CN114371239A - 用于测定氧化三甲胺的试剂盒及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于测定氧化三甲胺的试剂盒及其制备方法和应用，本发明提供的试剂盒能够有效解决溶液工艺制备的试剂盒稳定性不佳的现状，且能实现内标物的可冻干和长期稳定性。所述试剂盒包括系列氧化三甲胺校准品和氘代氧化三甲胺内标品；所述系列氧化三甲胺校准品为具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液的冻干物，所述系列氧化三甲胺校准品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有浓度梯度的氧化三甲胺校准品工作液；所述氘代氧化三甲胺内标品为已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液的冻干物；基质溶液中的基质为血清白蛋白。

Description

用于测定氧化三甲胺的试剂盒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及内源性生物标志物的检测技术领域，特别涉及一种测定氧化三甲胺的试剂盒及其制备方法和应用。

背景技术

作为一种内源性生物标志物，氧化三甲胺（TMAO）也同其他的生物标志物（biomarker）一样，需要首先解决基质的干扰，才能确保定量的准确性。因此在选择合适的基质时，研发人员往往会采取2种主要方式：

1）扣除零浓度空白血基质，即选择混合血作为基质，将不同浓度的校准品、质控品分别与零浓度混合血基质相减，去掉混合血基质中本身存在的TMAO干扰，然后再进行曲线拟合以及开展样本的含量测定。这个做法虽然保证了基质的“原汁原味”，但忽略了样本间的TMAO含量存在显著差异，且混合基质也存在批间的不一致性的事实，加上混合人血基质的获得来源和伦理受到诸多限制，因此难以应用到如开发体外诊断试剂盒（IVD）的产业化上。该做法主要是用于实验室研发以及临床试验阶段，参考文献2即采用的该模式用于建立1种TMAO定量方法开发。

2）采用非血源的替代基质，通过选择血液中的高蛋白组分，如人血清白蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）等作为替代基质，保证校准品、质控品的基质中不存在除TMAO标准品之外的其他内源性TMAO。同时，借助同位素标记的TMAO作为内标，可抵消替代基质与人源血基质之间的背景响应差异，从而真正意义上杜绝内源性TMAO的干扰，也可实现不同待测样本间的不同含量的TMAO被全部检出。此外，替代基质的来源易得，成分简单，质量易控，因此该做法常常用于生物标志物的IVD产品开发。参考文献1选择HSA作为替代基质，开发了TMAO的定量试剂盒，初始检验性能合格。综合来看，在产品开发中，替代基质的做法往往更容易保证TMAO的定量准确度。

由于替代基质基本属于蛋白类，容易受到温度、湿度等物理条件影响而发生降解、聚合、霉变等情况，因此品种、来源和纯度这些因素是在考察基质的稳定性时需重点考虑的。HSA和BSA作为最常使用的替代基质，在TMAO产品化中需要首先考察它们的稳定性，如采用37℃加速试验、冻融试验、复溶试验等极端条件来检验基质的稳定性对TMAO测定的精密度和准确度的影响。只有通过稳定性测试的基质，才能进一步用于TMAO产品的工艺开发中。即使获得稳定性好的基质时，面对不同工艺的处理，对待测物的影响也是截然不同的。

参考文献：

[1] 李晓辉，李莹，余鹏，等. 一种氧化三甲胺定量检测试剂盒及方法[P]，CN201710502265.5。

[2] 刘燕，谭栩颖，许斌，等. 血清中氧化三甲胺的高效液相色谱串联质谱法测定研究[J].华南预防医学，2015,41(3):207-212。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于测定氧化三甲胺的改进型试剂盒，该试剂盒能够有效解决溶液工艺制备的试剂盒稳定性不佳的现状，且能实现内标物的可冻干和长期稳定性。

本发明为达到其目的，提供如下技术方案：

本发明一方面提供一种用于测定氧化三甲胺的试剂盒，所述试剂盒包括系列氧化三甲胺校准品和氘代氧化三甲胺内标品；

所述系列氧化三甲胺校准品为具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液的冻干物，所述系列氧化三甲胺校准品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有浓度梯度的氧化三甲胺校准品工作液；

所述氘代氧化三甲胺内标品为已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液的冻干物；

所述基质溶液中的所述基质选自血清白蛋白，优选牛血清白蛋白或人血清白蛋白；

优选的，所述试剂盒还包括系列氧化三甲胺质控品，所述系列氧化三甲胺质控品为具有多个浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液的冻干物，所述系列氧化三甲胺质控品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释而成的具有不同浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液。一些实施方式中，所述基质溶液为基质浓度1%~8%的基质水溶液，单位为g/mL，即每100mL基质水溶液中基质含量为1~8g。

一些实施方式中，所述系列氧化三甲胺校准品工作液的浓度范围为5~1000 ng/mL。

一些实施方式中，所述氘代氧化三甲胺内标品工作液的浓度为200~2000 ng/mL。

一些实施方式中，所述系列氧化三甲胺质控品工作液包括高浓度水平、中浓度水平和低浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液；优选的，所述高浓度水平的浓度值在500~1000 ng/mL范围内，所述中浓度水平的浓度值在100~200 ng/mL范围内，所述低浓度水平的浓度值在10~20 ng/mL范围内。

一些实施方式中，所述试剂盒还包括流动相所需的溶质，优选所述溶质包括乙酸铵。

本发明还提供上文所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

将所述已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到具有浓度梯度的所述系列氧化三甲胺校准品工作液；

将所述已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到所述预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液；

将所述已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到具有多个浓度水平的所述系列氧化三甲胺质控品工作液；

将所述系列氧化三甲胺校准品工作液、所述氘代氧化三甲胺内标品工作液和所述系列氧化三甲胺质控品工作液分别冻干，得到所述系列氧化三甲胺校准品、所述氘代氧化三甲胺内标品和所述系列氧化三甲胺质控品；

优选的，所述冻干包括在冻干机中按照如下温度程序进行处理的步骤：1）区段一，在-35.0℃处理30~180min；2）区段二，在-25.0℃处理200~800min；3）区段三，在-15.0℃处理100~500min；4）区段四，在-4.0℃处理500~1000min。

