WO2005070953A1 - Reinigung von hochmolekularen verbindungen mittels affinitätsmembranchromatographie - Google Patents

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WO2005070953A1
WO2005070953A1 PCT/EP2005/000810 EP2005000810W WO2005070953A1 WO 2005070953 A1 WO2005070953 A1 WO 2005070953A1 EP 2005000810 W EP2005000810 W EP 2005000810W WO 2005070953 A1 WO2005070953 A1 WO 2005070953A1
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WO
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molecular weight
high molecular
membrane
compounds
ion exchange
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PCT/EP2005/000810
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Wolfgang Demmer
Matthias Grabosch
Oscar-Werner Reif
Wolfgang Nagel
Mariel Donzeau
Peter Reichelt
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Sartorius Ag
Apanovis Biotechnologie Gmbh
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    • C12N2795/14151—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for purifying and / or isolating high-molecular compounds, such as high-molecular proteins or protein-like compounds, contained in a solution or suspension, by means of affinity chromatography using membranes containing metal ions.
  • Chromatographic processes play an important role in the purification and isolation of proteins or proteinaceous compounds, especially when used as a vaccine.
  • affinity-chromatographic methods for the purification of recombinant bacteriophages are described in the prior art which, however, disadvantageously have, among other things, a very low binding capacity of the chromatography material used (cf. Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1991; US 5,750,373; US 5,688,666; WO 92/09690).
  • such recombinant proteins can be, for example, antigens for use as therapeutic vaccines against cancer or autoimmune diseases, or antigens for the use of prophylactic vaccines against infectious diseases , in most cases receive a mixture of bacteriophages that carry many, few or no recombinant proteins, the latter being wild-type bacteriophages.
  • antigens for use as therapeutic vaccines against cancer or autoimmune diseases
  • a mixture of bacteriophages that carry many, few or no recombinant proteins the latter being wild-type bacteriophages.
  • different levels of expression of the antigen are obtained. This means that the proportion of phages that carry antigens can vary depending on the antigen used.
  • recombinant bacteriophages In contrast to other viral particles, which mostly represent the antigen themselves, there are consequently in the production of recombinant bacteriophages a particular problem, namely the separation of the wild-type bacteriophages from the desired bacteriophages which carry the recombinant protein, for example an antigen, on the surface.
  • the density of the recombinant antigen, which is expressed on the surface of the phage is important, because the actual aim of the immunization is to induce a specific immune response against the expressed recombinant antigen.
  • the wild-type bacteriophages can have an interfering effect here, since the aim is not the immune response against the bacteriophage, but an immune response against the "foreign" antigens which are expressed on the phage.
  • High contamination with wild-type bacterial phage makes the relationship between immune response against the antigen and immune response against the phage worse. Therefore, it is desirable to purify the bacteriophages that have the desired antigen on the surface and to separate the undesirable wild-type bacteriophages.
  • contaminating molecules of any kind in particular proteins and endotoxins of the host organism used for the production of the recombinant vaccines, for example E. coli or mammalian cells, and potentially contaminating proteins and low-molecular compounds such as antibiotics, cytokines, etc.
  • Fd phages have an unusual shape (for example, the fd phage has a diameter of 6 nm and a length of up to 900 nm) with a molecular weight of approximately 15 ⁇ 10 6 daltons, which places special demands on cleaning.
  • PCT / EP99 / 03380 describes a method for producing phage vaccines against tumors. These vaccines are already being used with good success, but it would be desirable to further simplify the manufacturing process described therein for large-scale use.
  • the present invention is therefore based on the object of providing a method which, in particular, provides inexpensive and rapid concentration, purification and / or isolation of high-molecular compounds, such as high-molecular proteins or protein-like compounds, for example filamentous bacteriophages which do not naturally occur on the surface on an industrial scale.
  • high-molecular compounds such as high-molecular proteins or protein-like compounds, for example filamentous bacteriophages which do not naturally occur on the surface on an industrial scale.
  • a method for the purification and / or isolation of high-molecular compounds, such as high-molecular proteins or high-molecular protein-like compounds, contained in a solution or suspension comprising the steps:
  • the high molecular weight compounds can be due to their size and / or shape via conventional chromatography material, such as modified agarose, e.g. B. Sepharose ® , essentially do not purify and / or isolate.
  • viruses can have an icosahedral, helical or complex shape and can be enveloped or non-enveloped, viruses, for example, having a size of approximately 10 nm to approximately 100 nm.
  • viruses are rod-shaped and have a length of several hundred nanometers.
  • the phage is M13 a length of about 900 nm.
  • metal ion (s) is not subject to any particular restriction insofar as the metal ions used have a specific affinity for the proteins or protein-like compounds to be purified and / or isolated.
  • Preferred metal ions are selected from the group consisting of Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ , Co 3+ , Fe 3+ , Mn 2+ and Ca 2+ and mixtures of at least two of these metal ions.
  • the metal ion Cu 2+ is particularly preferred.
  • the matrix material of the membrane used according to the invention is not subject to any particular restriction and is preferably selected from the group consisting of agaroses, modified agaroses, modified dextrans, polystyrenes, polyethers, polyacrylamides, polyamides, for example nylon, cellulose, modified celluloses such as crosslinked celluloses, nitrocelluloses, Cellulose acetates, silicates and poly (meth) acrylates, polytetrafluoroethylene, polyesters, polyvinyl chlorides, polyvinylidene fluoride, polypropylene, polysulfones and polyether sulfones.
  • the pore size of the membrane used according to the invention is preferably in the range from 0.01 to 12 ⁇ m, preferably from 0.45 to 7 ⁇ m, particularly preferably from 3 to 5 ⁇ m.
  • high molecular weight compounds encompasses high molecular weight proteins and high molecular weight protein-like compounds as well as biopolymers, lipids, micelles and liposomes.
  • proteinaceous compound (s) encompasses (poly) peptides and derivatives thereof, derivatized proteins, recombinant proteins and (poly) peptides, di-, tri-, tetra-, to multimers of peptides, polypeptides or proteins, (multi) protein complexes, cell organelles, fusion proteins, viruses and parts thereof, such as, for example, coat proteins, recombinant viruses and parts thereof, recombinant bacteriophages, such as, for example, recombinant filamentous bacteriophages, and parts thereof which carry antigens which are not naturally occurring on their surface.
  • recombinant, filamentous bacteriophages are purified and / or isolated as protein-like compounds.
  • filamentous bacteriophage encompasses all phages which have helical rather than icosahedral symmetry.
  • the filamentous bacteriophage can be a class I phage, e.g. fd, M13, f1, Ifl, Ike, ZJ / Z or Ff phage or a class Il phage, such as B. Xf, Pf1 or Pf3 phage.
  • the proteinaceous compound is the filamentous bacteriophage M13.
  • Non-naturally occurring antigens in the context of this invention are understood to mean antigens, such as proteins, which do not occur in the capsids of the wild-type forms of filamentous bacteriophages. These are antigens, which are recombinant by the phage can be expressed and incorporated into the capsid, or which can be chemically bound to the capsid, for example.
