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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Gewinnung von Proteinen
mit IFN-β-Aktivität.
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An
die Qualität und Sicherheit von Proteintherapeutika werden
hohe Anforderungen gestellt. Dies gilt auch für deren Herstellprozess,
der üblicherweise in die sogenannten Abschnitte „upstream
processing” und „downstream processing” unterteilt
wird und zur Gewinnung des aktiven Wirkstoffs („drug substance”)
sowie zur Formulierung des festen Arzneimittels („drug
product”) führt. Aus Gründen der Sicherheit
wird der Gebrauch von Stoffen tierischer und humaner Herkunft zunehmend
vermieden. Solche Stoffe wie fötales Kälberserum
(FCS), menschliches Albumin (HSA) sowie Transferrin finden sich
allerdings nach wie vor noch in der Mehrzahl der Zellkulturmedien
im Bereich des „upstream processing”, ebenso wie
HSA im Bereich des „downstream processing” zur
Stabilisierung von Zwischenprodukten, sowie zur Stabilisierung von
Injektionslösungen. Aus diesem Grund wird vielfach untersucht,
ob der Gebrauch von Stoffen, die aus Sammelblut stammen, bei der
Herstellung von Proteintherapeutika, wie Wildtyp-Interferon-beta
und mutanten Varianten davon, zum Beispiel Soluferon®,
vermindert werden kann.
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Ein
funktioneller, synthetisch hergestellter Ersatzstoff für
HSA in der Zellkulturtechnik ist Pluronic
®,
ein Blockcopolymer aus Ethylenoxid und Propylenoxid. Blockcopolymere
aus Ethylenoxid und Propylenoxid werden in der Zellkultur und bei
Fermentationen eingesetzt (
WO01/59069 ,
WO 2004/106494 ,
US2006149042 ,
CA 2,549,564 ,
US 6,171,825 ,
WO98/28007 ,
JP8070859 ).
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Der
vorliegenden Erfindung liegt daher das technische Problem zugrunde,
Verfahren zur Gewinnung von einem Protein mit Interferonaktivität,
insbesondere Interferon-β-Aktivität bereitzustellen,
die die vorgenannten Nachteile überwinden, insbesondere unter
Einsatz möglichst unbedenklicher, risikoarmer Mittel, insbesondere
Zellkulturbestandteile, derartige Proteine in möglichst
kostengünstiger und hocheffizienter Weise in hochreiner
Form bereitzustellen. Die vorliegende Erfindung löst das
ihr zugrundeliegende technische Problem durch die Bereitstellung
der in den unabhängigen Ansprüchen ausgeführten
Ausführungsformen.
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Insbesondere
löst die vorliegende Erfindung das ihr zugrundeliegende
technische Problem durch die Bereitstellung eines Verfahrens zur
Gewinnung von einem Protein mit Interferon(IFN)-β-Aktivität,
wobei
- a) Zellen mit der Fähigkeit,
ein Protein mit IFN-β-Aktivität zu synthetisieren,
sowie ein Kulturmedium mit einem Gehalt eines Blockpolymers aus
Ethylenoxid und Propylenoxid bereitgestellt,
- b) die Zellen in dem Kulturmedium unter Bedingungen kultiviert
werden, die die Expression des Proteins und dessen Sezernierung
in das Kulturmedium erlauben und
- c) das Protein mit IFN-β-Aktivität gewonnen
wird.
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Die
Erfindung sieht also vor, Zellen einzusetzen, die in der Lage sind,
ein Protein mit IFN-β-Aktivität zu synthetisieren
und diese Zel len in ein Medium einzubringen, das die Kultivierung
und gegebenenfalls Proliferation der Zellen ermöglicht,
und zwar unter Bedingungen, die so gewählt sind, dass eine
Expression des Proteins mit Interferon-β-Aktivität
und dessen Sezernierung in das umgebene Kulturmedium ermöglicht
wird. Als Kulturmedien kann, insbesondere für CHO-Zellen,
bevorzugt Minimum Essential Medium (MEM-2) eingesetzt werden.
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Die
Kultivierung und Herstellung des Proteins mit Interferon-β-Aktivität
erfolgt in ansonsten an sich üblicher Weise, insbesondere
mit Hilfe von üblicherweise eingesetzten Wirtszellen wie
Zellkulturen aus Säugern, zum Beispiel menschliche Zellkulturen, Zellkulturen
von Nagern, insbesondere Mäusen, Hamstern oder Ratten oder
aus Rind, Schwein, Katze, Hund oder Affe. Vorzugsweise werden CHO-Zellen
(chinese hamster ovary-Zellen) eingesetzt. Gegebenenfalls können
auch Mikroorganismen wie Hefen oder Bakterien, zum Beispiel Escherichia
coli-Zellen eingesetzt werden. Überraschenderweise zeigt
die erfindungsgemäße Vorgehensweise, dass das üblicherweise
als notwendig erachtete HSA-haltige Medium durch ein Medium ersetzt
werden kann, das Blockcopolymere aus Ethylenoxid und Propylenoxid enthält,
ohne dass die das Protein exprimierenden Wirtszellen, insbesondere
die CHO-Zellen, in ihrem Wachstum und ihrer Interferon-Expressionsrate,
insbesondere der Menge an gebildeten und sezernierten Proteinen
mit IFN-β-Aktivität, gehemmt wurden.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform wird im Kulturmedium
eine Endkonzentration von 0,5 bis 10 mg/ml des Blockcopolymers eingestellt.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Blockcopolymers im
Kulturmedium 0,5 bis 2, vorzugsweise 1 mg/ml.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass
das Protein mit Interferon-β-Aktivität gewonnen
wird, in dem das zu isolierende Protein, das sich im Kulturmedium
befindet, von den Zellen, vorzugsweise mechanisch, abgetrennt wird,
beispielsweise durch Zentrifugation. Das das Protein aufweisende
Kulturmedium kann dann weiteren Reinigungsschritten unterzogen werden.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die Erfindung
ein Verfahren zur Gewinnung von einem, vorzugsweise isolierten,
Protein mit IFN-β-Aktivität aus einem dieses Protein
aufweisenden Medium, insbesondere Kulturmedium, wobei das dieses
Protein aufweisende Medium in einem ersten Verfahrensschritt (x)
einer Affinitäts-Chromatographie, anschließend
(y) einer hydrophoben Interaktions-Chromatograpie (HIC), anschließend
(z) einer Gelfiltration unterzogen wird und ein so aufgereinigtes
Protein mit IFN-β-Aktivität gewonnen wird. In
besonders bevorzugter Ausführungsform betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von einem, vorzugsweise isolierten,
Protein mit IFN-β-Aktivität aus einem erfindungsgemäßen
Verfahren zur Gewinnung von einem Protein mit Interferon-β-Aktivität
aufweisenden Medium, insbesondere einem Medium gemäß Schritt
c) des vorgenannten Verfahrens, wobei in einem ersten Verfahrensschritt (x)
das Protein-haltige Medium einer Affinitäts-Chromatographie,
anschließend in einem Verfahresschritt (y) einer hydrophoben
Interaktions-Chromatographie, anschließend in einem Verfahrensschritt
(z) einer Gelfiltration unterzogen und so ein aufgereinigtes Protein
mit IFN-β-Aktivität gewonnen wird.
