CN110687227A - 一种tmao及其相关代谢产物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及化学检测分析技术领域，具体涉及一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法。一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，包括以下步骤：1)代谢物提取：将处理后的样本溶液离心，取上清液，备用；2)标准溶液配制：分别配制各目标化合物的单标中间液，再将各单标中间液混合、稀释，配制成外标混合液，依次稀释该外标混合液，得一系列标准溶液；3)上机检测：设置液相色谱和质谱条件，进行上机检测。本申请中采用色谱质谱联用法，色谱能够对目标分析物进行有效的分离，并且质谱的灵敏度更高，能够在更少的样本中得到更准确的结果，而且能够同时检测到TMAO及其相关代谢产物，从而为疾病的诊断、治疗和预防提供更多的线索。

Description

一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法
技术领域
本发明涉及化学检测分析技术领域，具体涉及一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法。
背景技术
氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide，TMAO)，是水产品中含量相对较多的低分子胺类化合物。在人体中肠道微生物能够代谢胆碱和卵磷脂生成三甲胺进而被代谢成TMAO。氧化三甲胺及代谢物参与多种重要的生物学功能，如渗透压调节、稳定蛋白、参与细胞分裂等。研究表明TMAO水平升高与心血管疾病呈现明显正相关，与高血压、心功能不全、动脉硬化等多种疾病密切相关，氧化三甲胺及相关代谢物的研究在探索TMAO代谢、相关疾病发病机理、诊断、治疗及预防手段等方面均有重要的参考价值。因此，TMAO及其相关代谢产物在血浆中的定量检测方法具有重要的临床价值。
专利CN108507984A中通过酶联免疫法测定生物样本中的TMAO，这也是目前大部分科研人员使用的方法。但是酶联免疫法的主要缺陷是抗体之间的交叉反应导致的方法灵敏度不高。专利CN109917042A虽然也是通过色谱质谱联用的方法，但是只检测了TMAO一种物质，不能同时对TMAO及其相关代谢产物进行检测，方法的全面性不足，进而会影响到检测方法的准确度。
发明内容
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
1)代谢物提取：将处理后的样本溶液离心，取上清液，备用；
2)标准溶液配制：分别配制各目标化合物的单标中间液，再将各单标中间液混合、稀释，配制成外标混合液，依次稀释该外标混合液，得一系列标准溶液；
3)上机检测：设置液相色谱和质谱条件，进行上机检测；
所述液相色谱的流动相A相选自甲酸铵、甲酸铵水溶液、甲酸、甲酸水溶液中的一种或几种。
作为本发明一种优选的技术方案，所述处理后的样本溶液中包括内标混合液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述液相色谱的流动相A相为甲酸铵水溶液和甲酸水溶液。
作为本发明一种优选的技术方案，所述液相色谱的流动相B相为乙腈。
作为本发明一种优选的技术方案，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-1min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％；
1-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.3min：流动相A为50％→50％，流动相B为50％→50％；
9.3-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％。
作为本发明一种优选的技术方案，所述质谱的仪器为三重四极杆质谱仪。
作为本发明一种优选的技术方案，所述质谱的离子源参数如下：Capillaryvoltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V。
作为本发明一种优选的技术方案，所述质谱的离子源参数还包括：gastemperature＝300℃，gas flow＝5L/min，sheath gas temperature＝250℃，sheath gasflow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
作为本发明一种优选的技术方案，所述质谱的分析采用MRM模式。
本发明第二个方面提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用。
有益效果：本发明提供的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，通过采用特殊的仪器及分析模式，一方面使得复杂的碳水化合物(胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺等)的分析变得更高效，加强了梯度兼容性，提高了检测的准确度；另一方面通过对质谱参数进行精心设置，并结合正负离子模式，成功得到了分离度高、碎片丰富的谱图和特征碎片离子，提高了检测的灵敏度。此外，本申请中利用各种物质上多种作用力的共同作用最终提高了目标化合物的分离效果，使得信噪比高，进一步提高了检测的灵敏度；同时，由于本发明采用色谱质谱联用法，色谱能够对目标分析物进行有效的分离，并且质谱的灵敏度更高，能够在更少的样本中得到更准确的结果，而且能够同时检测到TMAO及其相关代谢产物，从而为疾病的诊断、治疗和预防提供更多的线索。
