiell strømningsfiltrering.

C. OPPRENSKNING AV INTERFERONER

Opprenskningsmetoder for interferoner er godt karakterisert og tilgjengelige for den vanlige fagmann. Slike metoder innbefatter enkelt- eller multitrinnsprosedyrer som involverer forskjellige kromatografiske separasjonstrinn. Se for eksempel U.S.Patent 5,015,730 (Friesen et al. - affinitets-kromatografi og HPLC); 4,541,952 (Hosoi et al. - chelate-ringskromatografi).

En eksempelvis metode involverer utnytting av den uvanlige hydrofobiske og relativt basiske natur av interferon beta molekylet så vel som dets sterke affinitet for å binde me-tallioner. Se for eksempel Knight og Fahey "Human Fibroblast Interferon, an Improved Purification", J. Biol. Chem.,256:3609-3611(1981), og Edy et al. "Purification of Human Fibroblast Interferon by Zinc Chelate Chromatography", J. Biol. Chem.,232:5934-5935(1981).

Kort angitt involverer innfavnings- og opprenskningstrin-nene å binde interferon beta til en serie av Sepharose®kolonner (markedsført av Pharmacia Biotech) og elue-ring med salter og en polyol. Når det endelige sepharose-eluat har blitt fortynnet og justert ved å senke pH, vil interferon betaet deri binde til SP Sepharose® (Pharmacia Biotech). Det meste av de gjenværende proteiner som er til stede i kolonnepåsetningsmaterialet er mer basiske av natur enn monomerisk interferon beta og binder kraftigere til kolonnen enn interferonet. DNA og virus skilles fra interferon beta på denne kolonne. Derpå blir kolonnen vasket med en serie buffere inneholdende natriumklorid.

Interferonproduktet vil nå binde til en chelaterende Sepharose® (Pharmacia Biotech)kolonne som på forhånd er blitt

tilført sink. Se Edy et al., supra. Denne kolonnen blir be-tjent under en oksygenfri atmosfære for å beskytte den frie sulfhudrylgruppe i molekylet og likeledes er alle de etter-følgende trinn. Det rensede interferon blir surgjort og

holdt ved lav pH for å inaktivere ethvert gjenværende virus. Etter nøytralisering blir interferonet konsentrert ved å bruke krysstrømningsfiltrering og derpå blir bufferen byttet ut til en nøytral bufferoppløsning. Bufferbyttepro-sessen reduserer konsentrasjonene av sink og organiske forbindelser. Etter dette kan bulkinterferonet bli lagret ved

-70°C før formuleringstrinnene.

D. FORMULERING AV INTERFERONER

I den eksempelvise opprenskningsmetode beskrevet ovenfor og etter første bufferbytte blir et andre bufferbytte satt i gang, bortsett fra at den nøytrale bufferoppløsning er erstattet med en bufferoppløsning mellom pH 4 og 7,2 som inneholder et stabiliserende middel beskrevet i større detalj nedenfor. Den resulterende formulering inneholdende interferon beta blir referert til som et "prosessintermediat" og kan bli frosset for lagring. Se også Eksempel 7.

Dersom lagret i frossen tilstand (under en atmosfære av en inert gass så som argon eller nitrogen) kan den bli tint og pumpet gjennom et 0.22 filter til et tarert kammer, fortrinnsvis rustfritt stål, hvor prosessintermediatet blir kombinert med et på forhånd filtersterilisert fortynnings-middel inntil den ønskede endelige produktvekt blir opp-nådd. Fortynningsmiddelet består av samme buffer som ble brukt i andre bufferskifteprosess. Det flytende sluttpro-dukt blir så filtersterilisert under aseptiske prosedyrer ved å bruke for eksempel to 0,22 filteret i serie, og overføres til en forseglet beholder, fortrinnsvis rustfritt stål, som inneholder et inert gassinntak i en avgasnings-ventil/filterkombinasjon og et innløp/utløps dypperør. Sluttproduktet blir pumpet gjennom dypperøret og inn i den forseglede beholder. Ved å bruke inert gass så som nitrogen blir sluttproduktet trykkoverført til pumpeutløpet av en anordning som er i stand til aseptisk å fylle sterile sprøyter.

Flere metoder for aseptisk å fylle sterile sprøyter er tilgjengelige. En eksempelvis metode involverer bruk av et HYPAC® autoklaverbart sprøytefyllmateriale (Becton Dickinson Pharmaceutical Systems, Franklin Lakes, NJ). Sprøytene blir autoklavert med tuppkapslene på plass. Generelt innbefatter anordninger av denne type et vakuumkammer som inneholder sprøytene som skal fylles med interferonformulering. Kammeret blir plassert i et aseptisk miljø. Hver sprøyte ligger vertikalt i kammeret hvor dens åpne ende blir matet til en stempelpinne tilpasset til å passe inn i den åpne ende av sprøytesylinderen. Pinnen er utformet til å sette inn en stopper i sylinderen for å fange inn væsken innenfor. Et lite overliggende rom blir etterlatt i sprøyten etter innsprøytning. Kammeret blir evakuert og tilbakespylt med en inert oksygenfri gass (f.eks. argon, nitrogen) flere ganger og så når det endelige vakuum blir nådd, blir pinne-ne mekanisk drevet inn i den åpne sprøytesylinder en kort avstand og kapslene blir automatisk satt inn i de respek-tive sprøyter. Kammeret blir så utluftet med filtrert luft for å bringe trykket inni kammeret tilbake til atmosfærisk nivå. Mengden av vakuum vil bestemme størrelsen av det inerte, gassinneholdende, overliggende rom.

I det spesielle system som anvendes av søker, blir sprøy-tene orientert vertikalt og holdt på plass av et tannhjul på en roterende skive. Sprøytene blir først festet under en nål som blir satt inn i sprøyten. Nålen spyler det indre av sprøyten med en inert gass (f.eks. nitrogen, argon). Nålen trekkes så ut av sprøyten. Sprøyten blir så plassert under en andre nål som føres inn i sprøyten. Denne nålen er festet til en pumpe som fyller produktet inn i sprøyten. Den andre nål trekkes så ut av sprøyten. Sprøyten plasseres så under en tredje nål som føres inn i sprøyten. Et stempel (på forhånd autoklavert) blåses inn i sprøyten med en inert oksygenfri gass (f.eks. nitrogen, argon) derpå trekkes nålen ut av sprøyten. Stempelet plasseres for å etterlate et overliggende rom av inert gass mellom toppen av væsken og bunnen av stempelet.

1. Eksipienten:

Eksipienten er fortrinnsvis et polyionisk materiale som maksimaliserer ionestyrke for en gitt osmolalitet så som for eksempel en polyelektrolytt som kan innbefatte heparin eller annet polymert materiale. Som diskutert i Eksempel 4 blir interferon beta stabilisert av høy ionestyrke, men to-tal ionestyrke er begrenset av nødvendigheten for oppløs-ningen å være isoton med blod. En foretrukket måte å maksi-mere ionestyrken på for en gitt osmolalitet er følgelig å bruke et polyionisk materiale. Interferon betaoppløsninger i følge oppfinnelsen er isotone med blod (omkring 290 mmol/kilo).

Det mest foretrukne stabiliseringsmiddel for foreliggende oppfinnelse er arginin som blir inkorporert i sin sure form (arginin-HCl) i pH 5,0 oppløsninger. Uten å ønske å være bundet av noen teori er det faktum at polyioniske eksipienter er foretrukket sannsynligvis grunnen til at arginin (med 3 ladede grupper) stabiliserer interferon og som i sin tur stabiliserer bedre enn noen av de undersøkte uladede materialer.

Dersom eksipienten er arginin-HCl vil dens konsentrasjon ligge i området mellom 0,5% (w/w) til 5%, og er mest foretrukket 3,13% (tilsvarende 150 mM arginin-HCl).

