DE60115383T2

DE60115383T2 - Hochreine lipopeptide, lipopeptid mizellen, deren herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE60115383T2
Application number: DE60115383T
Authority: DE
Inventors: J. Thomas KELLEHER; Jan-Ji Lai; P. Joseph DECOURCEY; D. Paul LYNCH; Maurizio Zenoni; R. Auro TAGLIANI
Original assignee: Cubist Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Cubist Pharmaceuticals LLC
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2021-01-19
Also published as: RU2311460C9; EP1586580B1; PT1586580E; HK1054240A1; US20120149062A1; CA2743326C; EP2264047B1; EP2940036B1; IL219889A; EP1586580A3; BRPI0107731B1; IL226636A0; CN102229650A; US20130280760A1; BRPI0107731B8; HK1217205A1; KR20120065440A; US20050009747A1; EP2940034B1; CZ307877B6

Description

Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer hochreinen Form des Lipopeptids Daptomycin. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Micellen des Lipopeptids. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung der Lipopeptid-Micellen aus nicht-assoziierten Monomeren des Lipopeptids und zur Umwandlung von Lipopeptid-Micellen in nicht-assoziierte Monomere. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von Lipopeptiden unter Verwendung von Micellen, das leicht der gewerblichen Produktion angepasst werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Die schnelle Zunahme der Inzidenz von Gram-positiven Infektionen – einschließlich solcher, die von Antibiotika-resistenten Bakterien verursacht sind – hat neues Interesse an der Entwicklung neuer Klassen von Antibiotika ausgelöst. Eine solche Klasse sind die Lipopeptid-Antibiotika, die Daptomycin umfassen. Daptomycin weist eine starke bakterizide Wirkung in vitro gegen klinisch bedeutsame Gram-positive Bakterien, die ernste und lebensbedrohliche Krankheiten verursachen, auf. Diese Bakterien umfassen resistente Pathogene wie z. B. Vancomycinresistente Enterokokken (VRE), Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA), Glycopeptidintermediat-empfindlicher Staphylococcus aureus (GISA), Coagulase-negative Staphylokokken (CNS) und Penicillin-resistenter Streptococcus pneumoniae (PRSP), für die es nur sehr wenige therapeutische Alternativen gibt; siehe beispielsweise Tally et al., 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8: 1223–1238, nachstehend als „Tally" bezeichnet. Bei der inhibitorischen Wirkung von Daptomycin handelt es sich um eine schnelle, konzentrationsabhängige bakterizide Wirkung in vitro und in vivo sowie eine vergleichsweise lang anhaltende konzentrationsabhängige post-antibiotische Wirkung in vivo.
Daptomycin wurde von Baltz in Biotechnology of Antibiotics, 2. Auflage, herausgegeben von W. R. Strohl (New York: Marcel Dekker, Inc.), 1997, Seiten 415–435, nachstehend als „Baltz" bezeichnet, beschrieben. Bei Daptomycin, das auch als LY146032 bekannt ist, handelt es sich um ein cyclisches Lipopeptid-Antibiotikum, das durch die Fermentation von Streptomyces roseosporus gewonnen werden kann. Daptomycin gehört zu den Antibiotika vom Faktor A-21978C₀-Typ von S. roseosporus und besteht aus einer Decanoyl-Seitenkette, die an das N-terminale Tryptophan eines cyclischen Peptids mit 13 Aminosäuren gebunden ist (1). Daptomycin weist ein hervorragendes Aktivitätsprofil auf, da es hochwirksam gegen die meisten Gram-positiven Bakterien ist; hochbakterizid und schnellwirkend ist; eine geringe Resistenzrate aufweist und gegen Antibiotika-resistente Organismen wirksam ist. Die Verbindung wird gegenwärtig in einer Vielfalt von Formulierungen zur Behandlung von ernsten Infektionen durch Bakterien, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) und Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE), entwickelt.
Mehrere US-Patente beschreiben A-21978C-Antibiotika und Derivate davon, einschließlich Daptomycin (LY146032), sowie Verfahren zur Herstellung und Isolierung der A-21978C-Antibiotika und von Derivaten davon.
Die US-Patente Re. 32,333, Re. 32,455 und 4,800,157 beschreiben ein Verfahren zur Synthese von Daptomycin durch Kultivieren von Streptomyces roseosporus NRL15998 unter eingetauchtaeroben Fermentationsbedingungen. Das US-Patent 4,885,243 beschreibt ein verbessertes Verfahren zur Synthese von Daptomycin durch Zugeben einer Decan-Fettsäure oder von einem Ester oder Salz davon zu einer Fermentationskultur.
Die US-Patente Re. 32,310, Re. 32,311, 4,537,717, 4,482,487 und 4,524,135 beschreiben Verfahren zum Entacylieren des A-21978C-Antibiotikums und erneutem Acylieren des Peptidkerns und von antibiotischen Derivaten, die mit diesem Verfahren hergestellt sind. Alle diese Patente beschreiben einen gereinigten entacylierten Kern des A-21978C-Antibiotikums oder eines Derivats davon, das durch Filtration aus der Fermentationsbrühe isoliert und dann durch Diaion HP-20-Chromatographie und Silicagel/C18-Chromatographie gereinigt worden ist.
Die US-Patente Re. 32,333 und Re. 32,455 offenbaren ein Reinigungsverfahren, bei dem ein Filtrat der gesamten Fermentationsbrühe durch mehrere Schritte von Präzipitation und Extraktion gereinigt wurde, um einen rohen A-21978C-Komplex zu erhalten. Der Rohkomplex wurde mit Ionenaustausch-Chromatographie auf IRA-68 und zwei Zyklen Silicagel-Chromatographie weiter gereinigt. Einzelne Faktoren von A-21978C wurden durch Umkehrphasen-Silicagel oder Silicagel/C18 getrennt. Die US-Patente Re. 32,333 und Re. 32,455 offenbaren auch, dass A-21978C durch diskoninuierliche Chromatographie unter Verwendung von Diaion HP-20-Harz, gefolgt von Silicagel-Säulenchromatographie, gereinigt werden kann.
Das US-Patent 4,874,843 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Daptomycin, bei dem die Fermentationsbrühe filtriert und durch eine Säule mit HP-20-Harz geleitet wurde. Nach dem Eluieren wurde das halbgereinigte Daptomycin durch eine Säule mit HP-20ss geleitet und anschließend erneut auf HP-20-Harz aufgetrennt. Das Patent '843 erwähnt, dass die abschließende Auflösung und Trennung des Daptomycins von strukturell ähnlichen Verbindungen bei diesem Verfahren durch Verunreinigungen, die nicht durch Ultraviolett-Analyse der Fermentationsbrühe identifizierbar sind, erschwert ist. Das Patent '843 erwähnt ferner, dass Versuche, diese Verunreinigungen mit Umkehrphasen-Chromatographie auf Silicagel, Normalphasen-Chromatographie auf Silicagel oder Ionenaustausch-Chromatographie zu entfernen, die Reinheit des Daptomycins ebenfalls nicht wesentlich verbessern konnten. Das Patent '843 beschreibt auch ein „Umkehrverfahren" zur Reinigung, umfassend die Schritte des Inkontaktbringens einer wässrigen Lösung des Fermentationsprodukts mit einem nicht-funktionellen Harz in wässriger Lösung, des physikalischen Entfernens des Wassers von dem beladenen Harz, des Wiederbenetzens des beladenen Harzes mit einem polaren organischen Lösungsmittel, des Waschens des Harzes mit dem organischen Lösungsmittel, des Eluierens des Fermentationsprodukts von dem Harz durch Erhöhen der Polarität des Lösungsmittels sowie des Gewinnens des Fermentationsprodukts. Das Patent '843 lehrt, dass dieses Verfahren die Endreinheit von etwa 80% auf etwa 93% verbessert und die Ausbeute von etwa 5% auf etwa 35% steigert; das Patent '843 offenbart jedoch nicht, welche Art von Verunreinigungen in der Daptomycinzubereitung vorhanden ist.
Das US-Patent 5,912,226 beschreibt den Nachweis und die Isolierung von zwei Verunreinigungen, die bei der Herstellung von Daptomycin anfallen. Daptomycin, bei dem es sich um ein α-Aspartylpeptid handelt, erfährt die Bildung eines trans-Peptids und bildet dabei ein stabiles Intermediat, bei dem die Aspartylgruppe zu einer Anhydrosuccinimidgruppe wird (3). Das Patent '226 beschreibt, dass das Vorhandensein dieses als Anhydrodaptomycin bezeichneten Intermediats bei einem pH-Wert von 4–6 stärker ausgeprägt ist. Erneute Hydrierung der Anhydrosuccinimidform führt zu einem zweiten Abbauprodukt, das eine β-Aspartylgruppe enthält und als „β-Isomerform" von Daptomycin bezeichnet wird (2).
Das Patent '226 offenbart, dass das t-BOC-Derivat von Anhydrodaptomycin mit Chromatographie über eine Umkehrphasen-Silicagel/C-18-Säule isoliert, ausgefällt und mit Umkehrphasen-Silicagel/C-18-Chromatographie erneut gereinigt werden kann. Das Patent '226 beschreibt auch, dass die β-Isomerform von Daptomycin mit Chromatographie über einem Diaion-HP-20ss-Harz gereinigt, mit Chromatographie über einem Diaion-HP-20-Harz entsalzt und unter Verwendung einer Umkehrphasen-C-18-Säule, gefolgt von einer HP-20-Harz-Säule im Umkehrmodus, weiter gereinigt werden kann.
Kirsch et. al. (Pharmaceutical Research, 6: 387–393, 1989, nachstehend als „Kirsch" bezeichnet) erwähnten, dass bei der Reinigung von Daptomycin Anhydrodaptomycin und das β-Isomer anfielen. Kirsch beschrieb Verfahren zum Minimieren der Mengen an Anhydrodaptomycin und des β-Isomers durch Manipulieren der pH-Wert- und Temperaturbedingungen. Es war Kirsch jedoch nicht möglich, Daptomycin zu stabilisieren und die Umwandlung von Daptomycin in Anhydrodaptomycin und dessen nachfolgende Isomerisierung in das β-Isomer zu verhindern. Ferner war es Kirsch auch nicht möglich, den Abbau von Daptomycin zu anderen Abbauprodukten, die nicht mit Anhydrodaptomycin und dem β-Isomer verwandt sind, zu verhindern.
Das Patent '226 erwähnt, dass Daptomycin unter Verwendung dieser Verfahren so hergestellt werden kann, dass das Daptomycin nicht mehr als 2,5 Gew.-% an Gesamtmenge von Anhydrodaptomycin und β-Isomer enthält, es gibt jedoch keinen Hinweis auf die Mengen anderer Verunreinigungen. Bei dem im US-Patent 4,874,843 gelehrten Verfahren und bei Zubereitungen von Daptomycin in großem Maßstab für klinische Versuche betrugen die höchsten beobachteten Reinheitsgrade des Daptomycins etwa 90% bis 93%. Es besteht Bedarf an einem gewerblich durchführbaren Verfahren zur Herstellung von höher aufgereinigtem Daptomycin und, wenn möglich, zur Steigerung seiner Ausbeute nach der Reinigung. Ferner wäre es wünschenswert, gereinigtes Daptomycin, das wenig oder kein Anhydrodaptomycin und wenig oder keine β-Isomerform von Daptomycin enthält, zu erhalten. Es wäre auch wünschenswert, die Mengen mehrerer anderer Verunreinigungen in Daptomycin zu verringern. Es ist jedoch im Stand der Technik kein Verfahren bekannt, von dem gezeigt worden ist, dass es die Mengen von Anhydrodaptomycin, der β-Isomerform und anderer Verunreinigungen in dem Daptomycinprodukt zu verringern vermag.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung widmet sich diesen Problemen, indem sie gewerblich durchführbare Verfahren zur Herstellung von auf hohen Niveaus des gereinigten Lipopeptids Daptomycin bereitstellt. Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden gewerblich durchführbare Verfahren offenbart, die Daptomycin mit einem Reinheitsgrad von 95–97% liefern. Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein gewerblich durchführbares Verfahren offenbart, bei dem die Hauptverunreinigungen Anhydrodaptomycin und β-Isomer sowie andere Verunreinigungen in Daptomycinzubereitungen beinahe vollständig entfernt werden. Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden gewerblich durchführbare Verfahren zur Reinigung von Lipopeptiden, umfassend Daptomycin und ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, offenbart, umfassend das Trennen von Lipopeptid-Micellen von Verunreinigungen mit niederem Molekulargewicht und das Trennen von nicht-assoziierten Lipopeptiden von Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht. Die Erfindung stellt auch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)-Verfahren zur Reinheitsanalyse von Daptomycin und zum Nachweisen und zur Charakterisierung anderer Verunreinigungen in Daptomycin, von denen manche bisher nicht bekannt waren, bereit.
Die Erfindung stellt auch gereinigtes Daptomycin, das eine Reinheit von wenigstens 98% aufweist oder in erheblichem Maß oder im Wesentlichen frei von Anhydrodaptomycin und dem β-Isomer ist, bereit. Die Erfindung stellt gereinigtes Daptomycin, bereit das von Anhydrodaptomycin frei oder im Wesentlichen frei ist und einen viel niedrigere Menge an β-Isomer und anderen Verunreinigungen, als bisher im Stand der Technik erreicht werden konnte, enthält. Die Erfindung stellt auch Lipopeptid-Micellen bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Micelle Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid. Die Erfindung stellt auch Arzneimittel, die Micellen aus hochgereinigtem Daptomycin oder einem hochgereinigten Daptomycin-verwandten Lipopeptid umfassen, sowie Verfahren zur Verwendung dieser Zusammensetzungen bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Struktur von Daptomycin.
2 zeigt die Struktur der Verunreinigung 8, CB-131010 (bereits früher als das β-Isomer identifiziert, LY213846).
3 zeigt die Struktur der Verunreinigung 13, CB-130952 (bereits früher als Anhydrodaptomycin identifiziert, LY 178480).
4 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 1, CB-131012 (bereits früher als LY212218 identifiziert).
5 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 2, CB-131011.
6 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 3, CB-131008 (bereits früher als LY213928 identifiziert).
7 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 4, CB-131006.
8 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 6, CB-130989 (bereits früher als LY213827 identifiziert).
9 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 7, CB-131005.
10 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 12, CB-131009.
11 zeigt die vorgeschlagene Struktur der Verunreinigung 14, CB-131078 (bereits früher als LY109208 identifiziert).
12 zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Massenzubereitung von Daptomycin, umfassend Verunreinigungen 1 bis 14.
13 zeigt ein HPLC-Chromatogramm einer Daptomycinzubereitung nach Reinigung auf einem Poros P150-Harz.