附图说明
图1为标准溶液的离子色谱图。
图2为样本溶液的离子色谱图。
符号说明：1代表氧化三甲胺；2代表胆碱；3代表肌酸酐；4代表甜菜碱；5代表L-肉碱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明提供技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，并非对其保护范围的限制。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
本发明中的词语“优选的”、“更优选的”、“最优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
单数形式包括复数讨论对象，除非上下文中另外清楚地指明。“任选的”或者“任意一种”是指其后描述的事项或事件可以发生或不发生，而且该描述包括事件发生的情形和事件不发生的情形。
为了解决上述问题，本发明第一个方面提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
1)代谢物提取：将处理后的样本溶液离心，取上清液，备用；
2)标准溶液配制：分别配制各目标化合物的单标中间液，再将各单标中间液混合、稀释，配制成外标混合液，依次稀释该外标混合液，得一系列标准溶液；
3)上机检测：设置液相色谱和质谱条件，进行上机检测。
步骤1)代谢物提取
本发明所述的代谢物提取是指对样本进行处理，得到处理后的样本溶液，再将处理后的样本溶液进行离心，取上清液，备用。
本发明对所述的样本没有特别的限制，只要是含有TMAO而不影响本发明目的即可，可以是人的血浆样本，也可以是取自哺乳动物、植物或真菌中。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的样本为血浆样本。
在一种优选的实施方式中，本发明所述处理后的样本溶液中包括内标混合液。
〈内标混合液〉
本发明所述的内标是指各目标化合物对应的同位素化合物。
本发明所述的目标化合物为肌酸酐、胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺和L-肉碱，其所对应的同位素化合物分别为肌酸酐-(甲基-d3)、氯化胆碱-(三甲基-d9)、甜菜碱-(三甲基-d9)、三甲胺-d9 N-氧化物、L-肉碱-(三甲基-d9)。
所述的肌酸酐(Creatinine)，又称2-氨基-1,5-二氢-1-甲基-4H-咪唑啉-4-酮、肌氨基酐、缩水肌肉素、2-氨基-1-甲基咪唑啉-4-酮、肌酸-DL-酒石酸(葡萄酸)1-甲基乙内酰脲-2-酰亚胺，分子式为C4H7N3O，呈棱柱状结晶。
所述的肌酸酐-(甲基-d3)，英文名称为Creatinine-(methyl-d3)，分子式为C4H4D3N3O，CAS号为143827-20-7。
所述的胆碱(Choline hydroxide)，又称氢氧化胆碱、氢氧化羟乙基三甲胺，分子式为C5H15NO2，强碱性的粘性液体或结晶。溶于水和醇，不溶于醚。在酸性溶液中对热稳定，在空气中易吸收二氧化碳，吸水性极强，遇热分解。味辛而苦。
所述的氯化胆碱-(三甲基-d9)，英文名称为Choline chloride-(trimethyl-d9)，分子式为C5H5ClD9NO，CAS号为61037-86-3。
所述的甜菜碱(Betaine)，学名为三甲基甘氨酸，又称甜菜素、三甲铵乙内酯、三甲基乙内酯、甘氨酸三甲胺内盐，分子式为C5H11NO2，是一种生物碱，具有强烈的吸湿性能。
所述的甜菜碱-(三甲基-d9)，英文名称为Betaine-(trimethyl-d9)，分子式为C5H2D9NO2。
所述的氧化三甲胺(Trimethylamine N-Oxide)，简称TMAO，又称三甲胺N-氧化物，分子式为C3H9NO，CAS号为1184-78-7。
所述的三甲胺-d9 N-氧化物，英文名称为Trimethylamine-d9 N-Oxide，分子式为C3D9NO，CAS号为1161070-49-0。
所述的L-肉碱(L-carnitine)，又称左旋肉碱或卡尼丁，分子式为C7H15NO3，CAS号为541-15-1，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸。
所述的L-肉碱-(三甲基-d9)，英文名称为L-Carnitine-(trimethyl-d9)innersalt，分子式为C7D9H6NO3，CAS号为126827-79-0。
在一种优选的实施方式中，本发明所述内标混合液的配制包括以下步骤：
Ⅰ、用甲醇将5种内标物质〔肌酸酐-(甲基-d3)、氯化胆碱-(三甲基-d9)、甜菜碱-(三甲基-d9)、三甲胺-d9 N-氧化物、L-肉碱-(三甲基-d9)〕分别配制成内标中间液，其浓度均为1mmol/L；
Ⅱ、使用时将各内标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为20μmol/L的内标混合液。
本发明所述0.1％甲酸水溶液是指在甲酸水溶液中，甲酸所占的体积百分比为0.1％。
〈样本处理〉
在一种优选的实施方式中，本发明所述的样本处理包括以下步骤：
a.取40～60mL乙腈、40～60μL甲酸和400～600μL浓度为20μmol/L的内标混合液，混合，得内标工作液，备用；