Søker analyserte forskjellige eksipienter som stabiliseringsmiddel for flytende formuleringer av interferon beta ved å bruke pH-buffersystemet med 50 mM natriumacetat og iseddiksyre i kombinasjon med 100 mM natriumklorid pH 5,0. Flytende interferonprøver blir enten termisk stresset ved inkubering ved 37°C i omkring 1 til 3 uker eller plassert i en rotator i 1 til 3 dager som mekanisk stress. Behandlede prøver blir vurdert for interferon betastabilitet ved metodene beskrevet i Eksempel 1. Som beskrevet i større detalj i Eksempel 7 viser formuleringene bufret ved pH 5,0 med natriumacetat inneholdende en aminosyreeksipient (og even-tuelt inneholdende natriumklorid) den beste stabilitet.

2. Interferonet

Det foretrukne interferon er fibroblast interferon beta, og mest foretrukket som rekombinant humant interferon beta fremstilt av pattedyrceller. Det rekombinante humane interferon beta kan inneholde en fri sulfhudryl og minst en disulfidbinding. Et spesielt foretrukket molekyl inneholder en fri sulfhudryl ved posisjon 17 og en disulfidbinding mellom posisjon 31 og 141 per molekyl. Slik som er kjent å være tilfelle med naturlige human IFN-beta, N-glykosylering ventet ved Asn-80. Konsentrasjonsområdet i de flytende formuleringer av interferonet er fra omkring 30 ^g/ml til omkring 250 ^g/ml. Et foretrukket konsentrasjonsområde er 48 til 78 ug/ml og den mest foretrukne konsentrasjonen er omkring 60 ug/ml. Ut fra internasjonale standardverdier har den innvendige biogenstandard blitt standardisert til WHO Internasjonale Standard for Interferon, Natural #Gb-23-902-531, slik at konsentrasjonsområdet i IU (for et 0,5 ml injeksjonsvolum) er fra omkring 6 IMU til 50 IMU og den mest foretrukne konsentrasjon er 12 IMU.

3. Bufferen:

Den organiske syre og fosfatbuffere som skal brukes i foreliggende oppfinnelse for å opprettholde pH i området på omkring 4,0 til 6,0 og fortrinnsvis fra omkring 4,5 til omkring 5,5, og mest foretrukket 5,0, kan være konvensjonelle buffere av organiske syrer og salter derav, så som citrat-buffere (f.eks. mononatriumscitrat-dinatriumcitratblanding, sitronsyre-trinatriumcitratblanding, sitronsyre-mononatri-um-citratblanding osv.), suksinatbuffere (f.eks. ravsyre-mononatrium-suksinatblanding, ravsyre-natriumhydroksidblanding, ravsyre-dinatrium-suksinatblanding osv.), tartratbuf-fere (f.eks. vinsyre-natriumtartrat-blanding, vinsyre-ka-liumtartratblanding, vinsyre-natrium-hydroksidblanding osv.), fumaratbuffere (f.eks. fumarsyre-mononatrium-fumaratblanding, fumarsyre dinatrium-fumaratblanding, mono-natrium-fumaratdinatirum-fumaratblanding osv.), gluconat-buffere (f.eks. gluconsyre-natriumgluconatblanding, gluconsyre natriumhydroksid-blanding, gluconsyre kaliumgluconat-blanding osv.), oksalatbuffere (f.eks. oksalsyre natriumok-salatblanding, oksalsyre natirumhydroksidblanding, oksalsyre kaliumoksalatblanding osv.), laktatbuffere (f.eks. melkesyre natriumlaktatblanding, melkesyre natriumhydroksidblanding, melkesyre-kaliumlaktatblanding osv.), fosfatbuffere (natriumfosfatmonobasisk/natriumdibasisk) og ace-tatbuffere (f.eks. eddiksyre natriumacetatblanding, eddiksyre natriumhydroksidblanding osv.).

I eksemplene beskrevet nedenfor bruker søker forskjellige bufferkonsentrasjoner og forskjellige pH av natriumfosfat, natriumcitrat, natriumsuksinat, natriumkarbonat og natriumacetat for vurdering av den mest passende buffer. Interferon betaprøver blir enten plassert ved 37°C i 6 dager til 2 uker eller plassert på en rotator i 7 til 9 timer for å ak-selerere nedbrytningsprosesser. Kjemiske egenskaper av prø-vene blir så bestemt. Prøvene blir analysert med optisk tetthet, peptidkartlegging, størrelseseksklusjon HPLC, reduserende og ikkereduserende SDS-PAGE/Western blots, og isoelektrisk fokusering/Western blots (IEF), alle beskrevet nedenfor i Eksempel 1. Alle eksperimentelle interferon beta prøver blir sammenlignet med interferon beta utgangsmateri-ale eller interferon beta prøvene plassert mellom 2 og 8°C. Søkers data indikerer at pH er hovedfaktoren som bestemmer stabiliteten av interferon beta prøvene og at prøver mellom pH 4,0 og 5,0 er mer stabile enn dem av pH 7,0 eller større. Se Eksempel 2. Ikke desto mindre var søker i stand til å utvikle flere interferon beta formuleringer ved fysiologisk pH (pH7,2). Se Eksempel 6.

4. Kavitering

De fleste frisulfhudrylresiduer i interferon beta undergår oksidering ved høy pH (pH > 8,0), ved hvilken pH de sulfid-bindinger undergår omfordeling. Søker har funnet en viss aggregering av interferon beta i deres bulkintermediat med størrelseseksklusjonkromotografi, ikkereduserende SDS-PAGE og laserlysspredning. Søker har senere funnet at dannelse av aggregert interferon beta kan være avhengig av nivået av oppløst oksygen. Prosesskriteriene som søker har utviklet for å sikre at de flytende interferon betaformuleringer ikke blir kavitert innbefatter: (a) om mulig bør det ikke finnes noen oksygeninneholdende gass/væske interfase til stede under fremstilling og lagring, og/eller (b) det bør ikke finnes noen bobler dannet under fremstilling og lagring, og/eller (c) nivåene av oppløst oksygen i formuleringen bør bli holdt under 10% av atmosfærisk ekvilibrium ved fremstilling og lagringstemperatur. Se Eksempel 3.

5. Adsorpsjon av Interferon til Overflater

Søker bestemte også at interferon beta vil adsorbere til visse overflater og dets lagring i glassbeholdere krever at minst en overflate av beholderen i kontakt med interferonet er belagt eller på annen måte dekket med et materiale som vil forhindre eller i hovedsak eliminere adsorbsjonen. Denne overflate kan være kjemisk eller fysisk inert til ad-sorbsjon. Eksempelvise materialer til dette formål er kjent for fagmannen og kan for eksempel innbefatte sprayet eller bakt silikon, polypropylen eller polytetrafluoretylen (PTFE). Søker tok sine foretrukne 60 ^g/ml flytende formuleringer (BG9589-1,2,3 og 4: oppsummert i Tabell 1 nedenfor) og fylte dem i 1 ml lange Type 1 glassprøyter belagt med sprayet silikon (Beckon Dickinson) og i 0,75 ml Type 1 glassbeholdere. Prøvene ble så analysert med revers fase HPLC (rpHPLC) for bestemmelse av proteinkonsentrasjon. Dataene indikerer at det fantes mindre protein i oppløsning i de prøver som var fylt i glassbeholderne sammenlignet med de silikonbelagte pre-fylte sprøyter. Se Eksempel 5.

6. Foretrukne formuleringer

Søker utførte kinetisk analyse av proteinstabilitet ved å bruke de fire flytende formuleringer hvis endelige konsentrasjoner er vist nedenfor i Tabell 1, hver inneholdende 60 Hg/ml interferon beta. Andre formuleringer, enkelte inneholdende surfaktanter, så som Pluronic F68 (markedsført av BASF), er gitt i Tabell 2.

Alle formuleringsbestanddeler er USP-grad materialer. De angitte sammensetninger er: BG9589-1 BG9589-2

BG9589-3

BG9589-4

Andre materialer kan bli inkorporert i formuleringene i følge foreliggende oppfinnelse. Disse kan innbefatte de følgende preservativer hvor alle foretrukne prosentdeler er w/v: fenol (omkring 0,2%), metylparaben (0,08%), propyl-paraben (0,008%), m-kresol (0,1%), klorbutanol (0,25%), benzylalkohol (0,1%) og timerasol (0,1%). Basert på analy-ser for å bestemme proteinaggregering og deamidering (data ikke vist), er de mest foretrukne preservativer klorbutanol og benzylalkohol.