14(a) bis 14(c) zeigen micellare Strukturen. 14(a) zeigt eine sphärische Micelle, bei der die hydrophoben Schwänze von amphipathischen Molekülen auf den Kugelmittelpunkt hin gerichtet sind, während die hydrophilen Köpfe der amphipathischen Moleküle auf das Kugeläußere hin gerichtet sind, wobei sie in Kontakt mit der wässrigen Umgebung steht. 14(a) zeigt ein Beispiel, bei dem die hydrophilen Köpfe negativ geladen sind. 14(b) zeigt eine Lipiddoppelschicht-Struktur, bei der zwei Schichten amphipathischen Moleküle so miteinander verbunden sind, dass die hydrophoben Schwänze der Schichten aufeinander zu gerichtet sind, während die hydrophilen Köpfe auf beiden Seiten der Doppelschicht in Kontakt mit der wässrigen Umgebung stehen. Lipiddoppelschichten können sowohl sphärisch als auch planar sein. 14(c) zeigt ein Liposom, bei dem eine Lipiddoppelschicht wie z. B. die in 14(b) gezeigte, eine sphärische Struktur, die einen wässrigen Innenraum umschließt, bildet. Die hydrophilen Köpfe des Liposoms sind auf den wässrigen Innenraum und auf die äußere wässrige Umgebung hin gerichtet.
15 zeigt die Ergebnisse eines Experiments zur Bestimmung der kritischen Micellenkonzentration (cmc) von Daptomycin bei einem pH-Wert von 4,0.
16 zeigt die mit Lichtstreuung bestimmte Größenverteilung von Daptomycin-Micellen. Die Daptomycin-Micellen weisen eine mittlere Größe von 5,4 nm (54 Å) auf.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Aufgaben der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Lipopeptiden, das leicht der gewerblichen Produktion angepasst werden kann und das eine einzigartige Kombination von Anionenaustausch-Chromatographie und hydrophober Chromatographie umfasst. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung von Daptomycin verwendet, das mehr als 95% rein ist und geringere Verunreinigungsgrade als im Daptomycin, das mit Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt ist, aufweist. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung von Daptomycin unter Verwendung verringerter Lösungsmittelmengen im Vergleich zu denjenigen, die bei Verfahren aus dem Stand der Technik verwendet werden, verwendet. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung von gereinigten Daptomycin-verwandten Lipopeptiden mit einer Reinheit von über 95% verwendet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Steigern der Mengen eines von einem Mikroorganismus hergestellten Lipopeptids durch Zugeben einer verringerten Menge einer Fettsäure zu der Fermentationskultur. Die Verwendung geringerer Decansäuremengen im Vergleich zu denjenigen, die im US-Patent 4,885,243 für die Daptomycinfermentation vorgeschlagen werden, führt zu einer verbesserten Wirtschaftlichkeit zusätzlich zu der Herstellung einer hochreinen Form von Daptomycin oder eines Daptomycinverwandten Lipopeptids. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zum Steigern der Konzentration und der Menge des von Streptomyces roseosporus hergestellten Daptomycins verwendet, wobei zugleich die Herstellung von verwandten Verunreinigungen minimiert wird. Geringere Verunreinigungspegel in der Fermentationsbrühe führen zu einer effizienteren Gewinnung und Reinigung von Daptomycin, wodurch ein Herstellungsverfahren mit einer höheren Ausbeute bereitgestellt wird.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung von Daptomycin oder von Daptomycin-verwandten Lipopeptiden, umfassend die Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographie, die durch einen modifizierten Puffer verstärkt ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung von Daptomycin, das wenigstens 98% rein ist oder das in erheblichem Maß oder im Wesentlichen frei von Anhydrodaptomycin oder dem β-Isomer ist, verwendet. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Reinigung von Daptomycin-verwandten Lipopeptiden auf eine Reinheit von wenigstens 98% verwendet.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines chromatographischen Prozessverfahrens zur Reinigung des Lipopeptids Daptomycin, umfassend eine neue Kombination von Anionenaustausch-Chromatographie, hydrophober Wechselwirkungschromatographie und durch einen modifizierten Puffer verstärkte Anionenaustausch-Chromatographie. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das chromatographische Prozessverfahren zur Reinigung von Daptomycin oder einem Daptomycin verwandten Lipopeptid verwendet. Der modifizierte Puffer ermöglicht in unerwarteter Weise eine Trennung von Anhydrodaptomycin und Daptomycin, die mit Chromatographieverfahren aus dem Stand der Technik bisher nicht möglich war.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Reinigung des Lipopeptids Daptomycin unter Verwendung von Lipopeptid-Micellen, das leicht der gewerblichen Produktion angepasst werden kann. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die bei Reinigungsvorgängen durchgeführte Umwandlung einer Lipopeptidlösung aus einem monomeren nicht-micellaren Zustand in einen micellaren Zustand und wieder zurück. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Unterwerfen der Lipopeptide Bedingungen, bei denen Micellen gebildet werden, und anschließendes Trennen der Lipopeptid-Micellen von Verunreinigungen mit niederem Molekulargewicht durch, beispielsweise, ein Größentrennverfahren. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren das Unterwerfen der Lipopeptide Bedingungen, bei denen die Lipopeptide in monomerer Form vorliegen, und anschließendes Trennen der monomeren Lipopeptidmoleküle von Molekülen mit hohem Molekulargewicht oder Aggregaten durch, beispielsweise, ein Größentrennverfahren. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren beide Schritte: Unterwerfen der Lipopeptide Bedingungen, bei denen Micellen gebildet werden, und Trennen der Lipopeptid-Micellen von Verunreinigungen mit niederem Molekulargewicht, und anschließend Unterwerfen der Lipopeptid-Micellen Bedingungen, bei denen die Lipopeptide in monomerer Form vorliegen, und Trennen der Lipopeptid-Monomere von Molekülen mit hohem Molekulargewicht oder Aggregaten. Diese beiden Schritte können in beiden Reihenfolgen durchgeführt werden. Bei einer sogar noch stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Größentrennverfahren um Ultrafiltration oder um Größenausschlußchromatographie.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von verbesserten Verfahren zur Messung der Reinheit des Lipopeptids Daptomycin mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung des gereinigten Lipopeptids Daptomycin oder eines gereinigten Daptomycin-verwandten Lipopeptids und von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder Formulierungen davon. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, das durch eines der in der Beschreibung beschriebenen Verfahren gereinigt ist, bereit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Lipopeptid-Micellen und pharmazeutisch verträglichen Formulierungen davon. Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Daptomycin-Micellen oder Micellen eines Daptomycin-verwandten Lipopeptids und pharmazeutisch verträgliche Formulierungen davon bereit. Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung auch Verfahren zur Verabreichung der Lipopeptid-Micellen oder von pharmazeutischen Formulierungen davon an Patienten mit Bedarf bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die Lipopeptid-Micellen intravenös, parenteral, intramuskulär oder topisch verabreicht.
Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle technische und wissenschaftliche Begriffe, die hier verwendet werden, die Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet der Erfindung im Allgemeinen verstanden wird. Die Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet, wenn nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren der Chemie, Biochemie und Mikrobiologie sowie die darin verwendete Grundterminologie.
Der Begriff „isoliert" bezeichnet eine Verbindung oder ein Produkt, das heißt ein Produkt, das wenigstens 10%, vorzugsweise wenigstens 20 oder 30%, stärker bevorzugt wenigstens 50%, 60% oder 70%, am stärksten bevorzugt mindestens 80% oder 90% des in dem Gemisch vorhandenen Stoffs darstellt.
Der Begriff „Lipopeptid" bezeichnet Daptomycin oder ein verwandtes Molekül sowie Salze, Ester, Amide und Ether davon. Der Begriff „Lipopeptid" umfasst auch geschützte Formen von Lipopeptiden, bei denen eine oder mehrere Amino-, Carboxylat- oder Hydroxygruppen geschützt sind. Für Beispiele von Schutzgruppen siehe beispielsweise „Protective Groups in Organic Synthesis" von Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, New York, 1981. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid ein Antibiotikum. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Lipopeptid um LY303366, ein Echinocandin, ein Pneumocandin, ein Aculeacin, Surfactin, Plipastatin B1, Amphomycin oder das im US-Patent 5,629,288 offenbarte Lipopeptid-Derivat. Diese Lipopeptide sind im Stand der Technik bekannt; siehe beispielsweise das US-Patent 5,202,309 und die internationale PCT-Anmeldung WO 00/08197. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid ein Daptomycin-verwandtes Molekül, unter anderem umfassend Daptomycin, A54145, ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, das in den US-Patenten 4,537,717, 4,482,487, Re. 32,311, Re. 32,310, 5,912,226, gegenwärtig in Neuherausgabe als US-Seriennr. 09/547,357, den Vorläufigen US-Anmeldungen 60/170,943, 60/170,946 oder 60/170,945, eingereicht am 15. Dez. 1999, der Vorläufigen US-Anmeldung 60/208,222, eingereicht am 30. Mai 2000, die hier alle durch Bezugnahme ausdrücklich aufgenommen sind, offenbart ist, oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Die in 60/170,943, 60/170,946, 60/170,945 und 60/208,222 offenbarten Daptomycin-verwandten Lipopeptide sind synthetische und halbsynthetische Lipopeptide, bei denen die Ornithin- oder Kynurinreste oder die Fettsäure-Seitenkette von Daptomycin verändert sind. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Der Begriff Daptomycin-verwandtes Lipopeptid bezeichnet die vorstehend beschriebenen Verbindungen und Salze davon.
Der Begriff „Daptomycin" bezeichnet das n-Decanoylderivat des Antibiotikums vom Faktor A-21978C₀-Typ oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon. „Daptomycin" ist gleichbedeutend mit LY146032; siehe 1.
Der Begriff „Anhydrodaptomycin" bezeichnet das Daptomycinderivat, bei dem die α-Aspartylgruppe von Daptomycin durch Transpeptidase in eine Anhydrosuccinimidgruppe überführt wird; siehe 3.
Der Begriff „β-Isomer" oder „β-Isomer von Daptomycin" bezeichnet das Daptomycinderivat, das eine β-Aspartylgruppe anstatt einer α-Aspartylgruppe enthält; siehe 2.
Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist „im Wesentlichen rein", wenn es sich bei wenigstens 95% einer Probe um Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid handelt. Vorzugsweise ist Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid „im Wesentlichen rein", wenn es sich bei wenigstens 97% einer Probe um Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid handelt.
Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist „in hohem Maß rein", wenn es sich bei wenigstens 98% einer Probe um Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid handelt. Vorzugsweise ist Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid „in hohem Maß rein", wenn es sich bei wenigstens 99% einer Probe um Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Lipopeptid handelt.
Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist „im Wesentlichen frei" von einer anderen Verbindung, wenn die andere Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 1% der Menge der Daptomycinzubereitung oder der Zubereitung des Daptomycin-verwandten Lipopeptids vorhanden ist.
Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist „in hohem Maß frei" von einer anderen Verbindung, wenn die andere Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 0,5% der Menge der Daptomycinzubereitung oder der Zubereitung des Daptomycin-verwandten Lipopeptids vorhanden ist.
Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist „frei" von einer anderen Verbindung, wenn die andere Verbindung in einer Menge von nicht mehr als 0,1% der Menge der Daptomycinzubereitung oder der Zubereitung des Daptomycin-verwandten Lipopeptids vorhanden ist. Bei einer anderen Ausführungsform ist Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Lipopeptid „frei" von einer anderen Verbindung, wenn die Verbindung mit HPLC unter Bedingungen maximaler Empfindlichkeit, bei der die Nachweisgrenze etwa 0,05% oder weniger der Menge der Daptomycinzubereitung oder der Zubereitung des Daptomycinverwandten Lipopeptids beträgt, nicht nachgewiesen werden kann. Beispielgebende HPLC-Verfahren sind hier beschrieben (Tabellen 1 und 2).
„Gereinigtes" Daptomycin oder Daptomycin-verwandtes Lipopeptid bezeichnet im Wesentlichen reines Daptomycin oder Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, im Wesentlichen reines Daptomycin oder Daptomycin-verwandtes Lipopeptid oder ein Salz davon oder Daptomycin, Daptomycin-verwandtes Lipopeptid oder ein Salz davon, das in erheblichem Maß frei, im Wesentlichen frei oder frei von einer anderen Verbindung ist.
„Teilweise gereinigtes" Daptomycin oder Daptomycin-verwandtes Lipopeptid bezeichnet Daptomycin, ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid oder ein Salz davon, das weniger als 90% rein ist.
Die Reinheit von Daptomycin, einem Daptomycin-verwandten Lipopeptid oder eines anderen Lipopeptids bezieht sich auf das Lipopeptid vor seiner Formulierung in ein Arzneimittel. Die Reinheit kann mit jedem Mittel gemessen werden, einschließlich kernmagnetische Resonanz (NMR), Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS), Flüssigkeitschromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) oder mikrobiologische Tests. Ein bevorzugtes Mittel zur Messung der Reinheit von Daptomycin ist die analytische Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
Der Begriff „Micelle" bezeichnet Aggregate amphipathischer Moleküle. In einem wässrigen Medium sind die lipophilen Bereiche der Moleküle des Aggregats in Richtung auf das Innere der Micelle orientiert, während die hydrophilen Bereiche in Kontakt mit dem Medium stehen. Micellstrukturen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, sphärische, laminare, zylindrische, ellipsoide, bläschenförmige (liposomale), lamellare und flüssigkristalline; siehe 14.
Der Begriff „gemischte Micelle" bezeichnet einen bestimmten Micellentyp, bei dem die Micelle mehr als eine einzige Art von amphipathischem Molekül umfasst. Im Zusammenhang dieser Erfindung umfassen gemischte Micellen ein Lipopeptid und wenigstens ein anderes amphipathisches Molekül, bei dem es sich um ein weiteres Lipopeptid handeln kann. Gemischte Micellen enthalten wenigstens 10 Gew.-% des Lipopeptids. Bei anderen Ausführungsformen enthält eine gemischte Micelle wenigstens 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% des Lipopeptids.
Der Begriff „micellare Lösung" bezeichnet eine Lösung, bei der mehr als 50 Gew.-% der Lipopeptidmoleküle in der Lösung in Micellen vorliegen. Vorzugsweise liegen wenigstens 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% der Moleküle in Micellen vor. Eine micellare Lösung wird von einer Ultrafiltrationsmembran mit einer nominellen Molekulargewichts (NMW)-Ausschlussgrenze von 10000 Dalton zurückgehalten.
Der Begriff „kritische Micellenkonzentration" (cmc) bezeichnet eine bestimmte Molekülkonzentration, die von der Temperatur, der Salzkonzentration und der Beschaffenheit und dem Typ des amphipathischen Moleküls abhängt. Über der cmc liegen nicht-assoziierte Monomere und Micellen im Gleichgewicht vor.
Der Begriff „Monomer" bezeichnet ein amphipathisches Molekül, das nicht Teil eines Aggregats ist, sondern als Einzelmolekül vorliegt. Im Zusammenhang dieser Erfindung bezeichnet der Begriff Monomer ein nicht-assoziiertes Lipopeptid.
Der Begriff „monomere Lösung" bezeichnet eine Lösung, in der mehr als 50 Gew.-% der Lipopeptidmoleküle als Monomere vorliegen. Vorzugsweise liegen wenigstens 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% als Monomere vor. Eine monomere Lösung wird von einer Ultrafiltrationsmembran mit einer NMW-Ausschlussgrenze von 10000 Dalton nicht zurückgehalten, sondern passiert die Membran.
Der Begriff „Puffer mit niedriger Ionenstärke" bezeichnet eine Lösung mit einer Salzkonzentration unter 50 mM; der Begriff „Puffer mit mittlerer Ionenstärke" bezeichnet eine Lösung mit einer Salzkonzentration zwischen 50 und 250 mM; der Begriff „Puffer mit hoher Ionenstärke" bezeichnet eine Lösung mit einer Salzkonzentration über 250 mM.