  • the recombinant expressed protein on the bacteriophage is a fusion protein with the protein III and / or the protein VIII of the bacteriophage.
  • the antigen must be a fusion protein with a phage protein if it is to be expressed recombinantly on the phage. Otherwise it cannot be installed.
  • protein III part of this protein is also sufficient, since it is located at the head of the phage and is only connected to the phage at one end.
  • protein VIII the entire protein is necessary because otherwise it cannot be incorporated into the phage (p VIII is relatively small and forms the envelope of the phage).
  • the advantage of incorporating the antigen by recombinant expression as a fusion protein is that the presentation is directed or precisely defined on the phage surface.
  • purification of high molecular weight compounds such as proteins or proteinaceous compounds, for example recombinant filamentous bacteriophages
  • purification of high molecular weight compounds means that at least 97%, preferably at least 98%, particularly preferably at least 99% and most preferably at least 99, 8% of the proteins or proteinaceous compounds to be purified by the process are present.
  • Isolation of high molecular compounds, such as proteins or proteinaceous compounds, for example recombinant, filamentous bacteriophages in this invention is to be understood to mean that all high molecular compounds purified by the process are essentially pure.
  • the isolated high-molecular compounds preferably contain no contaminating proteins, as in the case of isolated bacteriophages, for example, no more contaminating E. coli proteins and / or no nutrient medium components.
  • recombinant, antigen-bearing bacteriophages are purified and / or isolated, it being surprisingly possible to use at least 1 ⁇ 10 13 antigen-bearing bacteriophages per 50 to 100 cm 2 membrane area from a mixture which contains both wild-type bacteriophages and also contains antigen-bearing bacteriophages to be purified and / or isolated.
  • the principle of metal ion affinity chromatography is based on the metal chelate formation or complex formation between metal ions such as Cu 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ and Co 3+ , and the protein to be purified, which is preferably a sequence of 5 to 6 histidine residues ( "His-Tag") or more such units in a row.
  • the metal ion can be coupled to the membrane matrix via a further complexing agent.
  • the principle behind this is that many metals, such as copper and zinc, and their ions can form coordination complexes with the amino acids histidine, cysteine and tryptophan via electron donor groups on the side chains of the amino acids. In order to use this effect for chromatography, these metal ions must be immobilized on an inert matrix.
  • a chelating group to the matrix.
  • IDA iminodiacetic acid
  • the most common metals are copper and zinc, but others such as cobalt, nickel, iron, lanthanum, manganese and calcium have also been described.
  • the His tag can be located in the protein at the N-terminus, at the C-terminus or also internally.
  • a "tag” in the sense of the invention is a binding partner which forms a fusion protein with the protein or proteinaceous compound to be purified, the specific interaction then taking place between the tag and a metal ion specific for the day.
  • the tag is selected from the group consisting of His tag, flag tag and Myc tag.
  • natively occurring protein motifs with metal chelate properties e.g. so-called zinc finger motifs of transcription factors to be understood as tags in the sense of the invention, since they are able to carry out a special interaction with metal ions.
  • the shape of the metal ion-containing membrane used according to the invention is not subject to any particular restriction and it can be arranged in a housing, for example a plastic housing or a chromatography column.
  • a flat design of the membrane containing metal ions is preferred, it being possible for several layers of the membrane containing metal ions to be arranged one above the other in a packing for a chromatography column.
  • a mixture containing the high-molecular compounds to be cleaned and / or isolated can be used before step (a) be subjected to ion exchange chromatography to remove contaminants.
  • the ion exchange chromatography is carried out using an ion exchange membrane.
  • the ion exchange membrane preferably comprises a matrix material selected from the group consisting of agarose, modified agarose, modified dextrans, polystyrenes, polyethers, polyacrylamides, polyamides, for example nylon, cellulose, modified celluloses such as crosslinked celluloses, nitrocelluloses, cellulose acetates, silicates and poly (meth ) acrylates, polytetrafluoroethylene, polyesters, polyvinyl chlorides, polyvinylidene fluoride, polypropylene, polysulfones and polyether sulfones.
  • the ion exchange membrane preferably has a pore size in the range from 0.01 to 12 ⁇ m, preferably from 0.45 to 7 ⁇ m, particularly preferably from 3 to 5 ⁇ m.
  • the functional groups of the ion exchange membrane are not subject to any particular restriction and are adapted, for example, according to the protein to be purified or the proteinaceous compound to be purified. Preferred examples of functional groups are DEAE, DEA, CM, QA, TMA, S, SP and phosphate groups.
  • impurities that are via ion exchange chromatography e.g. B. can be removed by binding to the ion exchange membrane
  • endotoxins are to be mentioned, for example, in the recombinant production of proteins or proteinaceous compounds such as recombinant filamentous bacteriophages, by the host organism, for. B. E. coli.
  • the mixture which contains, for example, the protein to be purified or the proteinaceous compound to be purified, such as recombinant filamentous bacteriophage, is subjected to affinity membrane chromatography and / or ion exchange (membrane) chromatography of a filtration using commercially available filtration systems, such as the crossflow microfiltration system from Sartorius.
  • a filter cassette with a Hydrosart ® membrane with a nominal pore size of 0.45 ⁇ m or 0.2 ⁇ m is used in a suitable clamping device.
  • Filtration can remove other contaminants, such as the host organism or components thereof.
  • the filtrate thus obtained can then be used for ion exchange chromatography and / or affinity membrane chromatography, if appropriate after suitable, conventional processing.
  • the process according to the invention can be carried out as a "batch" process or continuously.
  • the process according to the invention comprises the further formulation of the purified and / or isolated high molecular compound, e.g. B. a protein or a proteinaceous compound, as a vaccine.
  • a protein or a proteinaceous compound e.g. B. a protein or a proteinaceous compound
  • phage are dialyzed against PBS after purification and then the protein concentration, the PFU, the endotoxin concentration and the amount of antigen are determined.
  • the endotoxin concentration and the amount of antigen are preferably determined using the LAL test or an immunodot blot. The concentration is adjusted to the desired level by dilution.
  • the method is carried out under GMP conditions, where GMP means “good manufacturing practice” and is known to the person skilled in the art and is therefore state of the art.
  • GMP means “good manufacturing practice” and is known to the person skilled in the art and is therefore state of the art.
  • Another object of the present invention relates to the use of the high molecular weight compounds according to the invention, such as proteins or proteinaceous compounds, preferably recombinant filamentous bacteriophages, as biologically or pharmacologically active constituents in a pharmaceutical composition, for example a vaccine, which may optionally contain a pharmaceutically acceptable carrier and / or diluent.
  • suitable carriers or diluents include, for example for phosphate buffered saline solutions, water, emulsions such as' include, for example oil / water emulsions, various types of wetting agents or detergents, sterile solutions, etc.
  • Compositions comprising such carriers and / or diluents, can be made by known conventional methods.