7. Sett for Parenteral Administrering

Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen innbefatter et pakket sett for parenteral administrasjon av foreliggende flytende formuleringer. Pakken kan innbefatte sprøyter som på forhånd er fylt med de flytende formuleringer i følge oppfinnelsen, flere alkoholtørk, minst en nål, en eller flere klebebandasjer og bruksanvisning. Det vil også bli forstått at foreliggende flytende formuleringer i følge oppfinnelsen kan bli brukt med konvensjonelle, nålefrie injeksjons systemer .

E. ANVENDELSE AV INTERFERONER

Interferonformuleringen i følge foreliggende oppfinnelse har antiviral aktivitet. Se Eksempel 7. For klinisk bruk avhenger mengden av interferon som blir administrert i et hvert spesielt tilfelle, så vel som frekvensen hvorved interferonet blir administrert, av slike faktorer som type av benyttet interferon, sykdommen som blir behandlet og pasi-entens respons til interferonbehandling.

En foretrukket anvendelse av de flytende sammensetninger i følge oppfinnelsen er til behandling av gjentagende multippel sklerose. Frysetørkede (dvs. rekonstituerte) flytende formuleringer av naturlig interferon beta og rekombinant interferon beta har blitt administrert til pasienter som lider av tilbakevendende multippel sklerose. Se Jacobs et al., Annals of Neurology 39: 285-294 (Mars 1996) og refe-ranser angitt deri samt Jacobs og Munschauer, "Treatment of multiple sclerosis with interferons" (s.223-250) i Treatment of multiple sclerosis: trial design, results and fu-ture perspectives, (R.A.Rudnick et al.,eds), London: Springer, 1992. Bruk av flytende formuleringer beskrevet heri for å behandle multippel sklerose følger de samme metoder og måler de samme primære utløpsvariable som beskrevet i Jacobs et al. artikkelen, supra.

En måte å undersøke anvendbarheten av foreliggende flytende formuleringer på er å utføre et toksikologistudium og vurdere vevsirritasjonen assosiert med administrasjon av den flytende formulering. Søker har utført et toksikologistudium av foreliggende flytende formuleringer i kaniner. Se Eksempel 8.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere utførelses-former av oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1 Assaymetoder

Flere velkarakteriserte metoder blir brukt for å bestemme de fysiokjemiske egenskaper av interferon beta i søkers flytende formuleringer og disse metoder kan bli brukt for å overvåke egenskaper av også andre interferoner.

Tilstedeværelse/fravær av uoppløselig aggregat blir overvåket ved å måle absorbansen ved 320 nm og transmittansen ved 580 nm. Konsentrasjonen av oppløselig protein blir bestemt ved enten å måle absorbans ved 278-280 nm (med en ekstinksjonskoeffisient på 1,5) med revers fase høyeffektsvæske-kromatografi (HPLC) ved å bruke kjente konsentrasjoner av interferon beta tilført formuleringsbufferen som standar-der. De flytende formuleringsprøver blir sentrifugert før assay. Den oppløselige aggregatprosentdelen blir bestemt ved å adskille aggregater fra interferon beta monomeer med størrelseseksklusjonkromatografi på en TSK-Gel® G2000SWXL kolonne (Toso Haase, Montgomeryville, PA). Toppområdene overvåket ved 280 nm blir brukt for å regne ut prosentdelen oppløselig aggregat.

Stabiliteten av peptidstammen blir bekreftet med natriumdo-decylsulfat-polyakrylamidgel-elektroporese (SDS-PAGE). Interferon beta reduseres med merkaptoetanol i nærvær av na-triumdodecylsulfat før den blir utsatt for elektroforese i en 10 - 20% gradient gel (MiniPlus Sepragel®, Integrated Separation Systems, Natick, MA). Proteinene blir så over-ført elektroforetisk til en nitrocellulosemembran og frem-kalt ved immunopåvisning ved å bruke antiinterferon beta-antistoff og geite-anti-mus-antistoff koblet til pepperrot-peroksidase. Se, for eksempel, Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, 2. utgave, B.D.Hames og D.Rickwood, IRL Press.

Forandringen i nettooverflateladning, forårsaket av deami-nering og andre kjemiske endringer, blir overvåket med isoelektrisk fokusering på en polyakrylamidgel (IEF 3-10 MiniPlus Sepragel®, Integrated Separation Systems). Se Gel Electrophoresis of Proteins, A Practical Approach, id.

Metioninoksidering, asparagindeamidering og andre mulige kjemiske forandringer blir også overvåket ved peptidkartlegging. Interferon beta blir spaltet med Endoproteinase Lys-C (Wako Pure Chemicals) i nærvær av ditiotreitol, og de resulterende peptidfragmenter blir adskilt med reversfase HPLC. Se generelt Kalgahtgi, K.,& Horvath, C. "Rapid Pep-tide Mapping by High Performance Liquid Chromatography", J.Chromatography 443,343-354 (1988).

Den N-bundne oligosakkaridprofil blir bestemt ved å bruke et fluoroforassistert-karbohydrat-elektroforese (FACE® system av Glyko, Inc. (Novato, CA). De asparaginbundne (N-bundne) oligosakkarider blir frigjort fra glykoproteinet ved å bruke enzymet peptid N-glykosidase F, derpå merket med en fluorofor ved den reduserende ende ved reduktiv ami-nering adskilt og så mengdebestemt på en polyakrylamidgel.

Antiviral aktivitet av interferoner blir bestemt med et antall metoder så som dem beskrevet mer fullstendig i W.E. Stewart II, The Interferon System, Springer-Verlag (2. utgave 1981). Cytopatisk effekt inhiberingsassay (CPE) er spesielt anvendelig for å bestemme antiviral interferonaktivitet. Søkers foretrukne metode er beskrevet i WHO Technical Report Series No. 725, Annex 1, (1985) innbefattet heri pr. referanse. Kort angitt blir denne CPE-metode initiert ved å fremstille en utgangsmengde av interferon beta standard som på forhånd har blitt kalibrert mot en WHO referansestandard. Dette materiale blir fremstilt i D-MEM+medium inneholdende 10% fetalt bovint serum og 4 mm L-glutamin ved en konsentrasjon på 10.000 enheter (U) pr. ml. På dagen for assayet blir standard, kontroll og prøver fortynnet i D-MEM+ i tre separate fortynningsserier: a) ved å starte ved 32 U/ml fulgt av 2-gangers fortynninger; b) ved å starte ved 12 U/ml fulgt av 1,5-gangers fortynninger; og c) ved å starte ved 6 U/ml fulgt av 1,2-gangers fortynninger. Femti mikroliter av fortynningene blir tilsatt i ko-lonner til brønnene av en 96-brønners mikrotiterplate, en plate pr. fortynningsserie. Dernest blir A549-celler (ATCC katalog nr. CCL-185, Rockville, MD) i D-MEM+ tilsatt til hver brønn ved 5 x 10 5 celler/ml, 50 mikroliter pr. brønn og utføre en to gangers fortynning av begge celler og interferon-beta. Cellene og interferonet inkuberes ved 37°C i 5% karbondioksid i 15 - 20 timer. Plateinnholdet blir ristet i en blekebøtte og 100 mikroliter EMC (encefalomyo-karditis)virus ved passende fortynning i medium ble tilsatt til hver brønn. Viruset og cellene inkuberes ved 37°C og 5% karbondioksid i 30 timer. Plateinnholdet blir ristet i en blekebøtte, og 0,75% krystallfiolettfarge tilsettes til platene. Etter 5-10 minutter blir platene vasket med de-stillert vann og tillatt å tørke. Hver assayplate innbefatter cellevekstkontrollbrønner inneholdende hverken interferon eller EMC, viruskontrollbrønner inneholdende EMC og celler, men ikke interferon, og en fortynningsserie av interferonstandard.

Plater undersøkes visuelt for å bestemme den siste brønn i hver kolonne med levedyktige celler (>25% konfluent rød-farging). Påvisningsgrensen blir bestemt som den laveste konsentrasjon av standard som beskytter fra viruscytotoksi-sitet. Prøvefortynningen i siste positive brønn blir mul-tiplisert med påvisningsgrensen bestemt for standarden, og prøvefortynningsfaktoren for å finne interferonaktiviteten (MU/ml) i prøven. Resultater fra hver plate blir overført til loggenheter for å bestemme geometrisk middel og utregning av 95% konfidensintervaller.