Verfahren zur Herstellung von gereinigten Lipopeptiden
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein prozesschromatographisches Verfahren zur Herstellung eines gereinigten Lipopeptids auf einem gewerblich gangbaren Weg, wobei das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid ist. Das prozesschromatographische Verfahren umfasst die aufeinanderfolgende Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographie, hydrophober Chomatographie (HIC) und Anionenaustausch-Chromatographie zur Reinigung einer Zubereitung, die ein Lipopeptid wie z. B. Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid umfasst.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Reinigungsverfahren ferner das Verändern der Fermentationsbedingungen, bei denen das A21978C-haltige Rohprodukt von Streptomyces roseosporus hergestellt wird, um die Daptomycinproduktion zu steigern und die von der S. roseosporus-Fermentationskultur hergestellten Verunreinigungen und verwandten Verunreinigungen zu verringern.
Nachstehend wird eine bevorzugte Ausführungsform des prozesschromatographischen Verfahrens beschrieben.
Streptomyces roseosporus wird mit einer Gabe von n-Decansäure, wie im US-Patent 4,885,243 beschrieben, fermentiert, mit der Abänderung, dass die Gabe von Decansäure bei den niedrigsten Mengen, die möglich sind, ohne die Gesamtausbeute der Fermentation zu vermindern, gehalten wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die verbleibende Decansäure bei der aeroben Fermentation bei weniger als 50 Millionstelteilen (ppm) gehalten. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die verbleibende Decansäure bei der aeroben Fermentation bei zwischen 1 und 20 ppm gehalten. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform wird die verbleibende Decansäure bei der aeroben Fermentation bei etwa 10 ppm gehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration der verbleibenden Decansäure während des Ablaufs der Fermentation gemessen und der Menge der Gabe von Decansäure wird angepasst, um die Mengen der verbleibenden Decansäure in kontinuierlicher Weise innerhalb der bevorzugten Werte zu halten. Im Stand der Technik sind die spezifischen und niedrigen gleichbleibenden in situ-Konzentrationen der verbleibenden Decansäure, die zum Erzielen einer optimalen Expression von Daptomycin mit niedrigen Mengen von Verunreinigungen notwendig sind, nicht beschrieben.
Nach der Fermentation wird die extrazelluläre Lösung durch Entfernung der Myzelien aus der Fermentationsbrühe geklärt. Die Entfernung der Myzelien aus der Fermentation wird mit einem beliebigen herkömmlichen Trennverfahren wie z. B. Zentrifugieren oder Mikrofiltration durchgeführt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fermentationsbrühe durch Mikrofiltration, beispielsweise unter Verwendung eines Pall Sep^TM-Membransystems, geklärt. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die Fermentationsbrühe unter Verwendung einer industriellen Zentrifuge wie z. B. einer Westfalia^TM-Zentrifuge geklärt, gefolgt von abschließender Tiefenfiltration. Andere Vorrichtungen wie z. B. Filterpressen, Filter mit rotierender Trommel oder Einweg-Tiefenfilter können ebenfalls verwendet werden, um Myzelien aus der Fermentationsbrühe zu entfernen und so eine geklärte Brühe, die für Säulenchromatographie von großem Maßstab geeignet ist, herzustellen.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann Daptomycin aus einer Myzel-Fermentation vor dem Klären unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie z. B. Butanol mit Hilfe einer Lösungsmitteltrennungszentrifuge oder eines Filters direkt extrahiert werden. Bei der Extraktion gemäß dieser Ausführungsform kann jeder Alkohol mit vier oder mehr Kohlenstoffatomen verwendet werden. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist n-Butanol. Die Verwendung eines organischen Lösungsmittels führt, im Vergleich zu einer rein wässrigen Trennung von Daptomycin, zu einer zusätzlichen anfänglichen Reinigung von Daptomycin. Beispielsweise scheidet sich Daptomycin in das n-Butanol, wenn n-Butanol in einer Konzentration von mehr als 10% verwendet wird und der Prozess unter Bedingungen geführt wird, bei denen das n-Butanol eine getrennte Phase bildet, wie z. B. bei einem pH-Wert von 4–5, der nahe des isoelektrischen Punkts von Daptomycin liegt (siehe Beispiel 4).
Bei einer weiteren Ausführungsform wird Daptomycin in einem immobilisierten Reaktor, der voraktivierte Myzelien für die nicht-fermentierende Herstellung von Daptomycin unter Verwendung einer Energiequelle, vorzugsweise einem Zucker, von Grundkomponenten wie z. B. Aminosäuren und Ammoniak und Decansäure verwendet, hergestellt. Die Herstellung von Daptomycin in einem immobilisierten Enzymreaktor wird anschließend mit hier beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Nach dem Klären der Fermentationsbrühe werden die Daptomycinmengen in der geklärten Lösung durch Anionenaustausch-Chromatographie angereichert (d. h. konzentriert). Die geklärte Lösung wird zuerst mit einem Anionenaustauscherharz unter Bedingungen, bei denen das meiste oder das gesamte Daptomycin an das Anionenaustauscherharz bindet, In Kontakt gebracht. Nach dem Binden wird das Harz mit einem geeigneten ionischen wässrigen Puffer gewaschen, um nichtgebundenes Material und einige der Daptomycin-Verunreinigungen zu entfernen. Schließlich wird das an das Harz gebundene gereinigte Daptomycin von dem Harz unter Bedingungen, bei denen Daptomycin von dem Harz dissoziiert, eluiert.
Die Schritte des Bindens, Waschens und Eluierens können gemäß dieser Erfindung unter Verwendung von Puffern und Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Elution unter Verwendung eines Puffers, der eine höhere Salzkonzentration als der Puffer zum Waschen aufweist, eines Puffers, der einen niedrigeren pH-Wert als der Puffer zum Waschen aufweist, oder eines Puffers, der eine höhere Salzkonzentration und auch einen niedrigeren pH-Wert als der Puffer zum Waschen aufweist, durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin an ein Anionenaustauscherharz, das in einem Puffer, der kein zugesetztes Salz oder eine niedrige Salzkonzentration bei einem neutralen bis basischen pH-Wert enthält, äquilibriert worden ist, gebunden. Das beladene Harz wird mit drei Säulenbett-Volumina Wasser und anschließend mit drei bis sechs Bettvolumina eines mittleren Salzpuffers mit 30 bis 60 mM NaCl gewaschen. Das Daptomycin wird mit einem bis drei Säulenvolumina eines Puffers mit einer erhöhten Salzkonzentration und/oder einem niedrigeren pH-Wert, der 300 bis 500 mM NaCl enthält, von der Säule eluiert. Höhere Konzentrationen von Natriumchlorid sowie auch andere Salze wie z. B. Kaliumchlorid eluieren Daptomycin ebenfalls von dem Harz. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein anionisches Austauscherharz mit hoher Flussrate verwendet. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird FP-DA 13-Harz (Mitsubishi) verwendet.
Die Anionenaustausch-Chromatographie kann durch Säulenchromatographie oder chargenweise durchgeführt werden. Für die gewerbliche Produktion kann die chargenweise Durchführung bevorzugt sein. Das Anionenaustauscherharz kann mit stufenförmigen Salzgradienten oder mit einem kontinuierlichen Salzgradienten gewaschen und eluiert werden. Ein geeigneter stufenförmiger oder kontinuierlicher Salzgradient ist jeder, der es ermöglicht, Daptomycin von Verunreinigungen zu trennen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich ein kontinuierlicher Salzgradient von 0 bis 1000 mM NaCl. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich ein kontinuierlicher Salzgradient von 100 bis 500 mM NaCl oder von 0 bis 400 mM NaCl. Es kann auch Radialfluss-Chromatographie verwendet werden, wie in den US-Patenten 5,756,680, 4,865,729, 4,840,730 und 4,708,782 beschrieben ist.
Nach der Anionenaustausch-Chromatographie wird die Daptomycinzubereitung durch hydrophobe Chromatographie (HIC) weiter gereinigt. Eine Ausführungsform dieses Schritts ist im US-Patent 4,874,843, das hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, beschrieben. Die eluierte wässrige Daptomycinzubereitung wird mit einem HIC-Harz unter Bedingungen, bei denen das meiste oder das gesamte Daptomycin an das Harz bindet, in Kontakt gebracht. Der Wassergehalt des mit Daptomycin beladenen Harzes wird durch Inkontaktbringen des Harzes mit einer erhöhten Konzentration eines nichtpolaren Lösungsmittels verringert. Das Harz wird mit einem geeigneten polaren organischen Lösungsmittel unter Bedingungen, bei denen Verunreinigungen von dem Harz dissoziieren, während das Daptomycin gebunden bleibt, gewaschen. Schließlich wird die Daptomycinzubereitung unter Bedingungen, bei denen das Daptomycin von dem Harz dissoziiert, eluiert. Im Allgemeinen wird das Daptomycin unter Verwendung eines Lösungsmittel-haltigen Puffers mit einer niedrigeren Polarität (höhere Menge von polarem Lösungsmittel) und/oder einem höheren pH-Wert als der Puffer zum Waschen eluiert.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem nichtfunktionalen Harz für die HIC um kleinpartikuläres HP-20ss (Mitsubishi). Das gebundene Daptomycin wird mit einer organischen Lösungsmittelphase wie z. B. einer, die Isopropylalkohol, Acetonitril, Butanol oder ein anderes geeignetes Lösungsmittel enthält, von dem HP-20ss-Harz spezifisch entfernt. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin an HP-20ss-Harz, das in einem Acetatpuffer mit 10% Acetonitril oder einem gleichwertigen polaren Lösungsmittel wie z. B. Isopropylalkohol äquilibriert worden ist, gebunden. Das mit Daptomycin beladene Harz wird mit wenigstens drei Säulenbett-Volumina Äquilibrierungspuffer gewaschen. Das mit Daptomycin beladene Harz wird ferner durch Waschen mit drei bis sechs Bettvolumina eines Acetatpuffers zum Waschen, der eine nicht-eluierende Konzentration des polaren Lösungsmittels enthält, von weiteren Verunreinigungen gereinigt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das mit Daptomycin beladene Harz mit 30%-igem Acetonitril oder 45%-igem Isopropylalkohol gewaschen. Das mit Daptomycin beladene Harz wird mit einem bis drei Bettvolumina Acetatpuffer, der 35% oder mehr Acetonitril oder mehr als 50% Isopropylalkohol enthält, eluiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin mit 35%-igem Acetonitril bei einem pH-Wert von 4,0–5,0 oder mit 55–60%-igem Isopropylalkohol eluiert. Bei einer weiteren Ausführungsform wird das mit Daptomycin beladene Harz mit einem bis drei Bettvolumina Puffer mit einem erhöhten pH-Wert eluiert. Bei dieser Ausführungsform wird der pH-Wert des Puffers allmählich erhöht, um verschiedene Verbindungen mit verschiedenen Geschwindigkeiten, die sich wegen Unterschieden der Ladungen unterscheiden, von der Säule zu eluieren. Bei erhöhtem pH-Wert, beispielsweise einem pH-Wert von 6,0–7,0, ist die Elutionskonzentration von Acetonitril auf 10–20% verringert. In ähnlicher Weise ist bei erhöhtem pH-Wert, beispielsweise einem pH-Wert von 6,0–7,0, die Elutionskonzentration von Isopropylalkohol auf 20–25% verringert. Das Steuern der Temperatur, bei der die Chromatographie durchgeführt wird, beeinflusst auch die Lösungsmittelkonzentration. Die Elution bei niedrigen Temperaturen, beispielsweise unter gekühlten Bedingungen, erfordert bei allen pH-Wert-Bedingungen gesteigerte Lösungsmittelmengen.
Nach der HIC wird das organische Lösungsmittel in der Daptomycinzubereitung durch Anionenaustausch-Chromatographie herabgesetzt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird, wie vorstehend dargelegt, FP-DA 13 verwendet.
Nach der zweiten Anionenaustausch-Chromatographie wird das gereinigte Daptomycin von Pyrogen befreit, filtriert und unter gekühlten Bedingungen konzentriert. Das Filtrieren von Daptomycin kann mit jedem im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bei einer Ausführungsform kann das Filtrieren und Entfernen von Pyrogen folgendermaßen durchgeführt werden:

i) Bereitstellen einer Daptomycinlösung unter Bedingungen, bei denen das Daptomycin in einem monomeren und nicht-micellaren Zustand vorliegt;
ii) Filtrieren der Daptomycinlösung unter Bedingungen, bei denen das Daptomycin das Filter passiert, während Pyrogene das Filter nicht passieren; beispielsweise bei einem pH-Wert der Daptomycinlösung von 6,0–8,0 und Filtrieren der Lösung mit einem Ultrafilter von 3000 NMW bis 30000 NMW;
iii) Verändern der Daptomycinlösung, die das Filter passiert hat, auf eine Weise, bei der das Daptomycin aggregiert, beispielsweise durch Verändern des pH-Werts der Daptomycinlösung auf 2,5–4,5, so dass das Daptomycin Micellen bildet;
iv) Filtrieren der Daptomycinlösung unter Bedingungen, bei denen das Daptomycin von dem Filter zurückgehalten wird, beispielsweise durch Konzentrieren des Daptomycins auf einem Ultrafilter von 30000 NMW oder weniger wie z. B. einer Umkehrosmosemembran; und
v) Entnehmen des von Pyrogen befreiten Daptomycins.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin bei Schritt (ii) unter Druck auf einem Ultrafilter mit einer Molekulargewichts-Ausschlussgrenze (MWCO) von 10000 Dalton bei einem pH-Wert von etwa 7–8 filtriert. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform liegt das Daptomycin in einer Ausgangskonzentration von weniger als 40 mg/ml vor, stärker bevorzugt in einer Konzentration von etwa 31,25 mg/ml. Unter diesen Bedingungen passiert Daptomycin das Filter, Pyrogene wie z. B. Lipopolysaccharide (LPS) jedoch nicht. Nach der Ultrafiltration zu Beginn wird der pH-Wert des Filtrats auf einen pH-Wert von 2,5 bis 4,5 abgesenkt, dann wird das Filtrat mit einem 10000 MWCO-Ultrafilter auf etwa 120 mg/ml aufkonzentriert. Unter diesen Bedingungen wird Daptomycin von dem Filter zurückgehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH-Wert des Filtrats 3,5. Im Anschluss an das Konzentrieren wird die Daptomycinkonzentration auf 105 mg/ml eingestellt und nach dem Kontrollieren der Endotoxinmengen zum Abfüllen in Fläschchen unter keimfreien Bedingungen verwendet.
Bei einer weiteren Ausführungsform wird eine Umkehrosmose-Nanofiltration bei einem pH-Wert von 1,5–3,0 durchgeführt. Der niedrige pH-Wert und gekühlte Bedingungen werden verwendet, um den Abbau von gereinigtem Daptomycin zu verzögern. Zum Verringern der biologischen Belastung kann das Daptomycin ferner durch ein 0,2 μm-Filter filtriert und dann entweder in Masse oder in Fläschchen gefriergetrocknet werden.