一些实施方式中，所述氧化三甲胺标准品溶液和/或所述氘代氧化三甲胺标准品溶液用有机溶剂或有机溶剂水溶液配制；其中，有机溶剂例如甲醇、乙腈等；优选所述系列氧化三甲胺校准品工作液、所述系列氧化三甲胺质控品工作液和所述氘代氧化三甲胺内标品工作液中，所述有机溶剂的体积百分含量小于0.1%，利于获得冻干物。在一些较佳实施例中，所述氧化三甲胺标准品溶液和所述氘代氧化三甲胺标准品溶液所用的溶剂相同，优选所用溶剂均为甲醇水溶液，例如所述甲醇水溶液中甲醇的体积百分比为50%。

本发明还提供上文所述的试剂盒在氧化三甲胺的测定中的应用，在进行氧化三甲胺的测定之前，按照所述系列氧化三甲胺校准品工作液的相应浓度梯度用水复溶所述系列氧化三甲胺校准品，从而得到系列氧化三甲胺校准品使用液，得到的系列氧化三甲胺校准品使用液的浓度梯度与系列氧化三甲胺校准品工作液的浓度梯度一致；

按照所述氘代氧化三甲胺内标品工作液的所述预定浓度用水复溶所述氘代氧化三甲胺内标品，得到氘代氧化三甲胺内标品使用液，得到的氘代氧化三甲胺内标品使用液的浓度与氘代氧化三甲胺内标品工作液的所述预定浓度一致；

按照所述系列氧化三甲胺质控品工作液的所述多个浓度水平用水复溶所述系列氧化三甲胺质控品，得到系列氧化三甲胺质控品使用液；得到的系列氧化三甲胺质控品使用液的多个浓度水平与系列氧化三甲胺质控品工作液的多个浓度水平一致。

一些实施方式中，对所述氧化三甲胺进行测定的步骤包括：

1）向所述系列氧化三甲胺校准品使用液中加入所述氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到各氧化三甲胺校准品使用液中氧化三甲胺的质谱峰面积与所述氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并得到所述比值与所述氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系；

2）向待测样品中加入所述氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到所述待测样品中氧化三甲胺的质谱峰面积与所述氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并根据步骤1）得到的所述比值与所述氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系，得到所述待测样品中氧化三甲胺的浓度；

所述沉淀剂优选为乙腈。

一些实施方式中，进行液相色谱分析采用的流动相以乙酸铵水溶液（例如10mM乙酸铵水溶液）为A相，以100%乙腈为B相，色谱柱为Hilic色谱柱，流动相流速为0.2~0.4 mL/min；

进行质谱分析的条件为：正离子电喷雾离子化模式（ESI+），多反应监测（MRM）的扫描方式。

本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

本发明提供的试剂盒，其中的校准品、质控品、内标品以冻干物形式提供，并在冻干过程中被基质所包裹，具有优异的加速稳定性、冻融稳定性、复溶稳定性和开盖稳定性，能进一步保障TMAO测定的精密度和准确度。

附图说明

图1实际样本拟合标准曲线；

图2为本发明一种实施例中试剂盒开盖稳定性测试结果；

图3为本发明一种实施例中试剂盒加速稳定性测试结果；

图4为本发明一种实施例中试剂盒复溶稳定性测试结果；

图5为对比例中内标开盖稳定性测试结果；

图6为本发明一种实施例中试剂盒冻干前后测试结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将结合附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与本发明所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

TMAO：中文名为氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide），是一种与心血管疾病相关的内源性生物标志物，分子量75.11 Da，溶于水。

液质联用：一种检测技术，分为液相部分和质谱部分，其中液相部分将待测物质与其他物质分离开，并通过管路进入质谱部分；质谱通过电离，将待测物质带上电荷，并进一步裂解为特征碎片离子，在真空条件下的质量分析器中实现待测物质的特异性检出。

本发明提供的用于测定氧化三甲胺的试剂盒，包括系列氧化三甲胺校准品和氘代氧化三甲胺内标品。在一些实施方式中，还进一步包括系列氧化三甲胺质控品。

本发明的试剂盒中，系列氧化三甲胺校准品为具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液的冻干物，其中，系列氧化三甲胺校准品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有浓度梯度的氧化三甲胺校准品工作液。

本发明的试剂盒中，氘代氧化三甲胺内标品为已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液的冻干物。在一些实施例中，氘代氧化三甲胺标准品为TMAO-d9。

本发明的试剂盒中，系列氧化三甲胺质控品为具有多个浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液的冻干物，其中，系列氧化三甲胺质控品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有不同浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液。

本发明中，系列氧化三甲胺校准品、氘代氧化三甲胺内标品、系列氧化三甲胺质控品均以冻干物形式提供，具有较高的稳定性，避免溶液状态下的待测物自身降解和聚合而降低待测物的测定准确性。此处“待测物”是指氧化三甲胺校准品中的氧化三甲胺、氘代氧化三甲胺内标品中的氘代氧化三甲胺或氧化三甲胺质控品中的氧化三甲胺。

所用到的基质溶液中的基质为血清白蛋白，优选自牛血清白蛋白（BSA）或人血清白蛋白（HSA），更优选牛血清白蛋白。一些实施例中，一些实施例中，所述基质溶液为基质浓度1%~8%（即1~8g/100mL水）的基质水溶液，例如基质浓度1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的基质水溶液；在一个较佳实施例中，所述基质溶液为基质浓度5%的基质水溶液。基质水溶液中的溶剂可以是水或PBS缓冲液，例如10mM pH7.4的PBS，以利于尽可能模拟人体血液的缓冲体系。