  • the pharmaceutical compositions can be administered to an individual in a suitable dosage.
  • Administration can be oral or parenteral, for example by intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, perinodal, intramuscular, topical, intradermal, intranasal or intrabronchial route or via a catheter into an artery.
  • the dosage level is determined by the attending physician and essentially depends on the clinical factors. These factors are known in the prior art and include, for example, the height or weight, the body surface, the age, sex and general health of the patient, the specific composition to be administered, the duration of treatment, the type of administration and the possible simultaneous Treatment with another medicine.
  • a typical dose can be, for example, in a range between 0.001 and 5000 ⁇ g, doses below or above this exemplary range being conceivable, especially taking into account the factors mentioned above.
  • the dose should be in a range between 1 ⁇ g and 10 mg units per day. If the composition is administered intravenously, which is not preferred to minimize the risk of an anaphylactic reaction, the dose should preferably range from about 1 ⁇ g to about 10 mg units per kg body weight per minute.
  • the pharmaceutical composition can be administered locally or systemically.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions and emulsions.
  • non-aqueous solvents are propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as e.g. Olive oil, and organic ester compounds such as e.g. Ethyl oleate suitable for injections.
  • Aqueous carriers include water, alcoholic aqueous solutions, emulsions, suspensions, saline solutions and buffered media.
  • Parenteral carriers include sodium chloride solutions, Ringer's dextrose, dextrose, sodium chloride, Ringer's lactate, and bound oils.
  • Intravenous carriers include e.g.
  • composition of the invention may also include preservatives and other additives such as e.g. antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • preservatives and other additives such as e.g. antimicrobial compounds, antioxidants, complexing agents and inert gases.
  • compounds such as e.g. Interleukins, growth factors, differentiation factors, interferons, chemotactic proteins or a non-specific immunomodulatory agent can be obtained.
  • Fig. 1 shows a graphic representation of the washing and elution steps of an ion exchange chromatography.
  • the first signal contains the main fraction of endotoxins and the second signal essentially contains the phages.
  • the dashed line represents the NaCI gradient.
  • Fig. 2 is a photographic illustration of a dot blot for the purification of recombinant M13 / fd phages with His-Tag / g8 fusion proteins, monoclonal for immunological detection
  • FIG. 3 is a photographic illustration of a dot blot for the purification of recombinant M13 / fd phages with His-Tag / g8 fusion proteins, using monoclonal peroxidase conjugated / anti-polyhistidine antibodies for immunological detection.
  • A Commercially available Ni 2+ " agarose beads are used as the chromatographic material.
  • B A Cu 2+ -containing membrane according to the invention is used as the chromatographic material.
  • Example 1 Cross-flow filtration of bacteriophage M13-containing solutions or suspensions.
  • 2 L of a bacteriophage M13 cultivation are cross-flow filtered using a Hydrosart membrane (pore size 0.4 ⁇ m) from Sartorius.
  • Example 2 Ion exchange chromatography of solutions or suspensions containing Baktiophage M13.
  • the regenerated cellulose has been stabilized against the enzymatic and chemical degradation by introducing bifunctional chemical groups. Furthermore, polymethacrylate chains were grafted on, the individual monomers each containing an epoxy group. Iminodiacetic acid groups were chemically coupled to these.
  • the membrane is 275 +/- 27 ⁇ m thick and has a flow rate of more than 80ml / min-bar if weakly buffered aqueous salt solutions in the pH range from 5 to 9 are used.
  • the nominal pore size is in the range of 3 to 5 ⁇ m.
  • the membrane which is arranged in a plastic housing, is connected with a 50 mL syringe without a plunger and treated or washed successively with 3 mL deionized water, 4 mL pre-filtered 0.3 M CuCl 2 solution, 3 ml deionized water and 5 ml PBS.
  • the membrane treated in this way is now ready for use in affinity chromatography.
  • Example 4 Affinity chromatographic purification of recombinant phages using a Cu 2+ -containing membrane.
  • the membrane is then washed three times with 5 mL PBS (W1, W2, W3) at a flow rate of 0.5 mL / min, and then the recombinant phages bound to the membrane are washed in succession with 2 mL 20 mM EDTA, 2 mL 40 mM EDTA and 20 mL 80 mM EDTA eluted at a flow rate of 0.25 mL / min (E1, E2, E3).
  • Affinity chromatographic purification was analyzed using a dot blot using monoclonal peroxidase-conjugated / anti-polyhistidine antibodies.
  • the recombinant phages are specifically bound to the Cu 2+ -containing membrane and eluted by means of EDTA.
  • the membrane used can be reused by washing sufficiently with 0.5 M EDTA to remove the Cu 2+ ions, washing with PBS / 5% SDS in the reverse direction and washing sufficiently with deionized water to remove SDS, or at 4 ° C. in be stored in a sealed container.
  • Comparative Example 1 Affinity chromatographic purification of rreekkoommbbiinnaanntteenn phages using Ni 2+ agarose beads.
  • Ni 2+ agarose beads from Amersham are loaded according to the manufacturer's protocol with the recombinant phages described in Example 4, incubated overnight and then eluted.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulare Proteine oder proteinartige Verbindungen, mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Metallionen-enthaltender Membranen.

Description

REINIGUNG VON HOCHMOLEKULAREN VERBINDUNGEN MITTELS AFFINITÄTSMEMBRANCHROMATOGRAPHIE
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulare Proteine oder proteinartige Verbindungen, mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung von Metallionen-enthaltender Membranen.
Chromatographische Verfahren spielen bei der Aufreinigung und Isolierung von Proteinen oder proteinartigen Verbindungen, insbesondere bei Verwendung als Impfstoff, eine wichtige Rolle. Beispielsweise werden im Stand der Technik affinitäts-chromatographische Verfahren zur Reinigung von rekombinanten Bakteriophagen beschrieben, die jedoch unter anderem nachteiligerweise eine sehr geringe Bindungskapazität des verwendeten Chromatographiematerials aufweisen (vgl. Bass et al., 1990; McCafferty et al., 1991 ; US 5,750,373; US 5,688,666; WO 92/09690).