Bei einer anderen Ausführungsform an Stelle des oben genannten Schritts der Ultrafiltration und des Konzentrierens werden die eluierten Daptomycin-haltigen Fraktionen mit Butanol (entweder n-, iso- oder t-Butanol) bei einem pH-Wert von etwa 4,5 in einem Verhältnis von mehr als einem Teil Butanol auf neun Teile Daptomycinlösung gemischt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil Butanol mit vier Teilen Daptomycinlösung gemischt, um eine 20%-ige Butanollösung zu erhalten. Der Butanol/Daptomycin-Lösung wird das Trennen in organische und wässrige Phasen erlaubt. Das Daptomycin sammelt sich in der organischen Phase, die abgetrennt wird. Der Wasserverlust des Daptomycins in dem organischen Lösungsmittel kann das Daptomycin stabilisieren und den Abbau des gereinigten Daptomycins zu Anhydrodaptomycin und die nachfolgende Bildung des β-Isomers verhindern. Anschließend kann das Daptomycin durch Zusetzen von Puffer mit einem pH-Wert von 6,5–7,5 zu der organischen Phase in die wässrige Phase zurückgebracht werden. Nach Konzentrieren oder Entnehmen des Daptomycins wird das Daptomycin gefriergetrocknet.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird bei der Reinigung von Daptomycin ein „Salzwolkenverfahren" [Genetic Engineering News, Band 19, Nr. 20, Seiten 1, 34 und 43 (15. Nov. 1999)] verwendet. Bei dem Salzwolkenverfahren handelt es sich um ein Verfahren auf Membranbasis, das selektive Trennung mit einem hohen Volumendurchsatz verbindet. Das Salzwolkenverfahren kann mit den hier offenbarten Verfahrensschritten kombiniert oder davon getrennt verwendet werden, um Daptomycin zu reinigen.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Chromatographieverfahren zur Herstellung des hochgereinigten Lipopeptids Daptomycin, das mit Chromatographieverfahren aus dem Stand der Technik nicht erhältlich ist. Das Chromatographieverfahren umfasst die Verwendung von Anionenaustausch-Chromatographie, die durch einen modifizierten Puffer verstärkt ist, zur Reinigung einer Zubereitung, die ein Lipopeptid enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren zur Herstellung von hochgereinigtem Daptomycin oder einem hochgereinigten Daptomycin-verwandten Lipopeptid verwendet. Wenn dieses Verfahren mit teilweise gereinigtem Daptomycin verwendet wird, liefert es Daptomycin, das wenigstens 98% rein ist. Das Verfahren liefert auch Daptomycin, das von Anhydrodaptomycin frei oder im Wesentlichen frei ist. Das Verfahren umfasst folgende Schritte.
Teilweise gereinigtes Daptomycin wird mit einem beliebigen im Stand der Technik bekannten oder hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Daptomycinzubereitung wird dann durch Anionenaustausch-Chromatographie, die durch einen modifizierten Puffer verstärkt ist, weiter gereinigt. Das Daptomycin wird an ein Anionenaustauscherharz in Gegenwart eines geeigneten ionischen modifizierten Puffers unter Bedingungen, bei denen Daptomycin in einem monomeren und nicht-micellaren Zustand an die Harzionen bindet, gebunden. Der modifizierte Puffer umfasst ein Puffermittel wie z. B., aber nicht darauf beschränkt, Acetat, Phosphat, Citrat, Tris-HCl oder ein beliebiges anderes Puffermittel, das bei neutralem pH-Wert eine gute Pufferwirkung aufweist. Der modifizierte Puffer umfasst ferner ein oder mehrere chaotrope Mittel, umfassend, aber nicht darauf beschränkt, Guanidin, Ammoniak, Harnstoff, ein starkes Reduktionsmittel, Benzoat, Ascorbat oder einen anderen ionischen Verstärker, der zum Modifizieren des Puffers auf die Weise, bei der das Daptomycin leicht von Verunreinigungen getrennt wird, fähig ist. Das mit Daptomycin beladene Harz wird mit einem geeigneten ionischen modifizierten Puffer gewaschen, um Verunreinigungen einschließlich Anhydrodaptomycin zu eluieren. Anschließend wird das Daptomycin unter Bedingungen eluiert, die das Abtrennen des Daptomycins von Verunreinigungen, die an das Harz gebunden bleiben und das β-Isomer umfassen, ermöglichen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt der modifizierte Puffer mit neutralem pH-Wert (einem pH-Wert von 6 bis 8) vor und enthält 2 bis 6 M Harnstoff. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Anionenaustauscherharz um Porous Resin P150 oder Porous D50 (PE Biosystems). Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Anionenaustauscherharz um Porous P 150. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin in einem Puffer von niedriger Ionenstärke an das Harz gebunden, mit einem Puffer von niedriger bis mittlerer Ionenstärke gewaschen und mit einem Puffer von hoher Ionenstärke eluiert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin an das Porous P150-Harz in einem Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff gebunden. Das mit Daptomycin beladene Porous P150-Harz wird mit drei Bettvolumina Tris-Puffer oder einem anderen geeigneten Puffer mit einem Salzgehalt, der Verunreinigungen und Anhydrodaptomycin ohne Eluieren von Daptomycin entfernt, gewaschen. Das Daptomycin wird mit Tris-Puffer oder einem anderen geeigneten Puffer unter erhöhten Salzbedingungen, wobei weitere Verunreinigungen einschließlich eines wesentlichen Anteils an β-Isomer an der Säule gebunden bleiben, von dem Porous P150-Harz eluiert. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Porous P150 verwendet und das Daptomycin in einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff an das Harz gebunden. Das mit Daptomycin beladene Porous 150-Harz wird ähnlich wie bei dem oben genannten Verfahren gewaschen und eluiert, mit der Ausnahme, dass ein Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff verwendet wird. Die Produktfraktionierung kann durch HPLC oder durch UV-Beobachtung gemessen werden.
Die durch einen modifizierten Puffer verstärkte Anionenaustausch-Chromatographie kann als Säulenchromatographie oder in einem diskontinuierlichen Modus durchgeführt werden. Es kann auch Radialfluss-Chromatographie verwendet werden, wie in den US-Patenten 5,756,680, 4,865,729, 4,840,730 oder 4,708,782 beschrieben ist. Das durch einen modifizierten Puffer verstärkte Anionenaustauscherharz kann mit stufenartigen Salzgradienten oder mit einem kontinuierlichen Salzgradienten gewaschen und eluiert werden. Jeder stufenartige oder kontinuierliche Salzgradient, der das Trennen von Daptomycin von Verunreinigungen, die Anhydrodaptomycin und das β-Isomer umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind, ermöglicht, ist geeignet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich ein kontinuierlicher Salzgradient von 0 bis 1000 mM NaCl. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich der Salzgradient von 100 bis 500 mM NaCl oder von 0 bis 400 mM NaCl.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine neue Kombination von prozesschromatographischen Schritten zur Reinigung von Daptomycin oder eines Daptomycin-verwandten Lipopeptids verwendet. Das Verfahren umfasst Anionenaustausch-Chromatographie, Kleinteilchen-Umkehrphasen-Chromatographie und durch einen modifizierten Puffer verstärkte Anionenaustausch-Chromatographie. Das Reinigungsverfahren kann ferner das Verändern der Fermentationsbedingungen, bei denen das A21978C-haltige Rohprodukt von Streptomyces roseosporus hergestellt wird, umfassen. Diese Verfahren liefern Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid mit einer Reinheit von wenigstens 98%. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liefern die Verfahren Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Lipopeptid mit einer Reinheit von mehr als 99%.
Nachstehend wird eine bevorzugte Ausführungsform des prozesschromatographischen Verfahrens beschrieben.
Streptomyces roseosporus wird mit einer Zufuhr von n-Decansäure, wie in dem US-Patent 4,885,243 beschrieben, fermentiert, mit der Abänderung, dass die Decansäurezufuhr bei den niedrigsten Mengen, die möglich sind, ohne die Gesamtausbeute der Fermentation zu vermindern, gehalten wird, wie vorstehend beschrieben ist. Bei einer anderen Ausführungsform kann ein anderes Zuführausgangsmaterial verwendet werden, sofern es letzten Endes eine n-Decanoylgruppe zur Addition an den Daptomycinkern bereitstellt. Beispiele dieses Zufuhrausgangsmaterials umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Decansäureamid, Decansäureester, umfassend Butylester, rohe Quellen von Kokosnuss- oder Palmöl, Decansäure tierischen Ursprungs, verschiedene Decansäuresalze sowie petrochemische Quellen von Decansäure. Nach der Fermentation wird die extrazelluläre Lösung, wie vorstehend beschrieben, geklärt. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Daptomycin unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels wie z. B. n-Butanol vor dem Klären mit einer Lösungsmitteltrennungs-Zentrifuge oder einem Filter, wie vorstehend beschrieben, von den Myzelien extrahiert werden. Nach dem Klären der Fermentationsbrühe wird der Daptomycinpegel in der geklärten Lösung zuerst durch Anionenaustausch-Chromatographie und anschließend durch HIC, wie vorstehend beschrieben, angereichert.
Nach Abschluss der HIC wird das organische Lösungsmittel in der Daptomycinzubereitung durch ein beliebiges im Stand der Technik bekanntes Verfahren verringert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das organische Lösungsmittel, wie vorstehend beschrieben, durch Anionenaustausch-Chromatographie verringert. Das Daptomycin sollte mit einem Puffer, der mit dem Puffer verträglich ist, der für die durch einen modifizierten Puffer verstärkte Chromatographie benötigt wird, von der Säule eluiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Elutionspuffer mit Umkehrosmose oder Filtration auf einem 10000 MWCO-Filter durch den modifizierten Puffer ersetzt werden. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das organische Lösungsmittel durch Abdampfen oder Verdünnen mit Puffer verringert. Bei einer dritten bevorzugten Ausführungsform wird das Lösungsmittel für die Umkehrphasen-Chromatographie und das Restsalz unter Verwendung von Umkehrosmose bei einem pH-Wert von 1,5–4,0 oder Ultrafiltration bei einem pH-Wert von 2,5–4,5 entfernt. Das so erhaltene Produkt kann für die Massenlagerung eingefroren werden, oder durch Gefriertrocknung getrocknet und dann mit Wasser oder mit dem Puffer, der für die durch einen modifizierten Puffer verstärkte Anionenaustausch-Chromatographie verwendet wird, erneut hydratisiert werden.
Das Daptomycin wird mit durch einen modifizierten Puffer verstärkter Anionenaustausch-Chromatographie, wie vorstehend beschrieben, weiter gereinigt.
Nach der durch einen modifizierten Puffer verstärkten Anionenaustausch-Chromatographie wird das gereinigte Daptomycin filtriert und bei gekühlten Bedingungen konzentriert. Das Filtrieren von Daptomycin kann mit einem beliebigen im Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Daptomycin, wie vorstehend beschrieben, von Pyrogen befreit und konzentriert. Bei einer anderen Ausführungsform kann das Daptomycin durch Umkehrosmose bei gekühlten Bedingungen bei einem pH-Wert von 1,5 bis 4 konzentriert werden. Die Bedingungen von niedrigem pH-Wert und Kühlung werden verwendet, um den Abbau von gereinigtem Daptomycin zu verzögern.
Als andere Ausführungsform von oder zusätzlich zu dem oben genannten Schritt der Filtration und des Konzentrierens können die eluierten Fraktionen, die Daptomycin aus der durch einen modifizierten Puffer verstärkten Anionenaustausch-Chromatographie enthalten, mit Butanol (entweder n-, iso- oder t-Butanol) bei einem pH-Wert von etwa 4,5 in einem Verhältnis von mehr als einem Teil Butanol auf neun Teile Daptomycinlösung gemischt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Teil Butanol mit vier Teilen Daptomycinlösung gemischt, um eine 20%-ige Butanollösung zu erhalten. Der Butanol/Daptomycin-Lösung wird das Trennen in organische und wässrige Phasen erlaubt. Das Daptomycin sammelt sich in der organischen Phase, die abgetrennt wird. Der Wasserverlust des Daptomycins in dem organischen Lösungsmittel kann das Daptomycin stabilisieren und den Abbau des gereinigten Daptomycins zu Anhydrodaptomycin und die nachfolgende Bildung des β-Isomers verhindern.
Nach dem Konzentrieren oder Sammeln des Daptomycins wird das Daptomycin gefriergetrocknet.
Bei einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das prozesschromatographische Verfahren zur Reinigung von anderen Lipopeptiden als Daptomycin wie z. B. diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, verwendet.
Herstellung von Lipopeptid-Micellen und Verfahren zur deren Verwendung
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Lipopeptid-Micellen, Verfahren zur Herstellung von Lipopeptid-Micellen und Verfahren zur Verwendung der Lipopeptid-Micellen bei der Lipopeptidreinigung und bei Arzneimitteln bereit. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid ein Daptomycin-verwandtes Molekül, einschließlich, unter anderem, Daptomycin A54145, ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, das in den U.S.-Patenten 4,537,717, 4,482,487, Re. 32,311, Re. 32,310, 5,912,226, gegenwärtig in Neuerteilung als US-Seriennr. 09/547,357, den Vorläufigen US-Anmeldungen Nr. 60/170,943, 60/170,946 oder 60/170,945, eingereicht am 15. Dez. 1999, der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/208,222, eingereicht am 30. Mai 2000, offenbart ist, oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoylseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Seitenkette ersetzt ist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin.
Micellen sind Aggregate von amphipathischen Molekülen. In wässrigen Medien sind die lipophilen Teile der Moleküle in Richtung auf das Innere der Micelle hin ausgerichtet und die hydrophilen Teile der Moleküle stehen in Kontakt mit dem wässrigen Medium. Micellen bilden sich spontan in einer Lösung, die amphipathische Moleküle enthält, wenn die Konzentration der Moleküle hoch genug ist.
Die Bildung von Micellen verursacht Veränderungen mehrerer wichtiger physikalischer Eigenschaften einer Lösung, umfassend Veränderungen des osmotischen Drucks, der Trübung, der elektrischen Leitfähigkeit, der Oberflächenspannung, der Ko-Ionen- und Gegenionenaktivitäten (bei ionischen amphipathischen Molekülen), des Brechungsindex, der UV- und NMR-Spektren, des partiellen molaren Volumens, der Viskosität, des Diffusionskoeffizienten und der Farbstoffsolubilisation. Die cmc kann durch Messung einer oder mehrerer dieser Micellen-abhängigen physikalischen Eigenschaften als Funktion der Konzentration des amphipathischen Moleküls gemessen werden. Die Größe und die Form von Micellen können durch dynamische Streuung von Laserlicht, Ultrazentrifugation, Viskositätsexperimente und/oder Kleinwinkel-Röntgenstreuungsexperimente bestimmt werden. Micellen können auch in flüssigkristallinem Zustand vorliegen.