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Demgemäß betrifft
die vorliegende Erfindung insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung
von einem Protein mit Interferon(IFN)-β-Aktivität,
wobei das gemäß der Schritte (a), (b) und (c)
gewonnene Protein mit IFN-β-Aktivität aufweisende
Kulturmedium in einem Schritt (x) einer Affinitäts-Chromatographie,
anschließend in einem Schritt (y) einer hydrophoben Interaktions-Chromatographie
(HIC) und in einem Schritt (z) einer Gelfiltration unterzogen und
so ein aufgereinigtes Protein mit IFN-β-Aktivität
gewonnen wird.
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Diese
erfindungsgemäß besonders bevorzugte Ausführungsform
zur Gewinnung aufgereinigten, insbesondere isolierten, Proteins
führt zu einer besonders effizienten Abtrennung von Mediumsbestandteilen,
Wirtszellen-Proteinen, DNA-Viren, Endotoxin und/oder sonstigen Substanzen
von dem interessierenden Protein.
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Überraschenderweise
stellt die vorliegende Erfindung daher auch den Vorteil bereit,
dass, offensichtlich aufgrund der Verwendung des die genannten Blockcopolymere
aus Ethylenoxid und Propylenoxid enthaltenden Kulturmediums, unter
Erhalt der Expressionsrate die weitere Aufarbeitung des zu gewinnenden
Proteins erleichtert wird, insbesondere dadurch, dass größere
Volumina des Kulturmediums der Affinitäts-Chromatographie
zugeführt werden können. Das bisher üblicherweise
zur Stabilisierung von z. B. Soluferon® eingesetzte
Rinder- oder Human-Serumalbumin bindet ebenfalls an dem für
die Affinitäts-Chromatographie eingesetzten Material, konkurriert
somit mit dem Zielprotein und vermindert daher die Bindungskapazität
für das erwünschte Protein. Der erfindungsgemäß ermöglichte
Verzicht auf Serumalbumin stellt daher einen weiteren Vorteil dar. Darüber
hinaus erhöht sich die Reinheit des erhaltenen Proteins
mit IFN-β-Aktivität, was die weitere Aufarbeitung
nochmals vereinfacht.
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Die
Erfindung betrifft in besonders bevorzugter Ausführungsform
daher Verfahren zur Gewinnung von Proteinen mit Interferon-β- Aktivität,
inbesondere aufgereinigten Proteinen mit Interferon-β-Aktivität, wobei
sowohl die Verfahren zur Kultivierung von Zellen zur Expression
des genannten Proteins als auch die anschließenden Aufreinigungsverfahren
ohne Einsatz von Serumalbumin, insbesondere ohne Einsatz von humanem
oder Rinder-Serumalbumin durchgeführt werden, d. h. besonders
bevorzugt, dass weder die Kulturmedien noch die zur Aufarbeitung
verwendeten Medien Serumalbumin, insbesondere Rinder- oder menschliches
Serumalbumin enthalten.
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Erfindungsgemäß bereitgestellt
werden besonders hoch aufgereinigte Präparationen von Proteinen
mit INF-Aktivitäten, insbesondere Interferon-β wt
(Wildtyp) und dessen Varianten wie Soluferon®, die
vorzugsweise Serumalbumin-frei sind und/oder vorzugsweise den regulatorischen
Anforderungen entsprechen.
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Die
Aufarbeitung erfolgt in besonders bevorzugter Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung durch eine Kombination orthogonaler,
chromatographischer Verfahrensschritte, bei denen Mediumsbestandteile,
Wirtszell-Proteine, DNA, Viren, Endotoxine und Substanzen, die aufgrund
von „column leaching” oder als Verunreinigungen
in die Medien oder Laufmittel gelangen, abgereichert werden. Man
fasst die aufeinander folgenden Reinigungsschritte hierauf unter
den Bezeichnungen „capture”, „intermediate purifaction” und „polishing” zusammen.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist das so hergestellte
Protein mit IFN-β-Aktivität ein Protein mit einer
Reinheit von mindestens 98%, mindestens 99%, vorzugsweise 99,1%,
insbesondere 99,2%, vorzugsweise 99,3% und besonders bevorzugt mindestens
99,8%, insbesondere 99,9%.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass
die Affinitäts-Chromatographie in Schritt x) an kovalent
mit polymeren Matrices verknüpften Farbstoffen, z. B. Farbstoffen
aus der Familie Cibacron Blue, z. B. Cibacron Blue F3G-A, durchgeführt
wird. Derartige polymere Matrices können natürliche
Polymere wie Agarose oder synthetische Polymere, wie Methacrylate,
Derivate oder Mischpolymere davon oder Acrylate, Derivate oder Mischpolymere
davon sein. Selbstverständlich können auch Mischpolymere
verwendet werden, umfassend als polymere Matrices natürliche
Polymere oder synthetische Polymere, an die die Farbstoffe gebunden
werden. Als Agarose basierte Polymere können in bevorzugter
Ausführungsform Sepharose (GE Healthcare) und als Mischpolymere
das TSK-Gel (Toyopearl) oder Bio-Gel (BioRad) dienen.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass
die Affinitäts-Chromatographie in Schritt x) an Blue Sepharose
oder Toyopearl AF Blue HC durchgeführt werden.