So wird bei der Herstellung von filamentösen Bakteriophagen, die auf ihrer Oberfläche rekombinante Proteine tragen bzw. exprimieren, wobei solche rekombinanten Proteine z.B. Antigene für den Einsatz als therapeutische Vakzine gegen Krebserkrankungen oder Autoimmunkrankheiten, oder Antigene für den Einsatz von prophylaktischen Vakzinen gegen Infektionskrankheiten, sein können, in den meisten Fällen ein Gemisch aus Bakteriophagen erhalten, die viele, wenige oder keine rekombinanten Proteine tragen, wobei es sich in letztem Fall um Wildtyp-Bakteriophagen handelt. Je nach verwendetem Antigen wird eine unterschiedlich gute Expression des Antigens erhalten. Dies bedeutet, daß der Anteil der Phagen, die Antigene tragen, je nach verwendetem Antigen unterschiedlich hoch sein kann. Im Gegensatz zu anderen viralen Partikeln, die meist selbst das Antigen darstellen, gibt es folglich bei der Herstellung von rekombinanten Bakteriophagen ein besonderes Problem, nämlich die Abtrennung der Wildtyp-Bakteriophagen von den gewünschten Bakteriophagen, die das rekombinante Protein, beispielsweise ein Antigen, auf der Oberfläche tragen. Bei der Verwendung von rekombinanten Phagenimpfstoffen kommt es unter anderem auf die Dichte des rekombinanten Antigens an, das auf der Oberfläche des Phagen exprimiert wird, denn das eigentliche Ziel der Immunisierung ist eine spezifische Immunantwort gegen das exprimierte rekombinante Antigen zu induzieren. Die Wildtyp-Bakteriophagen können hierbei interferierend wirken, da nicht die Immunantwort gegen den Bakteriophagen das Ziel ist, sondern eine Immunantwort gegen die "fremden" Antigene, die auf dem Phagen exprimiert werden. Durch hohe Verunreinigungen mit Wildtyp-Bakterienphagen wird das Verhältnis zwischen Immunreaktion gegen das Antigen und Immunreaktion gegen den Phagen schlechter. Darum ist es wünschenswert, die Bakteriophagen aufzureinigen, die das gewünschte Antigen auf der Oberfläche aufweisen und die unerwünschten Wildtyp-Bakteriophagen abzutrennen.
Ferner ist es inbesondere bei rekombinanten Impfstoffen wünschenswert, kontaminierende Moleküle jeglicher Art insbesonders Proteine und Endotoxine des für die Herstellung der rekombinanten Impfstoffe verwendeten Wirtsorganismus, beispielsweise E. coli oder Säugerzelfen, und potentiell kontaminierende Proteine und niedermolekulare Verbindungen, wie Antibiotika, Cytokine etc., aus dem Kulturnährmedium von z.B. Bakterien oder Säugerzellen von den rekombinanten Impfstoffen abzutrennen, um eine möglichst hohe Reinheit zu erzielen.
Eine weitere wichtige Anforderung an das Reinigungsverfahren für gentechnologisch hergestellte Proteine, (Poly)peptide oder rekombinante Bakteriophagen, welche als Impfstoffe verwendet werden können, ist die großtechnische Herstellbarkeit, damit solche Mengen an beispielsweise rekombinanten Bakteriophagen produziert werden können, die zur Anwendung beim Menschen ausreichend sind. Die strukturellen Eigenschaften von partikulären Substanzen, wie Multimere Proteinkomplexe, Multienzymkomplexe, rekombinante Viren, VLP's und Bakteriophagen, stellen ein Problem für herkömmliche Aufreinigungsmedien auf Partikelbasis dar, wobei sich derartige Substanzen durch solche Medien auf Partikelbasis nicht oder nur sehr schlecht aufreinigen lassen. Am nachfolgenden Beispiel von filamentösen Bakteriophagen wird dies deutlich.
Fd-Phagen weisen eine ungewöhnliche Form (z.B. hat der fd-Phage einen Durchmesser von 6 nm und eine Länge von bis zu 900nm) mit einem Molekulargewicht von etwa 15x106 Dalton auf, was spezielle Anforderungen an die Reinigung stellt. In der PCT/EP99/03380 ist ein Verfahren zur Herstellung von Phagenvakzinen gegen Tumoren beschrieben. Diese Vakzine werden bereits mit gutem Erfolg eingesetzt, es wäre jedoch wünschenswert, das darin beschriebene Herstellungsverfahren für den großtechnischen Einsatz weiter zu vereinfachen.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, welches eine kostengünstige und schnelle Konzentrierung, Aufreinigung und/oder Isolierung von hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulare Proteine oder proteinartige Verbindungen, beispielsweise filamentöse, nicht natürlicherweise auf der Oberfläche vorkommende Antigene tragende Bakteriophagen, insbesondere im großtechnischen Maßstab ermöglicht.
Diese Aufgabe wird durch Bereitstellung der in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen, wie hochmolekulare Proteine oder hochmolekulare proteinartige Verbindungen, bereitgestellt, umfassend die Schritte:
(a) Aufbringen der Lösung oder Suspension auf eine Metallionen-enthaltende Membran und (b) affinitätschromatographische Abtrennung der hochmolekularen Verbindungen durch deren Bindung an die Metallionen-enthaltende Membran, wobei die hochmolekularen Verbindungen die Fähigkeit zur Metallchelat-Bildung aufzeigen und vorzugsweise ein Molekulargewicht von größer als 1x106 Da, mehr bevorzugt größer als 2x10δ und besonders bevorzugt größer 5x106 Da aufweisen.
Die hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, lassen sich aufgrund ihrer Größe und/oder Form über herkömmliches Chromatographiematerial, wie modifizierte Agarose, z. B. Sepharose®, im wesentlichen nicht aufreinigen und/oder isolieren. Beispielsweise können Viren eine icosahedrale, helikale oder komplexe Form aufweisen und behüllt oder unbehüllt sein, wobei Viren beispielsweise eine Größe von etwa 10 nm bis etwa 100 nm aufweisen. In besonderen Fällen sind Viren stäbchenförmig und weisen eine Länge von mehreren hundert Nanometem auf. Beispielsweise hat der Phage M13 eine Länge von etwa 900 nm. Insbesondere können bei einer gelchromatischen Auftrennung bzw. Isolierung die hochmolekularen Verbindungen im wesentlichen nicht in das heteroporöse gequollene Netzwerk der Perlen bzw. „Beads" (wie beispielsweise Sepharose®), die herkömmlicherweise als stationäre Phase in der Gelchromatographie verwendet werden, eindringen.
Der Begriff "Metallion(en)" unterliegt keiner besonderen Einschränkung, insoweit die verwendeten Metallionen eine spezifische Affinität zu den zu reinigenden und/oder zu isolierenden Proteinen oder proteinartigen Verbindungen aufweisen. Bevorzugte Metallionen sind aus der Gruppe, bestehend aus Cu2+, Ni2+, Zn2+, Co3+, Fe3+, Mn2+ und Ca2+ und Gemischen aus mindestens zwei dieser Metallionen, ausgewählt. Besonders bevorzugt ist das Metallion Cu2+.
Das Matrixmaterial der erfindungsgemäß verwendeten Membran unterliegt keiner besonderen Einschränkung und ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen, modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethem, Polyacrylamiden, Polyamiden, z.B. Nylon, Cellulose, modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestern, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen. Die Porengröße der erfindungsgemäß verwendeten Membran liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 12 μm, bevorzugt von 0,45 bis 7 μm, besonders bevorzugt von 3 bis 5 μm.
Der Begriff „hochmolekulare Verbindungen" umfaßt hochmolekulare Proteine und hochmolekulare proteinartige Verbindungen sowie Biopolymere, Lipide, Mizellen und Liposomen.
