CN109917047A - 超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明超高效液相色谱‑四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，同时筛查的多类别药物为恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B，通过优化d‑SPE前处理方法的参数以保证所有目标药物均获得良好的回收率，用优化后的色谱质谱条件对29种目标药物同时进行筛查，可实现鱼中常见多类别药物残留的同时筛查，在鱼类食品领域具有较好的应用前景。

Description

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类 别药物残留的方法

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体为超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法。

背景技术

鱼及鱼类制品为主要饮食来源之一，也是食品安全事件的高发种类。近两年来问题频频发生，《中国食品安全发展报告2016》指出，虾及鱼等13种水产品存在安全问题，其合格率持续3年低于96％，安全系数有待提高。鱼类食品质量安全存在的首要问题为药物残留超标。近年来个别无良商家在渔业增养殖过程中，不遵循农业部颁发的NY 5071-2002《无公害食品渔用药物使用准则》，忽视水域生态环境状况，在投放饲料及使用渔用药物过程中，存在滥用、盲目增大用量或用药时间等问题，从而引发水质恶化，导致各类疾病产生，继而再次违规用药，形成恶性循环。

目前常见的药物残留主要有喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、磺胺类、氯霉素类等抗生素及苏丹红、罗丹明等色素类药物，这些药物会通过食物链最终传递给人和动物，从而影响人类健康，导致身体免疫力下降，损害神经系统、内分泌及生殖系统等；同时影响水产品产量及进出口，致使产品产量大幅度下降；还会影响土壤、水和空气等自然环境，因此有必要对鱼中常见的药物残留进行筛查，然而现有技术多为单一药物的筛查，缺乏同时筛查恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B共6类29种药物的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，操作简单、分辨率高、定性与定量结果准确、灵敏度高、质量精度高，在鱼类食品领域中具有较好的应用前景。

本发明通过以下技术方案来实现：

超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，所述同时筛查的多类别药物为恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B，包括以下步骤：

步骤1，向鱼样品中依次加入甲醇和乙酸酸化的乙腈水溶液得到混合体系A，向混合体系A中加入Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液后混合均匀得到混合体系B，其中鱼样品取样量、甲醇体积、混合体系A体积和Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液体积四个参数的比例为(1.0～5.0g)：(2.0～3.0mL)：12.5mL：2.5mL；

所述乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈与水的体积比为84:16，乙酸体积占乙腈水溶液体积的1％；

所述Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH＝4.0±0.1；

步骤2，向混合体系B加入3.0～6.0g无水硫酸镁、1.9g乙酸钠和1.5g氯化钠，混合均匀后离心得到上清液A；

步骤3，向上清液A中加入0.4g C18、0.4g PSA和0.1～0.5g无水硫酸镁，混合均匀后离心得到上清液B，将上清液B用0.22μm滤膜过滤后得到空白基质样液；

步骤4，采用空白基质样液稀释混合标准储备液至150μg/kg～750μg/kg得到混合体系C，采用流动相B稀释混合标准储备液至150μg/kg～750μg/kg得到混合体系D，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪，对混合体系C和混合体系D进行全扫描分析，与所述同时筛查的多类别药物的标准物质保留时间比对，对所述同时筛查的多类别药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法对所述药物进行定量分析；

其中，色谱柱型号为Thermo Hypersil GOLD AQ，规格为100mm×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序为：0.0～1.0min时，流动相A的比例保持100％；1.0～7.0min时，流动相A的比例由100％线性减少至0％；7.0～15.0min时，流动相A的比例保持0％；15.0～17.0min时，流动相A的比例由0％线性增加至100％；17.0～25.0min内，流动相A的比例保持100％；流速为0.3mL/min；进样量为10.0μL；

混合标准储备液的浓度为1μg/mL，所述同时筛查的多类别药物标准物质的溶剂为甲醇、100％的流动相A、100％的流动相B、体积份数为80％的流动相B+体积份数为20％的流动相A、体积份数为60％的流动相B+体积份数为40％的流动相A、体积份数为40％的流动相B+体积份数为60％的流动相A、体积份数为20％的流动相B+体积份数为80％的流动相A和乙腈中的任意一种；

质谱条件为：采用电喷雾离子源，于ESI⁺模式和ESI^-模式下检测，采用ESI⁺模式时毛细管电压为4.0kV，采用ESI^-模式时毛细管电压为3.5kV；ESI⁺模式和ESI^-模式下的其余共同参数如下：

喷嘴电压为1.0kV；干燥气温度为280.0℃；干燥气流量为13.0L/min；雾化气压力为20.0psi；鞘气温度为350.0℃；鞘气流量为12.0L/min，采用氮气作为雾化气、干燥气和鞘气，其中恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B的电离模式为ESI⁺，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的电离模式为ESI^-。