本发明在制备系列氧化三甲胺校准品、氘代氧化三甲胺内标品和系列氧化三甲胺质控品时，引入基质溶液，通过该基质溶液将氧化三甲胺标准品溶液、氘代氧化三甲胺标准品溶液稀释为一定浓度的校准品、质控品和内标品工作液，可以通过冻干获得冻干物，冻干物中除了含有相应的氧化三甲胺或氘代氧化三甲胺外，还含有基质；采用这样的方式，保证各工作液中氧化三甲胺或氘代氧化三甲胺的稳定性，以及保证试剂盒提供的冻干物形式的校准品、质控品和内标品的复溶可操作性。

一些实施例中，氧化三甲胺标准品溶液和氘代氧化三甲胺标准品溶液所用的溶剂相同，优选所用溶剂均为甲醇水溶液，优选甲醇水溶液中甲醇体积百分比为50%。

本发明提供的试剂盒中，氘代氧化三甲胺内标品为冻干物，采用基质溶液稀释氘代氧化三甲胺标准品溶液后经冻干而获得，在使用时，只需用水复溶即可；采用这种形式的氘代氧化三甲胺内标品可以克服现有技术中以乙腈为溶剂提供氘代氧化三甲胺内标品，存在因乙腈挥发而导致内标浓度批间差异变大、开盖稳定性不佳等缺陷，且现有技术中以乙腈等有机溶剂作为溶剂提供内标品，无法通过冻干工艺进行升华处理，因而将其进行产品转化时，稳定性受到一定影响。而本发明采用基质溶液（例如牛血清蛋白水溶液）稀释氘代氧化三甲胺标准品溶液（稀释后的内标品溶液中的有机溶剂（例如乙腈或甲醇）体积比例低于0.1%），能够通过冻干处理获取冻干物形式的氘代氧化三甲胺内标品。因而本发明的方法不仅能解决TMAO在溶液状态下不稳定的情况，而且同时实现氘代氧化三甲胺内标品的可冻干和长期稳定性。此外，本领域技术人员所熟知的，内标的浓度一般在ng~μg级别，若用纯水溶解后再冻干，基本上肉眼不可见，难以保证冻干粉的稳定性以及后续的复溶操作性；此外，考虑到内标除了要加入到校准品、质控品外，还需要额外加入到待测样品中，因此需要单独配置内标，再同步以同样体积、同样浓度加入到校准品使用液、质控品使用液和样品中，以保证操作的重复性和准确性；本申请采用基质溶液（例如BSA水溶液）作为制备内标品的稀释溶剂，既溶解了内标氘代氧化三甲胺到合适浓度，又可以获得肉眼可见且稳定性强的内标品冻干粉末，便于复溶操作与等体积量取。

基于本发明提供的解决方案，能够容易地做到氧化三甲胺校准品、氧化三甲胺质控品和氘代氧化三甲胺内标品的溶解基质、冻干条件和储存条件完全一致，保证产品整体的质量和工艺流畅性。

一些实施例中，系列氧化三甲胺校准品工作液的浓度范围为5~1000 ng/mL；在一个实施例中，系列氧化三甲胺校准品工作液包括如下浓度梯度的校准品工作液：5、10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL；所提供的试剂盒的定量范围为5~1000 ng/mL，定量灵敏度为5 ng/mL。基于系列氧化三甲胺校准品工作液按照固定体积分装后进行冻干得到的系列氧化三甲胺校准品以固体形式存在于试剂瓶中，例如1.8 mL试剂管中，其可以在2~8℃长期保存而不显著影响稳定性，使用时加入固定体积的水复溶至冻干前对应的浓度，使用方便。

一些实施例中，氘代氧化三甲胺内标品工作液的浓度为200~2000 ng/mL。基于氘代氧化三甲胺内标品工作液按照固定体积分装后进行冻干得到的氘代氧化三甲胺内标品以固体形式存在于试剂瓶中，例如1.8 mL试剂管中，其可以在2~8℃长期保存而不显著影响稳定性，使用时加入固定体积的水复溶至冻干前对应的浓度，使用方便。

一些实施例中，系列氧化三甲胺质控品工作液包括高浓度水平、中浓度水平和低浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液；优选的，高浓度水平的浓度值在500-1000 ng/mL范围内，中浓度水平的浓度值在100-200 ng/mL范围内，低浓度水平的浓度值在10-20 ng/mL范围内。在一个实施例中，系列氧化三甲胺质控品工作液包括如下三个浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液：15 ng/mL（低浓度水平）、150 ng/mL（中浓度水平）、800 ng/mL（高浓度水平）。基于系列氧化三甲胺质控品工作液按照固定体积分装后进行冻干得到的系列氧化三甲胺质控品以固体形式存在于试剂瓶中，例如1.8 mL试剂管中，其可以在2~8℃长期保存而不显著影响稳定性，使用时加入固定体积的水复溶至冻干前对应的浓度，使用方便。

一些实施例中，试剂盒还包括流动相所需的溶质，优选溶质包括乙酸铵，在一个实施例中，试剂盒包括流动相溶质瓶，其中含有770.8±7.708 mg的乙酸铵，作为流动相A（或称A相）的溶质。可以长期保持而不显著影响稳定性，使用时用固定体积的水溶解配制，使用方便。

在一些实施例中，试剂盒中还包括测定氧化三甲胺所需的耗材，例如但不限于反应载体和反应密封耗材等，反应载体例如96孔2mL深孔板，反应密封耗材例如96孔金属铝箔。

本发明提供的上述试剂盒的制备，可包括如下步骤：

将已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释得到具有浓度梯度的所述系列氧化三甲胺校准品工作液；其中，已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液的浓度例如可以为约1mg/mL，具体以实际称量配制为准；该已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液也可称作氧化三甲胺校准品储备液；

将已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释得到所述预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液；其中，已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液的浓度例如可以为约1mg/mL，具体以实际配制为准；该已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液也可称作氘代氧化三甲胺内标品储备液；

将已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释得到具有不同浓度水平的所述系列氧化三甲胺质控品工作液；其中，已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液的浓度可以为约1mg/mL，具体以实际称量配制为准；该已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液也可称作氧化三甲胺质控品储备液；