Der Begriff "proteinartige Verbindung(en)" umfaßt (Poly)peptide und Derivate davon, derivatisierte Proteine, rekombinante Proteine und (Poly)peptide, Di-, Tri-, Tetra-, bis Multimere von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, (Multi)proteinkomplexe, Zellorganelle, Fusionsproteine, Viren und Teile davon, wie beispielsweise Hüllproteine, rekombinante Viren und Teile davon, rekombinante Bakteriophagen, wie beispielsweise rekombinante filamentöse Bakteriophagen, und Teile davon, die auf ihrer Oberfläche nicht natürlicherweise vorkommende Antigene tragen. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden rekombinante, filamentöse Bakteriophagen als proteinartige Verbindungen aufgereinigt und/oder isoliert.
Der Begriff "filamentöser Bakteriophage" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sämtliche Phagen, welche eher helikale als eikosaedrische Symmetrie aufweisen. Der filamentöse Bakteriophage kann ein Klasse I-Phage, wie z.B. fd-, M13-, f1-, Ifl-, Ike-, ZJ/Z- oder Ff-Phage sein oder ein Klasse Il-Phage, wie z. B. Xf-, Pf1- oder Pf3-Phage sein. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die proteinartige Verbindung der filamentöse Bakteriophage M13.
Unter "nicht natürlicherweise vorkommende Antigene" im Zusammenhang mit dieser Erfindung werden Antigene, wie z.B. Proteine, verstanden, die nicht in den Capsiden der Wildtyp-Formen filamentöser Bakteriophagen vorkommen. Es handelt sich hierbei um Antigene, welche rekombinant durch den Phagen exprimiert und in das Capsid eingebaut werden können, oder welche chemisch beispielsweise an das Capsid gebunden werden können.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das rekombinante exprimierte Protein auf dem Bakteriophagen ein Fusionsprotein mit dem Protein III und/oder dem Protein VIII des Bakteriophagens.
Das Antigen muß ein Fusionsprotein mit einem Phagenprotein sein, wenn es auf dem Phagen rekombinant exprimiert werden soll. Sonst kann es nicht eingebaut werden. Im Falle des Proteins III reicht auch ein Teil dieses Proteins aus, da sich dieses am Kopf des Phagen befindet und nur an einem Ende mit dem Phagen verbunden ist. Beim Protein VIII ist das gesamte Protein notwendig, weil sonst kein Einbau in den Phagen erfolgen kann (p VIII ist relativ klein und bildet die Hülle des Phagen). Der Vorteil des Einbaues des Antigens durch rekombinante Expression als Fusionsprotein ist, daß die Präsentation auf der Phagenoberfläche gerichtet bzw. genau definiert ist.
Unter "Aufreinigung von hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, beispielsweise rekombinante, filamentöse Bakteriophagen", ist im Sinne dieser Erfindung zu verstehen, daß mindestens 97%, vorzugsweise mindestens 98%, besonders bevorzugt mindestens 99% und am meisten bevorzugt mindestens 99,8% der durch das Verfahren zu reinigenden Proteine oder proteinartigen Verbindungen vorliegen.
Unter "Isolierung von hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, beispielsweise rekombinante, filamentöse Bakteriophagen" ist in dieser Erfindung zu verstehen, daß alle durch das Verfahren gereinigten hochmolekularen Verbindungen im wesentlichen rein sind. Vorzugsweise enthalten die isolierten hochmolekularen Verbindungen keine kontaminierenden Proteine, wie beispielsweise im Fall von isolierten Bakteriophagen keine kontaminierenden E. coli -Proteine, und/oder keine Nährmediumbestandteile mehr. ln einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden rekombinante, Antigen-tragende Bakteriophagen aufgereinigt und/oder isoliert, wobei es überraschenderweise möglich ist, mindestens 1x1013 Antigen- tragende Bakteriophagen pro 50 bis 100 cm2 Membranfläche aus einem Gemisch, welches sowohl Wildtyp-Bakteriophagen als auch Antigen-tragende Bakteriophagen enhält, aufzureinigen und/oder zu isolieren.
Aufgrund der überraschenderweise hohen Menge an aufgereinigtem Material pro Flächeneinheit der Membran kombiniert mit der hohen Reinheit, welche die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren aufgereinigten und/oder isolierten hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, aufweisen, ist es möglich, diese in großtechnischem Maßstab als Impfstoffe herzustellen und einzusetzen. Das trifft insbesondere für die rekombinanten Bakteriophagen zu. Die unerwarteten Vorteile der Erfindung zeichnen sich besonders durch eine im Tierversuch wesentlich höhere Wirksamkeit im Vergleich zu den nicht gereinigten Bakteriophagen aus. Die Erprobung der Wirksamkeit eines Impfstoffes sind dem Fachmann bekannt und somit Stand der Technik.
Das Prinzip der Metallionen-Affinitätschromatographie beruht auf der Metallchelat- Bildung bzw. Komplexbildung zwischen Metallionen wie Cu2+, Ni2+, Zn2+ und Co3+, und dem zu reinigenden Protein, welches vorzugsweise eine Abfolge von 5 bis 6 Histidinresten ("His-Tag") oder mehrer solcher Einheiten hintereinander, aufweist. Das Metallion kann über einen weiteren Komplexbildner an die Membranmatrix gekoppelt sein. Das Prinzip dahinter ist, dass viele Metalle, wie Kupfer und Zink, und deren Ionen Koordinationskomplexe mit den Aminosäuren Histidin, Cystein und Tryptophan über Elektronendonatorgruppen der Seitenketten der Aminosäuren bilden können. Um diesen Effekt für die Chromatographie nutzen zu können, müssen diese Metallionen auf einer inerten Matrix immobilisiert werden. Dies kann durch Aufbringen einer chelatbildenden Gruppe auf die Matrix erreicht werden. Von besonderer Bedeutung ist zum Gebrauch solcher Gruppen, dass sie auf der Matrix fixiert sind und eine hohe Affinität zur zu reinigenden Substanz aufweisen. Der gebräuchlichste chelatbildende Ligand in dieser Art der Chromatographie ist Iminodiessigsäure (IDA). Sie bildet ein Chelat (mehrfache Koordinationsstellen) mit Metallen. Die gebräuchlichsten Metalle sind Kupfer und Zink, aber auch andere, wie Kobalt, Nickel, Eisen, Lanthan, Mangan und Calcium sind beschrieben worden. Der His-Tag kann sich im Protein am N-Terminus, am C-Terminus oder auch intern befinden. Das Besondere bei der erfindungsgemäßen Reinigung von rekombinanten Bakteriophagen ist, daß es sich dabei nicht um ein einzelnes Protein handelt, sondern um einen Phagenpartikel, das aus tausenden Proteinen besteht oder um Phagenpartikelfragmente, die aus kleineren Multimeren bestehen und eine sehr ungewöhnliche Form besitzen.