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In
vorteilhafter Ausgestaltung kann vorgesehen sein, dass das Kulturmedium
nach optional in besonders vorteilhafter Weise vorgesehener Abtrennung
der Zellen, zum Beispiel durch Zentrifugation, und vor Durchführung
der Affinitäts-Chromatographie konditioniert wird.
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Gegebenenfalls
kann in besonders bevorzugter Ausführungsform vorgesehen
sein, das konditionierte Medium zu filtrieren, gegebenenfalls einer Sterilfiltration
zu unterziehen.
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Erfindungsgemäß bevorzugt
kann diese Konditionierung durchgeführt werden, indem NaCl zugesetzt
und anschließend eine Abtrennung partikulärer
Bestandteile durchgeführt wird. Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt kann auf den Einsatz von Ethylenglycol in diesem Verfahrensschritt
verzichtet werden, wodurch sich vorteilhafterweise eine niedrige
Viskosität des konditionierten Mediums und damit höhere
Flussraten in der Affinitäts-Chromatographie ergeben. Da
in dieser besonders bevorzugten erfindungsgemäßen
Variante die Konditionierung vor Durchführung der Affinitäts-Chromatographie ohne
Zusatz von Ethylenglycol durchgeführt werden kann, insbesondere
dann, wenn die Kulturmediumsüberstände steril
gelagert wurden, ist es möglich, das aus der Affinitäts-Chromatographie
resultierende Medium ohne aufwendige Umpufferung direkt einer hydrophoben
Interaktions-Chromatographie durchzuführen, die zu einer
wesentlich verbesserten Ausbeute, höheren Proteinkonzentration
und damit auch einer verbesserten weiteren Aufarbeitung führt.
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Die
Erfindung sieht weiterhin vor, nach Durchführung der Affinitäts-Chromatographie
im Schritt (y) eine hydrophobe Interaktions-Chromatographie (HIC)
durchzuführen. Die hydrophobe Interaktions-Chromatographie
wird vorzugsweise an mit hydrophoben Gruppen verknüpften
polymeren Matrices durchgeführt. Als hydrophobe Gruppen
können beispielsweise Phenylgruppen, z. B. Phenylsepharose
(GE Health Care), Butyl-Gruppen, Octyl-Gruppen oder Ether-Gruppen
dienen. Derartige polymere Matrices können natürliche
Polymere wie Agarose oder synthetische Polymere, wie Methacrylate,
Derivate oder Mischpolymere davon oder Acrylate, Derivate oder Mischpolymere
davon sein. Selbstverständlich können auch Mischpolymere
verwendet werden, umfassend als polymere Matrices natürliche
Polymere oder synthetische Polymere, an die die Farbstoffe gebunden
werden. Als Agarose basierte Polymere können in bevorzugter
Ausführungsform Sepharose (GE Healthcare) und als Mischpolymere
das TSK-Gel (Toyopearl) oder Bio-Gel (BioRad) dienen. Vorzugsweise
wird Schritt (y) an Phenylsepharose oder Phenylsuperose durchgeführt.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen sein,
nach Durchführung von Schritt x) und vor Durchführung
von Schritt y) das Affinititäts-chromatographierte Medium
zu konditionieren.
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In
einem weiteren Verfahrensschritt z) wird die Protein-haltige Fraktion
einer Gelfiltration zur Abtrennung von hoch- und niedrigmolekularen
Verunreinigungen unterzogen. Die Gelfiltration trennt die Substanz-Gemische
aufgrund ihrer Größe weiter auf. Die dazu eingesetzten
Materialien sind vorzugsweise nicht funktionalisiert. Erfindungsgemäß bevorzugt werden
für die Gelfiltration polymere Matrices eingesetzt werden,
die sich in ihren Porengrößen und damit in ihrem
Trennbereich unterscheiden. Derartige polymere Matrices können
natürliche Polymere wie Agarose oder synthetische Polymere,
wie Methacrylate, Derivate oder Mischpolymere davon oder Acrylate,
Derivate oder Mischpolymere davon sein. Selbstverständlich
können auch Mischpolymere verwendet werden, umfassend als
polymere Matrices natürliche Polymere oder synthetische
Polymere, an die die Farbstoffe gebunden werden. Als Agarose basierte
Polymere können in bevorzugter Ausführungsform
Sepharose (GE Healthcare) und als Mischpolymere das TSK-Gel (Toyopearl)
oder Bio-Gel (Bio-Rad) dienen. Das Gelfiltrations-Material kann besonders
bevorzugt Superdex 75 (GE Healthcare) sein.
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In
bevorzugter Ausführungsform kann vorgesehen werden, nach
Durchführung von Verfahrensschritt y) und vor Durchführung
des Verfahrensschrittes z), also vor der Durchführung der
Gelfiltration, eine Reverse Phase (RP)-HPLC zur weiteren Aufreinigung
durchzuführen. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft,
wenn sich das Eluat der HIC durch niedrige Proteinkonzentrationen,
insbesondere unter 0,1 mg/ml, auszeichnet und/oder der aktive Wirkstoff
in Form einer Proteinlösung im physiologischen pH-Bereich
bereitgestellt sein soll. Erfindungsgemäß kann jedoch
in einer bevorzugten Ausführungsform auch vorgesehen sein,
die RP-HPLC im Anschluss an Verfahrensschritt z), also die Gelfiltration,
gegebenenfalls sogar im Anschluss an einen sich an die Gelfiltration
anschließenden Anionenaustauscherschritt, durchzuführen.