将系列氧化三甲胺校准品工作液、氘代氧化三甲胺内标品工作液和系列氧化三甲胺质控品工作液冻干，分别得到系列氧化三甲胺校准品、氘代氧化三甲胺内标品和系列氧化三甲胺质控品。在一些实施例中，通过将系列氧化三甲胺校准品工作液、氘代氧化三甲胺内标品工作液和系列氧化三甲胺质控品工作液按照设定的体积分装到试剂管中，经过冷冻处理成固体，再置于冻干机中，将冷冻固体中的水分直接升华为气态，并被冻干机中的抽真空泵吸走，试剂管中则存留下固态的由基质包裹的待测物固体。

在一些实施例中，进行上述冻干的工艺步骤具体包括：

1）称量：分别称量氧化三甲胺标准品、基质（例如BSA）、氘代氧化三甲胺标准品（例如TMAO-d9）。

2）制备储备液：将氧化三甲胺标准品用50%甲醇水溶液分别制备成氧化三甲胺校准品储备液、氧化三甲胺质控品储备液，将氘代氧化三甲胺用50%甲醇水溶液制备成氘代氧化三甲胺内标品储备液。

3）基质水溶液：将基质用水或PBS缓冲液配制成一定浓度的基质水溶液，优选基质水溶液的基质浓度范围在1%~8%。

4）制备工作液：将氧化三甲胺校准品储备液、氧化三甲胺质控品储备液、氘代氧化三甲胺内标品储备液，分别用基质水溶液稀释，获得具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液、具有不同浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液、具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液。

5）分装与预冻：分别将上述3类工作液，按固定体积分装到试剂管中。并置于-20℃开展预冻过夜。

6）冻干：将分装的3类工作液，分别置于冻干机中，开展冻干处理，待水分全部抽干，冻干品成粉状或饼状时，即完成冻干处理。

在一些实施例中，在冻干机中进行冻干的温度程序包括：1）区段一，在-35.0℃处理30~180min；2）区段二，在-25.0℃处理200~800min；3）区段三，在-15.0℃处理100~500min；4）区段四，在-4.0℃处理500~1000min。

本发明提供的上述试剂盒特别适用于测定氧化三甲胺，具体的，例如可使用本发明的试剂盒通过液质联用检测氧化三甲胺，可以用于血清、血浆等生物基质（即作为待测样品）中的生物标志物TMAO的含量测定。

在将本发明的试剂盒用于氧化三甲胺的测定之前，先进行复溶操作，具体的：按照系列氧化三甲胺校准品工作液的相应浓度梯度用水复溶系列氧化三甲胺校准品，得到系列氧化三甲胺校准品使用液；

按照氘代氧化三甲胺内标品工作液的预定浓度用水复溶氘代氧化三甲胺内标品，得到氘代氧化三甲胺内标品使用液；

按照系列氧化三甲胺质控品工作液的浓度水平用水复溶系列氧化三甲胺质控品，得到系列氧化三甲胺质控品使用液。

本发明的试剂盒可以采用现有技术中氧化三甲胺测定的常规步骤进行氧化三甲胺的测定，例如可以参照CN201710502265.5中的检测方法步骤进行氧化三甲胺的测定。作为一种参考，在一些实施方式中，基于本发明的试剂盒进行氧化三甲胺测定包括如下步骤：

1）向系列氧化三甲胺校准品使用液中加入氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到各氧化三甲胺校准品使用液中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并得到该比值与氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系。

2）向待测样品中加入氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到待测样品中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并根据步骤1）得到的上述比值与氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系，得到待测样品中氧化三甲胺的浓度。

在一些实施例中，步骤1）中，还包括根据步骤1）得到的比值与氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系绘制标准回归曲线的步骤，标准回归曲线的方程为：Y=a+bX。其中a为标准回归曲线的截距，b为标准回归曲线的斜率，该方程中Y为所检测的样品中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，X为所检测的样品中氧化三甲胺的浓度，单位为ng/mL。采用内标法，采用氧化三甲胺校准品使用液中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值为Y值进行线性回归，得到标准回归曲线。步骤2）中，通过将待测样品中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值代入得到的标准回归曲线方程中，计算得到待测样品中氧化三甲胺的浓度。

在一些实施例中，还包括如下步骤：利用质控品/内标品的比值计算质控品的实际浓度，比较质控品的实测浓度和理论浓度的偏差（RE），其中RE%=（实测浓度-理论浓度）/理论浓度×100%，RE%一般需要满足<±15%的要求，来判断试剂盒的性能是否满足检测需求（例如是否符合IVD产品开发的相关要求）。具体的，向氧化三甲胺质控品使用液中加入氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到氧化三甲胺质控品使用液中氧化三甲胺的质谱峰面积与氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，然后根据已经得到的如上文中所提到的标准回归曲线方程，得到氧化三甲胺质控品使用液中氧化三甲胺的实测浓度，比较该实测浓度与理论浓度之间的偏差，来判断试剂盒的性能是否符合检测需求。

一些实施例中，进行氧化三甲胺测定的步骤中所用的沉淀剂优选为乙腈。

一些实施例中，基于本发明的试剂盒进行氧化三甲胺测定的色谱和质谱条件，可参照如下条件进行，但应理解，以下参数仅作为一种参考，具体应用时本领域技术人员可根据实验室优化的仪器参数进行设置：

色谱条件：0.00~2.00 min，30%流动相A（10mM乙酸铵），70%流动相B（100%乙腈），流速0.3 mL/min，进样2μL；色谱柱为Hilic色谱柱；

质谱条件：正离子电喷雾离子化模式（ESI+），多反应检测（MRM）的扫描方式，离子通道参数为TMAO（m/z 76.000→58.100）、TMAO-d9（m/z 85.1.000→66.100）。

下面通过具体实施例对本发明作进一步的示例性说明。

设备名称	厂家，型号	试剂名称	来源
				冻干机	永和创信，CTFD-10P	TMAO	TRC，>95%
液相色谱仪	Waters，UPLC I-Class	TMAO-d9	TLC，>95%
				质谱仪	Waters，Xevo TQ-S micro	牛血清白蛋白	Solarbio，>95%
电子天平	梅特勒，XPE105	乙酸铵	国药，>95%
				离心机	湘仪，ST16R	甲醇	Merck，>98%
数显多管式涡旋震荡器	熙扬，YMT-2500	/	/