Ein "Tag" im Sinne der Erfindung ist ein Bindungspartner, welcher mit dem zu reinigenden Protein oder proteinartigen Verbindung ein Fusionsprotein bildet, wobei die spezifische Interaktion dann zwischen dem Tag und einem für den Tag spezifischen Metallion stattfindet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Tag ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus His-Tag, Flag-Tag und Myc-Tag.
Weiterhin sind nativ auftretende Proteinmotive mit Metallchelateigenschaften, wie z.B. sog. Zinkfingermotive von Transkriptionsfaktoren als tags im Sinne der Erfindung zu verstehen, da sie in der Lage sind, eine spezielle Interaktion mit Metallionen auszuführen.
Die Form der erfindungsgemäß verwendeten Metallionen-enthaltenden Membran unterliegt keiner besonderen Einschränkung und sie kann in einem Gehäuse, beispielsweise einem Kunststoffgehäuse oder einer Chromatographiesäule angeordnet sein. Bevorzugt ist eine flächige Ausbildung der Metallionen- enthaltenden Membran, wobei in einer Packung für eine Chromatographie-Säule mehrere Lagen der Metallionen-enthaltenden Membran übereinander angeordnet sein können.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann vor Schritt (a) ein die zu reinigenden und/oder isolierenden hochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemisch einer lonenaustauscherchromatographie zur Entfernung von Verunreinigungen unterzogen werden. Vorzugsweise wird die lonenaustauscherchromatographie unter Verwendung einer lonenaustauschermembran durchgeführt. Die lonenaustauschermembran umfaßt vorzugsweise ein Matrixmaterial, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen, modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden, Polyamiden, z.B. Nylon, Cellulose, modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestern, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen Die lonenaustauschermembran weist vorzugsweise eine Porengröße im Bereich von 0,01 bis 12μm, bevorzugt von 0,45 bis 7μm, besonders bevorzugt von 3 bis 5μm auf. Die funktioneilen Gruppen der lonenaustauschermembran unterliegen keiner besonderen Einschränkung und sie sind beispielsweise entsprechend dem zu reinigenden Protein oder der zu reinigenden proteinartigen Verbindung angepaßt. Bevorzugte Beispiele für funktionelle Gruppen sind DEAE, DEA, CM, QA, TMA, S, SP und Phosphat- Gruppen.
Als Beispiele für Verunreinigungen, die über lonenaustauschchromatographie, z. B. durch Bindung an die lonenaustauschmembran, entfernt werden können, sind insbesondere Endotoxine anzuführen, die beispielsweise bei rekombinanter Herstellung von Proteinen oder proteinartigen Verbindungen wie rekombinante filamentöse Bakteriophagen, von dem Wirtsorganismus, z. B. E. coli, stammen.
Es ist ferner möglich, daß Verfahren so zu optimieren, daß vor der Affinitätsmembranchromatographie und/oder vor der lonenaus- tausch(membran)chromatographie möglichst viele Verunreinigungen beispielsweise durch im Stand der Technik bekannte Fällungsschritte oder im Stand der Technik bekannte Filtrationsschritte weiter reduziert werden, um so den Kontaminationsgrad so gering wie möglich zu halten. Dies reduziert die Wahrscheinlichkeit an unerwünschten Nebenwirkungen beim Einsatz als biologisch wirksame Substanz, insbesondere als Impfstoff. ln einer bevorzugten Ausführungsform wird das Gemisch, welches beispielsweise das zu reinigende Protein oder die zu reinigende proteinartige Verbindung, wie rekombinante filamentöse Bakteriophage enthält, vor der Affinitätsmembranchromatographie und/oder der lonenaustausch(membran)chromatographie einer Filtration unter Verwendung von im Handel erhältlichen Filtrationssysteme, wie das Crossflow- Mikrofiltrationssystems der Fa. Sartorius unterzogen. Dabei wird in einer geeigneten Einspannvorrichtung beispielsweise eine Filterkassette mit einer Hydrosart®-Membran mit einer nominellen Porenweite von 0,45 μm oder 0,2 μm verwendet. Der Betrieb solcher Systeme ist dem Fachmann bekannt. Durch die Filtration können weitere Verunreinigungen, wie der Wirtsorganismen oder Bestandteilen davon, entfernt werden. Das so erhaltene Filtrat kann dann, gegebenenfalls nach geeigneter, herkömmlicher Aufbereitung, für die lonenaustauschchromatographie und/oder Affinitätsmembranchromatographie eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann als "batch"-Verfahren oder kontinuierlich durchgeführt werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Weiterformulierung der aufgereinigten und/oder isolierten hochmolekularen Verbindung, z. B. ein Protein oder eine proteinartige Verbindung, als Impfstoff. Beispielsweise werden Phagen nach der Reinigung gegen PBS dialysiert und anschließend werden die Proteinkonzentration, die PFU, die Endotoxinkonzentration und die Antigenmenge bestimmt. Vorzugsweise werden die Endotoxinkonzentration und die Antigenmenge mit dem LAL-Test bzw. mit einem Immun-Dot-Blot bestimmt. Die Konzentration wird durch Verdünnung auf das gewünschte Maß eingestellt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren unter GMP-Bedingungen durchgeführt, wobei GMP "good manufacturing practice" bedeutet und dem Fachmann bekannt und somit Stand der Technik ist. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten hochmolekularen Verbindungen, wie Proteine oder proteinartige Verbindungen, vorzugsweise rekombinante filamentöse Bakteriophagen, als biologisch bzw. pharmakologisch wirksame Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, beispielsweise einen Impfstoff, welche gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel umfaßt. Beispiele geeigneter Träger oder Verdünnungsmittel sind dem Fachmann bekannt und umfassen z.B. Phophat-gepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen wie' z.B. Öl/Wasseremulsionen, verschiedene Arten von Netzmitteln oder Detergenzien, sterile Lösungen, etc. Zusammensetzungen, die solche Träger und/oder Verdünnungsmittel umfassen, können mittels bekannten herkömmlichen Verfahren hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können einem Individuum in geeigneter Dosierung verabreicht werden. Eine Verabreichung kann oral oder parenteral erfolgen, z.B. auf intravenösem, intraperitonealem, subkutanem, perinodalem, intramuskulärem, topischem, intradermalen, intranasalem oder intrabronchialem Weg oder über einen Katheder in eine Arterie. Die Höhe der Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt im wesentlichen von den klinischen Faktoren ab. Diese Faktoren sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise die Körpergröße bzw. das Gewicht, die Körperoberfläche, das Alter, das Geschlecht und den allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten, die spezielle zu verabreichende Zusammensetzung, die Behandlungsdauer, die Art der Verabreichung und die eventuelle gleichzeitige Behandlung mit einem anderen Arzneimittel. Eine typische Dosis kann z.B. in einem Bereich zwischen 0,001 und 5000 μg liegen, wobei Dosen unterhalb oder oberhalb dieses beispielhaften Bereiches, vor allem unter Berücksichtigung der oben erwähnten Faktoren, vorstellbar sind. Im allgemeinen sollte sich bei regelmäßiger Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung die Dosis in einem Bereich zwischen 1 μg- und 10 mg- Einheiten pro Tag befinden. Wird die Zusammensetzung intravenös verabreicht, was nicht bevorzugt empfohlen wird, um die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktion zu minimieren, sollte sich die Dosis vorzugsweise in einem Bereich von etwa 1 μg bis etwa 10 mg Einheiten pro kg Körpergewicht pro Minute befinden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann lokal oder systemisch verabreicht werden. Präparate für eine parenterale Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht- wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie z.B. Olivenöl, und organische Esterverbindungen wie z.B. Ethyloleat, die für Injektionen geeignet sind. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische wässrige Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Salzlösungen und gepufferte Medien. Parenterale Träger umfassen Natriumchlorid-Lösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose, Natriumchlorid, Ringer-Laktat und gebundene Öle. Intravenöse Träger umfassen z.B. Flüssigkeits-, Nährstoff-, und Elektrolyt-Ergänzungsmittel (wie z.B. solche, die auf Ringer-Dextrose basieren). Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann außerdem Konservierungsmittel und andere Zusätze umfassen, wie z.B. antimikrobielle Verbindungen, Antioxidantien, Komplexbildner und inerte Gase. Des weiteren können, abhängig von der beabsichtigten Verwendung, Verbindungen wie z.B. Interleukine, Wachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren, Interferone, chemotaktische Proteine oder ein unspezifisches immunmodulatorisches Agens erhalten sein.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt eine graphische Darstellung der Wasch- und Elutionsschritte einer lonenaustausch-Chromatographie. Das erste Signal enthält die Hauptfraktion von Endotoxinen und das zweite Signal enthält im wesentlichen die Phagen. Die gestrichelte Linie stellt den NaCI-Gradienten dar.