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Die
RP-HPLC kann in vorteilhafter und bevorzugter Ausführungsform
an nicht porösen Kieselgel-basierten RP-Materialien, beispielsweise
mit Gradientenelution gereinigt werden. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform kann vorgesehen sein, poröse RP-Materialien,
zum Beispiel C-18, C-8 oder C-4 mit weiten Poren auf Kieselgelbasis
einzusetzen. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform kann
vorgesehen sein, Polymermaterialien auf Polystyrolbasis, bevorzugt
vernetzt mit Divinylbenzol einzusetzen. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform können für die RP-HPLC
auch nicht poröse RP-Materialien verwendet werden.
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In
einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
kann die RP-HPLC auch als letzter Verfahrensschritt der vorliegenden
erfindungsgemäßen Verfahrensabfolge eingesetzt
werden, vorzugsweise in Kombination mit einem Gefriertrocknungs-
oder Trocknungsschritt.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen,
dass das aufzureinigende Medium mindestens einem Kationenaustauscherschritt unterzogen
wird. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen,
dass das aufzureinigende Medium einem Anionenaustauscherschritt
unterzogen ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist vorgesehen, dass das aufzureinigende Medium einem Anionen- und
einem Kationenaustauscherschritt unterzogen wird.
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Bevorzugt
wird der Anionenaustauscherschritt nach der Gelfiltration, vorzugsweise
unmittelbar danach, durchgeführt.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist vorgesehen, dass
der Anionenaustauscherschritt dem Verfahrensschritt z) anschließt,
das heißt nach der Gelfiltration und vor einer sich in
optionaler Weise daran anschließenden RP HPLC durchgeführt
wird.
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In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform kann vorgesehen
sein, einen Kationenaustauscherschritt zu Beginn des erfindungsgemäßen
Verfahrens, das heißt vor Verfahrensschritt x) durchzuführen.
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Sowohl
der Anionen- als auch der Kationenaustauscherschritt kann an partikulären
Anionen- beziehungsweise Kationenaustauschermaterialien, an modifizierten
Membranmaterialien oder an makroporösen monolitischen Trennmedien
durchgeführt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann
vorgesehen sein, den Kationen- oder/und Anionenaustauscherschritt
an modifizierten Membranmaterialien wie Satorbind C und S und Q
oder Vivasience durchzuführen.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform sieht die Erfindung
ein Verfahren zur Gewinnung von einem Protein mit IFN-β-Aktivität
vor, das die Abfolge der Verfahrensschritte x), y), einen RP HPLC-Schritt, z)
und einen optionalen Anionenaustauscherschritt vorsieht.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren
zur Gewinnung von einem Protein mit IFN-β-Aktivität
vorgesehen, das die Abfolge der Verfahrensschritte x), y), z), einen
optionalen Anionenaustauscherschritt und einen optionalen RP HPLC-Schritt
vorsieht.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein Verfahren
zur Gewinnung von einem Protein mit IFN-β-Aktivität
vorgesehen, das die Abfolge der Verfahrensschritte einen Kationenaustauscherschritt,
x), y), einen RP-HPLC-Schritt, z) und einen optionalen Anionenaustauscherschritt
vorsieht.
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Die
Erfindung betrifft auch Proteinpräparationen, enthaltend
ein Protein mit Interferon-β-Aktivität, hergestellt
nach einem der vorgenannten Verfahren.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden unter Blockpolymeren
(hier auch als Blockcopolymere bezeichnet) aus Ethylenoxid und Propylenoxid
bevorzugt Polymere verstanden, die aus Ethylenoxid und Propylenoxid
aufgebaut sind. Diese sind bevorzugt schaumarme und schaumdämpfende
nichtionische Tenside. Derartige Blockpolymere aus Ethylenoxid und
Propylenoxid können als Propylenoxid-Ethylenoxidblockpolymerisate
oder als Ethylenoxid-Propylenoxidblockpolymerisate ausgeführt
sein. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Blockpolymere
solche Polymere, die aus Molekülen aus linear verknüpften
Blöcken bestehen und wo bei ein Block ein Abschnitt eines
Polymermoleküls ist, der mehrere identische Repitiereinheiten
umfasst und sich durch mindestens ein Merkmal von angrenzenden Abschnitten,
also Blöcken, unterscheidet. Die Blöcke können
direkt oder durch Bestandteile, die kein Teil der Blöcke
sind, miteinander verbunden sein.
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Erfindungsgemäß besonders
bevorzugt sind Blockcopolymere aus Ethyloxid und Propyloxid Blockcopolymere,
die aus Abschnitten von Polyethylenglycol (hydrophile Bereiche)
und Abschnitten von Polypropylenglycol (hydrophobe Bereiche) aufgebaut
sind. Die chemische Bezeichnung lautet Poly-(ethylenglycol)-block-poly-(propylenglycol)-block-poly-(ethylenglycol)
oder Poly-(propylenglycol)-block-poly-(ethylenglycol)-block-poly(propylenglycol)
mit der CAS-Nr. (Chemical-Abstracts Registry Number) 9003-11-6.
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In
besonders bevorzugter Weise wird als Blockcopolymer aus Ethylenoxid
und Propylenoxid Pluronic® (auch
bekannt als Lutrol®), insbesondere Pluronic® F-68
(Lutrol® F-68) oder Pluronic® F-127 (Lutrol® F-127),
oder Synperonic verwendet.