优选的，所述标准物质的溶剂为100％流动相B。

优选的，步骤2和步骤3的离心转速和离心时间均分别为6000～10000r/min和5～10min。

优选的，步骤1、步骤2和步骤3均通过震荡和涡旋混合均匀。

优选的，所述的鱼样品为均质后的样品。

优选的，所述的鱼样品采用鳕鱼。

优选的，所述的样品为肌肉样品。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，药物包含喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、磺胺类、氯霉素类和色素类共6类29种药物，通过优化d-SPE前处理方法的参数，以保证所有目标药物均获得良好的回收率；利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，采用优化后的色谱质谱条件，结合一级质谱全扫描及基质匹配标准校正法对29种目标药物同时进行筛查，可实现鱼中常见药物残留的同时筛查，在鱼类食品领域中具有较好的应用前景。

进一步的，标准物质的溶剂为100％流动相B，流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，各类目标药物在甲醇中具有更好地溶解度，且使用甲酸-甲酸铵缓冲体系将溶液酸度控制在了pH为3.0～4.0的范围内，各药物在该条件下具有良好的稳定性，提高了各药物的电离度及检测的灵敏度，目标药物可获得最佳峰形及响应强度。

进一步的，样品经均质后能真实反映鱼体内的药物含量，提高筛查的准确性。

附图说明

图1为本发明的四环素类物质在不同成分提取剂下的回收率，其中重复试验次数n＝6。

图2为本发明的恩诺沙星、四环素、氯霉素、磺胺嘧啶、替米考星及苏丹红Ⅲ在不同除水剂下的回收率，其中重复试验次数n＝6。

图3为本发明的磺胺甲噻二唑在不同C18和PSA用量组合作用下的回收率，其中重复试验次数n＝6。

图4为本发明不同色谱柱下四环素及强力霉素的质谱图。

图5为本发明不同成分标准溶剂下恩诺沙星的峰面积，其中重复试验次数n＝6。

图6为本发明采用HPLC-Q-TOF-MS法得到的四环素类物质色谱图，其中加标浓度为150μg/kg。

图7为本发明以溶剂标准曲线及基质匹配标准曲线比值考察恩诺沙星基质效应图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而非限定。

质谱技术具有特异性高及灵敏度高的特点，质谱技术的迅速发展为传统的单一药物检测提供了突破性的进展，质谱技术与色谱技术联用可对多种甚至多类别目标药物同时进行痕量分析，避免了最初依靠色谱法测定一种或几种药物的繁琐。四极杆飞行时间质谱，即Q-TOF-MS，为兼具高分离度及超高质量精确度、具备飞克级灵敏度的高分辨质谱仪，具备高达5个数量级的谱图内动态范围，可准确分析和筛查包含痕量及更高丰度的目标药物组分，分析速度高达50幅谱图/秒，灵敏度较高，可实现复杂背景下的高通量筛查分析，适用于鱼类复杂基质背景下多类别风险药物的筛查和确证分析。

d-SPE前处理方法是一种适用于药物多残留分析的新型样品制备方法，可同时完成样品分离净化与浓缩，节省时间、能提高检测效率和节省溶剂，具有重现性较好和可批量处理等特点。本发明对d-SPE前处理方法进行了优化，鳕鱼为全世界年捕捞量最大的鱼类之一，具有重要的食用和经济价值，有必要对鳕鱼体内外源性风险物质进行筛查，因此以鳕鱼为代表，建立了同时筛查鱼体内喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、大环内酯类和色素类6类29种风险残留药物的方法，为渔业养殖监管提供了理论依据，为监控鱼类食品安全提供了技术支持。

本发明提供了一种超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼体内多类别药物残留的方法，包括如下内容：

第一，以鳕鱼为基质，以喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、大环内酯类和色素类6类29种药物为目标药物，利用d-SPE前处理法，针对缓冲体系的选择、除水剂与固体分散净化剂的选择及用量方面进行优化，以保证所有目标药物均获得良好的回收率；

第二，运用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法对鳕鱼中目标药物进行一级质谱扫描及二级质谱扫描，对29种目标药物进行定性、定量及确证分析；