b.将血浆样本在1～10℃下解冻，涡旋20～50s，取5～15μL样本于EP管中；
c.在步骤b中加30～50μL0.1％甲酸水溶液，再加150～250μL步骤a所得内标工作液，涡旋20～50s，冰水浴超声2～10min；
d.将步骤c所得混合物在-30～0℃下静置0.5～2h，即得处理后的样本溶液。
〈离心〉
本发明对所述的离心没有特别的限制，只要能够得到上清液而不影响本发明的目的即可。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的离心是指在1～10℃的条件下，将处理后的样本溶液在8000～16000rpm的转速下离心5～15min。
步骤2)标准溶液配制
在一种优选的实施方式中，本发明所述标准溶液的配制包括以下步骤：
A、用甲醇分别将5种目标化合物(肌酸酐、胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺和L-肉碱)配制成外标中间液，其浓度均为1mmol/L；
B、使用时将各外标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为100μmol/L的外标混合液；
C、再用0.1％甲酸水溶液将步骤B所得外标混合液向下依次稀释两倍，制得15个浓度梯度的系列标准溶液，各浓度标记为L1～L15，具体见表1。
表1标准溶液中各目标化合物的浓度(nmol/L)
目标化合物 肌酸酐 胆碱 甜菜碱 氧化三甲胺 L-肉碱
L1 100000 100000 100000 100000 100000
L2 50000 50000 50000 50000 50000
L3 25000 25000 25000 25000 25000
L4 12500 12500 12500 12500 12500
L5 6250 6250 6250 6250 6250
L6 3125 3125 3125 3125 3125
L7 1562.5 1562.5 1562.5 1562.5 1562.5
L8 781.25 781.25 781.25 781.25 781.25
L9 390.625 390.625 390.625 390.625 390.625
L10 195.3125 195.3125 195.3125 195.3125 195.3125
L11 97.6563 97.6563 97.6563 97.6563 97.6563
L12 48.8282 48.8282 48.8282 48.8282 48.8282
L13 24.4141 24.4141 24.4141 24.4141 24.4141
L14 12.2070 12.2070 12.2070 12.2070 12.2070
L15 6.1035 6.1035 6.1035 6.1035 6.1035
步骤3)上机检测
在一种优选的实施方式中，本发明所述的上机检测步骤依次为：绘制标准曲线，正常样本上机检测，加标样品上机检测。
所述绘制标准曲线的过程为：分别从配制好的每个浓度标准溶液中各取50μL至1.5mL EP管中，加入200μL内标工作液，涡旋30s，冰水浴超声5min，然后在-20℃下静置1h，再在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心10min，取100μL上清液上机检测，以目标化合物与内标的峰面积比为y轴，目标化合物的浓度(nmol/L)为x轴，绘制标准曲线。
所述的正常样本是指待测样本，也就是步骤1)代谢物提取过程中得到的上清液。
所述加标样本的配制方法为：将样本处理过程中的“在步骤b中加30～50μL0.1％甲酸水溶液”替换为“在步骤b中加40μL浓度为2.5μmol/L的外标混合液”，其它处理步骤同正常样本，即得加标样本。
所述浓度为2.5μmol/L外标混合液的配制方法为：将各外标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为2.5μmol/L，即得。
〈液相色谱条件〉
在一种优选的实施方式中，本发明采用的液相色谱仪器为Agilent 1290Infinity II series(Agilent Technologies)超高效液相色谱仪。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱的色谱柱为Waters ACQUITYUPLC BEH Amide(100×2.1mm，1.7μm，Waters)。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的柱温箱温度为35℃。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的样品盘设为4℃。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的进样体积为1μL。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱的流动相A相选自甲酸铵、甲酸铵水溶液、甲酸、甲酸水溶液中的一种或几种。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱的流动相A相为甲酸铵水溶液和甲酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，本发明所述甲酸铵水溶液的浓度为7～13mmol/L。