Eksempel 2: Valg av buffersystem

Søker fremstilte tre sett buffere inneholdende mellom ni og ti forskjellige komponenter for hvert sett. Sett I inneholder en serie natriumfosfat og/eller 100 mm natriumklo-ridoppløsninger mellom pH 4,0 og 7,2. Sett II inneholder en ytterligere serie natriumcitratbuffere mellom pH 4,0 og 7,0. Sett III inneholder en serie natriumsukksinat-, natriumacetat- og natriumkarbonatbufferoppløsninger, alle kombinert med 100 mm natriumklorid med pH-verdier i området fra 4,0 til 7,2. To andre oppløsninger erstattet natrium-kloridet med 50 mm natriumsulfat ved en pH på 4,0 og 7,2.

Tinet bulkinterferon beta dialyseres i forskjellige buffere over natten ved 2 - 8°C med minst to bufferskift, derpå sterilfiltrert bruk. Proteinkonsentrasjoner blir bestemt ved absorbans ved 278 nm (med ekstinksjonskoefffisient på 1,5 mg<-1> ml.crrf<1>' og alle prøver inneholdt 140 ^g/ml eller 150 ug/ml interferon-beta. Prøver blir filtrert og oppdelt i fire sett ved delvis å fylle 2,2 ml eppendorfrør. Ett sett plasseres ved 2 - 8°C; ett sett ble plassert ved 37°C

i 6 dager til to uker; et annet sett plasseres på en rotator i 7 - 9 timer; og sluttsettet anvendes som nulltids-kontroll. Prosentvis tap av protein grunnet oppløselige aggregater regnes ut ved tapet av proteinkonsentrasjonen i løpet av forskjellige behandlinger delt på startkonsentra-sjonen.

Resultater

Prosentdelen proteintap ved uoppløselige aggregater blir regnet ut som tap av proteinkonsentrasjonen delt på pro-teinutgangskonsentrasjonen. En statistisk analyse av alle data indikerer at interferonprøvene i buffer med pH 4,0 og 5,0 hadde en lavere prosentdel tap av protein grunnet aggregering enn dem med høyere pH. Interferonprøver inkubert ved 37°C og pH 4,0 og 5,0 tapte mellom omkring 10% og 15% grunnet aggregering. Ved pH-verdier større enn 6,0 økte tap opp til 40 - 50%. Søker bestemte også at interferon-prøvene hadde mer oppløselige aggregater ved pH-verdier større enn 6,0. Videre har søker bestemt ved peptidkartlegging at idet pH øker fra 4,0 til 7,2 er det en i hovedsak lineær økning i mengden av interferon som er deamidert; ved pH 7,0 og høyere, større enn 85% interferon deamidert i løpet av studiet. Søker målte det isoelektriske punkt (pl) av proteintypene i prøven (dvs. den pH hvor proteinet ikke migrerer i et elektrisk felt og den gjennomsnittlige ladning av proteinet er null) med IEF/Western-blot og blottene viser ekstra pl-bånd av prøvene i natriumcitrat og et skift av båndintensitet for prøver i natriumsukksinat. Fosfat har ingen bufrende kapasitet ved pH 5,0. Natriumacetat med natriumklorid ved pH 5,0 viste ingen endring i båndmønster eller intensitet.

Eksempel 3: Effekt av kavitering.

I løpet av søkers pH-undersøkelsesforsøk beskrevet i eksempel 2 oppdaget de at det overliggende rom av lagrings-rørene synes å være kritisk for tap av protein i enkelte av prøvene. Med 1,5 ml av prøvene i 2,2 ml rørvolum ble intet tap av protein observert. I motsetning til dette ga 1,2 ml prøve signifikant økning i aggregater. Dette er konsistent med søkers observasjoner at dannelse av aggregert interferon-beta i løpet av det virale inaktiveringstrinnet av opprenskningsprosessen er avhengig av nivået med oppløst oksygen i løpet av dette trinn.

Kort angitt involverer det virale inaktiveringstrinnet jus-tering av pH av det chelaterende Sefarose-eluat (se del C) fra 7,85 + 0,25 til mellom 2,5 til 3,5 med 15% fosforsyre ved å holde det surgjorte eluat i 120 - 135 minutter, og derpå rejustere pH til 6,7 ± 0,7 med 0,5 N natriumhydroksid. Alle trinn blir utført ved 2 - 8°C. Søker utformet et studium for å bestemme hvorvidt et forhold eksisterer mellom dannelse av interferon beta aggregater i dette trinn og mengden av oppløst oksygen.

Materialer og metoder.

Eluat fra den chelaterende Sefarosekolonne blir delt i 50 ml eller 100 ml porsjoner og plassert i 100 ml spinnerflasker. Til hver flaske blir 1 ml argonrenset 15% fosforsyre tilsatt. Flasken blir så forsiktig omrørt i omkring 2 minutter, og holdt uten omrøring i omkring 2 timer ved 2 - 8°C. Etter denne hvileperiode blir 6,5 ml argonskylt natriumhydroksid tilsatt og prøven undersøkt med størrelseseks-klusjonskromatografi ved forskjellige tider. Oppløst oksygen inne i væsken blir målt kontinuerlig med en oksygen-probe (Orion, modell 860) og nedtegnet ved tiden for base-tilsetning. For prøver med oppløste oksygennivå lik eller mindre enn 10% blir argongass spylt gjennom reaksjonskamme-rets overliggende rom.

Resultater: Data er gitt i figur 1 som viser et klart forhold mellom mengden av oppløst oksygen som er tilstede ved tiden for natriumhydroksidtilsetning og utbytte av interferon beta monomer gjennom virusinaktiveringstrinnet. Ut-bytteverdiene som er funnet ved oppløste oksygenkonsentra-sjoner som er mindre enn eller lik 10% er signifikant for-skjellig fra alle andre utbytter ved andre oksygenkonsen-trasjoner. Søker karakteriserte også aggregatet (data ikke vist her) og bestemte at dets spesifikke aktivitet er redu-sert omkring 30 - 40 ganger i forhold til bulkintermedia-tet. Søker bestemte også at mer enn omkring 90% av aggregatet er motstandsdyktig mot SDS-denaturering under ikke-reduserende betingelser, noe som antyder en kovalent kryssbinding. Under reduserende betingelser (2% betamerkapto-etanol) faller aggregatet sammen til monomeren, noe som antyder kryssbinding som involverer disulfidbindinger.

Eksempel 4: Valg av eksipient.

En serie interferon beta (60 ^g/ml) formuleringer inneholdende forskjellige eksipienter blir fremstilt i en foretrukket pH på 5,0 buffer inneholdende 50 mm natriumacetat og 100 mm natriumklorid. Eksipientene innbefatter glysin, arginin-HCl, lysin-HCl, sukkrose, glyserin, PEG3350, glutation og Pluronic F-68. Interferon beta bulkintermediat dialyseres i 50 mm natriumacetat og 100 mm natriumklorid, pH 5,0 over natten ved 2 - 8 °C med minst 2 bufferskift og filtreres før bruk. Interferon beta konsentrasjoner blir bestemt ved absorbans ved 278 nm med fratrekk av bakgrunn. Alle prøver fortynnes til endelige interferonkonsentrasjon-er på omkring 60 ^g/ml. Alle fremstilte prøver blir filtrert, 2 ml overføres til 4 ml glassbeholdere (ikke sili-konbehandlet) og det overliggende rom spylt med argon og beholderne forsegles. Sett av prøver plasseres ved 2 - 8°C og 37°C i perioder opp til 2 uker. Andre prøver blir mekanisk stresset ved å rotere dem ved romtemperatur i 3 dager.

Prøver analyseres i henhold til fremgangsmåtene fra eksempel 1. I tillegg blir prosentdelen av oppløst oksygen i formuleringene målt med en Ciba-Corning, modell 248 blod-gassanalysator. Den "eksperimentelle" verdi er deloksy-gentrykket (mm Hg) av prøvene minus den for den nitrogenspylte bufferblindprøve og "kontroll"-verdien er deltrykk av oksygen i bufferblindprøven lagret ved romtemperatur minus oksygendeltrykket av den nitrogenspylte bufferblind-prøve. Det prosentvise oppløste oksygen ("eksperimen-tell"/"kontroll") er alltid mindre enn 30%.