第三，对所建立的筛查方法进行多方面方法学参数验证，具体包括基质效应、线性范围、检出限、定量限、回收率及精密度。

1.样品的d-SPE前处理

d-SPE样品前处理过程的本质为通过固液萃取手段，利用除水剂及吸附剂与基质中的水分、杂质等充分作用，从而去除水分及各类杂质，达到净化的目的。方法的关键控制点主要为缓冲体系的选择、除水剂与固体吸附剂的选择及用量，本发明通过单因素实验对以上参数进行了优化。

a.提取溶液的优化

本发明在样品提取过程中使用乙酸-乙酸钠缓冲体系，含体积百分比为1％乙酸及体积百分比为16％水的酸化乙腈提取溶液作为提取溶液，通过在15mL提取液中加入1.9g无水乙酸钠，将酸性溶液体系的pH值维持在4.5～4.8范围内，以避免样品提取、除水及净化过程中，在酸性或碱性条件下易分解的不稳定目标分析物因溶液酸性变化过大而造成不必要的分解。该缓冲体系较强，所测目标物在该酸性条件下均具有良好的稳定性，且除四环素类物质外，其余目标物均获得了较好的回收率。四环素类药物在该过程中大量损失，回收率小于10％。考虑到四环素类药物的结构属于氢化并四苯环衍生物，含有许多羟基(即-OH)、烯醇(即C＝C-OH)及羰基(即-C＝O-)，该官能团可与多种金属离子形成有色螯合沉淀物，其中C₁₀酚羟基和C₁₂烯醇基能与金属离子如Ca²⁺、Mg²⁺等形成不溶性的钙盐或镁盐，与Fe³⁺形成红色络合物，与Al³⁺形成黄色络合物。鱼基质中含有一定量的Ca²⁺及Mg²⁺，同时因无水硫酸镁作为盐析剂引入了大量Mg²⁺，导致四环素类药物与Ca²⁺、Mg²⁺络合沉淀，无法萃取至乙腈层中，故在提取过程中引入2.5mL 0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine溶液，采用EDTA螯合溶液中的Ca²⁺和Mg²⁺，释放四环素类药物进入溶液参与萃取过程。

当引入Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液后，样液出现分层现象，过程中观察到下层液体相比于上层液体，溶液混浊且体积较小，因此，本发明于前处理初期，在样品中引入2.5mL甲醇。结果显示经甲醇、酸化乙腈及Na₂EDTA-Mcllvaine三种溶剂综合提取后，再配合C18及PSA两种固体分散净化剂的作用，有效沉淀了样品基质中的蛋白质、脂肪、色素等物质，增强了净化效果。取上清液上机检测，四环素类4种物质的回收率得到明显改善，如图1所示。其余5类25种物质回收率亦相对较高，即大于80％。

b.除水剂的选择

无水硫酸镁和无水硫酸钠为两种常用除水剂，因其均表现为中性，故加入样品体系后，不会引起体系pH值的波动，且不和体系中其他药物作用，故初步选择无水硫酸镁或无水硫酸钠作为鳕鱼样品的除水剂。无水硫酸镁吸水后可形成七水合硫酸镁，3g无水硫酸镁的吸水量为3.15g水，无水硫酸钠吸水后可形成十水合硫酸钠(Na₂SO₄·10H₂O)，相同质量下的吸水量3.87g，除水效果为无水硫酸镁的1.2倍，但无水硫酸镁的吸水速率高于无水硫酸钠，故在除水过程中，对无水硫酸钠及无水硫酸镁的除水效果进行了比较，分别以3g无水硫酸钠或无水硫酸镁作为除水剂，加入1.5g氯化钠来中和蛋白质等杂质表面的电荷，从而使蛋白质大量聚集而凝结析出，起盐析作用。将样液震荡及涡旋10min以充分作用，以恩诺沙星、四环素、氯霉素、磺胺嘧啶、替米考星及苏丹红Ⅲ的回收率为考察指标，加标浓度为150μg/kg，考察无水硫酸钠和无水硫酸镁两种除水剂对鳕鱼样品的除水效率。由图2可知，使用无水硫酸镁除水时，以上六种物质的回收率稍高于无水硫酸钠，在较短时间内表现出了较明显的优势，更符合本发明快速、高效的主旨；且在样品提取过程中，因无水硫酸镁的粒径小于无水硫酸钠，经震荡、涡旋及高速离心后，加大了溶剂与样品的接触面积，从而提高了除水效率。实验后期的净化步骤中所使用的PSA为正向吸附剂，该吸附剂在水含量较低的环境中除杂效率更高，做好前期除水工作对后期除杂具有一定影响。同时，观察实验过程发现，采用无水硫酸镁作为除水剂时，在前处理过程可得到界面清晰的有机相层，而无水硫酸钠则时常出现乳化层。因此实验中选择无水硫酸镁作为除水剂。