在一种更优选的实施方式中，本发明所述甲酸铵水溶液的浓度为10mmol/L。
在一种优选的实施方式中，本发明所述甲酸水溶液中甲酸所占的体积百分数为0.05～0.3％。
在一种更优选的实施方式中，本发明所述甲酸水溶液中甲酸所占的体积百分数为0.1％。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱流动相A相的配制方法为：取0.01mol甲酸铵溶于去离子水中，通过滤膜将未溶解的杂质过滤，得到透明液体，备用；在透明液体中加入1mL甲酸，并用超纯水定容至1000mL，得到10mmol/L甲酸铵/0.1％甲酸水溶液，即可。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱的B相为乙腈。
在一种优选的实施方式中，本发明所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-1min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％；
1-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.3min：流动相A为50％→50％，流动相B为50％→50％；
9.3-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％。
本申请采用UPLC BEH Amide色谱柱，选择亚乙基桥杂化颗粒(BEH)技术作为基础颗粒和独特的键合技术，使得复杂的碳水化合物(胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺等)的分析变得更高效，加强了梯度兼容性，提高了检测的准确度。而且本申请人意外发现，选用A相为10mmol/L甲酸铵/0.1％甲酸水溶液，B相为乙腈；且控制不同时间段A和B的体积比，能够提高检测的灵敏度，猜测是因为：胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺、肌酸酐等由于-N+、羟基、羧基等基团与流动相的甲酸铵/甲酸中的基团产生吸引或排斥等作用力，胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺、肌酸酐每一种物质上多种作用力的共同作用最终提高了五种化合物的分离效果，而且乙腈具有较稳定的基团来平衡洗脱速度，得到的基线稳定性好，使得信噪比高，提高检测的灵敏度。但随着流动相中甲酸或甲酸铵比例的增加，基线噪声会随之增加，影响峰形，反而不利于检测。
〈质谱条件〉
在一种优选的实施方式中，本发明所述质谱的仪器为三重四极杆质谱仪。
在一种更优选的实施方式中，本发明所述质谱的仪器为装备AJS-ESI离子源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪。
在一种优选的实施方式中，本发明所述质谱的离子源参数如下：Capillaryvoltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V。
本发明所述的Capillary voltage是指毛细管电压。
本发明所述的nozzle voltage是指喷嘴电压。
在一种优选的实施方式中，本发明在数据采集时，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。
本发明所述的多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。
本申请选用三重四极杆串联质谱仪，采用多反应监测模式(MRM)，第一组四级杆充当过滤器，只允许胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺、肌酸酐化合物的某一特征碎片离子通过，然后进入第二组四级杆碰撞室，与室内的惰性气体进行碰撞，并使其碎裂成若干碎片离子，再通过第三组四级杆选出有指定母离子产生的特征子离子进行分析。多反应监测模式利用了母离子和子离子具有一一对应的关系，有效清除了其他离子的干扰，提高了信噪比。而且本申请人发现，当离子源参数为Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V时，能进一步提高检测的灵敏度，猜测原因是：如果仅使用正离子模式，由于甜菜碱、L-肉毒碱、胆碱的结构相似或分子量相近，在色谱图上很难区分；结合负离子模式，对于含有羟基、酮基或羧基的物质，可以利用不同的离子模式进行电离，从而得到分离度高、碎片丰富的谱图和特征碎片离子。
在一种优选的实施方式中，本发明所述质谱的离子源参数还包括：gastemperature＝300℃，gas flow＝5L/min，sheath gas temperature＝250℃，sheath gasflow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
本发明所述的gas temperature是指雾化气温度。
本发明所述的gas flow是指雾化气流量。
本发明所述的sheath gas temperature是指鞘气温度。
本发明所述的sheath gas flow是指鞘气流量。
本发明所述的nebulizer是指喷雾气压。
在一种优选的实施方式中，本发明所述离子源中的气体为N2。
在一种优选的实施方式中，本发明在进行UHPLC-MS/MS分析之前，将目标化合物标准溶液引入质谱中。针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其MRM参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析，具体参数见表2。