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In
besonders bevorzugter Weise werden als Blockpolymere bzw. Blockcopolymere
aus Ethylenoxid und Propylenoxid Poloxamere verwendet, also Blockpolymere
bestehend aus Polyoxyethylen(POE-) und Polyoxypropylen- (POP-)Einheiten. Besonders
bevorzugt wird Poloxamer 188 (Lutrol® F-68)
eingesetzt. Eingesetzt werden kann auch Poloxamer 407, bekannt auch
als Lutrol® F-127.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform verwendet die Erfindung
als Blockpolymer aus Ethylenoxyd und Propylenoxyd Blockpolymere,
die von 70 bis 85 POE-Einheiten pro POE-Block und 20 bis 45 POP-Einheiten
pro POP-Block aufweisen.
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Poloxamer
188 (Lutrol® F-68) weist etwa 79 POE-Einheiten
pro POE-Block und etwa 28 POP-Einheiten pro POP-Block auf. Poloxamer
407 (Lutrol® F-127) weist etwa
98 POE-Einheiten pro POE-Block und etwa 57 POP-Einheiten pro POE-Block
auf.
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In
besonders bevorzugter Ausführungsform weist das eingesetzte
Blockpolymer Copolymer aus Ethylenoxyd und Propylenoxyd ein Molekulargewicht von
4 000 bis 10 000 Da, vorzugsweise 4 000 bis 9 000 Da auf.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Protein
mit IFN-β-Aktivität ein, vorzugsweise menschliches,
Protein aus der Familie der Cytokine oder ein funktionaler Bestandteil davon
verstanden, das oder der antivirale Aktivitäten aufweist.
Die vorliegend bereitgestellten Proteine können rekombinant
hergestellte Proteine oder natürlicherweise vorkommende
Proteine sein. Dementsprechend können die für
die Gewinnung der Proteine eingesetzten Zellen natürlicherweise
vorkommende Zellen ebenso wie gentechnisch veränderte Zellen,
insbesondere mit Interferon-Aktivität codierenden Nucleotidsequenzen
transformierte Zellen sein. Insbesondere werden im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung unter derartigen Proteinen Interferon
Typ I und Interferon Typ II verstanden. Im Zusammenhang mit der
vorliegenden Erfindung wird unter Interferon Typ I insbesondere
Interferon-α, Interferon-β, lnterferon-ω sowie
Interferon-τ verstanden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden
Erfindung wird unter Interferon II, vorzugsweise Interferon-γ verstanden.
Vorzugsweise versteht die Erfindung unter dem Protein mit Interferon-β-Aktivität
Interferon-β-Wildtyp (wt) oder Varianten davon, insbesondere
solche Varianten, die die pharmakologisch, therapeutisch sowie prophylaktisch
bedeutsamen Eigenschaften von Interfe ron-β zumindest in
gleichem, vorzugsweise aber verbessertem Umfang aufweisen. Derartige
Varianten sind insbesondere mutante Interferon-β-Proteine,
die sich durch mindestens eine Aminosäureänderung,
insbesondere Austausch, und/oder ein anderes Glycolysierungsmuster
gegenüber Interferon-β-Wildtyp auszeichnen. In
besonders bevorzugter Ausführungsform ist eine solche Variante
ein mutantes Interferon-β, in dem mehrere Aminosäuren
ausgetauscht wurden, insbesondere in dessen nichtfunktionalen Bereich.
In besonders bevorzugter Weise sind derartige Varianten solche,
in denen neun hydrophobe Aminosäuren durch hydrophile Aminosäuren,
insbesondere Hydroxylgruppen aufweisende Aminosäuren, zum
Beispiel Threonin, Serin oder Tyrosin, ausgetauscht wurden. Vorzugsweise
versteht die Erfindung unter einer Variante eines Proteins mit der
Aktivität von Interferon-β eine hydrophobizitätsreduzierte
mutante Interferon-β-Variante, in der neun hydrophobe Aminosäuren,
vorzugsweise im nicht-funktionalen Teil des Proteins, durch jeweils Serinreste
ersetzt werden, vorzugsweise Soluferon
®. Soluferon
® weist eine verbesserte Biozugänglichkeit aus
und ist in der
EP 0
975 761 B1 beschrieben.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer HPLC
(high performance liquid chromatography, Hochleistungs- oder Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie)
eine Flüssigkeitschromatographie verstanden, bei der einzelne Komponenten
einer Lösung aufgetrennt werden und wobei die Komponenten
sich unterschiedlich zwischen einer mobilen flüssigen und
einer stationären festen Phase verteilen und sich mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
durch die für die Chromatographie eingesetzte Säule
bewegen.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer hydrophoben
Interaktionschromatographie (HIC) eine, vorzugsweise unter nativen
Bedingungen durchgeführte, Chromatographie verstanden,
wobei hydrophobe Anteile von zu trennenden Stoffen, insbesondere
an deren Oberfläche, an einer hydrophoben Säulenmatrix
adsorbieren und demgemäß eine hydrophobe Interaktion
von zu trennenden Stoffen, insbesondere deren Oberfläche,
mit einem Säulenmaterial eingesetzt und zur Trennung genutzt
wird. Die über die hydrophobe Interaktion an die Säule
bindenden Stoffe werden dann vorzugsweise mit einem absteigenden
Salzgradienten eluiert. Je geringer die Hydrophobizität
eines Proteins ist, desto eher wird es eluiert.
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Im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einer Gelchromatographie,
die auch als Gelfiltration bezeichnet wird, eine Trennung von Stoffen
anhand ihrer Größe verstanden, wobei vorzugsweise
für die Trennung eine Säule mit einem inerten,
insbesondere polymeren, Material definierter Porengröße
eingesetzt wird. Derartige Materialien sind zum Beispiel Sephadex®, Sephacryl oder Agarose.