c.吸附剂的选择

鳕鱼肉样品基质中含有大量完全蛋白质，所占比例为10％～25％、少量脂肪，所占比例为1％～4％、维生素及金属离子等成分，其基质相对复杂，加大了前处理净化的难度。故本发明在净化过程中，采用多种不同类型的分散固相吸附剂，针对性地对鳕鱼样品中不同类型杂质进行净化。PSA为正相固体吸附剂，主要用来吸附中等极性杂质与极性杂质，有利于去除鳕鱼中大量完全蛋白质及少量脂肪的干扰；C18为反相固体吸附剂，主要吸附脂类等非极性杂质，有利于去除鳕鱼基质中的不饱和脂肪酸、有机酸等杂质的干扰。故本发明同时采用C18与PSA两种吸附剂，以提高净化效率。同时对两种吸附剂的用量进行了优化，以磺胺甲噻二唑的回收率为考察指标，加标浓度为150μg/kg，探究了PSA和C18填料的用量对目标药物净化效率的影响。使用以下5个不同固体分散净化剂使用量组合：1)100mg C18+100mg PSA；2)200mg C18+200mg PSA；3)400mg C18+400mg PSA；4)800mg C18+800mg PSA；5)1200mg C18+1200mg PSA。结果如图3所示，添加400mg PSA与400mg C18时，磺胺甲噻二唑的回收率最佳，添加过少，则净化不完全，导致基质效应加大；添加过多，回收率出现减少的现象。同时，通过实验证明了单独使用两种吸附剂，吸附效果将大大降低，单独使用C18或PSA，均会因基质中杂质干扰而导致目标药物基质效应增强。故选择400mg PSA+400mg C18组合作为固体分散净化剂来进行进一步分析。

在具体操作时，称取经均质后的鳕鱼肌肉样品1.0～5.0g于50mL离心管中，加入2.0～3.0mL甲醇，采用乙酸酸化的乙腈水溶液定容至12.5mL，乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈和水的体积比为84:16，乙酸体积占乙酸酸化的乙腈水溶液体积的1％，再加入2.5mL浓度为0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，震荡并涡旋，实现均匀混合；加入无水硫酸镁3.0～6.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡并涡旋，在6000～10000r/min的转速下离心5～10min；取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.1～0.5g无水硫酸镁，涡旋和震荡，在6000～10000r/min的转速下离心5～10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，得到空白基质样液。

共分析检测26个鳕鱼样品，该产品从不同的零售商业点获得，并按照上述方法进行分析。

2.色谱质谱分析

a.色谱柱的选择

本发明对比了Thermo Hypersil GOLD AQ柱和岛津公司Inertsil ODS-3柱的分离效果，Thermo Hypersil GOLD AQ柱的规格为：长度：100mm，内径：4.6mm，填料粒径：5μm；Inertsil ODS-3柱的规格为：长度：150mm，内径：4.6mm，填料粒径：5μm。从理论上分析，Thermo Hypersil GOLD AQ柱具有以下特点：1)对极性药物具有良好的保留及分离度；2)采用高纯硅胶制造，峰形较好且对称，可对结构相近的药物进行分离；3)是流动相中水比例高时的理想选择，采用极性包埋C18键合相技术，增加了反向基质的水可润性，不会造成“疏水塌陷”，可在100％水溶液条件下使用，不会引起柱效下降或不稳定等问题。Inertsil ODS-3柱具有以下特点：1)重现性高：不同批次间色谱柱具有优异的重现性；2)低柱压：硅胶颗粒为球形表面，颗粒大小几乎一致，不会因微小粒子的存在而引发柱压上升的问题，使用压力较低，耐受性和寿命因此延长；3)高惰性：硅胶表面残存的硅羟基易引起极性药物，尤其是碱性药物的拖尾，该柱采用端基封尾技术，屏蔽了残余的硅醇基，最大限度地减少了因硅醇基残留所引起的次级作用。将以上两个色谱柱均应用于实验中，结果表明：采用两种色谱柱均获得了良好的重现性及峰形，无拖尾；后者在实验中的使用压力比前者小8～12倍，但由于Thermo Hypersil GOLD AQ柱对结构相近的药物具有分离优势，故能分离四环素及强力霉素两种同分异构体，确保了所有类型分析物均具有较高的分离度与灵敏度，如图4所示；本发明采用梯度洗脱，水相比例最高可达100％，考虑到柱效及稳定性的问题，本发明最终选用Thermo Hypersil GOLD AQ柱进行下一步分析。

b.标准溶液溶剂的选择

本发明在配制标准溶液过程中对比了以下不同类型的溶剂：1)甲醇；2)