Lipopeptide können durch Bereitstellung einer Lipopeptidkonzentration, die größer als die cmc des Lipopeptids ist, zu Micellen aggregiert werden. Die cmc ist von der Beschaffenheit des Lipopeptids und von der Temperatur, der Salzkonzentration und dem pH-Wert der wässrigen Lösung, die das Lipopeptid umfasst, abhängig. Bezüglich der Beschaffenheit des Lipopeptids wird die cmc eines Lipopeptids durch Anfügen von CH₂-Gruppen an die lipophilen Kohlenstoffketten verringert. Bei einer cmc, die für Daptomycin bei einer bestimmten Salzkonzentration, einer bestimmten Temperatur und einem bestimmten pH-Wert gegeben ist, wird ein Antibiotikum vom A-21978-Typ, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette durch eine n-Octanoyl- oder n-Nonanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist, somit eine höhere cmc aufweisen, während ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist, eine niedrigere cmc als Daptomycin aufweisen wird.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann die cmc eines Lipopeptids durch Zufügen oder Entfernen einer CH₂-Gruppe an das bzw. von dem Lipopeptid verändert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid A-21978, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die angenäherte cmc eines Lipopeptids gemäß den Lehren der Beschreibung berechnet werden. Mit einer gegebenen cmc eines Lipopeptids wie z. B. Daptomycin kann die angenäherte cmc eines verwandten Lipopeptids, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist, berechnet werden. Dies kann mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgeführt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann bei gegebener cmc eines Lipopeptids die angenäherte cmc eines Lipopeptids, das eine verwandte Peptideinheit enthält, berechnet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann bei gegebener cmc von Daptomycin und mit den Lehren des Stands der Technik leicht die cmc eines verwandten Lipopeptids wie z. B. A54145, ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, das in den US-Patenten 4,537,717, 4,482,487, Re.
32,311, Re. 32,310, 5,912,226, gegenwärtig in Neuerteilung als US-Seriennr. 09/547,357, den Vorläufigen US-Anmeldungen Nr. 60/170,943, 60/170,946 oder 60/170,945, eingereicht am 15. Dez. 1999, der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/208,222, eingereicht am 30. Mai 2000, offenbart ist, bestimmt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die cmc eines Lipopeptids durch Veränderung der Temperatur der Lösung, die das Lipopeptid umfasst, manipuliert. Die cmc eines Lipopeptids steigt üblicherweise mit steigender Temperatur der Lösung. Die Micellenbildung wird somit durch Verringern der Temperatur gefördert und durch Erhöhen der Temperatur gehemmt. Beispielsweise kann eine Lösung, die ein Lipopeptid umfasst, bei 4°C Micellen bilden, da die cmc bei dieser Temperatur herabgesetzt ist und die Konzentration des Lipopeptids über der cmc liegt; die gleiche Lipopeptidlösung kann jedoch bei 20°C monomer vorliegen, da die cmc mit der Temperatur gestiegen ist und die Lipopeptidkonzentration nun unter der cmc liegt. Daher ist bei einer bevorzugten Ausführungsform die Konzentration eines Lipopeptids bei einer Temperatur höher als die cmc, während sie bei einer anderen Temperatur, die höher ist, niedriger als die cmc ist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Molekül, wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin.
Bei eine weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch Verwendung verschiedener Temperaturen zum Beeinflussen der cmc zu manipulieren, bei der Reinigung des Lipopeptids verwendet. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein verwandtes Molekül wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch Verändern der Temperatur zu manipulieren, zur Herstellung von Arzneimitteln, die bei bestimmten Temperaturbedingungen micellar und bei anderen Temperaturbedingungen monomer vorliegen, verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin oder ein wie vorstehend beschriebenes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Zusetzen eines Elektrolyten verwendet, um die cmc eines ionischen Lipopeptids zu verringern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird einer Lipopeptid-haltigen Lösung ein Salz wie z. B. NaCl zugesetzt, um die Abstoßung zwischen den geladenen Gruppen in einer Lipopeptid-Micelle zu verringern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Molekül wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Beispielsweise enthält die Peptideinheit von Daptomycin drei Asparaginsäurereste und einen L-Threo-3-methylglutaminsäurerest (3-MG), die bei neutralem pH-Wert alle geladen sind. Das Zusetzen eines Elektrolyten wie z. B. NaCl oder ein gleichwertiges Salz senkt daher die cmc von Daptomycin. Bei einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Salzkonzentration wenigstens 100 mM. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt die Salzkonzentration 150 mM bis 300 mM. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Salz NaCl.
Eine Abnahme der cmc bei Zusetzen eines Elektrolyten wird auch bei anderen Lipopeptiden wie z. B. Daptomycin-verwandten Molekülen mit Asparaginsäureresten, 3-MG-Resten oder anderen geladenen Resten beobachtet. Daher wird bei einer bevorzugten Ausführungsform einer Lösung Salz zugesetzt, um die cmc eines Daptomycin-verwandten Lipopeptids wie z. B. A54145, ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid, das in den U.S.-Patenten 4,537,717, 4,482,487, Re. 32,311, Re. 32,310, 5,912,226, gegenwärtig in Neuerteilung als US-Seriennr. 09/547,357, den Vorläufigen US-Anmeldungen Nr. 60/170,943, 60/170,946 oder 60/170,945, eingereicht am 15. Dez. 1999, der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/208,222, eingereicht am 30. Mai 2000, offenbart ist, oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist, zu senken. Bei einer weiteren Ausführungsform wird die Salzkonzentration verringert, um die cmc eines ionischen Lipopeptids zu erhöhen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das ionische Lipopeptid Daptomycin oder ein wie vorstehend beschriebenes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch Verändern der Elektrolytkonzentration zum Beeinflussen der cmc zu manipulieren, bei der Reinigung des Lipopeptids verwendet. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Molekül wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch die Elektrolytkonzentration zu manipulieren, zur Herstellung von Arzneimitteln, die bei bestimmten Elektrolytkonzentrationen micellar und bei anderen Elektrolytkonzentrationen monomer vorliegen, verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin oder ein wie vorstehend beschriebenes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der pH-Wert einer Lösung, die ein Lipopeptid umfasst, manipuliert, um die cmc des Lipopeptids zu beeinflussen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Molekül wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Bei einer Ausführungsform wird der pH-Wert so manipuliert, dass die Konzentration eines Lipopeptids bei einem pH-Wert höher als die cmc und bei einem anderen pH-Wert niedriger als die cmc ist. Beispielsweise war die cmc von Daptomycin bei einem pH-Wert von 4,0 in Wasser bei einer Temperatur von 20–25°C viel niedriger als bei einem pH-Wert von 6,0 oder 7,5. Bei einem pH-Wert von 4,0 liegt die cmc bei diesen Bedingungen bei etwa 400 μg/ml; siehe 15. Ferner ist Daptomycin bei einem pH-Wert von 6,5 sogar bei 150 mg/ml Daptomycin monomer (wobei die Salzkonzentration 150 mM bis 300 mM NaCl und die Temperatur 4°C beträgt). Für Daptomycin ist daher die cmc bei einem pH-Wert von 4,0 niedriger als bei Lösungen sowohl mit höherem pH-Wert als auch mit niedrigerem pH-Wert. Die Veränderung der cmc bei verschiedenen Niveaus des pH-Werts können auch bei anderen geladenen Lipopeptiden, umfassend die wie vorstehend beschriebenen Daptomycin-verwandten Lipopeptide, verwendet werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch Verändern des pH-Werts zum Beeinflussen der cmc zu manipulieren, bei der Reinigung des Lipopeptids verwendet. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Molekül wie z. B. die vorstehend beschriebenen. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vermögen, die Micellenbildung eines Lipopeptids durch den pH-Wert zu manipulieren, zur Herstellung von Arzneimitteln, die bei einem bestimmten pH-Wert micellar und bei einem anderen pH-Wert monomer vorliegen, verwendet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin oder ein wie vorstehend beschriebenes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Arzneimittel Daptomycin.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann das Lipopeptid Teil einer gemischten Micelle sein. Bei einer gemischten Micelle bildet das Lipopeptid zusammen mit einer anderen Art oder mehreren anderen Arten amphipathischer Moleküle eine Micelle. Beispiele solcher amphipathischer Moleküle umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Fettsäuren mit mittleren und langen Ketten, Phosphoglyceride (Phospholipide), Sphingomyelin, Glycolipide und Cholesterin. Bei einer Ausführungsform können Alkohole mit mittlerer Kettenlänge in die Micelle einverleibt werden, wo sie die elektrostatische Abstoßung und die sterische Behinderung herabsetzen und somit die cmc des Lipopeptids erniedrigen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Zusetzen einer Art oder mehrerer Arten amphipathischer Moleküle verwendet werden, um die Struktur der Micelle von der sphärischen Micelle (siehe 14, Teil (a)) zu einer planaren Lipid-Doppelschichtstruktur (siehe 14, Teil (b)) oder einer Liposomenstruktur (siehe 14, Teil (c)) abzuändern. Im Allgemeinen bewirken gemischte Micellen, die Phospholipide und/oder Glycolipide umfassen, die Umwandlung einer sphärischen Micelle in eine Lipid-Doppelschichtstruktur, die als Durchlässigkeitsbarriere für Ionen und die meisten polaren Moleküle dient.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann die gemischte Micelle aus zwei oder mehreren verschiedenen Lipopeptiden gebildet werden. Beispielsweise kann die gemischte Micelle aus Daptomycin und einem anderen Lipopeptid wie z. B. A54145 oder einem wie vorstehend dargelegten Daptomycin-verwandten Lipopeptid gebildet werden. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die gemischte Micelle ein Lipopeptid zusammen mit einem oder mehreren therapeutisch nützlichen amphipathischen Molekülen wie z. B. ein Antibiotikum, ein entzündungshemmendes oder ein fungizides Mittel, die dem Fachmann bekannt sind, umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Lipopeptid wie z. B. A54145, die vorstehend beschriebenen Daptomycinverwandten Lipopeptide oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Micelle, die gemischt sein oder eine einzige Art von Lipopeptidmolekül umfassen kann, ein therapeutisch nützliches Lipopeptid. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid ein Antibiotikum. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Daptomycin bildet in Wasser bei einer Konzentration von 1 mg/ml bei einem pH-Wert von etwa 4,0 Micellen von etwa 5,4 nm (54 Å); siehe 16.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Micellen eine Art oder mehrere verschiedene Arten von therapeutischen Wirkstoffen. Bei einer Ausführungsform kann ein therapeutischer Wirkstoff mit dem Lipopeptid in Lösung gemischt werden, so dass von dem Lipopeptid eine Micelle gebildet und der therapeutische Wirkstoff in dem hydrophoben Inneren eingeschlossen wird. Bei einer anderen Ausführungsform wird ein therapeutischer Wirkstoff mit einem Lipopeptid und einem oder mehreren anderen amphipathischen Molekülen gemischt, so dass von dem Lipopeptid und anderen amphipathischen Molekülen eine Micelle gebildet und der therapeutische Wirkstoff in dem hydrophoben Inneren gefunden wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum, ein entzündungshemmendes oder ein fungizides Mittel. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum oder ein fungizides Mittel, das nachstehend beschrieben wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff in einer hydrophoben Umgebung löslich, aber in einer wässrigen Lösung unlöslich.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die Lipopeptide in die Form von Liposomen gebracht werden, bei denen es sich um vesikuläre Micellen, bei denen eine sphärische Lipiddoppelschicht einen wässrigen Innenraum umschließt, handelt; siehe 14, Teil (c). Liposomen sind für therapeutische Verwendungen vorteilhaft, da sie leicht mit einer Plasmamembran verschmelzen und auch zum Einschließen von Stoffen in ihrem wässrigen Innenraum verwendet werden können. Bei dem Stoff kann es sich um einen solchen handeln, der nur in wässrigen Lösungen löslich ist. Bei einer Ausführungsform kann eine Lösung, die ein Lipopeptid und ein weiteres amphipathisches Molekül enthält, beschallt werden, um Liposomen herzustellen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Lipopeptid allein beschallt werden, um Liposomen herzustellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Liposom Daptomycin oder ein Daptomycin-verwandtes Lipopeptid wie z. B. A54145, ein Lipopeptid, das in den US-Patenten 4,537,717, 4,482,487, Re. 32,311, Re. 32,310, 5,912,226, gegenwärtig in Neuerteilung als US-Seriennr. 09/547,357, den Vorläufigen US-Anmeldungen Nr. 60/170,943, 60/170,946 oder 60/170,945, eingereicht am 15. Dez. 1999, der Vorläufigen US-Anmeldung Nr. 60/208,222, eingereicht am 30. Mai 2000, offenbart ist, oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin.
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die Liposomen in ihren wässrigen Innenräumen einen therapeutischen Wirkstoff oder mehrere therapeutische Wirkstoffe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum, ein entzündungshemmendes oder ein fungizides Mittel. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum oder ein fungizides Mittel, das nachstehend beschrieben wird. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff in einer wässrigen Umgebung löslich. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Arzneimittel das Liposom.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Arzneimittel Anordnungen vom Lipopeptid-Micellen-Typ, die einen therapeutischen Wirkstoff enthalten. Bei den Anordnungen vom Lipopeptid-Micellen-Typ kann es sich um sphärische Micellen, gemischte Micellen oder Liposomen handeln. Arzneimittel, die Lipopeptid-Micellen umfassen, können lokale Irritationen bei der Injektion oder bei der intravenösen Verabreichung minimieren. Bei einer Ausführungsform umfasst das Arzneimittel ein Salz, einen Puffer zur Aufrechterhaltung eines bestimmten pH-Werts und Micellen. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das Arzneimittel ein oder mehrere Mittel zur Stabilisierung der Micellen und/oder zur Stabilisierung des Lipopeptids oder des anderen therapeutischen Wirkstoffs. Bei einer Ausführungsform umfasst das Arzneimittel ferner einen therapeutischen Wirkstoff oder mehrere therapeutische Wirkstoffe. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum, ein entzündungshemmendes oder ein fungizides Mittel. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform ist der therapeutische Wirkstoff ein Antibiotikum oder ein fungizides Mittel, das nachstehend beschrieben wird. Der therapeutische Wirkstoff kann zusätzlich zu dem therapeutischen Wirkstoff, der in der Micelle eingeschlossen ist, vorliegen, oder er kann der therapeutische Wirkstoff sein, der in die Micelle eingeschlossen ist.
Das Arzneimittel kann getrocknet oder gefriergetrocknet werden, wobei dann die Micellen gebildet werden, wenn dem Arzneimittel entweder eine wässrige Lösung wie z. B. Wasser oder ein Puffer zugesetzt wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird das Arzneimittel gefriergetrocknet und enthält beim Rekonstituieren Salz mit einer physiologischen Konzentration und einen Puffer, der einen pH-Wert aufrecht erhält, bei dem sich bei Raumtemperatur spontan Micellen bilden, wenn steriles Wasser oder ein anderer Puffer zugesetzt wird. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Arzneimittel Daptomycin oder ein verwandtes Lipopeptid wie z. B. A54145, die vorstehend beschriebenen Daptomycinverwandten Lipopeptide oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Arzneimittel wasserhaltig. Dies ist bevorzugt, wenn Liposomen verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Arzneimittel ein Stabilisierungsmittel für die Liposomen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die micellare Lösung isoliert und/oder gereinigt. Bei einer Ausführungsform werden Micellen durch Ultrafiltration von kleineren Substituenten isoliert. Die Wahl der Ultrafiltrationsmembran wird auf der Grundlage der Größe der Micelle erfolgen. Im Allgemeinen wird eine 10000 NMW- oder 30000 NMW-Membran ausreichend sein, um Micellen zurückzuhalten und kleinere Substituenten wie z. B. Verunreinigungen durchfließen zu lassen. Bei einer weiteren Ausführungsform können Micellen durch Dialyse, Dichtegradientenzentrifugation oder Größenausschluß-Chromatographie isoliert und/oder gereinigt werden. Diese Verfahren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Bei einer Ausführungsform sind die Micellen mehr als 30% rein, wobei die Reinheit als das Gewicht der Micellen im Vergleich zu dem Gewicht von Monomerformen des Lipopeptids oder von anderen Molekülen gemessen wird. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Micellen mehr als 50%, 60%, 70%, 80%, 90% oder 95% rein.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung stellt das Vermögen, durch Veränderung von Temperatur, pH-Wert, Elektrolytkonzentration und/oder Lipopeptidkonzentration Lipopeptid-Micellen herzustellen und anschließend zu dissoziieren, ein Verfahren zur Reinigung von Lipopeptiden bereit. Bei einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Reinigung von Lipopeptiden von Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht durch Unterwerfen der Lipopeptide Bedingungen, bei denen die Lipopeptide Micellen bilden, und anschließendes Trennen der Micellen von den Verunreinigungen durch ein Größentrennverfahren wie z. B.