表2目标化合物的MRM具体参数
Figure BDA0002247410430000091
Figure BDA0002247410430000101
本申请人通过研究发现，通过对质谱参数进行精心设置，能够进一步提高检测方法的准确度，可能是因为雾化气流量和温度、鞘气(sheath gas)温度和流量等参数相互协同，加速溶剂雾化并产生高电荷液滴，提高信号的稳定性；鞘气位于ESI毛细管喷口处，它能够辅助喷雾雾化，通过控制鞘气流速和压力，最大限度利用气喷，得到更为细小的初始喷雾液滴。同时通过设置毛细管出口电压(Frag)和碰撞能量(CE)，使目标化合物形成合适的碰撞能量，形成碎片离子，最终加和获得碎片丰富的二级谱图和特征碎片离子，方便进行特征峰匹配和用于目标化合物的定性确认。
但是过高的碰撞能量会增加离子间的碰撞，引起源内裂解，能量太低也难以获得特征碎片离子。
此外，本申请人发现，色谱流动相中的酸、酸铵、乙腈以及通过溶剂引入的Na+、K+等会对分析物的离子化产生一定的影响，例如得到[M+Na]+、[M-H2O+H]+等离子峰。对于不同的流动相，代谢产物的碎裂途径以及各个碎片离子的丰度会产生差异；本申请通过精心设计样品的处理、流动相的物质以及洗脱条件再加上质谱参数的设定，减弱了基质效应，更有利于对代谢产物进行全面、准确的分析。
本发明第二个方面提供了一种基于质谱法的TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用。
下面通过实施例对本发明进行具体描述，另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的。
实施例
实施例1
实施例1提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，包括以下步骤：
1)代谢物提取：将处理后的样本溶液离心，取上清液，备用；
2)标准溶液配制：分别配制各目标化合物的单标中间液，再将各单标中间液混合、稀释，配制成外标混合液，依次稀释该外标混合液，得一系列标准溶液；
3)上机检测：设置液相色谱和质谱条件，进行上机检测。
步骤1)所述样本处理的过程包括以下步骤：
a.准确量取50mL乙腈、50μL甲酸和500μL浓度为20μmol/L的内标混合液，混合，得内标工作液，备用；
b.将血浆样本在4℃下解冻，涡旋30s，取10μL样本于1.5mL EP管中；
c.在步骤b中加40μL 0.1％甲酸水溶液，再加200μL步骤a所得内标工作液，涡旋30s，冰水浴超声5min；
d.将步骤c所得混合物在-20℃下静置1h。
步骤a所述浓度为20μmol/L的内标混合液的配制包括以下步骤：
Ⅰ、用甲醇将5种内标物质〔肌酸酐-(甲基-d3)、氯化胆碱-(三甲基-d9)、甜菜碱-(三甲基-d9)、三甲胺-d9 N-氧化物、L-肉碱-(三甲基-d9)〕分别配制成内标中间液，其浓度均为1mmol/L；
Ⅱ、使用时将各内标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为20μmol/L的内标混合液。
步骤a所述混合方式为手动振荡，时间为2min。
步骤1)所述的离心是指将在4℃的条件下，将处理后的样本溶液在12000rpm的转速下离心10min。
步骤2)所述标准溶液的配制包括以下步骤：
A、用甲醇分别将5种目标化合物(肌酸酐、胆碱、甜菜碱、氧化三甲胺和L-肉碱)配制成外标中间液，其浓度均为1mmol/L；
B、使用时将各外标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为100μmol/L的外标混合液，将浓度为100μmol/L的点作为标准曲线上的第一个点；
C、再用0.1％甲酸水溶液将步骤B所得外标混合液向下依次稀释两倍，制得15个浓度梯度的系列标准溶液，各浓度标记为L1～L15，具体见表1。
表1标准溶液中各目标化合物的浓度(nmol/L)
Figure BDA0002247410430000121
步骤3)所述液相色谱的条件为：
(1)液相色谱仪器为Agilent 1290 Infinity II series(AgilentTechnologies)超高效液相色谱仪。
(2)色谱柱选用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide(100×2.1mm，1.7μm，Waters)；
(3)柱温箱温度为35℃；
(4)样品盘设为4℃；
(5)进样体积为1μL；
(6)流动相A相为10mmol/L甲酸铵/0.1％甲酸水溶液，流动相B相为乙腈；
(7)梯度洗脱条件为：
0-1min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％；
1-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.3min：流动相A为50％→50％，流动相B为50％→50％；
9.3-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％。
步骤3)所述的质谱条件为：
(1)选用仪器：装备AJS-ESI离子源的Agilent 6460三重四极杆质谱仪；