Fig. 2 ist eine photographische Abbildung eines Dot-Blots hinsichtlich der Aufreinigung von rekombinanten M13/fd-Phagen mit His-Tag/g8- Fusionsproteinen, wobei zur immunologischen Detektion monoklonale Peroxidase-konjugierte/Anti-polyhistidin-Antikörper verwendet werden. Verdünnungsreihe von links nach rechts: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800; T=total; FT=Durchfluß; W1 , W2, W3=jeweilige Waschschritte; E1, E2, E3=jeweilige Elutionsschritte; WT-Wildtyp-Phage (vgl. Beispiel 4).
Fig. 3 ist eine photographische Abbildung eines Dot-Blots hinsichtlich der Aufreinigung von rekombinanten M13/fd-Phagen mit His-Tag/g8- Fusionsproteinen, wobei zur immunologischen Detektion monoklonale Peroxidasekonjugierte/Anti-polyhistidin-Antikörper verwendet werden. Verdünnungsreihe von links nach rechts: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800; T=total; FT=Durchfluß; W1 , W2, W3=jeweilige Waschschritte; E1 , E2, E3=jeweilige Elutionsschritte; WT-Wildtyp-Phage (vgl. Beispiel 4). (A) Als Chromatopgraphiematerial werden im Handel erhältlich Ni2+"Agarosebeads verwendet. (B) Als Chromatographiematerial wird eine erfindungsgemäße Cu2+-enthaltende Membran verwendet.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung ohne Beschränkung des Schutzbereichs. Beispiele
Beispiel 1 : Cross-flow-Filtration von Bakteriophage M13-haltigen Lösungen bzw. Suspensionen. 2 L einer Bakteriophagen M13-Züchtung werden einer Cross-flow- Filtration unter Verwendung einer Hydrosart-Membran (Porengröße 0,4 μm) von Sartorius filtriert.
Die Ergebnisse zeigen, dass mit der einstufigen Methode der Cross-flow-Filtration ein Phagentiter von 8x104 Phagen/L erhalten werden kann, was ungefähr dem Ergebnis einer Isolierung der Phagen unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten zweistufigen Methode „Zentrifugation und PEG/NaCI-Präzipitation" entspricht. Ferner können mit der Cross-flow-Filtration Kontaminationen mit Bakterienzellen im wesentlichen verhindert werden. Somit wird mit der Cross-flow-Filtration eine einfache und schnelle Methode zur Abtrennung von Phagen von Bakterienzellen bereitgestellt, die eine mindestens gleich gute Ausbeute wie die im Stand der Technik bekannte Methode „Zentrifugation und PEG/NaCI- Präzipitation" liefert. Der Endotoxin-Gehalt der durch Cross-flow- Filtration erhaltenen Phagen entspricht ungefähr dem der Methode „Zentrifugation und PEG/NaCI-Präzipitation".
Beispiel 2: Inonenaustausch-Chromatographie von Baktiophage M13-haltigen Lösungen bzw. Suspensionen.
2 mL einer 7 mg M13-Phagen enthaltenden Lösung, welche aus Beispiel 1 stammt, werden einer lonenaustauschchromatographie unter Verwendung einer von Sartorius erhältlichen lonenaustausch-Membran Q75 bei 4°C unterzogen. Die Bindung der Phagen an die Membran erfolgt mit einem Bindungspuffer (PBS, pH7). Zur Elution der ebenfalls an die Membran gebundene Endotoxine wird die Membran mit einem Waschpuffer (PBS, 0,1 % (v/v) Triton X-114, pH7) gewaschen. Die an die Membran gebundenen Phagen werden danach mit einem Elutionspuffer (PBS, kontinuierlicher Gradient: 150 mM bis 1 M NaCI, pH6) eluiert (vgl. auch Fig. 1). Die einzelnen Schritte der lonenaustausch- Chromatographie werden durch Bestimmung der Phagen (mittels quantitativem ELISA) -und Endotoxin (mittels LAL-Test)- Konzentrationen analysiert.
Mit der lonenaustausch-Chromatographie kann zwar eine Abreicherung der Endotoxine erhalten werden kann, aber eine vollständige Entfernung ist nicht möglich. Beispiel 3: Beladen der mikroporösen Membran Sartobind®, IDA Typ 19442 aus regenerierter Cellulose, welche mit einem Vlies verstärkt wurde, mit Cu2+-lonen (IDA=lmidodiessigsäure).
Die regenerierte Cellulose ist durch Einführung bifunktioneller chemischer Gruppen gegenüber enzymatischem und chemischem Abbau stabilisiert worden. Des weiteren wurden Polymethacrylatketten aufgepfropft, wobei die einzenen Monomere jeweils eine Epoxygruppierung enthalten. An diese wurden chemisch Iminodiessigsäuregruppen gekoppelt. Die Membran ist 275 +/- 27μm dick und weist eine Durchflussrate von mehr als 80ml/min-bar auf, wenn schwach gepufferte wässrige Salzlösungen im pH-Bereich von 5 bis 9 verwendet werden. Die nominelle Porengröße liegt im Bereich von 3 bis 5 μm. Die in einem Kunststoffgehäuse angeordnete Membran wird mit einer 50 mL Spritze ohne Kolben verbunden und nacheinander mit 3 mL deionisiertem Wasser, 4 mL vorgefilterter 0,3 M CuCI2-Lösung, 3 ml deionisiertem Wasser und 5 ml PBS behandelt bzw. gewaschen. Die so behandelte Membran ist nun gebrauchsfertig für eine Affinitätschromatographie.