Ultrafiltration oder Größenausschluß-Chromatographie. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren das Konzentrieren von Lipopeptiden durch Unterwerfen der Lipopeptide Bedingungen, bei denen die Lipopeptide Micellen bilden, und anschließend deren Konzentrieren durch ein Größentrennverfahren. Bei einer stärker bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren sowohl die Reinigung als auch das Konzentrieren in einem einzigen Schritt.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Reinigung eines Lipopeptids von Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht, einschließlich Pyrogene (beispielsweise Lipopolysaccharide), durch Unterwerfen des Lipopeptids Bedingungen, bei denen das Lipopeptid monomer vorliegt, und anschließendes Trennen der monomeren Lipopeptidlösung von den Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht durch ein Größentrennverfahren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Größentrennverfahren, wie vorstehend beschrieben, Ultrafiltration. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein verwandtes Lipopeptid wie z. B. A54145, die vorstehend beschriebenen Daptomycin-verwandten Lipopeptide oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin.
Nachstehend wird eine bevorzugte Ausführungsform des prozesschromatographischen Verfahrens unter Verwendung von Micellen zur Reinigung von Daptomycin beschrieben.
Streptomyces roseosporus wird mit einer Gabe von n-Decansäure, wie vorstehend beschrieben, fermentiert. Nach der Fermentation wird die extrazelluläre Lösung, wie vorstehend beschrieben, geklärt.
Wie vorstehend beschrieben, wird die geklärte Zubereitung anschließend auf ein Anionenaustauscherharz wie z B. FP-DA 13 aufgebracht. Das Daptomycin wird mit einem bis drei Säulenvolumina eines Puffers mit erhöhter Salzkonzentration, der 300 bis 500 mM NaCl enthält, von der Säule eluiert.
Die eluierte Daptomycinzubereitung wird unter Verwendung einer Säure auf einen pH-Wert von 2,5 bis 5,0 eingestellt. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Säure verdünnte Phosphorsäure. Bei einem pH-Wert von 2,5 bis 4,7, 300 bis 500 mM NaCl und einer Temperatur von 2–15°C bildet das Daptomycin Micellen.
Die Daptomycinzubereitung wird auf einer 10000 bis 30000 NMW-Ultrafiltrationsmembran filtriert. Während der Ultrafiltration wird die Daptomycinzubereitung mit einem Puffer, der 30 mM Natriumacetat bei einem pH-Wert von 3,5 enthält, bei Temperaturen von bis zu 15°C gewaschen. Wegen der Elutionsbedingungen beträgt die anfängliche Salzkonzentration 300 mM NaCl, im Verlauf des Waschens nimmt die Salzkonzentration jedoch ab. Da das Daptomycin in micellarer Form vorliegt, wird es von dem Filter zurückgehalten, während Verunreinigungen, die kleiner als die 10000 bis 30000 (in Abhängigkeit des verwendeten Filters) sind, das Filter passieren. Die erhaltene Daptomycinzubereitung ist etwa 85–90% rein.
Bei einem wählbaren Schritt kann die Daptomycinzubereitung verdünnt und ihr pH-Wert auf 6,5 angehoben werden, um das Daptomycin in einen monomeren Zustand zu überführen. Die Daptomycinzubereitung wird dann durch eine 10000 NMW-Ultrafiltrationsmembran geleitet. Dieser wählbare Schritt senkt den Pyrogengehalt wesentlich.
Verfahren zur Reinheitsanalyse von Daptomycin
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt Analyseverfahren zur Messung der Reinheit von Daptomycin bereit.
Im Stand der Technik wurden viele der Verunreinigungen, die bei der Reinigung zusammen mit Daptomycin angefallen sind, nicht getrennt oder nachgewiesen, da das Vermögen zum Sichtbarmachen und Messen von Verunreinigungen durch die verfügbaren Analyseverfahren und die verfügbare Ausrüstung beschränkt war; siehe beispielsweise das US-Patent 4,874,843 und Kirsch et al. Die Entwicklung empfindlicherer analytischer HPLC-Systeme und -Techniken ermöglicht die Auflösung einer Reihe von Verunreinigungen in Daptomycinchargen, die mit Verfahren aus dem Stand der Technik hergestellt sind. Die HPLC-Verfahren höherer Auflösung zeigen, dass mit Verfahren aus dem Stand der Technik gereinigtes Daptomycin mit bereits nachgewiesenen Verunreinigungen wie z. B. Anhydrodaptomycin und dem β-Isomer verunreinigt ist, sowie mit anderen, bisher unbekannten Verunreinigungen, die bei Durchführung von Verfahren aus dem Stand der Technik bei der Reinigung zusammen mit Daptomycin anfallen (und bei herkömmlichen HPLC-Nachweisbedingungen zusammen mit Daptomycin eluiert werden). Der Nachweis dieser Verunreinigungen ermöglicht nunmehr die Entwicklung von Verfahren, die zur Entfernung dieser Verunreinigungen entworfen werden.
Wie vorstehend dargelegt, sind Anhydrodaptomycin und das β-Isomer bereits früher als Verunreinigungen, die bei der Herstellung von Daptomycin hartnäckig und wiederholt auftraten, beschrieben worden. Unter Verwendung der hier beschriebenen HPLC-Analyseverfahren wurden etwa zwölf weitere Verunreinigungen, die bei der Herstellung von Daptomycin entstehen, unterschieden, von denen einige noch nicht früher nachgewiesen worden sind. Diese Verunreinigungen waren nach der Reinigung mit dem im US-Patent 4,874,843 offenbarten Verfahren nicht entfernt. Wenigstens zehn dieser Verbindungen wurden nachgewiesen (siehe beispielsweise 2–11). Ferner sind wenigstens sechs dieser Verbindungen nicht das direkte Ergebnis der Umsetzung, die Anhydrodaptomycin und die β-Isomerform von Daptomycin erzeugt, sondern sind vielmehr Verbindungen, die durch andere, nicht-verwandte Vorgänge, die bei der Fermentation oder bei der Reinigung von Daptomycin auftreten, erzeugt werden. Das nachstehend beschriebene Verfahren der vorliegenden Erfindung verringert auch die Mengen einiger dieser Verunreinigungen wesentlich (siehe Beispiele).
Jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren kann verwendet werden, um die Menge von anderen Verbindungen in einer Daptomycinzubereitung zu messen. Verfahren zum Nachweisen von Daptomycinverunreinigungen umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, Massenspektroskopie, Intrarotspektroskopie, Kapillarelektrophorese und magnetische Kernresonanzspektroskopie. Ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der Menge von anderen Verbindungen in einer Daptomycinzubereitung ist HPLC.

Bei der vorliegenden Erfindung wurden zwei Verfahren verwendet, um Daptomycinverunreinigungen zu messen. Das erste Verfahren ist ein Verfahren mit etwas geringerer Auflösung als das zweite Verfahren. Bei beiden Verfahren wird ein Shimadzu- oder HP HPLC-System mit PE Nelson's Turbochrom Software Version 4.1 verwendet. Das „erste" Verfahren zur Auflösung ist in Tabelle 1 zusammengefasst, während das „zweite" Verfahren zur Auflösung in Tabelle 2 zusammengefasst ist. Tabelle 1

1. System zur Lösungsmittelbereitstellung
Modus:	isokratisches Pumpen
Durchflussrate:	1,5 ml/min
Laufzeit:	30 Minuten
2. Lösungsmittel A:	34%-iges Acetonitril in 0,5% NH₄ H₂PO₄ bei pH-Wert 4,5
Lösungsmittel B:	20%-iges Acetonitril in 0,5% NH₄ H₂PO₄ bei pH-Wert 4,5

Die Zielbedingung ist die Retention von Daptomycin bei 15,0 ± 0,5 Minuten. Das Lösungsmittel B kann zusammen mit Lösungsmittel A verwendet werden, um die Bedingungen der mobilen HPLC-Phase zum Erzielen der gewünschten Retentionszeit anzupassen.

3. Autosampler-Kühlung:	5 (4 bis 6)°C
4. Injektionsvolumen:	5 μl bis 75 μl (üblicherweise 20 μl)
5. Säule:	IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5μ, 4,6 mm × 250 mm (oder gleichwertig)
6. Vorsäule:	IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5μ, 4,6 mm × 30 mm (oder gleichwertig)
7. Detektionswellenlänge:	214 nm
8. Säulentemperatur:	Umgebungstemperatur
9. Integration:	Ein Computersystem oder ein Integrator, das bzw. der zum Messen einer Peakfläche fähig ist.

Tabelle 2

1. System zur Lösungsmittelbereitstellung
Modus:	isokratisches Pumpen
Durchflussrate:	1,5 ml/min
Laufzeit:	75 Minuten
2. Lösungsmittel A:	20%-iges Acetonitril in 0,45% NH₄ H₂PO₄ bei pH-Wert 3,25
Lösungsmittel B:	50%-iges Acetonitril in 0,45% NH₄ H₂PO₄ bei pH-Wert 3,25

Die Zielbedingung ist etwa 35% Acetonitril in 0,45% NH₄ H₂PO₄ bei einem pH-Wert von 3,25 (50% Lösungsmittel B) zur Retention von Daptomycin bei 36,0 ± 1,5 Minuten; das Lösungsmittelverhältnis wird jedoch verwendet, um die Zusammensetzung der mobilen HPLC-Phase zum Erzielen der gewünschten Retentionszeit anzupassen.

3. Autosampler-Kühlung:	5 (4 bis 6)°C
4. Injektionsvolumen:	5 μl bis 75 μl (üblicherweise 20 μl)
5. Säule:	IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5 μ, 4,6 mm × 250 mm (oder gleichwertig)
6. Vorsäule:	IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5μ, 4,6 mm × 30 mm (oder gleichwertig)
7. Detektionswellenlänge:	214 nm
8. Säulentemperatur:	25 (22 bis 28)°C
9. Integration:	Ein Computersystem oder ein Integrator, das bzw. der zum Messen einer Peakfläche fähig ist.

Gereinigte Lipopeptide, Arzneimittel und Verfahren zu deren Verwendung
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von gereinigten Lipopeptiden sowie von deren Salzen, Estern, Amiden, Ethern und geschützten Formen sowie von pharmazeutischen Formulierungen, die gereinigte Lipopeptide oder deren Salze umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Lipopeptid Daptomycin oder ein Daptomycinverwandtes Lipopeptid, wie vorstehend beschrieben. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Arzneimitteln, die Anordnungen vom Lipopeptid-Micellen-Typ umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Lipopeptid-Micellen Micellen, die Daptomycin oder ein oder mehrere Daptomycin-verwandte Lipopeptide umfassen. Jede Bezugnahme auf Lipopeptid-Micellen bezieht sich hier nicht nur auf alle Anordnungen vom Lipopeptid-Micellen-Typ, sondern umfasst ausdrücklich Daptomycin oder ein verwandtes Lipopeptid wie z. B. A54145, die vorstehend beschriebenen Daptomycin-verwandten Lipopeptide oder ein A-21978-Antibiotikum, bei dem die n-Decanoyl-Fettsäureseitenkette von Daptomycin durch eine n-Octanoyl-, n-Nonanoyl-, n-Undecanoyl-, n-Dodecanoyl-, n-Tridecanoyl- oder n-Tetradecanoyl-Fettsäureseitenkette ersetzt ist. Ferner umfassen alle Bezugnahmen auf Anordnungen vom Lipopeptid-Micellen-Typ ausdrücklich sphärische Micellen, gemischte Micellen und Liposomen, wie vorstehend dargelegt.
Gereinigte Lipopeptide, pharmazeutisch verträgliche Salze davon oder Lipopeptid-Micellen können für die orale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, aerosolische, topische oder parenterale Verabreichung für die therapeutische oder vorbeugende Behandlung von Krankheiten, insbesondere von bakteriellen Infektionen, formuliert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das gereinigte Lipopeptid gereinigtes Daptomycin oder ein gereinigtes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid. Die Bezugnahme auf „gereinigtes Daptomycin", ein „gereinigtes Daptomycin-verwandtes Lipopeptid" oder „gereinigtes Lipopeptid" umfasst hier pharmazeutisch verträgliche Salze davon. Micellen von Daptomycin, Daptomycin-verwandten Lipopeptiden oder anderen Lipopeptiden können unter Verwendung jedes pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Exzipienten, der mit Daptomycin oder dem betrachteten Lipopeptid kompatibel ist, formuliert werden. Als allgemeine Beschreibung der Verfahren zur Verabreichung verschiedener antimikrobieller Mittel in der Humantherapie siehe beispielsweise Handbook of Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name, Chemical, Function, and Manufacturer, Ashgate Publishing Co., Herausgeber: M. Ash und I. Ash, 1996; The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, Herausgeber: S. Budavari, jährlich; Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA; Martindale: The Complete Drug Reference, Herausgeber: K. Parfitt, 1999; und Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY, Herausgeber: L. S. Goodman et al., deren Inhalte hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die Micellen dieser Erfindung aus gereinigtem Daptomycin, Daptomycin-verwandten Lipopeptiden oder anderen Lipopeptiden können mit herkömmlichen pharmazeutischen Trägern und Exzipienten gemischt werden und in der Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirupen, Oblaten, Cremen und dergleichen verwendet werden. Micellen aus Daptomycin, Daptomycin-verwandten Lipopeptiden oder anderen Lipopeptiden können mit anderen therapeutischen Wirkstoffen und Antibiotika, wie hier dargelegt, gemischt werden. Die Zusammensetzungen, die eine Verbindung der Erfindung umfassen, werden etwa 0,1 bis etwa 90 Gew.-% des Wirkstoffs, allgemeiner etwa 10 bis etwa 30%, enthalten.
Die Zusammensetzungen der Erfindung können unter Verwendung von Verabreichungssystemen mit kontrollierter Freisetzung (beispielsweise Kapseln) oder Depotfreisetzung (beispielsweise biologisch abbaubare Grundlagen) verabreicht werden. Beispielgebende Verabreichungssysteme mit verzögerter Freisetzung zur Arzneistoffverabreichung, die zur Verabreichung der Zusammensetzungen der Erfindung geeignet sind, sind in den US-Patenten Nr. 4,452,775 (an Kent erteilt), 5,239,660 (an Leonard erteilt) und 3,854,480 (an Zaffaroni erteilt) beschrieben.
Die Zusammensetzungen können gewöhnliche Träger und Exzipienten wie z. B. Maisstärke oder Gelatine, Lactose, Saccharose, mikrokristalline Cellulose, Kaolin, Mannit, Dicalciumphosphat, Natriumchlorid und Alginsäure enthalten. Die Zusammensetzungen können Natriumcroscarmellose, mikrokristalline Cellulose, Maisstärke, Natriumstärkeglycolat und Alginsäure enthalten.