Resultater:

IEF/Western-blot og SDS-PAGE/Western-blot av prøver inkubert ved 37°C i 2 uker indikerer båndskift og intensitets-tap så vel som tilstedeværelse av interferon-multimere i prøver inneholdende PEG3350 og glutation. Etter en ytterligere uke ved 37°C viser glyserineksipient et ekstra bånd i søkers blot. Sukkroseeksipient viser tap av båndintensitet. Denne opprinnelige undersøkelsesprosedyre tillot søker å vurdere i større detalj arginin-HCl, glysin, natriumklorid og mannitol for ytterligere studier.

Eksempel 5: Adsorpsjon av interferon.

Tinet bulk interferon beta dialyseres til BG9589-1,2,3 og 4 (se tabell 1) over natten ved 2 - 8°C med minst 2 bufferskift og filtreres derpå før bruk. Proteinkonsentrasjonene blir bestemt med absorbans ved 280 nm (med ekstinksjonskoeffisient på 1,5 mg<-1> ml.cm<-1>). Alle prøver fortynnes til endelige konsentrasjoner på omkring 60 ^g/ml. De fortyn-nede prøver filtreres og fylles enten 0,5 ml i triplikate 1,0 ml lange, sprayede silikon-BD-sprøyter (Type I glass) med nitrogenspylt overliggende rom eller 0,75 ml i triplikat, 0,75 ml type I glassbeholdere med argonspylt overliggende rom. Proteinkonsentrasjoner blir bestemt med revers fase HPLC (eksempel 1).

Resultater:

Tabell 3 nedenfor lister opp proteinkonsentrasjonene som ble bestemt med revers fase HPLC. Dataene indikerer at det finnes mindre protein for prøvene som ble fylt i glassbeholderne sammenlignet med de silikonbelagte forfylte sprøy-ter. Således blir silikonbelagte sprøyter benyttet for den flytende formulering av interferon beta.

Eksempel 6: Formuleringer ved fysiologisk pH.

Ionestyrke/fosfat. Søker utførte initiale studier i fosfat/natriumklorid, pH 7,2 buffersysterner med varierende bufferkomponentkonsentrasjoner hvor fosfatkonsentrasjonen varierte mellom 10, 50 og 75 mm med en ionestyrke (definert med I = ZciZi2, hvor Ci og zz er henholdsvis den molare konsentrasjonen og valensladningen av ionisk forbindelse I) på 0,2, 0,4 og 0,6, justert ved tilsetning av natriumklorid. Søker brukte en full faktoriell utforming av variablene av fosfatkonsentrasjonen (10, 50 og 75 mm) og ionestyrke (I = 0,2, 0,4 og 0,6). Sammensetninger av monobasisk natriumfosfat, dibasisk natriumfosfat og natriumklorid (for å oppnå den ønskede ionestyrke) i bufferne blir regnet ut ved å bruke et spredningsark tilpasset fra Ellis og Morrison, "Buffers of Constant Ionic Strength for Studying pH-depen-dent Processes", Methods Enzymol. 87: 405-426 (1982) . Lig-ningene tillot bestemmelse av de nødvendige mengder for hver bufferkomponent for spesifikk pH, fosfatkonsentrasjon og ionestyrke. Hver av de ni oppløsninger som ble anvendt i det faktorielle eksperiment ble dannet med bufferbytting av interferon beta bulkintermediat gjennom Pharmacia PD-10 avsaltingskolonner. pH av alle de resulterende oppløsnin-ger er ved 7,20 + 0,15. Konsentrasjoner blir undersøkt ved absorbans ved 280 nm og så fortynnet til 150 ^g/ml interferon beta med den passende buffer. De resulterende oppløs-ninger blir sterilfiltrert under argon gjennom 0,22 filtere og 1,3 ml blir porsjonsfordelt i 5 ml glassbeholdere med et overliggende rom av argon. Prøver blir inkubert ved 37°C i 6 dager og undersøkt i triplikat. Prøver blir analysert med prosentvis transmittans ved 580 nm, prosentvis gjenvunnet protein og IEF-PAGE/Western-blot.

Resultater:

Analyse av prosentvis transmittans med hensyn til varierende ionestyrke viser en tendens mot økende transmittans

(dvs. minkende mengder av uoppløselige proteinaggregater)

med økende ionestyrke. Prosentvis proteingjenvinningsdata viser en lignende tendens selv om IEF-PAGE/Western blots viser ingen tendens i deamidering med varierende ionestyrke slik at alle prøvene er likt deamidert. Således, etter lagring i 6 dager ved 37°C hadde prøvene en tendens til å vise mindre aggregering med minkende fosfatkonsentrasjon og økende ionestyrke. Resultatene av forsøkene angående den prosentvise transmittans og den prosentvise gjenvinning som en funksjon av varierende fosfatkonsentrasjon (ikke vist her) viser en svak tendens mot minkende prosent transmittans med økende fosfatkonsentrasjon, men en variansanalyse

viser ingen signifikant forskjell i gjennomsnittene av prø-ver med forskjellige fosfatkonsentrasjoner. De prosentvise gjenvinningsdata viser forbedret proteingjenvinning for lavere fosfatkonsentrasjoner (en signifikant forskjell ved

94% konfidensnivå). IEF-PAGE/Western-blots viser ingen på-viselig tendens i deamidering med varierende fosfatkonsent-ras j on .

Eksipient/saltforhold. Preliminære studier (ikke vist) indikerte at enkelte eksipienter kan kreve salter (for eksempel natriumklorid) for å opprettholde høy ionestyrke og for å oppvise en stabiliserende effekt ved pH 7,2. Søker utformet et faktorielt studium ved å bruke eksipienter (glysin, lysin, arginin, sukkrose og mannitol) og fraksjon av natriumklorid som hjelper til med isotonisitet (fSait = 0, 025, 0, 75 og 1,0). Fraksjonen blir regnet ut med: fsait = Osalt <=> Osait/ (Osait+Oeksipient) r hvor Osait Og Oek.sipient er osmolalitetene i mOsm/kg av henholdsvis natriumklorid og eksipient i oppløsningen. Saltfraksjonen gir en mulighet for å sammenligne salteffekter på tvers av forskjellige eksipienter. Alle prøver inneholdt additiver til isotonisitet med varierende forhold av eksipient:salt (som definert av f salt) •

Ti prosent (w/v) stamoppløsninger av hver eksipient i 20 mm fosfat, pH 7,2 blir fremstilt, avgasset og spylt med argon. En stamoppløsning på 250 mM natriumklorid, 20 mm fosfat pH 7,2 fremstilles, avgasses og spyles med argon. Bulk interferon beta intermediat blir dialysert i utstrakt grad mot argonspylt 20 mm fosfat, pH 7,2 buffer. Den resulterende oppløsning undersøkes for interferon beta konsentrasjon ved absorbans ved 280 nm og fortynnes med fosfatbuffer og res-pektive stamoppløsninger av eksipient og salt for å oppnå 60 ug/ml interferon beta og de ønskede, endelige salt og eksipienttilstander. De resulterende prøver blir filtersterilisert (0,22 fom) og fylt i 1,0 ml Becton Dickinson sprayet silikon, type I glassprøyter (0,5 ml fyllvolum) med et nitrogenoverliggende rom. Prøver blir lagret ved 40°C.

Etter 6 dager blir arginin, glysin og sukkroseprøver analysert ved absorbans ved 320 og 280 nm, både før og etter filtrering gjennom 0,22 filtere. Etter 2 uker blir arginin, lysin og mannitol på lignende måte analysert sammen med IEF-PAGE, reduserende SDS-PAGE og ikke-reduserende SDS-PAGE. Kontrollprøver ble lagret ved mellom 2 og 8°C og analysert på lignende måte.