100％的流动相A；3)100％的流动相B；4)体积份数为80％的流动相B+体积份数为20％的流动相A；5)体积份数为60％的流动相B+体积份数为40％的流动相A；6)体积份数为40％的流动相B+体积份数为60％的流动相A；7)体积份数为20％的流动相B+体积份数为80％的流动相A；8)乙腈。结果表明，相对于混合溶剂，采用甲醇、乙腈、流动相A及流动相B等纯溶剂时29种目标药物具有更好的峰形，以流动相A或流动相B作为溶剂时，四环素和金霉素的峰形较差；与纯溶剂相比，喹诺酮类、四环素类、大环内酯类药物在混合溶剂中的峰面积偏小；在4)～7)中流动相B含量越高，峰面积越小，以恩诺沙星为例，如图5所示。因此，初步选择甲醇、乙腈、流动相A和流动相B进行进一步筛选。结果表明，相对于甲醇，以乙腈为溶剂时，土霉素的峰面积较小，而杂峰响应值变大；以流动相A作为溶剂时，磺胺类药物峰面积较小；而以纯流动相B作为溶剂时，所有目标药物的峰面积均增大，差别以四环素类最为明显。原因是各类目标药物在甲醇中具有更好地溶解度，且使用甲酸-甲酸铵缓冲体系将溶液酸度控制在了pH为3.0～4.0的范围内，各药物在该条件下具有良好的稳定性，且提高了电离度及灵敏度。因此，选择流动相B溶液作为标准品的最佳溶剂。

c.质谱条件的优化

本发明采用一级质谱采集模式对目标药物进行全扫描分析，通过与标准物质保留时间比对的途径，对29种目标药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法定量分析。采用正离子电离模式对喹诺酮类、四环素类、色素类、磺胺类、大环内酯类5类26种目标药物进行分析。氯霉素类药物因含有酚羟基，可失去电子而在ESI^-模式下更易离子化，其余药物因含有羰基等多电子基团而在ESI⁺模式下更易电离。采用空白基质样液稀释混合标准储备液至150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg得到混合体系C，用流动相B稀释混合标准储备液至150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg得到混合体系D，将混合体系C和混合体系D采用直接进样方式进行全扫描，得到各个物质的分子离子峰，所有物质的峰形相对良好，且峰形对称，分离度良好，值得强调的是四环素及强力霉素两种同分异构体被成功分离，如图6所示，其中四环素及强力霉素分别在8.04min、9.26min出峰。6类29种目标药物的标准物质保留时间见表1。

采用目标二级质谱，以单独进样方式，分别将29种目标药物在以下碰撞能下进行扫描：10eV、20eV、30eV、40eV、50eV及60eV，以对各个药物的碰撞能进行优化。选择响应程度最高的两个碎裂子离子分别作为定量离子及定性离子，对目标药物进行确证分析，所得喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、大环内酯类及色素类6类29种目标药物的碰撞能及碎裂子离子信息见表1。

表1 29种目标药物的相关技术指标

检测仪器：美国Angilent公司的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，其中配有电喷雾离子源。

色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil GOLD AQ柱，参数为100mm×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序为0.0～1.0min，100％A，1.0～7.0min，100％～0％A，7.0～15.0min，0％A，15.0～17.0min，0％～100％A，17.0～25.0min，100％A；流速为0.3mL/min；进样量为10.0μL。

质谱条件

采用电喷雾离子源，离子源为ESI⁺和ESI^-，当离子源为ESI⁺时毛细管电压为4.0kV，当离子源为ESI^-时毛细管电压为3.5kV；喷嘴电压为1.0kV；干燥气温度为280.0℃；干燥气流量为13.0L/min；雾化气压力为20.0psi；鞘气温度为350.0℃；鞘气流量为12.0L/min，采用氮气作为雾化气、干燥气及鞘气。

采用目标二级质谱模式对29种目标药物进行分析，以获得目标药物的特征碎裂离子。该模式在离子全通过和离子检测模式之间切换，采用单次进样方式，针对每种目标药物对碰撞能进行优化，以获得目标药物的特征碎裂离子，每种药物至少监测两个碎裂离子，对目标药物进行确证分析，采用名称为B.06.00版安捷伦Mass Hunter定性分析的软件对数据进行处理。

3.溶液配制

a.标准溶液的配制

标准储备液：分别称取上述29种目标药物标准品各0.01g，用流动相B混合溶液定容至100mL，配制成浓度为100μg/mL的溶液，其中流动相B混合溶液中，甲酸的浓度为0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L，标准储备液用该混合溶液配制，与其他7个不同类型的溶剂相比，目标药物可获得最佳峰形及响应强度。将以上浓度为100μg/mL的标准储备溶液均储存于-20℃下待用。实验中根据需要配制不同浓度的系列标准工作液，现用现配。