Beispiel 1
Daptomycin wurde in einer Fermentationskultur von S. roseosporus hergestellt; teilweise gereinigtes Daptomycin (9,9 kg) wurde durch Mikrofiltration von 5500 Litern Fermentationsbrühe durch das im US-Patent 4,885,243 beschriebene Verfahren gereinigt. Das teilweise gereinigte Daptomycin wurde mit dem im US-Patent 4,874,843 beschriebenen Verfahren weiter gereinigt, wodurch eine Hauptzubereitung von Daptomycin mit einer Reinheit von 91% erhalten wurde. Gemäß einer HPLC-Analyse enthielt die Daptomycinzubereitung 14 Verunreinigungen (siehe Beispiel 8). Die Daptomycinzubereitung wurde auf Poros P150-Anionenaustauscherharz (PE Biosystems) in Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff aufgebracht und man ließ sie an das Harz binden. Das Harz wurde mit drei Säulenvolumina Puffer gewaschen, bevor ein NaCl-Gradient in dem gleichen Puffer gestartet wurde. Bei einer anderen Ausführungsform können die Verunreinigungen mit einem gleichbleibenden Salzspiegel von 30 mM NaCl wirksam von der Säule entfernt werden. Die Elution des gereinigten Daptomycins von dem Harz fand bei etwa 300 mM NaCl eines NaCl-Gradienten von 0 bis 1000 mM statt. Das von der Säule eluierte Daptomycin war über 99% rein, wie mit dem „ersten" HPLC-Verfahren gemessen wurde. Das gereinigte Daptomycin enthielt nur eine nachweisbare Daptomycin-Verunreinigung. Anhydrodaptomycin and das β-Isomer waren nicht nachweisbar (weniger als 0,01% Verunreinigung). Die Menge der nicht identifizierten Verunreinigung war höher als 0,1% und niedriger als 0,5%.
Beispiel 2
Eine Hauptzubereitung von Daptomycin mit einer Reinheit von 91% wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Das Produkt wurde auf Poros D50-Anionenaustauscherharz (PE Biosystems) in einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff aufgebracht. Das Poros D50-Harz wurde auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gewaschen und eluiert. Das von der Säule eluierte Daptomycin war über 96,92% rein, wie mit dem „zweiten" HPLC-Verfahren gemessen wurde. Das Produkt der Erfindung enthielt nur zwei der ursprünglich 14 Verunreinigungen (weniger als 0,5% Verunreinigung). In der gereinigten Daptomycinzubereitung konnte Anhydrodaptomycin nicht nachgewiesen werden (weniger als 0,01% Verunreinigung, bei genauer Messung weniger als 0,05%).
Beispiel 3
Eine Daptomycin-haltige Fermentationsbrühe wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Die Fermentationsbrühe wurde durch Mikrofiltration geklärt. Das geklärte Produkt wurde mit 20% n-Butanol oder iso-Butanol bei einem pH-Wert von 4,5 (ein Teil Butanol auf vier Teile geklärte Lösung) extrahiert. Die geklärten Lösung wurde erneut extrahiert, um eine Ausbeute an teilweise gereinigtem Daptomycin von mehr als 90% des gesamten Daptomycins in der geklärten Lösung zu erzielen. Daptomycin wurde aus der Butanolphase zurückgewonnen, indem ein wässriger Puffer mit einem pH-Wert von 6,5 und einem Volumen, das die Hälfte des Volumens des Butanols oder mehr betrug, zugesetzt wurde, um das Daptomycin aus der Butanolphase in die wässrige Phase zu extrahieren. Der Schritt der Butanolextraktion lieferte eine teilweise gereinigte Daptomycinzubereitung, die im Vergleich zu der geklärten Lösung 5-fach gereinigt und 10-fach konzentriert war.
Die wässrige Daptomycinzubereitung wurde anschließend mit dem im US-Patent Nr. 4,874,843 beschriebenen Verfahren gereinigt, wodurch Daptomycin mit einer Reinheit von 91% erhalten wurde. Das Daptomycin enthielt 14 Verunreinigungen. Das Produkt wurde in einem Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff auf Poros D50-Harz aufgebracht. Das Harz wurde mit drei Bettvolumina Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff gewaschen, bevor ein NaCl-Gradient von 0 bis 1000 mM in dem gleichen Puffer gestartet wurde. Die Elution des gereinigten Daptomycins von dem Harz fand bei etwa 300 mM NaCl statt. Das Daptomycin war 98% rein, wie mit dem „zweiten" HPLC-Verfahren gemessen wurde.
Beispiel 4
Daptomycin wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, fermentiert. Die 5500 Liter Fermentationsbrühe enthalten 13 kg Daptomycin. Die Fermentationsbrühe wird mit 20% n-Butanol bei einem pH-Wert von 4,5 direkt extrahiert, wobei sich das Daptomycin in dem Butanol ansammelt. Es werden weitere Extraktionen der Fermentationsbrühe mit Butanol durchgeführt, um eine Ausbeute von mehr als 90% des gesamten Daptomycins in der Fermentationsbrühe zu erzielen. Die Butanolphase wird mit einem wässrigen Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,5 extrahiert, wobei Daptomycin, das im Vergleich zu der Fermentationsbrühe 5-fach gereinigt (35%) und 10-fach konzentriert ist, erhalten wird. Das wässrige Daptomycin wird mit dem im US-Patent 4,885,243 beschriebenen Verfahren mikrofiltriert und anschließend mit dem Verfahren von US- Patent Nr. 4,874,843 gereinigt. Dieses Verfahren liefert Daptomycin mit einer Reinheit von etwa 91%. Gemäß dem HPLC-Verfahren nach dem Stand der Technik enthält das Daptomycin 14 Verunreinigungen. Das Produkt wird in Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 und 6 M Harnstoff auf eine Säule mit Poros D50-Harz aufgebracht. Das Waschen und die Elution des Harzes wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Produkt des chromatographischen Schritts ist etwa 98% bis 99% rein, wie mit dem zweiten HPLC-Verfahren gemessen wird.
Beispiel 5
Eine Daptomycinzubereitung mit einer Reinheit von 93% wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Das Produkt wurde in einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff auf Poros P150-Harz (PE Biosystems) aufgebracht. Das Poros P150-Harz wurde mit drei Säulenvolumina des Puffers gewaschen. Das Daptomycin wurde unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 0 bis 400 mM in dem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff von dem Harz eluiert. Das Daptomycin eluierte zwischen 150 und 300 mM NaCl. Das von der Säule eluierte Daptomycin war zwischen 99,0 und 99,5% rein, wie mit dem „ersten" HPLC-Verfahren gemessen wurde. Das Daptomycin enthielt Spurenmengen von vier Verunreinigungen, die weniger als 1% der Gesamtmenge des Daptomycins betrugen. In der gereinigten Daptomycinzubereitung konnte Anhydrodaptomycin nicht nachgewiesen werden (weniger als 0,02% Verunreinigung).
Beispiel 6
Eine Daptomycinzubereitung mit einer Reinheit von 93% wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt. Das Produkt wurde auf Poros P150-Harz (PE Biosystems) in einem Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff aufgebracht. Die Säule wurde mit sechs Säulenvolumina 60 mM NaCl in Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff (dem „Waschpuffer") gewaschen. Der Waschpuffer kann von 50–75 mM NaCl variieren. Das Waschen entfernt beinahe das gesamte Anhydrodaptomycin. Das Daptomycin wurde mit 16 Säulenvolumina von 250 mM NaCl in Acetatpuffer mit einem pH-Wert von 6,0 und 2 M Harnstoff eluiert. Das Daptomycin war 98,5% bis 99,5% rein, wie mit dem „ersten" HPLC-Verfahren gemessen wurde.
Beispiel 7
Eine wie in Beispiel 1 beschriebene Daptomycinzubereitung wurde unter Verwendung eines Verfahrens, das die für die Durchführung der HP20ss-Chromatographie benötigte Lösungsmittelkonzentration wesentlich verringerte, durchgeführt. Unerwarteterweise wurde das Lösungsmittel für die Daptomycinelution, 40% Acetonitril oder 55–60% Isopropylalkohol, auf 12% bzw. 25% vermindert, wenn die HP-20ss-Chromatograpie bei neutralem pH-Wert anstatt, wie im US-Patent 4,874,843 beschrieben, bei saurem pH-Wert durchgeführt wurde. Bei einer bevorzugten Ausführungsform können Verschiebungen des pH-Werts verwendet werden, um das HP-20ss-Harz ohne Entfernung von Lösungsmittel zurückzugewinnen.
Nach der Elution von einer FP-DA13-Säule bei einem pH-Wert von 6,5–7,0 wird das Daptomycin auf eine äquilibrierte HP-20ss-Säule, die z. B. in 60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 6,6 äquilibriert worden ist, aufgebracht. Die Säule wird mit fünf bis acht Säulenbettvolumina (CBV) Waschpuffer gewaschen. Ein beispielgebender Waschpuffer ist 5% Isopropylalkohol/60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 6,6. Das Daptomycin wird mit einem Elutionspuffer von der Säule eluiert. Ein beispielgebender Elutionspuffer ist zwei bis drei CBV 25% Isopropylalkohol/60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 6,6. Die Säule wird mit einem Resorptions-Puffer desorbiert. Bei einer Ausführungsform wird die Säule mit ein CBV 40% Isopropylalkohol/60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 6,6–7,0 desorbiert. Die Daptomycinlösung wird auf einen pH-Wert von 3,5–4,0 eingestellt und erneut auf die HP-20ss-Säule aufgebracht, um die Reinheit weiter zu verbessern. Bei einer Ausführungsform wird das bei einem pH-Wert von 6,5 von der HP-20ss-Säule eluierte Daptomycin unter Verwendung von 0,25 M Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt. Die Daptomycinlösung wird erneut auf die zuvor desorbierte HP-20ss-Säule aufgebracht, die in 60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 3,5 äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit einem Puffer zum Einstellen des pH-Werts gewaschen, so dass der pH-Wert 6,5 beträgt. Ein beispielgebender Puffer zum Einstellen des pH-Werts ist fünf bis acht CBV 5% Isopropylalkohol/60 mM Acetat bei einem pH-Wert von 6,6. Das Daptomycin wird mit einem Elutionspuffer eluiert und kann, wenn gewünscht, durch Anionenaustausch oder andere Reinigungsverfahren weiter gereinigt werden. Die HP-20ss-Säule wird vor der Wiederverwendung mit einem Resorptions-Puffer desorbiert und gereinigt. Ein beispielgebendes Reinigungsverfahren vor dem Äquilibrieren umfasst Waschen mit drei CBV 0,5 M NaOH, Waschen mit 1 CBV Wasser und anschließendes Waschen mit 0,25 M Phosphorsäure. Die Säule kann in 0,5 M NaOH gelagert werden.
Beispiel 8
Die wie in Beispiel 1 beschriebene Daptomycin-Hauptzubereitung, wurde mit halbpräparativer HPLC und mit Flüssigkeitschromatographie/Massenspektroskopie (LC/MS) unter Verwendung von sowohl positiven als auch negativen Ionenmodi charakterisiert. Ein Verunreinigungsprofil der Daptomycin-Hauptzubereitung vor der Chromatographie auf dem Poros P150-Anionenaustauscherharz ist in Tabelle 3 gezeigt; ein Chromatogramm der Hauptzubereitung von Daptomycin ist in 12 gezeigt.
Tabelle 3
Verunreinigung 1 (CB-131012) eluiert bei etwa 7,96 Minuten (MW: 1638); es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei um ein Lacton-Hydrolyseprodukt von Daptomycin (4) handelt. Die Ergebnisse scheinen LY212218, das von Lilly bereits als ein Daptomycinderivat mit geöffnetem Decylring identifiziert worden ist, zu entsprechen.
Verunreinigung 2 (CB-131011) eluiert bei etwa 9,11 Minuten (MW: 1638); es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei ebenfalls um ein Lacton-Hydrolyseprodukt des β-Isomers (5) handelt.
Verunreinigung 3 (CB-131008) eluiert bei etwa 11,54 Minuten (MW: 745); es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei um ein lineares Lipopeptid, das aus einer fünfgliedrigen Aminosäurekette aus Tryptophan, Asparagin, Aspartat, Threonin und Glycin mit einer Decansäurekette besteht (6), handelt. Dieses Ergebnis scheint dem bereits von Lilly identifizierten LY213928 zu entsprechen.
Verunreinigung 4 (CB-131006) eluiert bei etwa 12,28 Minuten (MW: 1624); es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei um ein oxidatives Analogon von Daptomycin, bei dem die Aminosäure Tryptophan zu Kynursäure oxidiert ist (7), handelt.
Der Verunreinigung 5, die bei etwa 13,10 Minuten eluiert (MW: 1618), wurde noch keine Struktur zugeordnet.
Verunreinigung 6 (CB-130989) und Verunreinigung 7 (CB-131005) eluieren gemeinsam bei etwa 14,43 Minuten. CB-130989 (MW: 587) scheint LY213827 zu entsprechen, einem linearen Lipopeptid, das aus einer dreigliedrigen Aminosäurekette aus Tryptophan, Asparagin und Aspartat mit einer Decansäurekette besteht (8), wie bereits von Lilly identifiziert. CB-131005 (MW: 1606) entspricht einem Daptomycinanalogon, bei dem der Decansäure eine Methylgruppe fehlt (9).
Die Verunreinigung 8 (CB-131010) eluiert bei etwa 15,10 Minuten (MW: 1620) und entspricht LY213846 (β-Isomer), wie bereits von Lilly identifiziert (2). Die Mengen des β-Isomers sind größer als 1%.
Der Verunreinigung 9, die bei etwa 17,92 Minuten eluiert (MW: 874), wurde noch keine Struktur zugeordnet.
Den Verunreinigungen 10 und 11, die gemeinsam bei etwa 19,57 Minuten eluieren, wurde keine Struktur zugeordnet.
Verunreinigung 12 (CB-131009) eluiert bei etwa 20,93 Minuten (MW: 859), es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei um ein lineares Lipopeptid, das aus einer sechsgliedrigen Aminosäurekette aus Tryptophan, Asparagin, Aspartat, Threonin, Glycin und Ornithin mit einer Decansäurekette besteht (10), handelt.
Verunreinigung 13 (CB-130952) eluiert bei etwa 23,11 Minuten (MW: 1602), es wird vorgeschlagen, dass es sich dabei um Anhydrodaptomycin (3) handelt, und sie scheint das gleiche wie LY178480 zu sein. Die Mengen von Anhydrodaptomycin sind größer als 1%.
Die Verunreinigung 14 (CB-131078), die bei etwa 24,53 Minuten eluiert (MW: 1634), scheint das gleiche wie LY109208, das bereits früher von Lilly als ein Daptomycinanalogon mit einer zusätzlichen Methylgruppe in der Decansäurekette identifiziert worden ist (11), zu sein.