以下实施例和对比例中，出现的相对偏差（或偏差）均按如下公式计算：RE%=（实测浓度-理论浓度）/理论浓度×100%。

实施例1

1.1、按照如下步骤制备试剂盒：

1）称量：分别称量TMAO-d9标准品、BSA、TMAO标准品。

2）制备储备液：将TMAO标准品用50%（体积）甲醇水溶液分别配制成浓度1mg/mL的氧化三甲胺校准品储备液、浓度1mg/mL的氧化三甲胺质控品储备液，将TMAO-d9标准品用50%（体积）甲醇水溶液配制成浓度1mg/mL的氘代氧化三甲胺内标品储备液。

3）基质水溶液：将基质BSA用10mM pH7.4的PBS配制成5%的基质溶液。

4）将氧化三甲胺校准品储备液、氧化三甲胺质控品储备液、氘代氧化三甲胺内标品储备液，分别用基质水溶液稀释，获得具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液、具有不同浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液、具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液；将各工作液按照预定体积分装至1.8mL试剂瓶中，经冻干处理，待水分全部抽干，冻干成粉状或饼状时，即获得氧化三甲胺校准品（以下简称“校准品”）、氘代氧化三甲胺内标品（以下简称“内标品”）和系列氧化三甲胺质控品（以下简称“质控品”）。具体操作如下：

校准品C1-C8：将步骤2）得到的已知浓度的氧化三甲胺校准品储备液用步骤3）的基质水溶液分别稀释至5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL，得到系列氧化三甲胺校准品工作液，分装，并进行冻干成粉末，2~8℃保存，依次得到校准品C1、校准品C2、校准品C3、校准品C4、校准品C5、校准品C6、校准品C7、校准品C8；

质控品LQC/MQC/HQC：将步骤2）得到的已知浓度的氧化三甲胺质控品储备液用步骤3）的基质水溶液分别稀释至15ng/mL、150ng/mL、800ng/mL，得到三个浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液，分装，并进行冻干成粉末，2~8℃保存，依次得到质控品LQC、质控品MQC和质控品HQC。

内标品：将步骤2）已知浓度的氘代氧化三甲胺内标品储备液用步骤3）的基质水溶液稀释至750ng/mL得到内标品工作液，分装，并进行冻干成粉末，2~8℃保存，得到内标品。

本实施例中配得的系列氧化三甲胺校准品工作液、系列氧化三甲胺质控品工作液和内标品工作液中的甲醇体积百分比均低于0.1%。

上述进行冻干的具体操作为：置于-20℃开展预冻过夜，然后置于冻干机中，待水分全部抽干，冻干品成粉状或饼状时；在冻干机中，按照如下工艺参数进行冻干：

区段	温度（℃）	时间（min）
			1	-35.0	100
2	-25.0	300
			3	-15.0	100
4	-4.0	1000

5）流动相A小瓶：称量乙酸铵固体粉末770.8 mg，称量偏差控制在±10%，封装于小瓶中。

1.2、试剂盒的使用方法

检测前取出所有试剂，并平衡至室温（18~25℃），混匀。

校准品的复溶：分别取预定体积的超纯水加入到相应的校准品C1~C8的试剂瓶中，彻底混匀，直到完全溶解，得到C1~C8校准品使用液，浓度依次对应5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL。2～8℃条件下储存在密封的试剂瓶中，此溶液可以稳定28天，使用前恢复至室温。

质控品的复溶：分别取预定体积的超纯水加入到相应的质控品LQC、MQC、HQC的试剂瓶中，彻底混匀，直到完全溶解，得到LQC、MQC、HQC质控品使用液，浓度依次对应15ng/mL、150ng/mL、800ng/mL。2～8℃条件下储存在密封的试剂瓶中，此溶液可以稳定28天，使用前恢复至室温。

内标品的复溶：取预定体积的超纯水加入到相应的内标品试剂瓶中，彻底混匀，直到完全溶解，得到内标品使用液，浓度750ng/mL。2～8℃条件下储存在密封的试剂瓶中，此溶液可以稳定28天，使用前恢复至室温。

流动相A溶液：取5mL的超纯水加入到流动相A小瓶中，混匀，转移至1L的玻璃瓶中，重复上述步骤3次，确保流动相A小瓶中粉末全部转移至玻璃瓶中，加水至刻度1L，超声5min确保粉末全部溶解，室温条件下储存，此溶液可以稳定14天。

1.3、样本前处理步骤：

取待测血样、校准品使用液、质控品使用液各50μL到2mL的96孔深孔板中，做好相应标记，各孔中均加入内标品使用液10μL、乙腈140μL，用铝箔封膜进行封板。在2500 rpm振频下旋涡振荡120s，振荡后4000 rpm离心15 min。取上清50μL转移至新的96孔深孔板中，每孔中加入450μL超纯水，用铝箔封膜进行封板。在2500 rpm振频下旋涡振荡120s，振荡后4000 rpm离心5 min。

1.4、检测条件及标准曲线的绘制

色谱条件：0.00~2.00 min，30%流动相A（10mM乙酸铵水溶液），70%流动相B（100%乙腈），流速0.3 mL/min，进样2μL，色谱柱为Hilic色谱柱。

质谱条件：正离子电喷雾离子化模式（ESI+），多反应检测（MRM）的扫描方式，离子通道参数为TMAO（m/z 76.000→58.100）、TMAO-d9（m/z 85.1.000→66.100）

标准曲线的绘制方法：以校准品使用液中氧化三甲胺的标示浓度为横坐标（X），校准品使用液中氧化三甲胺的实测质谱峰面积与内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值（或简称TMAO/TMAO-d9比值）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，并进行线性回归，可获得回归方程：Y=a+bX，其中a为截距，b为斜率，并计算相关系数（r），要求r≥0.990。