混合标准储备液：分别移取上述各种单一标准储备液1mL于同一100mL容量瓶中，用甲醇定容，得到1μg/mL的混合标准储备液，并于-20℃冰箱中密封保存、备用。

b.0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的配制：

配制0.1mol/L柠檬酸缓冲溶液：称取2.1g柠檬酸于100mL容量瓶中，加水溶解并定容；配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，称取2.8g无水磷酸氢二钠于100mL容量瓶中，加水溶解并定容；将100mL 0.1mol/L柠檬酸溶液与62.5mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液混合，并加入6.1g Na₂EDTA溶解，混合均匀后采用NaOH调节pH＝4.0±0.1。

4.方法学验证

a.方法的标准曲线、检出限和定量限

在空白基质样液中分别添加150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg系列浓度的混合标准储备液，按上述色谱条件和质谱条件进行检测，统计各个物质在不同浓度下的回收率。以峰面积作为纵坐标，浓度为横坐标，绘制曲线，得到该方法在150μg/kg～750μg/kg线性范围内的线性回归方程及相关系数，如表1所示。

结果表明，29种药物在该范围内线性关系良好，相关系数R²均大于0.97。分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算鳕鱼中29种目标药物的检出限及定量限，如表2所示，喹诺酮类药物中，恩诺沙星的检出限和定量限分别为0.36μg/kg和1.20μg/kg，达氟沙星的检出限和定量限分别为0.31μg/kg和1.03μg/kg；四环素类药物的检出限最小值为10.81μg/kg，最大值为16.37μg/kg，定量限的最小值为36.03μg/kg，最大值为54.57μg/kg；氯霉素类药物的检出限最小值为0.55μg/kg，最大值为1.20μg/kg，定量限的最小值为1.83μg/kg，最大值为4.00μg/kg；磺胺类药物的检出限最小值为1.07μg/kg，最大值为3.06μg/kg，定量限的最小值为3.57，最大值为10.02μg/kg；大环内酯类药物的检出限最小值为0.51μg/kg，最大值为1.19μg/kg，定量限的最小值为1.70μg/kg，最大值为3.97μg/kg之间；色素类药物的检出限最小值为0.18μg/kg，最大值为5.30μg/kg，定量限的最小值为0.60μg/kg，最大值为17.67μg/kg。

表2 29种药物的检出限、定量限、回收率及日内精密度

R：回收率/％；RSD：相对标准偏差/％

b.基质效应

本发明选取鳕鱼样品考察基质效应。通过绘制溶剂标准曲线C_S及基质匹配标准曲线C_m，并计算其斜率比值，对每种目标物质的基质效应进行评价。采用公式1计算检测方法的基质效应X％：

式中：

X％——基质效应；

C_S——用由甲醇、甲酸和甲酸铵组成的流动相B稀释混合标准储备液所得的标准曲线斜率，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；

C_m——采用空白基质样液稀释混合标准储备液所得的标准曲线斜率。

采用空白基质样液稀释混合标准储备液至150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg得到5个混合体系，采用流动相B稀释混合标准储备液至150μg/kg、300μg/kg、450μg/kg、600μg/kg和750μg/kg得到5个混合体系，将浓度相同的混合体系一同上机测定。由于d-SPE法可分析的药物种类广、净化效果好，为目前风险药物残留分析中最为有效的净化方法，适合多种类药物的同时分析。故在前处理中，采用分散固相萃取法净化基质，与基质匹配标准校正法结合，将鳕鱼样品基质效应降低，最大限度地消除了基质效应对定量过程准确性的影响。从表1可知，空白鳕鱼基质中喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、大环内酯类及色素类药物基质效应值的最小值和最大值依次分别为-11.08和6.17、-17.23和12.27、-4.88和15.69、-12.39和13.82、-6.82和17.00及-11.55和12.81，基质效应较弱。以恩诺沙星为例，如图7所示。

c.方法的加标回收率与精密度

称取1g空白基质样液，29种药物的加标浓度为150μg/kg、300μg/kg及450μg/kg。按照上述色谱条件和质谱条件进行检测，考察该方法的回收率、日内精密度及日间精密度。于同一天不同时间点测定3次，每次进行3组平行实验，来确定日内精密度；将同样的步骤于同样条件下连续测定3天，来确定日间精密度，由表2和表3可知，喹诺酮类药物的回收率为81.6％～98.7％，其日内RSD和日间RSD范围分别为4.24％～11.94％和7.80％～11.65％；四环素类药物的平均回收率为82.9％～101.2％，其日内RSD和日间RSD范围分别为5.01％～9.34％和5.10％～11.92％；氯霉素类药物的回收率为81.6％～103.1％，其RSD日内和日间RSD范围分别为2.82％～8.43％和2.20％～9.95％；磺胺类药物的回收率为77.8％～106.3％，其日内RSD和日间RSD范围分别为1.29％～9.54％和1.14％～11.03％；大环内酯类药物的回收率为76.1％～105.6％，其RSD日内和日间RSD范围分别为3.96％～9.49％和2.33％～10.54％；色素类药物的回收率为77.8％～106.1％，其RSD日内和日间RSD范围分别为1.04％～9.51％和2.57％～11.33％。表明所建方法具有良好的回收率及精密度。