(2)Agilent 6460三重四极杆质谱仪器参数设置：采用多反应监测(MRM)模式进行质谱分析，离子化模式为电喷雾电离(ESI)，离子源参数如下：Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V，gas temperature＝300℃，gas flow＝5L/min，sheath gas temperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi，气体为N2。
实施例1在进行UHPLC-MS/MS分析之前，将目标化合物标准溶液引入质谱中。针对每个目标化合物，选取信号强度最高的数个母离子-子离子对(transition)，对其MRM参数进行优化，并选取其中响应最好的离子对用于定量分析，其它离子对用于目标化合物定性分析，具体参数见表2。
表2目标化合物的MRM具体参数
Figure BDA0002247410430000141
步骤3)所述的上机检测步骤依次为：绘制标准曲线，正常样本上机检测，加标样品上机检测。
所述绘制标准曲线的过程为：分别从配制好的每个浓度标准溶液中各取50μL至1.5mL EP管中，加入200μL内标工作液，涡旋30s，冰水浴超声5min，然后在-20℃下静置1h，再在4℃的条件下，以12000rpm的转速离心10min，取100μL上清液上机检测，以目标化合物与内标的峰面积比为y轴，目标化合物的浓度(nmol/L)为x轴，绘制标准曲线。
所述的正常样本是指待测样本，也就是步骤1)代谢物提取过程中得到的上清液。
所述加标样本的配制方法为：将样本处理过程中的“在步骤b中加40μL0.1％甲酸水溶液”替换为“在步骤b中加40μL浓度为2.5μmol/L的外标混合液”，其它处理步骤同正常样本，即得加标样本。
所述浓度为2.5μmol/L外标混合液的配制方法为：将各外标中间液混合，并用0.1％甲酸水溶液稀释至浓度均为2.5μmol/L，即得。
实施例1还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用。
实施例2
实施例2提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将色谱柱替换为Waters ACQUITY UPLC CSH C18(100×3.0mm，1.7μm，Waters)。
实施例3
实施例3提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将流动相A相替换为10mmol/L甲酸铵。
实施例4
实施例4提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将流动相A相替换为体积百分数为0.1％甲酸水溶液。
实施例5
实施例5提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将流动相A相替换为20mmol/L甲酸铵/1％甲酸水溶液；其中，液相色谱流动相A相的配制方法为：取0.02mol甲酸铵溶于去离子水中，通过滤膜将未溶解的杂质过滤，得到透明液体，备用；在透明液体中加入10mL甲酸，并用超纯水定容至1000mL，即得20mmol/L甲酸铵/1％甲酸水溶液。
实施例6
实施例6提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将流动相B相替换为体积百分数为50％乙腈水溶液。
实施例7
实施例7提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将梯度洗脱条件替换为：
0-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％。
实施例8
实施例8提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将梯度洗脱条件替换为：
0-1min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％；
1-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.3min：流动相A为50％→50％，流动相B为50％→50％；
9.3-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→0％，流动相B为90％→100％。
实施例9
实施例9提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将质谱仪替换为WatersMicromass Q-TOF飞行时间液质联用仪。
实施例10
实施例10提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将喷嘴电压替换为：nozzle voltage＝+500V。
实施例11
实施例11提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将毛细管电压替换为：Capillary voltage＝+4000V。
实施例12
实施例12提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将毛细管电压和喷嘴电压替换为：Capillary voltage＝+4000V，nozzlevoltage＝+500V。
实施例13
实施例13提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将离子源部分参数替换为：gas temperature＝200℃，gas flow＝7L/min，sheath gas temperature＝150℃，sheath gas flow＝13L/min，nebulizer＝60psi。