检测样本结果的计算：将检测样本中氧化三甲胺的实测质谱峰面积与各自对应内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值代入上述标准曲线方程，计算检测样本中氧化三甲胺的浓度。

1.5试剂盒的定量范围

采用试剂盒的组分、实际样本分别测试本产品的线性范围。试剂盒组分的定量范围在5~1000 ng/mL，拟合标准曲线的线性方程为y=0.0104613x+0.00490923，相关系数r=0.9987，各浓度校准品的相对偏差<±15%，质控品LQC/MQC/HQC的相对偏差<±15%，质控点的评价合格，定量范围符合要求。

收集临床受试者血浆样本并用本申请的试剂盒检测实际含量，获得高浓度样本（2816.761ng/mL）、低浓度样本（4.793ng/mL），并将二者按一定比例混合获得一系列不同混合比例的实际样本，混合后的实际样本理论浓度在4.793~1329.065 ng/mL，采用本实施例的试剂盒对不同混合比例的实际样本进行检测获得实测浓度，理论浓度与实测浓度的比较见表1，各混合浓度的相对偏差<±15%，采用多项式回归的统计方法，拟合标准曲线见图1，在4.793ng/mL~1410.777ng/mL范围内成线性，相关系数r=1。

以上述实际样本拟合的定量范围，包含了本申请提供的试剂盒的定量范围，因此本实施例的试剂盒定量范围可以确定为5~1000 ng/mL。

表1. 实际样本的理论浓度、实测浓度及偏差统计

表1（续）. 实际样本的理论浓度、实测浓度及偏差统计

注：表1中，以比例“1:1-1”为例，其中的“1:1”为高浓度样本和低浓度样本的混合比例，“-1”中的“1”是指该对应比例下的重复试验次数。

1.6、稳定性测试

以下对本发明试剂盒的稳定性进行测试，验收标准如下表2所示。

表2本发明试剂盒的性能验证总结

验证内容	验收指标	实验结果
			冻干前后验证	校准品：r>0.99，各浓度校准品的RE%<±15% 质控品：各浓度质控品的RE%<±15%	冻干前后合格
加速稳定性	校准品：r>0.99，各浓度校准品的RE%<±15% 质控品：各浓度质控品的RE%<±15% 37℃加速5天，批间CV%<±15%	合格 37℃5天无影响 有效期可达1年
			开盖稳定性	校准品：r>0.99，各浓度校准品的RE%<±15% 质控品：各浓度质控品的RE%<±15% 开盖4次，批间CV%<±15%	合格 开盖4次无影响
复溶稳定性	校准品：r>0.99，各浓度校准品的RE%<±15% 质控品：各浓度质控品的RE%和CV%<±15% 复溶后2~8℃放置7天，批间CV%<±15%	合格 复溶7天无影响

注：表2中，“实验结果”中的合格是指各验证实验中按照验收指标判断，当合格率大于66.7%即判断为试剂盒的该项验证实验的实验结果为合格。

1.6.1、冻干前后验证

实验过程：冻干前的氧化三甲胺校准品工作液和氧化三甲胺质控品工作液、及对应的冻干后得到的氧化三甲胺校准品和氧化三甲胺质控品经复溶后得到的氧化三甲胺校准品使用液和氧化三甲胺质控品使用液，分别测定它们的氧化三甲胺的含量获得实测浓度，并分别与理论浓度比较得到相对偏差RE%，冻干前后的内标随行开展测试（即对于冻干前的上述各工作液的氧化三甲胺实测浓度的检测均采用冻干前的内标品工作液进行，对于冻干后并复溶得到的上述各使用液的实测浓度的检测均采用冻干后并复溶得到的内标品使用液进行），以获得TMAO/TMAO-d9比值。

实验结果：冻干前后的验证结果见图6和表6.1数据。从实验结果可见，冻干前后校准品、质控品的RE%<±15%,经冻干工艺处理的校准品、质控品含量稳定。

1.6.2、开盖稳定性验证

实验过程：制备4批次冻干的校准品、内标品和质控品，不复溶的状态下进行开盖稳定性验证

第1次开盖：4批次各冻干的校准品、内标品和质控品，在室温下打开盖子，然后保留1批次在室温，作为开盖1次稳定性验证的样本，并立即开展开盖1次稳定性测试。其他3批次重新拧紧盖子，放回2~8℃保存至少2h；

第2次开盖：放回2~8℃保存至少2h的剩余3批次各冻干的校准品、内标品和质控品，在室温下打开盖子，然后保留1批次在室温，作为开盖2次稳定性验证的样本，并立即开展开盖2次稳定性测试。其他2批次重新拧紧盖子，放回2~8℃保存至少2h；

第3次开盖：放回2~8℃保存至少2h的剩余2批次各冻干的校准品、内标品和质控品，在室温下打开盖子，然后保留1批次在室温，作为开盖3次稳定性验证的样本，并立即开展开盖3次稳定性测试。其他1批次重新拧紧盖子，放回2~8℃保存至少2h；

第4次开盖：放回2~8℃保存至少2h的剩余1批次各冻干的校准品、内标品和质控品，在室温下打开盖子，然后保留该批次在室温，作为开盖4次稳定性验证的样本，并立即开展开盖4次稳定性测试。

测定各次开盖稳定性测试样本中的氧化三甲胺的含量变化。冻干后的内标品随行开展测试（即开盖考察的校准品或质控品的含量检测使用对应开盖次数的内标品进行），以获得TMAO/TMAO-d9比值。

实验结果：4次开盖稳定性的数据统计见图2和表6.4。从实测浓度来看，批间变异系数（CV%）<±10%。冻干物开盖4次，浓度、响应、峰面积的批间一致性良好。图2中“KG”代表“开盖”，“KG”后的数字代表开盖次数。

1.6.3、加速稳定性验证

实验过程：各冻干的校准品和质控品，于37℃水浴锅中依次孵育1d、2d、3d、4d、5d，进行1-5次加速处理，测定其中的氧化三甲胺的含量变化。冻干后的内标随行开展测试（即使用相同加速稳定性实验参数处理的内标品测量校准品和质控品的含量变化），以获得TMAO/TMAO-d9比值。