表3 29种药物的回收率及日间精密度

R：回收率/％；RSD：相对标准偏差/％

为了验证本发明所建立方法的实用性及适用性，对市售26个鳕鱼样品中每个鳕鱼样品6类中总共29种目标药物进行定量定性分析，结果共筛查出阳性样品3份，检出率为11.54％，如表4所示。

表4 3份阳性样品中各目标物质含量统计(n＝6)

其中筛查出四环素2份，含量分别为46μg/kg和53μg/kg；金霉素筛查出1份，含量为73μg/kg，具体过程见实施例1～实施例3。

实施例1

称取经均质鳕鱼肌肉样品A 2.0g于50mL离心管中，加入2.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至12.5mL，其中乙腈水溶液含0.1％乙酸及16％的水，再加入2.5mL0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，震荡并涡旋；加入无水硫酸镁3.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于6000r/min离心8min；取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.1g无水硫酸镁，涡旋震荡，于6000r/min离心8min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，得到空白基质样液A。用一级质谱采集模式对目标药物进行全扫描分析，通过与表1中所示标准物质保留时间比对的途径，对29种目标药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法定量分析。采用正离子电离模式对喹诺酮类、四环素类、色素类、磺胺类、大环内酯类5类26种目标药物进行分析。采用负离子模式对氯霉素类药物进行分析。定量结果显示样品A中检出四环素，经计算得四环素药物含量为46μg/kg，RSD值为1.5％。

实施例2

称取经均质鳕鱼肌肉样品B 5.0g于50mL离心管中，加入3.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至12.5mL，其中乙腈水溶液含0.1％乙酸及16％的水，再加入2.5mL0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，震荡并涡旋；加入无水硫酸镁6.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于8000r/min离心10min；取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.5g无水硫酸镁，涡旋震荡，于8000r/min离心10min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，得到空白基质样液B。用一级质谱采集模式对目标药物进行全扫描分析，通过与表1中所示标准物质保留时间比对的途径，对29种目标药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法定量分析。采用正离子电离模式对喹诺酮类、四环素类、色素类、磺胺类、大环内酯类5类26种目标药物进行分析。采用负离子模式对氯霉素类药物进行分析。结果显示，在样品B中检出四环素，含量为53μg/kg，RSD值为2.3％。

实施例3

称取经均质鳕鱼肌肉样品C 3.0g于50mL离心管中，加入2.5mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至12.5mL，其中乙腈水溶液含0.1％乙酸及16％的水，再加入2.5mL0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，震荡并涡旋；加入无水硫酸镁6.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于8000r/min离心6min；取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.3g无水硫酸镁，涡旋震荡，于7000r/min离心6min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，得到空白基质样液C。用一级质谱采集模式对目标药物进行全扫描分析，通过与表1中所示标准物质保留时间比对的途径，对29种目标药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法定量分析。采用正离子电离模式对喹诺酮类、四环素类、色素类、磺胺类、大环内酯类5类26种目标药物进行分析。采用负离子模式对氯霉素类药物进行分析。定量结果显示样品C中检出金霉素，经计算得金霉素药物含量为73μg/kg，RSD值为1.9％。

实施例4

称取经均质鳕鱼肌肉样品D 1.0g于50mL离心管中，加入2.0mL甲醇，采用经乙酸酸化的乙腈水溶液定容至12.5mL，其中乙腈水溶液含0.1％乙酸及16％的水，再加入2.5mL0.1mol/L且pH＝4.0±0.1的Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，震荡并涡旋；加入无水硫酸镁4.0g、乙酸钠1.9g及氯化钠1.5g，震荡涡旋，于7000r/min离心5min；取上清液至试管中，加入C18 0.4g、PSA 0.4g及0.2g无水硫酸镁，涡旋震荡，于7000r/min离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤后，得到空白基质样液D。用一级质谱采集模式对目标药物进行全扫描分析，通过与表1中所示标准物质保留时间比对的途径，对29种目标药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法定量分析。采用正离子电离模式对喹诺酮类、四环素类、色素类、磺胺类、大环内酯类5类26种目标药物进行分析。采用负离子模式对氯霉素类药物进行分析。定量结果显示所有目标药物在样品D中均未检出。