实施例14
实施例14提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将离子源部分参数替换为：gas temperature＝400℃，gas flow＝3L/min，sheath gas temperature＝350℃，sheath gas flow＝9L/min，nebulizer＝30psi。
实施例15
实施例15提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将离子源部分参数替换为：gas temperature＝250℃，gas flow＝11L/min，sheath gas temperature＝300℃，sheath gas flow＝5L/min，nebulizer＝40psi。
实施例16
实施例16提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将目标化合物的MRM具体参数替换为如下表所示：
化合物名称 Frag(V) CE(V) 用途
氧化三甲胺 40 10 Quantifier
胆碱 60 12 Quantifier
甜菜碱 80 20 Quantifier
肌酸酐 90 3 Quantifier
L-肉碱 60 10 Quantifier
三甲胺-d9 N-氧化物 30 11 Quantifier
氯化胆碱-(三甲基-d9) 75 13 Quantifier
甜菜碱-(三甲基-d9) 90 18 Quantifier
肌酸酐-(甲基-d3) 100 9 Quantifier
L-肉碱-(三甲基-d9) 75 11 Quantifier
实施例17
实施例17提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，还提供了一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于将目标化合物的MRM具体参数替换为如下表所示：
化合物名称 Frag(V) CE(V) 用途
氧化三甲胺 60 30 Quantifier
胆碱 80 35 Quantifier
甜菜碱 100 40 Quantifier
肌酸酐 110 18 Quantifier
L-肉碱 80 20 Quantifier
三甲胺-d9 N-氧化物 50 30 Quantifier
氯化胆碱-(三甲基-d9) 95 39 Quantifier
甜菜碱-(三甲基-d9) 110 40 Quantifier
肌酸酐-(甲基-d3) 120 28 Quantifier
L-肉碱-(三甲基-d9) 95 39 Quantifier
性能评价
1、方法最低检出限：将信噪比为3时所对应的化合物浓度定义为方法最低检出限，用LLOD表示，单位为nmol/L。
2、方法最低定量限：将信噪比为10时所对应的化合物浓度定义为方法最低定量限，用LLOQ表示，单位为nmol/L。
3、相关系数：采用最小二乘法对标准曲线进行回归分析，权重设为1/x，计算实施例1的相关系数，用R2表示。
4、加标回收率：对实施例1和实施例13～17的加标回收率进行计算：以实施例1为例，先用0.1％甲酸水溶液将浓度为100μmol/L的外标混合液分别稀释至浓度均为1000nmol/L和10000nmol/L的外标工作液；取实施例1步骤1)所得上清液两组，且每组样品的体积均为10μL，作为QC样品，分别记为QA和QB；在QA中加入40μL浓度为10000nmol/L的外标工作液，并在QB中加入40μL浓度为1000nmol/L的外标工作液；将两组QC样品(QA、QB)分别上机检测，且其重复进样次数均为7次。测得浓度与加标浓度的百分比值即为加标回收率，用recovery表示。
实施例13～17加标回收率的计算同实施例1。
5、标准相对偏差：实施例1和实施例13～17的标准相对偏差均根据其加标回收率进行计算。标准相对偏差用RSD表示，其计算公式如下：
RSD＝SD/X×100％
RSD为标准相对偏差；SD为标准偏差；X为加标回收率的算术平均值。
其中，X＝(X1+X2+……+Xn)/n；
SD＝√{〔(X1-X)^(2)+(X2-X)^(2)+……+(Xn-X)^(2)〕/(n-1)}；
Xn为第n次测得的加标回收率，n为进样次数。
实施例13～17标准相对偏差的计算同实施例1。
表1实施例1的LLOD、LLOQ和R2测试结果
项目 LLOD(nmol/L) LLOQ(nmol/L) R<sup>2</sup>
肌酸酐 2.44 4.88 0.9990
胆碱 1.22 2.44 0.9998
甜菜碱 1.22 2.44 0.9997
氧化三甲胺 2.44 4.88 0.9998
L-肉碱 2.44 4.88 0.9995
实施例2～12的LLOD的测试结果相比于实施例1，若增大的幅度不超过10％，则记为+；若增大的幅度在11％～40％，则记为++；若增大的幅度超过40％，则记为+++。
表2实施例2～12的LLOD(nmol/L)测试结果
Figure BDA0002247410430000201
Figure BDA0002247410430000211
实施例2～12的LLOQ的测试结果相比于实施例1，若增大的幅度不超过10％，则记为+；若增大的幅度在11％～40％，则记为++；若增大的幅度超过40％，则记为+++。
表3实施例2～12的LLOQ(nmol/L)测试结果