实验结果：5次加速稳定性的数据统计见图3和表6.2.1、表6.2.2。实测浓度批间变异系数（CV%）<±10%。冻干待测物复溶后，加速5d持续稳定，相当于2-8℃储存超过半年甚至1年。图3中“JS”代表“加速”，“JS”后的数字代表加速稳定性考察到第几天。

1.6.4、复溶稳定性验证

实验过程：各冻干的校准品和质控品复溶后，于2-8℃中依次放置1d、3d、5d、7d，依次进行1-7天复溶稳定性处理，测定其中的氧化三甲胺的含量变化。冻干后的内标随行开展测试（即采用相同复溶稳定性实验参数处理的内标品测量校准品和质控品的含量变化），以获得TMAO/TMAO-d9比值。

实验结果：1-7天复溶稳定性的数据统计见图4和表6.3。实测浓度批间CV<±10%。冻干待测物复溶后，在2~8℃储存7d仍保持基本稳定。图4中“FR”代表“复溶”，“FR”后的数字代表复溶稳定性考察到第几天。

以上对本发明的试剂盒进行稳定性测试的实验结果见表6.1、6.2.1、6.2.2、6.3、6.4。

1.7试剂盒的参考值范围

本申请的TMAO测定试剂盒的参考临界值（简称CUTOFF值），指“正常”人体血清中生物标志物TMAO的浓度。CUTOFF值用以区分“正常”和“异常”个体，为临床诊断提供参考。

选取体检血清样本311例，基本情况见表3。选择的血清样本来自健康受试者，均通过伦理审查，无明确的如心绞痛、冠心病、心衰等心血管疾病史和其他常见慢性疾病史，相关常规体格检查和实验室检测结果均在正常范围内。

表3 311例体检血清样本基本情况

检测结果及分析

整个数据的分布属偏态分布，客观而简便的方法是采用百分位数法。百分位数的计算公式为：

P_r=L+W*（n*r/100-C）/f

式中P_r为第r百分位数，L为第r百分位数所在组的下限，W为第r百分位数所在组的宽度，f为第r百分位数所在组的频数，n表示总频数，C为第r百分位数所在组的前一组的累计频数。

上述311例体检血清样本的TMAO检测结果分布频数表如下表4所示。

表4 311例体检血清样本的TMAO分布频数表

第95百分位数为：

P₉₅=L+W（n*95/100-C）/f=400+50（311*95/100-295）/5=404.50

统计的数值共311个，它的第95百分位数为第295.45个，从频数表中可知这个百分位数在第400-450单位组。由此确定计算式中各个值。根据表2的分析，以单个指标单侧95%的原则并对数值适当取整得出CUTOFF值，即TMAO在正常人群中的CUTOFF值为405 ng/mL。TMAO的CUTOFF值以表5统计，从表5中可得出，本试剂盒总体假阳性率为5.1%（311例样本中共有16例出现超过设定CUTOFF值405ng/mL的情况），基本满足临床检测的要求。

表5 TMAO实验数据百分比汇总表

含量分布（ng/mL）	例数	百分比%
			0~405	295	94.9
>405~900	16	5.1
			>900~1000	0	0.0
>1000~2000	0	0.0
			合计	311	100.0

对比例

参照参考文献1（CN CN201710502265.5）中的溶液工艺开展该对比例。

以牛血清白蛋白作为替代基质，模拟参考文献1用5%牛血清白蛋白水溶液配制了5~1000ng/mL的TMAO校准品和15/150/800ng/mL的TMAO质控品；还配置了内标TMA9-d9浓度为21ng/mL的内标工作液（通过将42μg/mL的内标TMA9-d9储备液（用50%（体积）甲醇水溶液配制）用纯乙腈溶剂稀释得到）。该配置基本涵盖了参考文献1所述的校准品浓度在2~500ng/mL、质控品为4/40/400ng/mL的范围，并随行加入该配置下的内标工作液，以获得TMAO/TMAO-d9比值。

加速稳定性考察：分别在37℃下存放以考察加速稳定性，孵育时间为48h、72h、96h，未详述之处参照1.6.3考察加速稳定性；

冻融稳定性考察：在-20℃冷冻和2~8℃融化，考察冻融稳定性；

开盖稳定性考察：在室温下开盖依次放置2h、4h、8h，考察开盖稳定性，未详述之处参照1.6.2进行。

检测结果见表7.1、7.2、7.3和附图5（图5中，nHKG表示开盖稳定性考察到第n小时）。经测试，溶液工艺的TMAO试剂盒只能维持在2次冻融（合格标准为冻融≥3次均稳定（浓度偏差RE%≤±15%），合格率>66.7%）、37℃加速只能维持3天（合格标准参照表2中对于加速稳定性的相应要求），开盖稳定性只维持4小时开盖（合格标准为开盖≥8小时，校准品：r>0.99，各浓度校准品的RE%<±15%；质控品：各浓度质控品的RE%<±15%；合格率>66.7%），且开盖稳定性中的内标，因为溶剂乙腈的挥发而变得批间不一致（合格标准为CV<±15%，合格率>66.7%），综合来看，参考文献1所描述的溶液工艺不能满足TMAO试剂盒的稳定性和重现性。

实验结果

本申请引入了冻干工艺制备TMAO测定试剂盒，从产品的主要性能验证结果表明，本发明提供的试剂盒中氧化三甲胺校准品和氘代氧化三甲胺内标品、氧化三甲胺质控品具有优异的稳定性，加速稳定性为5天无异常，有效期可达1年，开盖4次质控无异常，复溶稳定性7天无异常，综合性能指标显著超过对比例的溶液工艺，克服了现有技术（例如前文提到的参考文献1）中溶液工艺稳定性差的实际情况。