Resultater:

Gjenvinningen av interferon beta la (som prosentdel av kontroll) øker med økende salt for sukkrose og mannitol, og når en maksimumgjenvinning ved fsait = 1(130 mm natriumklorid) . For arginin og lysin minker gjenvinning med øking av fsait- Maksimal gjenvinning for glysinformuleringer ved pH 7,2 blir nådd ved omkring fsait = 0,75.

Dette eksipientundersøkelsesstudium ved å bruke en pH 7,2 fosfatbuffer med forskjellige eksipienter så som glysin, lysin, arginin, mannitol og sukkrose lagt til isotonisitet viste dårlig gjenvinning for alle ikke-ladede eksipienter. Utstrekningen av deamidering ble ikke påvirket av disse additiver. For eksempel indikerer reduserende og ikke-reduserende SDS/PAGE-tap av ikke-glykosylert interferon beta forbindelser i alle formuleringer, og tyngre multimerbånd for isoton natriumklorid alene og mannitol. Oppsummert finnes det en sterk korrelasjon mellom den ioniske karakter av eksipienten og dens egenskap å stabilisere interferon beta mot aggregering i disse buffersystemer fysiologisk pH. Ikke-ioniske additiver så som sukkrose og mannitol synes ikke å gi noen beskyttelse, eller kan faktisk fremme proteintap ved fysiologisk pH. Natriumklorid med en enkel ladning pr. oppløselig forbindelse har bedre effekt enn hver mannitol eller sukkrose. Aminosyrer inneholder to ladninger pr. molekyl ved fysiologisk pH. I tilfelle med glysin synes den zwitterioniske natur av molekylet i seg selv ikke å være tilstrekkelig til å stabilisere interferon beta. Arginin og lysin, som hver inneholder 3 ladninger pr. molekyl, stabiliserer interferon beta bedre enn noen natriumklorid alene eller glysin /natriumkloridformuleringer.

Eksempel 7: Stabilitet og kinetiske studier.

Formuleringer blir fylt aseptisk under en inert atmosfære i sprøyter inkubert ved et temperaturområde for varierende tidsperioder, og sprøyteinnholdet blir analysert. Kort angitt blir tint bulk interferon beta dialysert mot BG9589-1,

-2, -3 og -4 over natten ved 2 - 8 °C med minst 2 bufferskift. Proteinkonsentrasjoner blir bestemt med absorbans ved 280 nm med en ekstinksjonskoeffisient på 1,5 ml/mg/cm. Alle prøver fortynnes til en endelig interferon beta la-konsentrasjon på omkring 60 ug/ml. De 4 interferon-beta-la formuleringer av tabell 1 filtreres og 0,5 ml plasseres i 1,0 ml lange, Becton Dickinson (BD)sprøyter hvis indre

overflater ble belagt med bakt silikon eller med sprayet silikon. Prøvene ble analysert med OD, størrelseseksklu-sjon HPLC (SEC), iso-elektrisk fokusering gel-elektroforese (IEF)/Western blot, reduserende natriumdodecylsulfat-poly-akrylamid-gel-elektroforese(SDS/PAGE)/Western blot, peptidkartlegging, fluoroforassistert karbohydratelektroforese (FACE) og CPE-bioassay. Det overliggende rom i sprøyten er nitrogengass. Sprøytene inkuberes ved 2 - 8°C, 25°C, 33°C og 40°C i opptil 90 dager. Prøver analyseres i henhold til metodene fra eksempel 1.

Resultater:

Søker analyserte proteinkonsentrasjoner av sine prøver, normalisert mot dem for utgangsmaterialet for perioder opptil 90 dager ved et antall temperaturer. Figur 2 illustrerer at BG9589-1 viste fullstendig proteinstabilitet (intet tap av protein) etter 3 måneders inkubering ved temperaturer i området fra 2-8°C (gjennomsnitt 4°C) opptil 25°C. Ved en lagringstemperatur (33°C) som nærmere seg kroppstemperatur, ble omkring 18% av proteinet nedbrutt. Ved en lagringstemperatur (40°C) som overskrider kroppstemperatur, var omkring 30% protein nedbrutt ved slutten av 3 måneder. 1 hovedsak identiske resultater ble funnet for BG9589-2 (ikke vist). Figur 3 illustrerer resultater av 2 måneders lagringsforsøk på BG9589-3. Proteinnedbrytning var minimal ved 4 til 25°C men var rask ved høye temperaturer. Resultater for BG9589-4 er i hovedsak identiske med dem i figurer 2 og 3. Disse data ble bekreftet ved å bruke reduserende SDS-PAGE/Western blots.

I de "bakte" sprøyter finnes det over perioden for dette studium ingen påviselige oppløselige aggregater. Ingen signifikant endring blir observert i proteinkonsentrasjon, CPE-assay, prosentvis oksidert AP6 og karbohydratprofiler. Det finnes ingen observerbare endringer i prøvene som funnet ved reduserende SDS-PAGE/western blot og IEF/western blot. Det finnes en viss økning i prosentvis deamidering sammenlignet med starttidspunkter. Imidlertid har bulkin-termediatet som ble brukt for å fylle disse sprøyter 37% deamidering, som er høyere enn 33,8% verdien for materialet etter å ha blitt fylt i sprøytene. Denne sistnevnte lavere verdi kan være grunnet assay variabilitet. I de "sprayte" sprøyter over perioden for dette studium finnes det heller ingen påviselige oppløselige aggregater. Ingen signifikante endringer blir observert i proteinkonsentrasjon, CPE-assay, prosentvis deamidering, prosentvis oksidert AP6 og karbohydratprofiler. Det finnes ingen observerbare endringer i prøvene som observert med reduserende SDS-P-AGE/western blot og IEF/western blot. Kort angitt har resultater så langt vist at sluttproduktet BG9589-1 er stabilt opptil 3 måneder ved 2-8°C i de "bakte silikon" sprøyter og 6 måneder ved 2-8°C i "sprayet silikon" sprøyter.

Søker utførte det antivirale CPE-assay på formuleringer BG9589-1 og BG9589-2 (se tabell 1) etter at sprøyter ble fylt aseptisk. Rapporterte aktivitetsverdier for både BG9589-1 og BG9589-2 er 12,0 MU/ml. Det antivirale CPE-assay ble gjentatt etter lagring av prøvene i opptil 3 måneder ved mellom 2-8°C. De rapporterte aktivitetsverdier for BG9589-1 er 11,6 MU/ml (n=8) med et 95% konfidens interval på 10,2-13,3 MU/ml.

Søker målte også stabiliteten av bulk-intermediatmaterialet av BG9589-1 ved 2-8°C i 5 måneder, og -70°C i 6 måneder. Prøver av BG9589-1 fra pilot diafiltreringsstudier ble analysert ved metodene fra eksempel 1. Resultater har til nå vist at in-prosessmateriale av BG9589-1 er stabilt ved 2-8°C i 5 måneder, og ved -70°C i 6 måneder.

Over perioden for dette spesielle studium er det ingen påviselige oppløselige aggregater. Ingen signifikante endringer ble observert for prosentvis deamidering og karbohydratprofiler (Forskjellene i prosentvis deamidering ligger innenfor assayvariabilitet). Det finnes ingen observerbare endringer i prøvene som funnet med reduserende SDS-PAGE/western blot og IEF/western blot. Det finnes en liten senking i proteinkonsentrasjonen. Senkingen i proteinkon-sentras j onen for materialet ved -70°C kan være grunnet at prøven går gjennom en fryses/tinesyklus. Minkingen av pro-teinkonsentras j on ligger fremdeles innenfor 15% av den opprinnelige konsentrasjon.