Die Daptomycin-Hauptzubereitung kann auf Poros P150, wie vorstehend in den Beispielen 1 oder 5–6 beschrieben, gereinigt werden, oder es kann auf Poros D50, wie vorstehend in den Beispielen 2–4 beschrieben, gereinigt werden. Nach der wie in Beispiel 1 beschriebenen Reinigung auf Poros P150 zeigt ein Chromatogramm (13), dass die Daptomycinreinheit höher als 99,0% ist, wobei die Mengen des β-Isomers und von Anhydrodaptomycin unter der Nachweisgrenze (weniger als 0,05% des Gesamten) liegen. Es liegt eine nicht-identifizierte Verunreinigung in einer Menge von mehr als 0,1%, aber weniger als 0,5% vor.
Beispiel 9
Eine Fermentationskultur von S. roseosporus, NRRL Stamm 15998, wird in einer Fermentation mit kontrollierter Gabe von Decansäure bei Mengen, welche die Produktion des Antibiotikums optimieren und die Produktion von Verunreinigungen minimieren, durchgeführt. Die verbleibende Decansäuregabe wird mit Gaschromatographie gemessen, wobei die angestrebte verbleibende Menge von Beginn der Induzierung an (etwa bei Stunde 30) bis zum Ernten 10 ppm Decansäure beträgt. Zentrifugation der Kultur und nachfolgende Analyse der geklärten Brühe werden verwendet, um die Daptomycinproduktion mittels HPLC zu messen. Der Titer der geernteten Substanz beträgt üblicherweise zwischen 1,0 und 3,0 Gramm pro Liter der Fermentationsbrühe.
Die Fermentation wird entweder durch Mikrofiltration unter Verwendung eines Pall-Sep oder durch Zentrifugation in vollgewerblichem Maßstab und Tiefenfiltration geerntet. Die geklärte Brühe wird auf ein Anionenaustauscherharz, Mitsubishi FP-DA 13, aufgebracht, mit 30 mM NaCl mit einem pH-Wert von 6,5 gewaschen und mit 300 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,0–6,5 eluiert. Bei einer anderen Ausführungsform wird die FP-DA 13-Säule mit 60 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,5 gewaschen und mit 500 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,0–6,5 eluiert. Der pH-Wert wird auf 3,0 bis 4,8 und die Temperatur wird auf 2–15°C eingestellt. Unter diesen Bedingungen bildet Daptomycin Micellen. Die micellare Daptomycinlösung wird durch Waschen der micellaren Zubereitung gereinigt, wobei sie auf einem Ultrafilter unter Verwendung eines 10000 NMW-Filters (AG Technology Corp.-UF-Hohlfilter oder ein gleichwertiger Filter) von beliebiger Konfiguration zurückgehalten wird. Die Daptomycin-Micellen werden von dem Filter zurückgehalten, zahlreiche Verunreinigungen werden jedoch entfernt, da sie den 10000 NMW-Filter passieren. Die Ultrafiltration der Daptomycin-Micellen erhöht die Daptomycinreinheit von etwa 40% auf 80% oder mehr.
Das Eluat wird auf ein HIC-Harz, HP-20ss, aufgebracht, mit 30% Acetonitril gewaschen und mit 35% Acetonitril bei einem pH-Wert von 4,0–5,0 eluiert. Bei einer anderen Ausführungsform wird das HIC-Harz mit 20–30% Isopropylalkohol gewaschen und mit 30–40% Isopropylalkohol bei einem pH-Wert von 3,5–6,5 eluiert. Bei diesen Bedingungen von erhöhtem Lösungsmittel und einem höheren pH-Wert von 6,0–7,5 nimmt das Daptomycin wieder einen monomeren, nicht-micellaren Zustand an. Das Eluat wird auf eine Säule mit FP-DA 13-Harz aufgebracht und gewaschen und eluiert wie zuvor. Der letzte Anionenaustausch-Schritt verringert das Lösungsmittel um ein Drittel oder mehr. Eine Umkehrosmose-Diafiltration und Konzentrieren bei einem pH-Wert von 1,5–2,5 werden unter Verwendung eines 0,2 μm-Filters durchgeführt, anschließend wird die Daptomycinzubereitung eingefroren. Eine letzte Umkehrosmose-Diafiltration wird mit Wasser zur Injektion (WFI) durchgeführt, um das Daptomycin zu waschen und seine Konzentration vor dem sterilen Abfüllen einzustellen. Anschließend werden Fläschchen mit oder Massen von Daptomycin gefriergetrocknet.
Beispiel 10
Gefriergetrocknetes Daptomycin, das wie in einem beliebigen der vorstehend beschriebenen Beispiele gereinigt wurde, wie z. B. das von Beispiel 9, wird in physiologischer Kochsalzlösung (etwa 140 mM NaCl) bei einem pH-Wert von 4,0–5,0 rekonstituiert. Bei diesen Bedingungen liegt Daptomycin als Micellen vor und kann zur Injektion oder zur intravenösen, parenteralen, oralen oder topischen Verabreichung verwendet werden.
Beispiel 11
Daptomycin wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, durch Fermentation hergestellt und durch Mikrofiltration aus der Brühe geklärt. Die geklärte Brühe wird auf ein Anionenaustauscherharz, Mitsubishi FP-DA 13, aufgebracht, mit 30 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,5 gewaschen und mit 300 mM NaCl bei einem pH-Wert von 6,0–6,5 eluiert, um eine Daptomycinzubereitung mit einer Reinheit von etwa 40% zu ergeben. Das Eluat wird mit verdünnter Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt, so dass praktisch das gesamte Daptomycin Micellen bildet. Die Micellenzubereitung wird auf eine 10000 NMW-Ultrafiltrationsmembran aufgebracht. Die Daptomycinzubereitung wird mit 30 mM Natriumacetat bei einem pH-Wert von 3,5 und Temperaturen bis zu 15°C gewaschen. Die Volumenverringerung und das Waschen senken den Verunreinigungsgrad, wodurch eine Daptomycinzubereitung mit 85% Reinheit erhalten wird. Die Daptomycinzubereitung kann mit einem beliebigen der hier beschriebenen Verfahren weiter gereinigt werden.
Beispiel 12
Daptomycin wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, durch Fermentation hergestellt, durch Mikrofiltration aus der Brühe geklärt und auf dem FP-DA 13-Harz fraktioniert. Das Eluat wird mit verdünnter Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt, so dass praktisch das gesamte Daptomycin Micellen bildet. Die Micellenzubereitung wird auf eine 10000 NMW-Ultrafiltrationsmembran aufgebracht. Die Daptomycinzubereitung wird mit 30 mM Natriumacetat bei einem pH-Wert von 3,5 und Temperaturen bis zu 15°C gewaschen. Die Volumenverringerung und das Waschen senken den Verunreinigungsgrad, wodurch eine Daptomycinzubereitung mit 80–90% Reinheit erhalten wird. Die Daptomycinzubereitung kann mit einem beliebigen der hier beschriebenen Verfahren weiter gereinigt werden.
Beispiel 13
Daptomycin wird, wie in Beispiel 9 beschrieben, durch Fermentation hergestellt und durch Mikrofiltration aus der Brühe geklärt. Die Zubereitung wird unter Verwendung von hydrophober Chromatographie gereinigt, wie im US-Patent 4,874,843 beschrieben, das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Bei diesem Verfahren wird wiederholte Säulenchromatographie auf HP-20 und HP-20ss-Harz verwendet. Die Daptomycinreinheit beträgt 93% mit Verunreinigungen, die auf HPLC-Chromatogrammen erkennbar sind, und mit messbarem Pyrogen. Das Produkt wird mit Wasser verdünnt und der pH-Wert wird mit NaOH oder einem Äquivalent auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Die Daptomycinzubereitung wird durch eine 10000 NMW-Ultrafiltrationsmembran filtriert. Bei diesen Bedingungen liegt Daptomycin monomer vor und passiert die Ultrafiltrationsmembran. Das so erhaltene Produkt bleibt 93% rein, es sind jedoch mehrere Verunreinigungen, die mit 0,1–0,2% vorhanden waren, durch die Ultrafiltrationsmenbran entfernt worden. Außerdem ist der Pyrogengehalt auf nicht nachweisbare Mengen verringert.
Beispiel 14
Eine Daptomycinzubereitung mit etwa 93% Reinheit wird, wie in Beispiel 13 beschrieben, hergestellt. Die Daptomycinzubereitung wird durch Absenken des pH-Werts auf 4,7 mit HCl oder einem Äquivalenten und Abkühlen der Daptomycinzubereitung auf 2–5°C in einen micellaren Zustand überführt. Das Produkt wird durch Filtration auf einer 10000 NMW-Ultrafiltrationsmembran von 400 Liter auf drei Liter zu einer Endkonzentration von etwa 100 mg/ml konzentriert. Bei diesen Bedingungen wird Daptomycin von der Membran zurückgehalten. Dies führt zu einer starken Zunahme der Daptomycinkonzentration. Die Reinheit beträgt etwa 93%.
Beispiel 15
Eine Daptomycinzubereitung wird, wie in Beispiel 14 beschrieben, hergestellt. Es werden Fläschchen mit etwa 250 mg Daptomycin gefüllt und gefriergetrocknet. Das Daptomycin wird in 50 ml steriler 150 mM Kochsalzlösung mit einem pH-Wert von 4,0–5,0 zur Verabreichung an einen menschlichen Patienten oder einen Tierpatienten rekonstituiert. Die verabreichte Daptomycindosis wird von der Beschaffenheit der Infektion, dem Alter und dem Gewicht des Patienten und von der Tierart abhängen. Bei einem pH-Wert von 4,0–5,0 in 150 mM Kochsalzlösung wird das Daptomycin in einem micellaren Zustand vorliegen, der löslich und zur intravenösen, intramuskulären oder parenteralen Injektion geeignet ist. Die Formulierung wird lokale Irritationen durch die Lipopeptidbeschaffenheit von Daptomycin minimieren.
Beispiel 16
Daptomycin-Micellen wurden unter Verwendung von Daptomycin mit einer Konzentration von 1,0 mg/ml in Wasser bei einem pH-Wert von 4,0 und 25°C hergestellt. Die Abmessung einer Daptomycin-Micelle wurde unter Verwendung eines Zetasizer^TM-Geräts (Malvern Instruments, Model 3000 HS) gemessen. Die Zählrate betrug 36,3, die Zelle war vom Kapillarzellen-Typ, der Detektionswinkel (Grad) betrug 90°, die Wellenlänge (nm) betrug 633. Die Ergebnisse zeigten, dass der Durchmesser der Micelle 54 Å betrug, was etwa dem zweifachen Durchmesser eines einzelnen monomeren Daptomycinmoleküls entspricht; siehe 18.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, auf die in dieser Beschreibung verwiesen wird, sind hier durch Bezugnahme aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung ausdrücklich und einzeln dafür gekennzeichnet wäre, durch Bezugnahme aufgenommen zu werden. Obwohl die vorstehende Erfindung durch Erläuterungen und Beispiele zum Zweck der Klarheit und des Verständnisses in einiger Ausführlichkeit beschrieben worden ist, wird der Fachmann aus den Lehren dieser Erfindung leicht erkennen, dass daran bestimmte Veränderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne vom Geist oder dem Umfang der anhängenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

Verfahren zum Reinigen von Daptomycin, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen einer Daptomycinzubereitung, die mindestens 2,5% einer kombinierten Menge von Anhydro-Daptomycin und dem β-Isomer von Daptomycin enthält; b) Binden der Daptomycinzubereitung an ein Anionenaustauscherharz in Gegenwart eines modifizierten Puffers unter Bedingungen, bei welchen Daptomycin an das Anionenaustauscherharz in einem monomeren und nicht-micellaren Zustand bindet, wobei der modifizierte Puffer ein Pufferagens, ausgewählt aus Acetat, Phosphat, Citrat und Tris-HCl, und ein oder mehrere chaotrope Mittel, ausgewählt aus Ammoniak, Harnstoff, Benzoat und Ascorbat, umfasst; c) Waschen des Anionenaustauscherharzes in Gegenwart des modifizierten Puffers unter Bedingungen, die Anhydro-Daptomycin eluieren aber Dayptomycin zurückbehalten; d) Eluieren von Daptomycin in Gegenwart des modifizierten Puffers unter Bedingungen, die das gereinigte Daptomycin von dem β-Isomer von Daptomycin trennen; und e) Erhalten von gereinigtem Daptomycin.
Verfahren gemäß Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt des Filtrierens und Konzentrierens des eluierten Daptomycins.
Verfahren zum Reinigen von Daptomycin, umfassend die Schritte: a) Fermentieren von Streptomyces reseosporus mit einer Gabe von n-Decansäure, um Daptomycin in der Fermentationsbrühe herzustellen; b) Klären der Fermentationsbrühe; c) Durchführen einer Anionenaustauschchromatographie mit der Fermentationsbrühe, um eine angereicherte Daptomycinzubereitung zu erhalten; d) Durchführen einer hydrophoben Chromatographie mit der angereicherten Daptomycinzubereitung, um eine halbgereinigte Daptomycinzubereitung zu erhalten; und e) Durchführen einer mit einem modifizierten Puffer verbesserten Anionenaustauschchromatographie mit der halbgereinigten Daptomycinzubereitung, wobei der modifizierte Puffer ein Pufferagens, ausgewählt aus Acetat, Phosphat, Citrat und Tris-HCl, und ein oder mehrere chaotrope Mittel, ausgewählt aus Ammoniak, Harnstoff, Benzoat und Ascorbat, umfasst, um gereinigtes Daptomycin zu erhalten.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die Gabe an n-Decansäure in Schritt a) reguliert wird, um eine verbleibende Konzentration von n-Decansäure von nicht mehr als 50 Teile pro Million (ppm) bei der Fermentation zu erreichen; das Klären in Schritt b) Extrahieren der Fermentationsbrühe mit einem Butanol umfassenden Puffer umfasst; die Anionenaustauschchromatographie in Schritt c) auf FP-DA 13-Harz durchgeführt wird; oder einer der oder beide Schritte c) oder e) die Verwendung eines kontinuierlichen Salzgradienten oder eines stufenweisen Salzgradienten umfassen.
Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei die mit einem modifizierten Puffer verbesserte Anionenaustauschchromatographie in Schritt e) die Schritte umfasst: i) Bereitstellen der halbgereinigten Daptomycinzubereitung aus Schritt d) in einem für die mit einem modifizierten Puffer verbesserte Anionenaustauschchromatographie geeigneten Puffer; ii) Binden der Daptomycinzubereitung an ein Anionentauscherharz in Gegenwart des modifizierten Puffers unter Bedingungen, bei welchen Daptomycin an das Anionenaustauscherharz in einem monomeren und nicht-micellaren Zustand bindet; iii) Waschen des Anionentauscherharzes in Gegenwart des modifizierten Puffers unter Bedingungen, die Anhydro-Daptomycin eluieren, aber Daptomycin zurückhalten; und iv) Eluieren von Daptomycin in Gegenwart des modifizierten Puffers unter Bedingungen, die die Abtrennung von Daptomycin vom β-Isomer erlauben.
Verfahren gemäß Anspruch 3, weiterhin umfassend: den Schritt der Anionenaustauschchromatographie vor dem Schritt e); oder den Schritt des Filtrierens und/oder Konzentrierens von Daptomycin.
Verfahren gemäß Anspruch 3, weiterhin umfassend den Schritt des Depyrogenierens von Daptomycin.
Verfahren gemäß Anspruch 7, weiterhin umfassend den Schritt des Gefriertrocknens von Daptomycin.