表6.1-本发明实施例中TMAO试剂盒的冻干前后验证结果

表6.2.1-本发明实施例中TMAO试剂盒的加速稳定性验证结果

注：JSn表示加速稳定性考察到第n天；浓度偏差（RE%）合格标准为<±15%

表6.2.2-本发明实施例中TMAO试剂盒的加速稳定性验证结果

注：JSn表示加速稳定性考察到第n天；浓度偏差（RE%）合格标准为<±15%

表6.3-本发明实施例中TMAO试剂盒的复溶稳定性验证结果

注：FRnd表示复融稳定性考察到第n天；浓度偏差（RE%）合格标准为<±15%

表6.4-本发明实施例中TMAO试剂盒的开盖稳定性验证结果

注：KGn表示开盖稳定性考察到第n次；浓度偏差（RE%）合格标准为<±15%

表7.1-对比例加速稳定性验证结果

注：JS-nh表示加速稳定性考察到第n小时

表7.2-对比例冻融稳定性验证结果

注：nF&T表示冻融稳定性考察到第n次

表7.3-对比例开盖稳定性验证结果

注：nHKG表示开盖稳定性考察到第n小时

由以上实验结果可见，本发明提供的用于测定氧化三甲胺的改进型试剂盒，能够有效解决溶液工艺制备的试剂盒稳定性不佳的现状，且能实现内标物的可冻干和长期稳定性，能进一步保障TMAO测定的精密度和准确度。

Claims (9)

1.一种用于测定氧化三甲胺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括系列氧化三甲胺校准品和氘代氧化三甲胺内标品；

所述系列氧化三甲胺校准品为具有浓度梯度的系列氧化三甲胺校准品工作液的冻干物，所述系列氧化三甲胺校准品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有浓度梯度的氧化三甲胺校准品工作液；

所述氘代氧化三甲胺内标品为已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用基质溶液稀释而成的具有预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液的冻干物；

所述基质溶液中的所述基质选自血清白蛋白，优选为牛血清白蛋白或人血清白蛋白；

优选的，所述试剂盒还包括系列氧化三甲胺质控品，所述系列氧化三甲胺质控品为具有多个浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液的冻干物，所述系列氧化三甲胺质控品工作液为已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释而成的具有不同浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液。

2.根据权利要求1所述的用于测定氧化三甲胺的试剂盒，其特征在于，所述基质溶液为基质浓度1%~8%的血清白蛋白水溶液。

3.根据权利要求1所述的用于测定氧化三甲胺的试剂盒，其特征在于，所述系列氧化三甲胺校准品工作液的浓度范围为5~1000 ng/mL；

和/或，所述氘代氧化三甲胺内标品工作液的浓度为200~2000 ng/mL；

和/或，所述系列氧化三甲胺质控品工作液包括高、中、低浓度水平的氧化三甲胺质控品工作液；优选的，高浓度水平的浓度值在500~1000 ng/mL范围内，中浓度水平的浓度值在100~200 ng/mL范围内，低浓度水平的浓度值在10~20 ng/mL范围内。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测定氧化三甲胺的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括流动相所需的溶质，优选所述溶质包括乙酸铵。

5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将所述已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到具有浓度梯度的所述系列氧化三甲胺校准品工作液；

将所述已知浓度的氘代氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到所述预定浓度的氘代氧化三甲胺内标品工作液；

将所述已知浓度的氧化三甲胺标准品溶液用所述基质溶液稀释得到所述具有多个浓度水平的系列氧化三甲胺质控品工作液；

将所述系列氧化三甲胺校准品工作液、所述氘代氧化三甲胺内标品工作液和所述系列氧化三甲胺质控品工作液分别冻干，得到所述系列氧化三甲胺校准品、所述氘代氧化三甲胺内标品和所述系列氧化三甲胺质控品；

优选的，所述冻干包括在冻干机中按照如下温度程序进行处理的步骤：1）区段一，在-35.0℃处理30~180min；2）区段二，在-25.0℃处理200~800min；3）区段三，在-15.0℃处理100~500min；4）区段四，在-4.0℃处理500~1000min。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述氧化三甲胺标准品溶液和/或所述氘代氧化三甲胺标准品溶液用有机溶剂或有机溶剂水溶液配制；优选所述系列氧化三甲胺校准品工作液、所述系列氧化三甲胺质控品工作液和所述氘代氧化三甲胺内标品工作液中，所述有机溶剂的体积百分含量小于0.1%。

7.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在氧化三甲胺的测定中的应用，其特征在于，在进行氧化三甲胺的测定之前，按照所述系列氧化三甲胺校准品工作液的相应浓度梯度用水复溶所述系列氧化三甲胺校准品，从而得到系列氧化三甲胺校准品使用液；

按照所述氘代氧化三甲胺内标品工作液的所述预定浓度用水复溶所述氘代氧化三甲胺内标品，得到氘代氧化三甲胺内标品使用液；

按照所述系列氧化三甲胺质控品工作液的所述多个浓度水平用水复溶所述系列氧化三甲胺质控品，得到系列氧化三甲胺质控品使用液。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，对所述氧化三甲胺进行测定的步骤包括：

1）向所述系列氧化三甲胺校准品使用液中加入所述氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到各氧化三甲胺校准品使用液中氧化三甲胺的质谱峰面积与所述氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并得到所述比值与所述氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系；

2）向待测样品中加入所述氘代氧化三甲胺内标品使用液和沉淀剂，混合后离心，取上清液，经液相色谱和质谱分析，得到所述待测样品中氧化三甲胺的质谱峰面积与所述氘代氧化三甲胺内标品使用液中氘代氧化三甲胺的质谱峰面积的比值，并根据步骤1）得到的所述比值与所述氧化三甲胺校准品使用液的氧化三甲胺浓度之间的关系，得到所述待测样品中氧化三甲胺的浓度；

所述沉淀剂优选为乙腈。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，进行液相色谱分析采用的流动相以乙酸铵水溶液为A相，以乙腈为B相，色谱柱为Hilic色谱柱，流动相流速为0.2~0.4 mL/min；进行质谱分析的条件为：正离子电喷雾离子化模式，多反应监测方式扫描。

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