Eksempel 8: Prekliniske studier

Et enkelt intramuskulær (IM) dose lokalt tolerabilitets-studium i kaniner utføres som vurderer det lokale toksi-sitet av interferon når det administreres i flere nye formuleringer. Injeksjonsstedreaksjoner grunnet administrasjon av de foreliggende flytende formuleringen eller med fryse-tørkede og rekonstituerte interferonformuleringer kan sam-menlignes med dem som kommer fram etter administrering av normal fysiologisk saltvann. 1. Kaninirritasjon/Biotilgjengelighetsstudium etter enkel dose IM-administrasjon av fire formuleringer av interferon-beta) 20 New Zealand hvite hannkaniner mottok hver enkel 30 ^g intramuskulær (IM) injeksjon av Interferon-beta-la som en av fem formuleringer : BG9589-1 (pH 5,0, acetatbuffer, argininstabilisator, 0,5 ml/dose); BG9589-2 (pH 5,0, acetatbuffer, glysin/NaCL-stabilisator, 0,5 ml/dose); BG9589-3 (pH 7,2, fosfatbuffer, argininstabilisator, 0,5 ml/dose); BG9589-4 (pH 7,2, fosfatbuffer, glysin/NaCl-stabilisator, 0,5 ml/dose); og en frysetørket interferon beta formulering ved pH 7,2 inneholdende 1,5% HSA, 1,0 ml/dose (Se Jacobs et al., supra) .

Fire dyr mottok hver behandling. Dyr som mottok BG9589-1 eller den frysetørkede formulering mottok også et ekviva-lent volum injeksjon av normal fysiologisk saltvann på et kontralateralt område som en negativ kontroll. Blodprøver blir samlet opp gjennom 72 timer postdose for seruminterfe-ron beta aktivitetsanalyser. Makroskopiske dermale vurderinger for erytema, arrdannelse og ødem ble utført ved 6, 12, 24, 48 og 72 timer postdose. Etter 72 timer postdose blodoppsamling avlives dyrene injeksjonsstedene inspiseres makroskopisk for tegn på vevskade og fikseres derpå i 10% nøytral bufret formalin. Muskelprøvene (tre/injeksjonssted) blir undersøkt mikroskopisk for inflammasjon, nekrose, blødning og lesjoner.

Resultater:

Når vurdert med Primary Irritation Index scoringer (EPA Dermal Classification System), ble ingen av de ovennevnte flytende formuleringer bestemt til å være mer enn en lett hudirritant. Makroskopisk undersøkelse av et BG9589-4 in-jeksjonssted i et dyr indikerte lett irritasjon (blødning); men mikroskopisk undersøkelse viste ingen tegn for blødning og den makroskopiske observasjon ble bestemt å være en ar-tifakt. Kort angitt viser mikroskopiske undersøkelser at den flytende formulering testartikkel injeksjonsstedreak-sjonene konsistent var minimale til milde og at ingen reaksjon var alvorligere enn dem indusert ved administrasjon av den frysetørkede formulering eller normal fysiologisk saltvann .

I tillegg kan dermal irritasjon hos kaniner etter gjentatte IM-administrasjoner av de flytende formuleringer lett bli undersøkt ved å bruke flere grupper kaniner som vil motta intramuskulære injeksjoner av flytende formuleringer eller normal fysiologisk saltvann annen hver dag i 8 dager (to-talt fem doser). Doser blir administrert i et forhåndsdefi-nert område på ryggen hos hvert dyr for å maksimalisere lo-kal eksponering til forsøksstoffet. Makroskopisk dermale vurderinger blir utført ved 4-6 timer etter hver administrasjon og 24 timer etter siste administrasjon for hver behandlingsgruppe. Daglige totale observasjoner blir fore-tatt ved tiden for hver dermal vurdering. Etter den 24 ti-mers postdose makroskopisk undersøkelse blir dyrene avli-vet, injeksjonsstedene vil bli inspisert for tegn på vevs-skade og vevene fiksert i 10% nøytral bufret formalin. De preserverte vev blir undersøkt mikroskopisk for inflammasjon, nekrose, blødning og lesjoner. Blodprøver blir også samlet opp umiddelbart før den initiale forsøksartikkel administrering og ved tiden for avliving for hematologi og vurderinger av serumsammensetning.

Eksempel 9: Kliniske studier

De foreliggende flytende formuleringer er signifikant forskjellige fra tidligere interferonformuleringer. For enhver klinisk indikasjon finnes det potensielle for en endring i farmakokinetikk og farmakodynamisk oppførsel av interferonet når det administreres til mennesker. Uheldigvis er ak-tivitetene av interferon beta meget art spesifikke og den mest relevante farmakologiske informasjon er funnet fra studier i menneskeceller i kultur, i mennesker og i mindre utstrekking, i resusaper. En foretrukket måte å undersøke for farmakologisk endring, om noen, er å utføre et humant bioekvivalens forsøk.

Antivirale nivåer av interferon beta i serum kan bli mengdebestemt ved å bruke et cytopatisk effekt (CPE) bioassay, som for eksempel beskrevet i eksempel 1. Et humant bioekvivalens studium kan bli utført med ethvert antall flytende og frysetørkede interferonformuleringer. Gjennom analyse av serum, område under kurve (AUC) og CMAx-aktivitetsparamete-re, kan fagmannen bestemme hvor vidt frysetørkede og flytende formuleringer er bioekvivalente. Bortsett fra ett eksempel av en bioekvivalens studiumprotokoll beskriver søker kort et dobbeltblind, enkeldose, kryss over studium for å vise bioekvivalensen av en flytende formulering ifølge oppfinnelsen og et frysetørket interferon beta produkt i friske frivillige.

Utforming. Hver person mottok samme dose (for eksempel 60 Hg/12 MU) av interferon beta formuleringer i et dobbeltblind, to-periode kryssoverforsøk (Tabell 4). Personer er mellom 18 og til og med 45 år og innen 15% av den normale kroppsvektområde for høyde og kroppsbygning. Blodprøver for hematologi, kjemi, serum interferon beta aktivitet og farmakodynamiske profiler blir tatt umiddelbart før, og ved forskjellige tider etter hver dose gjennom 144 timer etter-dose. Vurdering av injeksjonssmerte og injeksjonsstedreaksjoner blir også fulgt.

Utføring av studium. Som profylakser mot interferonasso-siert influensasyndrom, vil alle personer mottar acetamino-fen umiddelbart før og gjennom doseringsperiodene.

Farmakokinetikk

Serum interferon beta bestemmelse. Serumnivåer blir målt som enheter av antiviral aktivitet med et (CPE) assay. Antivirale serumnivåer blir analysert for AUC, CmaX og Tmax. AUC-verdier vil bli regnet ut fra tiden for dosering til siste påvisbare nivå (AUCo-t) og gjennom 144 timer etter dose (AUC0-144) . Standard deskriptivt analyse av behandlingsdataene blir utført ved å bruke SAS (versjon 6.08, SAS Institute, Cary, North Carolina).

Farmakodynamikk. Den biologiske markør neopterin, som er et produkt av det interferon induserte enzym GTP-cyklohydro-lase som reflekterer makrofag og T-celleaktivering (C. Hu-ber et al., J Exp Med 1984; 160:310-314; 20. september 1996; D. Fuchs et al., Immunol. Today 9. 150-155, 1988) har blitt karakterisert. I både ikke-kliniske og kliniske studier av rekombinant humant interferon beta, korrelerer in-duksjon av neopterin med serumaktivitetsnivå etter administrering av forskjellige rekombinante humane interferon beta behandlinger.

Neopterin blir målt via standard laboratorieprosedyrer. Den farmakodynamiske profil av interferon beta er beskrevet på en kvantitativ måte ved utregning av tre serum neopterinpa-rametere. Den første parameter, EAUc, er arealet under neopterin mot tidskurven normalisert til baselinje nivå. Den andre parameter er EmaX; hvor denne parameter er forskjellen mellom det observerte topp neopterin nivå og baselinje neopterin nivået. Den tredje parameter er induksjonsforhol-det IR; hvor denne parameter blir regnet ut som topp neopterin nivå delt på baselinje neopterin nivået.

Statistikk. Wilcoxon-Mann-Whitney to, en-sidet testprose-dyrer blir brukt på AUC for å bestemme ekvivalens. For å beregne den relative biotilgjengelighet av interferon fra den flytende formulering i forhold til den frysetørkede formulering og dets 90% konfidensgrenser blir AUC utsatt for en variensanalyse (ANOVA) etter logaritmisk transforma-sjon. Fra "mellompasienf-variasjonen blir sekvensene og typene isolert. Fra "innenpasient"-variasjonen blir komponenter grunnet perioder og behandlinger isolert.