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Die
vorliegende Erfindung stellt daher Verfahren und mittels dieser
Verfahren hergestellter Proteine mit Interferon-β-Aktivität
bereit, die eine besonders hohe Reinheit und Aktivität
aufweisen, und wobei das Verfahren zur Herstellung dieser Proteine
bei hoher Ausbeute besonders unbedenkliche und sichere Mittel einsetzt.
Die vorliegende Erfindung stellt insbesondere durch ein besonders
vorteilhaftes Aufreinigungsverfahren eine Methodik zur Verfügung, die
zu besonders reinen und qualitativ hochwertigen Proteinpräparationen
führt. Die erfindungsgemäß bereitgestellten
Proteine können zur Herstel lung von Arzneimitteln, zum
Beispiel zum Einsatz gegen virale Infektionen oder Multiple Sklerose,
als Feinchemikalie oder für Interferonspiegelmessungen
eingesetzt werden.
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Weitere
vorteilhafte Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung ergeben
sich aus den Unteransprüchen. Die Erfindung wird anhand
der folgenden Beispiele und dazugehörigen Figuren näher
erläutert.
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Die
Figuren zeigen:
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1 die
Proliferationskurven von CHO(9x)-Zellen mit verschiedenen Supplementierungen.
Die mit Dreiecken markierte Wachstumskurve stellt eine mit 0,5 mg/ml
HSA, die mit Quadraten markierte eine mit 2,0 mg/ml Pluronic® F-127 und die mit Rauten markierte
eine mit 0,5 mg/ml Pluronic® F-68
versehene Mediensupplementierung dar. Die Proliferationswerte sowie
die Standardabweichungen basieren auf einer Versuchsanzahl von n
= 3,
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2 die
biologische Aktivität des sezernierten INF-β-Proteins
der mit Pluronic® F-68/F-127 und HSA
inkubierten CHO(9x)-Zellen. Die nicht ausgefüllten Balken
beziehen sich auf die Supplementierung mit 0,5 mg/ml HSA, die grauen
Balken beziehen sich auf die Supplementierung mit 2,0 mg/ml Pluronic® F-127 und die schwarzen Balken
auf die Supplementierung mit 0,5 mg/ml Pluronic® F-68
im Zeitverlauf von 8 Tagen. Je Probe wurden n = 2 AVAs (Antivirale Assays)
durchgeführt,
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3 die
biologische Aktivität von IFN-β (9x) bei verschiednen
Pluronic® F-68 Konzentrationen. Die
nicht ausgefüllten Balken beziehen sich auf eine Mediensupplementierung
von 0,3 mg/ml, die grauen Balken beziehen sich auf eine Supplementierung
mit 1,0 mg/l und die schwarzen Balken beziehen sich auf eine Supplementierung
mit 2,0 mg/ml Pluronic®F-68. Je
Probe wurden n = 2 AVAs durchgeführt.
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Beispiel 1: Zellkulturverfahren
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Dieses
Beispiel demonstriert den Einsatz von Pluronic® F-68
und F-127 zur HSA-freien Produktion von IFN-β (9x) (Soluferon®) mit CHO (chinese hamster ovary)-Zellen.
Das Medium wurde zuvor jeweils mit 0,5 mg/ml HSA, 0,5 mg/ml Pluronic® F-68 und 2 mg/ml Pluronic® F-127 supplementiert.
- Zelllinie:
CHO-dhfr-Ovarialzelllinie aus chinesischem Hamster DSMZ, Nr. DSM
ACC 126 (epitheliale Zellen aus den Eierstöcken des chinesischen
Hamsters, die Dehydrofolatreductase negativ sind)
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CHO-Medium
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- CHO-SFM-II/Mem α+(beides
Invitrogen, Karlsruhe) im Verhältnis 1:1
1% Penicillin/Streptomycin
1%
MEM- Vitamine (100x)
0,5 mg/ml HSA
bzw. 0, 5 mg/ml Pluronic® F-68
bzw. 2 mg/ml Pluronic® F-127
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Verwendet
wurden die Zelllinien CHO-dhfr- ACC126 und A-549 ACC 107. Bei den
Zelllinien aus der master cell bank (MCB) handelt es sich um adhärent
wachsende Zellen. Die genutzte working cell bank (WCB) der CHO-Zelllinie
besteht aus Suspensionszellen. Die Umstellung der adhärent
wachsenden Zelllinie auf eine Suspensionszellkultur erfolgte in
einem dreistufigen Adaptionsverfahren. Als Inokulum für
neue Kulturen wurden Zellen aus der WCB aufgetaut.
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Die
Kultivierung der CHO-Zellen erfolgte in T-Flasks bei 37°C
und 5% CO2 in einer mit Wasserdampf gesättigten
Atmosphäre. Als Kulturmedium wurde eine 1:1 Mischung der
Medien CHO-SFM II und MEM-α der Firma Invitrogen, versetzt
mit 1% MEM-Vitamin, 1% Penicillin/Streptomycin und entsprechenden
Konzentration an HSA, Pluronic F-68 bzw. Pluronic F-127 verwendet.
Zum Passagieren wurde der Kulturüberstand bei 1200 g für
3 min zentrifugiert, das Pellet mit 1 × PBS gewaschen und
anschließend in neuem, auf 37°C vortemperiertem
Medium wieder aufgenommen. Da die CHO-Zellen in Suspension zu Clusterbildung
neigen, wurden diese nach dem Überführen in neues
Medium durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren vereinzelt.
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Die Überprüfung
der Vitalität der Zelllinie erfolgte mittels Trypanblau-Färbung,
die Zellzahlbestimmung mit dem CASY Cell Counter. Da vitale Zellen
in einem Größenbreich von 10–50 μm
liegen, konnte die Vitalität auch mittels CASY-Messung
abgeschätzt werden.