实施例 肌酸酐 胆碱 甜菜碱 氧化三甲胺 L-肉碱
2 + + + + +
3 +++ ++ ++ +++ ++
4 +++ ++ ++ +++ ++
5 ++ ++ ++ ++ +
6 + + + + +
7 ++ ++ ++ ++ ++
8 + + + + +
9 + + + + +
10 + + + + +
11 + + + + +
12 ++ ++ ++ ++ +
表4实施例1的QC样品加标回收率和标准相对偏差测试结果
Figure BDA0002247410430000212
Figure BDA0002247410430000221
实施例13～17的加标回收率的测试结果相比于实施例1，若减小的幅度不超过10％，则记为—；若减小的幅度在11％～40％，则记为——；若减小的幅度超过40％，则记为———。
表5实施例13～17的加标回收率(％)测试结果
实施例13～17的标准相对偏差的测试结果相比于实施例1，若增大的幅度不超过10％，则记为+；若增大的幅度在11％～40％，则记为++；若增大的幅度超过40％，则记为+++。
表6实施例13～17的标准相对偏差(％)测试结果
Figure BDA0002247410430000223
Figure BDA0002247410430000231
由表1～6可知，本发明提供的基于质谱法的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，目标化合物的最低检出限(LLOD)在1.22～2.44nmol/L之间，最低定量限(LLOQ)在2.44～4.88nmol/L之间，目标化合物的相关系数(R2)均大于0.9990，说明色谱峰峰面积与化合物浓度间呈良好的定量关系，可满足靶向代谢组学分析的要求。此外，目标化合物的平均回收率在95.1～106.9％之间，标准相对偏差均小于2.0％，从而表明，本方法能够在以上所示的浓度范围内，准确可靠地检测出样品中的目标代谢物含量，提高了检测的灵敏度和准确度。
前述的实例仅是说明性的，用于解释本发明所述方法的一些特征。所附的权利要求旨在要求可以设想的尽可能广的范围，且本文所呈现的实施例仅是根据所有可能的实施例的组合的选择的实施方式的说明。因此，申请人的用意是所附的权利要求不被说明本发明的特征的示例的选择限制。在权利要求中所用的一些数值范围也包括了在其之内的子范围，这些范围中的变化也应在可能的情况下解释为被所附的权利要求覆盖。

Claims (10)

1.一种TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)代谢物提取：将处理后的样本溶液离心，取上清液，备用；
2)标准溶液配制：分别配制各目标化合物的单标中间液，再将各单标中间液混合、稀释，配制成外标混合液，依次稀释该外标混合液，得一系列标准溶液；
3)上机检测：设置液相色谱和质谱条件，进行上机检测；
所述液相色谱的流动相A相选自甲酸铵、甲酸铵水溶液、甲酸、甲酸水溶液中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述处理后的样本溶液中包括内标混合液。
3.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的流动相A相为甲酸铵水溶液和甲酸水溶液。
4.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的流动相B相为乙腈。
5.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述液相色谱的梯度洗脱条件为：
0-1min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％；
1-6.5min：流动相A为10％→29.5％，流动相B为90％→70.5％；
6.5-8min：流动相A为29.5％→50％，流动相B为70.5％→50％；
8-9.3min：流动相A为50％→50％，流动相B为50％→50％；
9.3-9.5min：流动相A为50％→10％，流动相B为50％→90％；
9.5-13min：流动相A为10％→10％，流动相B为90％→90％。
6.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述质谱的仪器为三重四极杆质谱仪。
7.根据权利要求6所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述质谱的离子源参数如下：Capillary voltage＝+4000/-3500V，nozzle voltage＝+500/-500V。
8.根据权利要求6或7所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述质谱的离子源参数还包括：gas temperature＝300℃，gas flow＝5L/min，sheath gastemperature＝250℃，sheath gas flow＝11L/min，nebulizer＝45psi。
9.根据权利要求1所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法，其特征在于，所述质谱的分析采用MRM模式。
10.一种如权利要求1～9任一项所述的TMAO及其相关代谢产物的检测方法在检测TMAO及其相关代谢产物中的应用。
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