为验证检测结果，本发明采用国家标准方法对上述检出的阳性样品进行了确证，与本发明新建方法的测定结果相对标准偏差在-4.21％～5.89％。证明本发明所建立的同时筛查6类中总共29种风险药物的高分辨质谱方法科学可靠，可用于鱼类产品的快速筛查。同时，在本例中个别样品虽筛查出抗生素，但含量控制在了最高限量之内，说明我国近年来对鱼类产品的监控力度大大提高。

以上仅为本发明的较佳实施例，并非仅限于本发明的实施范围，凡依本发明专利范围的内容所做的等效变化和修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (7)

1.超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，所述同时筛查的多类别药物为恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B，包括以下步骤：

步骤1，向鱼样品中依次加入甲醇和乙酸酸化的乙腈水溶液得到混合体系A，向混合体系A中加入Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液后混合均匀得到混合体系B，其中鱼样品取样量、甲醇体积、混合体系A体积和Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液体积四个参数的比例为(1.0～5.0g)：(2.0～3.0mL)：12.5mL：2.5mL；

所述乙酸酸化的乙腈水溶液中，乙腈与水的体积比为84:16，乙酸体积占乙腈水溶液体积的1％；

所述Na₂EDTA-Mcllvaine缓冲溶液的浓度为0.1mol/L，pH＝4.0±0.1；

步骤2，向混合体系B加入3.0～6.0g无水硫酸镁、1.9g乙酸钠和1.5g氯化钠，混合均匀后离心得到上清液A；

步骤3，向上清液A中加入0.4g C18、0.4g PSA和0.1～0.5g无水硫酸镁，混合均匀后离心得到上清液B，将上清液B用0.22μm滤膜过滤后得到空白基质样液；

步骤4，采用空白基质样液稀释混合标准储备液至150μg/kg～750μg/kg得到混合体系C，采用流动相B稀释混合标准储备液至150μg/kg～750μg/kg得到混合体系D，采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱，对混合体系C和混合体系D进行全扫描分析，与所述同时筛查的多类别药物的标准物质保留时间比对，对所述同时筛查的多类别药物进行定性分析，采用基质匹配标准校正法对所述药物进行定量分析；

其中，色谱柱型号为Thermo Hypersil GOLD AQ，规格为100mm×4.6mm，5μm；柱温为35℃；流动相A为水、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；流动相B为甲醇、甲酸和甲酸铵的混合溶液，其中甲酸体积占混合溶液体积的0.2％，甲酸铵的浓度为4.0mmol/L；梯度洗脱程序为：0.0～1.0min时，流动相A的比例保持100％；1.0～7.0min时，流动相A的比例由100％线性减少至0％；7.0～15.0min时，流动相A的比例保持0％；15.0～17.0min时，流动相A的比例由0％线性增加至100％；17.0～25.0min时，流动相A的比例保持100％；流速为0.3mL/min；进样量为10.0μL；

混合标准储备液的浓度为1μg/mL，所述同时筛查的多类别药物标准物质的溶剂为甲醇、100％的流动相A、100％的流动相B、体积份数为80％的流动相B+体积份数为20％的流动相A、体积份数为60％的流动相B+体积份数为40％的流动相A、体积份数为40％的流动相B+体积份数为60％的流动相A、体积份数为20％的流动相B+体积份数为80％的流动相A和乙腈中的任意一种；

质谱条件为：采用电喷雾离子源，于ESI⁺模式和ESI^-模式下检测，采用ESI⁺模式时毛细管电压为4.0kV，采用ESI^-模式时毛细管电压为3.5kV；ESI⁺模式和ESI^-模式下的其余共同参数如下：

喷嘴电压为1.0kV；干燥气温度为280.0℃；干燥气流量为13.0L/min；雾化气压力为20.0psi；鞘气温度为350.0℃；鞘气流量为12.0L/min，采用氮气作为雾化气、干燥气和鞘气，其中恩诺沙星、达氟沙星、四环素、土霉素、金霉素、强力霉素、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺多辛、磺胺异噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺醋酰、磺胺二甲基嘧啶、阿奇霉素、替米考星、麦迪霉素、罗红霉素、乙酰螺旋霉素、多拉菌素、苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ、苏丹红Ⅳ和罗丹明B的电离模式为ESI⁺，氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的电离模式为ESI^-。

2.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，所述标准物质的溶剂为100％流动相B。

3.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，步骤2和步骤3的离心转速和离心时间均分别为6000～10000r/min和5～10min。

4.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，步骤1、步骤2和步骤3均通过震荡和涡旋混合均匀。

5.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，所述的鱼样品为均质后的样品。

6.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，所述的鱼样品采用鳕鱼。

7.根据权利要求1所述的超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法同时筛查鱼中多类别药物残留的方法，其特征在于，所述的样品为肌肉样品。