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Über
acht Tage wurden Proliferationskurven erstellt sowie die IFN-β(9x)-Aktivität
untersucht. Ab dem 4. Kultivierungstag wurde täglich das
Medium gewechselt. Dadurch konnte einer Inhibition der Proliferation
und Expression durch mangelnde Nährstoffe beziehungsweise durch
akkumulierte Stoffwechselendprodukte entgegen gewirkt werden.
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Die
Proliferationskurven in 1 zeigen, dass weder Pluronic® F-68 noch Pluronic® F-127
das Wachstum der CHO(9x)-Zellen hemmen. Im Vergleich zu den mit
HSA kultivierten Zellen konnten keine signifikanten Unterschiede
festgestellt werden. So liegen die ermittelten maximalen Wachstumsrate
mit μmax(Pluronic®F-68) =
0,025 h–1, μmax(Pluronic®F-127) =
0,027 h–1 und μmax(HSA) = 0,018 h–1 im
gleichen Bereich. 2 stellt die biologische Aktivität
des sezernierten IFN-β(9x)-Proteins in Bezug zu den Mediensupplementierungen
dar.
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Das
IFN-β(9x) der mit Pluronic® F-68
inkubierten Zellen zeigt gegenüber dem in HSA-haltigem Medium
exprimierten keinen signifikanten Unterschied hinsichtlich der biologischen
Aktivität.
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Für
kurzzeitige Inkubierungen zeigt auch Pluronic® F-127
keine signifikanten Unterschiede zu der biologischen Aktivität
von IFN-β(9x) im Vergleich zur Kontrolle. Für
längere Kultivierungsdauer ist eine Verringerung der Aktivität
festzustellen.
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3 stellt
die Abhängigkeit der Soluferon®-Aktivität
von verschiedenen Mediumskonzentrationen an Pluronic® F-68
dar.
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Bis
zum 4. Tag der Zellkultivierung konnten keine signifikanten Unterschiede
in der biologischen Aktivität gemessen werden. Die IFN-β(9x)-Aktivität bei
den mit 1,0 mg/ml Pluronic® F-68
kultivierten Zellen ist ab dem 5. Tag höher als bei den
anderen Pluronic®-Konzentrationen,
so dass hier ein optimaler Konzentrationsbereich angenommen werden
kann.
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Die
gewählten Pluronic®-Konzentrationen
inhibieren die Proliferation der CHO(9x)-Zellen nicht. Ein besonders
positiver Einfluss auf die biologische Aktivität ließ sich
mittels AVA bevorzugt für eine Endkonzentration von 1,0
mg/ml Pluronic® F-68 im Medium
nachweisen. Die Produktbildung beziehungsweise Produktaktivität
ist vergleichbar der mit HSA als Mediumzusatz erzielten, so dass
besonders bevorzugt Pluronic® F-68
als geeigneter und risikofreier Ersatzstoff für HSA in
der CHO-Zellkultur zur Herstellung von Interferon-β und
dessen Derivaten, zum Beispiel Soluferon®,
gesehen werden kann.
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Beispiel 2: HSA-freie Gewinnung von Interferon-β(9x)
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2.1 Zellabtrennung und Konditionierung
der Überstände
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Die
HSA-freien Zellkulturmedien wurden wie die HSA-haltigen Medien aufgearbeitet.
Der erste Schritt ist die Abtrennung der Zellen mittels Zentrifugation.
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Danach
werden die klaren Medien mit festem NaCl auf die Konzentration von
1 M eingestellt und mit 1 M HCl oder 1 M NaOH auf pH 7,2 eingestellt. Die
so konditionierten Medien werden mit einem Papierfilter filtriert,
eine fakultative Sterilfiltration (0,45 μm) kann durchgeführt
werden.
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Auf
den Zusatz von Ethylenglycol in die Zellkulturüberstände
wird verzichtet.
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2.2 Affinitätschromatographie
(„Capture”)
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Immobilisiertes Cibacron Blue
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Die
konditionierten Überstände werden bei 4°C über
eine Säule von Blue Sepharose® 6
Fast Flow (GE Healthcare) oder TOYOPEARL® AF-BLUE HC-650M
(TOSOH) gepumpt, die mit einer 0,1 M Natriumphosphatlösung,
pH 7,2, 1 M NaCl äquilibriert wurde. Das Säulenvolumen
(SV) beträgt 2,5 ml pro Liter Medium. Die Säule
wird mit jeweils 5 Säulenvolumina (SV) Äquilibrierpuffer
(0,1 M Natriumphosphatpuffer, 1 M NaCl) und Waschpuffer (Äquilibrierpuffer
+ 20% Ethylenglycol (v/v)).
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Soluferon® wird unter Umkehr der Flussrichtung
mit dem Elutionspuffer eluiert (Äquilibrierpuffer mit 60%
Ethylenglycol v/v). Die Präparation kann auf dieser Reinigungsstufe
im flüssigen Zustand bei –20°C unter
Erhalt der biologischen Aktivität gelagert werden. Soluferon® wird bei diesem Schritt um den Faktor
50 bis 100 aufkonzentriert und unter Erhalt der biologischen Aktivität
(95%) angereichert. Die Hauptverunreinigung mit HSA-haltigen Medien
ist auf dieser Reinigungsstufe HSA neben einer Vielzahl von Wirtszell-Proteinen
und Mediumsbestandteilen.
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2.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie
(HIC) („Intermediate Purification”)
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HIC (Phenyl Sepharose® beziehungsweise
Phenyl Superose®)
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Zur
Konditionierung wird das Eluat aus dem vorhergehenden Reinigungsschritt
mit einer 2 M Ammoniumsulfatlösung (AS) in Wasser im Volumenverhältnis
1 + 1 verdünnt und, falls dabei Trübungen auftreten,
durch Filtration und/oder Zentrifugation geklärt. Die Proteinkonzentration
wird mittels UV-Absorptionsmessungen bei 280 nm abgeschätzt.