Beispiel 4: Affinitätschromatographische Aufreinigung von rekombinanten Phagen unter Verwendung von einer Cu2+-enthaltender Membran.
2 mL einer M13/fd-Phagensuspension (in PBS), welche rekombinante Phagen mit His-Tag/g8-Fusionsproteinen auf der Oberfläche enthält, wird mit einer peristaltischen Pumpe bei einer Flußrate von 0,25 mL/min auf die gemäß Beispiel 3 erhaltene Cu2+-enthaltende Membran aufgebracht. Die Membran wird danach dreimal mit 5 mL PBS (W1 , W2, W3) bei einer Flußrate von 0,5 mL/min gewaschen und anschließend werden die an die Membran gebunden rekombinanten Phagen nacheinander mit 2 mL 20 mM EDTA, 2 mL 40 mM EDTA und 20 mL 80 mM EDTA jeweils bei einer Flußrate von 0,25 mL/min eluiert (E1 , E2, E3). Die affinitätschromatographische Aufreinigung wurde mit einem Dot-Blot unter Verwendung von monoklonalen Peroxidase-konjugierten/Anti-polyhistidin- Antikörpem analysiert. Wie aus Fig. 2 deutlich ersichtlich ist, werden die rekombinanten Phagen spezifisch an die Cu2+-enthaltende Membran gebunden und mittels EDTA eluiert.
Die verwendete Membran kann durch ausreichendes Waschen mit 0,5 M EDTA zur Entfernung der Cu2+-lonen, Waschen mit PBS/5 % SDS in umgekehrter Richtung und ausreichendes Waschen mit deionisiertem Wasser zur Entfernung von SDS wiederverwendet werden oder bei 4 °C in einem versiegelten Behältnis gelagert werden.
Vergleichsbeispiel 1 : Affinitätschromatographische Aufreinigung von rreekkoommbbiinnaanntteenn Phagen unter Verwendung von Ni2+- Agarosebeads.
Im Handel erhältliche Ni2+-Agarosebeads (Fa. Amersham) werden gemäß dem Protokoll der Herstellerin mit den in Beispiel 4 beschriebenen rekombinanten Phagen beladen, über Nacht inkubiert und anschließend eluiert.
Als Ergebnis ist festzuhalten, daß die über Ni2+-Agarosebeads (siehe Dot-Blot in Fig. 3(A) erzielte Aufreinigung von rekombinanten Beaktriophagen mit den Ni2+- Agarosebeads deutlich schlechter ist als die in Fig. 3(B) dargestellte Aufreinigung mit der erfindungsgemäß verwendeten Cu2+-Membran.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Aufreinigung und/oder Isolierung von in einer Lösung oder Suspension enthaltenen hochmolekularen Verbindungen mit der Fähigkeit zur Metallchelat-Bildung, umfassend die Schritte: (a) Aufbringen der Lösung oder Suspension auf eine Metallionen- enthaltende Membran und (b) affinitätschromatographische Abtrennung der hochmolekularen Verbindungen durch deren Bindung an die Metallionen-enthaltende Membran.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die hochmolekularen Verbindungen ein Molekulargewicht von größer als 1x106 Da aufweisen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die hochmolekularen Verbindungen aus der Gruppe, bestehend aus hochmolekularen Proteinen, hochmolekularen proteinartigen Verbindungen, hochmolekularen Biopolymeren, hochmolekularen Lipiden, Mizellen mit einem hohen Molekulargewicht und Liposomen mit einem hohen Molekulargewicht, ausgewählt sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Metallionen aus der GGrruuppppee,, bbeesstteehheenndd aauuss CCuu22++,, NNii22++, Zn2+, Co + ,Fe3+, Mn2+ und Ca2+ und Gemischen davon, ausgewählt sind
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Metallion Cu2+ ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Membran ein Matrixmaterial, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen, modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethem, Polyacrylamiden, Polyamiden, Cellulose, modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestem, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen .
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Metallionen- enthaltende Membran eine Porengröße im Bereich von 0,01 bis 12 μm, bevorzugt von 0,45 bis 7 μm, besonders bevorzugt von 3 bis 5 μm aufweist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die hochmolekularen proteinartigen Verbindungen aus der Gruppe, bestehend aus (Poly)peptiden und Derivaten davon, derivatisierten Proteinen, rekombinanten Proteinen und (Poly)peptiden, Di-, Tri-, Tetra-, bis Multimeren von Peptiden, Polypeptiden oder Proteinen, (Multi)proteinkomplexen, Zellorganellen, Fusionsproteinen, Viren oder Teilen davon, rekombinanten Viren oder Teilen davon und rekombinanten Bakteriophagen oder Teilen davon, ausgewählt sind.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin vor Schritt (a) ein die hochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemisch einer lonenaustauschchromatographie zur Entfernung von Verunreinigungen unterzogen wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die lonenaustauschchromatographie unter Verwendung einer lonenaustauschermembran durchgeführt wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die lonenaustauschermembran ein Matrixmaterial, ausgewählt aus άer Gruppe, bestehend aus Agarosen, modifizierten Agarosen, modifizierten Dextranen, Polystyrolen, Polyethern, Polyacrylamiden, Polyamiden, Cellulose, modifizierten Cellulosen wie vernetzten Cellulosen, Nitrocellulosen, Celluloseacetaten, Silikaten und Poly(meth)acrylaten, Polytetrafluorethylen, Polyestem, Polyvinylchloriden, Polyvinylidenfluorid, Polypropylen, Polysulfonen und Polyethersulfonen umfaßt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , wobei die lonenaustauschermembran eine Porengröße im Bereich von 0,01 bis 12 μm, bevorzugt von 0,45 bis 7 μm, besonders bevorzugt von 3 bis 5 μm aufweist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die funktionellen Gruppen der lonenaustauschermembran aus der Gruppe, bestehend aus DEAE, DEA, CM, QA, TMA, S, SP und Phosphat-Gruppen, ausgewählt sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, wobei die Verunreinigungen bakterielle Endotoxine, Nährmediumbestandteile und Verunreinigungen von Nährmediumbestandteilen umfassen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin vor Schritt (a) und/oder vor der lonenaustauschchromatographie gemäß einem der Ansprüche 9 bis 14 ein die hochmolekularen Verbindungen enthaltendes Gemisch einer Filtration unter Verwendung einer Filtrationsmembran zur Entfernung von weiteren Verunreinigungen unterzogen wird.
16. Verwendung der gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 aufgereinigten und/oder isolierten hochmolekularen Verbindungen als biologisch wirksame Bestandteile in einer pharmazeutischen Zusammensetzung welche gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Verdünnungsmittel enthält.
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