Claims (50)

1. Pakket sett for parenteral administrasjon av interferon-beta, hvor settet inneholder en sprøyte fylt på forhånd med en flytende sammensetning omfattende nevnte interferon-beta og et aminosyrestabiliseringsmiddel hvor aminosyre stabiliseringsmiddelet er arginin og er til stede ved mellom 0,3% og 5% w/v, hvor den flytende sammensetning ikke har blitt rekonstituert fra frysetørket interferon; hvor den flytende sammensetning ikke er videre frysetørket, hvor den flytende sammensetning ikke omfatter serum albumin og hvor sprøyten har et topprom spylt med inertgass.

2. Pakket sett ifølge krav 1, hvor den minst ene overflate av sprøyten som er i kontakt med den flytende sammensetning er belagt med et materiale som er inert ovenfor interferon .

3. Pakket sett ifølge krav 1, hvor nevnte interferon beta er et rekombinant fremstilt interferon.

4. Pakket sett ifølge krav 1, h vor den flytende sammensetning har en pH mellom omkring 4,0 og omkring 7,2.

5. Pakket sett ifølge krav 4, hvor den flytende sammensetning har en pH på 4,8 til 5,2.

6. Pakket sett ifølge krav 5, hvor den flytende sammensetning har en pH på 5,0.

7. Pakket sett ifølge krav 1, hvor argininet er arginin-HCl.

8. Pakket sett ifølge krav 1, hvor den flytende sammensetning har en interferon-konsentrasjon mellom 6 MIU/ml og 50 MIU/ml.

9. Pakket sett ifølge krav 2, hvor minst en overflate av sprøyten er belagt med et materiale valgt fra gruppen omfattende silikon og polytetrafluoretylen.

10. Pakket sett ifølge krav 11, hvor den flytende sammensetning ytterligere omfatter 0,1% (w/v) Pluronic F-68.

11. Pakket sett ifølge krav 1, hvor den flytende sammensetning ytterligere omfatter en 20 mM fosfatbuffer ved pH 7,2; og hvor aminosyre stabiliseringsmiddelet er 140 mM arginin .

12. Pakket sett ifølge krav 1, hvor den flytende sammensetning ytterligere omfatter en buffer som opprettholder pH innenfor området 4,0 til 6,0.

13. Pakket sett ifølge krav 9, hvor sprøyten mangler en oksygeninneholdende gass/væskeinterfase.

14. Pakket sett ifølge krav 12, hvor den flytende sammensetning ikke har blitt kavitert.

15. Pakket sett ifølge krav 12, hvor bufferen er en orga-nisk syrebuffer valgt fra gruppen bestående av citrat-, succinat-, tartrat-, fumarat-, glukonat-, oksalat-, laktat-og acetatbuffer.

16. Pakket sett ifølge krav 12, hvor pH av den flytende sammensetning ligger i området 4,5 til 5,5.

17. Pakket sett ifølge krav 12, hvor pH av den flytende sammensetning er 5,0.

18. Pakket sett ifølge krav 12, hvor den flytende sammensetning er steril.

19. Pakket sett ifølge krav 12, hvor den flytende sammensetning er isoton med blod.

20. Pakket sett ifølge krav 12, hvor nevnte interferon beta er human rekombinant interferon beta.

21. Pakket sett ifølge krav 20, hvor aktiviteten av den humane rekombinante interferon beta er i område 6 MIU/ml til 50 MIU/ml.

22. Pakket sett ifølge krav 1, hvor aminosyre stabiliseringsmiddelet er til stede ved mellom 0,3% og 3,13% (w/v); og hvor den flytende sammensetning er frossen.

23. Flytende farmasøytisk sammensetning omfattende: (a) et interferon beta, (b) en acetatbuffer, og (c) arginin; hvor sammensetningen har en pH på mellom 4,0 og 6,0; hvor sammensetningen ikke omfatter serum albumin.

24. Flytende farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23, hvor argininet er arginin-HCl.

25. Flytende farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23, hvor interferonet er til stede ved mellom 6 MIU/ml og 50 MIU/ml.

26. Flytende sammensetning ifølge ethvert av kravene 23-25, hvor acetatbufferen er til stede ved 20 mM.

27. Flytende sammensetning ifølge ethvert av kravene 23-26, hvor argininet eller arginin-HCl er til stede ved mellom 0, 3% og 5% (w/v).

28. Flytende sammensetning ifølge ethvert av kravene 23-27, ytterligere omfattende en surfaktant.

29. Flytende sammensetning ifølge krav 28, hvor surfaktanten er 0,1% (w/v) Pluronic F-68.

30. Flytende sammensetning ifølge ethvert av kravene 23-29, hvor den flytende sammensetning har et oppløst oksygennivå som er mindre enn 30% av atmosfærisk likevektsnivå.

31. Flytende sammensetning ifølge krav 30, hvor nevnte flytende sammensetning har et oppløst oksygennivå som er indre eller likt 10% av atmosfæreisk likevektsnivå.

32. Fremgangsmåte for fremstilling av et pakket sett for parenteral administrasjon av interferon beta, hvor settet inneholder en sprøyte på forhånd fylt med en flytende far-masøytisk sammensetning omfattende interferon beta; en buffer, hvor bufferen har en pH mellom 4,0 og 7,2; og et aminosyre stabiliseringsmiddel; hvor nevnte aminosyre stabiliseringsmiddel er arginin og er til stede mellom 0,3% og 5% w/v; hvor nevnte flytende farmasøytiske sammensetning ikke har blitt rekonstituert fra frysetørket interferon, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning ikke er videre frysetør-ket, og hvor nevnte flytende sammensetning ikke omfatter serum albumin, idet fremgangsåten omfatter trinnene å blande sammen minst nevnte interferon beta, buffer og aminosyre stabiliseringsmiddel for å danne den flytende sammensetning, og fylle sprøyten med sammensetningen slik at sprøyten har et overrom spylt med en inert gass.

33. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor minst en overflate av sprøyten som er i kontakt med den flytende farmasøytiske sammensetning, blir belagt med et materiale som er inert overfor interferon.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor den flytende farma-søytiske sammensetning ikke har blitt kavitert.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor nevnte interferon-beta er et rekombinant fremstilt interferon.

36. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor nevnte buffer har en pH på mellom 4,8 og 5,2.

37. Fremgangsmåte ifølge krav 36, hvor nevnte buffer har en pH på 5,0.

38. Fremgangsåte ifølge krav 32, hvor argininet er arginin-HCl .

39. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor interferonet er til stede ved en konsentrasjon på mellom 6 MIU/ml og 50 MIU/ml.

40. Fremgangsåte ifølge krav 32, hvor nevnte minst ene overflate av sprøyten belegges med et materiale valgt fra gruppen bestående av silikon og polytetrafluoretylen.

41. Fremgangsmåte ifølge krav 32, hvor den flytende sammensetning videre omfatter 20 mM fosfatbuffer ved pH 7,2; hvor aminosyre stabiliseringsmiddelet er 140 mM arginin.

42. Fremgangsmåte for stabilisering av interferon i en flytende farmasøytisk sammensetning omfattende å blande: (a) et interferon beta, (b) en acetatbuffer, og (c) arginin; hvor sammensetningen har en pH på mellom 4,0 og 6,0; hvor den flytende farmasøytiske sammensetning ikke har blitt rekonstituert fra frysetørket interferon; hvor den flytende farmasøytiske sammensetning ikke blir videre fry-setørket, og hvor den flytende sammensetning ikke omfatter serum albumin.

43. Fremgangsmåte ifølge krav 42, hvor argininet er arginin-HCl .

44. Fremgangsmåte ifølge krav 42, hvor interferonet er til stede ved mellom 6 MIU/ml og 50 MIU/ml.

45. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-44, hvor acetatbufferen er til stede ved 20 mM.

46. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-45, hvor argininet eller arginin-HCl er til stede ved mellom 0,3% og 5% w/v.

47. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 24-46, ytterligere omfattende å blande inn en surfaktant.

48. Fremgangsåte ifølge krav 47, hvor surfaktanten er 0,1% (w/v) Pluronic F-68.

49. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-48, hvor den flytende sammensetning ikke har blitt kavitert.

50. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 42-49, hvor det ikke er noen oksygeninneholdende gass/væske-interfase mellom den flytende farmasøytiske sammensetning og sprøyten.