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Die
konditionierten Lösungen werden an einer Säule
mit Phenyl Sepharose® FF (high
sub oder low sub), Phenyl Sepharose® High
Performance oder Phenyl Superose® weiter
fraktioniert. Gebunden werden die Proteine unter Hochsalzbedingungen.
Das Säulenvolumen berechnet sich aus der zu trennenden
Proteinmenge. Das Säulenvolumen (SV) wird so eingestellt,
dass eine Beladung von 2 bis 3 mg Protein pro ml SV erreicht wird.
Nach Waschen mit 5 SV Bindepuffer HIC werden die Proteine mit einem
linearen Gradienten zu 100% Elutionspuffer fraktioniert eluiert.
Elutionspuffer ist ein 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,2, oder
ein 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 3,5. Die Fraktionen, die Soluferon® enthalten, werden vereinigt. Der
Soluferon®-Gehalt wird mit einer „dot
blot” Methode (western blot) halbquantitativ abgeschätzt.
Interferon-beta wt sowie Soluferon® werden
bei diesem Reinigungsschritt etwa um den Faktor 10 bis 20 aufkonzentriert.
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Die
weitere Reinigung erfolgt entweder an RP (reverse phase)-Materialien
oder mittels Gelchromatographie. Bei niedrigen Proteinkonzentrationen der
Eluate von der HIC (unter 0,1 mg/ml) und für den Fall,
dass als aktiver Wirkstoff („drug substance”) eine
Proteinlösung im physiologischen pH-Bereich angestrebt
wird, ist es von Vorteil, einen weiteren „konzentrierenden” Reinigungsschritt
wie die RP-HPLC anzuschließen. In diesem Fall lassen sich Verluste
durch Proteinabsorption an Oberflächen minimieren. Bei
Proteinkonzentrationen über 0,1 mg/ml und bei einer hohen
Reinheit kann als Alternative die weitere Reinigung mit Gelchromatographie,
zum Beispiel an Superdex 75® erfolgen.
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RP-H PLC
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Interferon-beta
wt und dessen Varianten (Soluferon®)
können an nichtporösen kieselgelbasierten RP-Phasen
mit Gradientenelution gereinigt werden. Das Laufmittelsystem besteht
aus Wasser und Acetonitril jeweils mit Trifluoressigsäure.
Ebenfalls geeignet sind poröse „wide Pore”-RP-Phasen
(C-18, C-8, C-4) auf Kieselgelbasis sowie Polymerphasen auf Polystyrol-Basis,
quervernetzt mit Divinylbenzol (zum Beispiel Source 15RPC, GE Healthcare
oder Amberchrom® CG-1000, TOSOH).
Nichtporöse RP-Phasen-Methoden werden auch zur quantitativen
Bestimmung von Soluferon® und Interferon-β-wt
eingesetzt. Die Chromatographie an RP-Phasen kann auch als letzter
Reinigungsschritt („polishing”) in Kombination
mit einem Trocknungsschritt, zum Beispiel Gefriertrocknung, genutzt
werden. Von Vorteil ist es, dass dabei der aktive Wirkstoff („drug
substance”) frei von Begleitstoffen gewonnen wird.
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2.4 Gelfiltration („Polishing”)
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Zur
Abtrennung von hoch- und niedrigmolekularen Verunreinigungen wird
die Gelfiltration an Superdex® 75
oder anderen Medien mit geeignetem Trennbereich eingesetzt. Dieser
Reinigungsschritt erlaubt zusätzlich das Umpuffern des
aktiven Wirkstoffs für die Lagerung beziehungsweise für
die Weiterverarbeitung, zum Beispiel durch Gefriertrocknung. Wenn
als Laufmittel für die Gelfiltration flüchtige
Puffersysteme eingesetzt werden, lassen sich die Zielproteine nach
Gefriertrocknung frei von Begleitstoffen gewinnen.
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2.5 Zusätzliche Reinigungsschritte
an Ionenaustauschermaterialien
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Erfindungsgemäß konnte
gezeigt werden, dass sowohl Interferon-β wt als auch eine
deren Varianten (Soluferon®) aufgrund
ihrer positiven Nettoladung im physiologischen pH-Bereich und niedrigen Salzkonzentrationen
weder an partikuläre Anionenaustauschermaterialien wie
Mono Q oder Q Sepharose® (GE Healthcare),
an modifizierten Membranmaterialien (zum Beispiel Satorbind® D und Q, Vivascience), noch an
makroporösen monolitischen Trennmedien gebunden werden.
Die positive Nettoladung der Zielproteine kann also zur Abtrennung
von kontaminierenden Proteinen mit negativer Nettoladung genutzt
werden, die aus dem Expressionssystem oder aus dem Zellkulturmedium
stammen. Zusätzlich werden bei diesem Schritt Reste von
DNA und Endotoxine von den Zielproteinen abgetrennt.
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Es
konnte ebenso gezeigt werden, dass die Zielproteine im pH-Bereich
von pH 3 bis pH 7 an Kationenaustauschermaterilien wie Mono S und
S Sepharose® (GE Healthcare) bei
niedrigen Salzkonzentrationen gebunden, und bei hohen Salzkonzentrationen
wieder eluiert werden. Diese Eigenschaft kann sowohl als „capture-Schritt” als
Alternative zur Bindung an Blue Sepharose® als
auch zur Abtrennung von kontaminierenden Proteinen, DNA und Endotoxinen
genutzt werden. Neben diesen partikulären Materialien können
für diesen Reinigungsschritt auch modifizierte Membranmaterialien,
zum Beispiel Satorbind® C und S
und Q, Vivascience, sowie makroporöse monolitische Trennmedien
genutzt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- - WO 01/59069 [0003]
- - WO 2004/106494 [0003]
- - US 2006149042 [0003]
- - CA 2549564 [0003]
- - US 6171825 [0003]
- - WO 98/28007 [0003]
- - JP 8070859 [0003]
- - EP 0975761 B1 [0045]