CN116593621A - 一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析血浆样本中药物的方法 - Google Patents

一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析血浆样本中药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用高效液相色谱‑串联质谱联用装置定量分析SYHA1807的方法，所述方法包括以下步骤：1)制备含有SYHA1807的样品溶液；2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱‑串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；3)根据所述质量色谱图使用内标法对SYHA1807进行定量分析，其中高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，其中所述流动相A选自：乙腈，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的乙腈溶液，以及含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水‑乙腈混合液，并且所述流动相B选自：含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的水溶液，含有1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水溶液，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的乙腈‑水混合液。

Description

一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析血浆样 本中药物的方法
技术领域
本发明属于生物化学和药物分析化学领域，具体而言，涉及一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析SYHA1807的方法。
背景技术
液相色谱-质谱分析法主要应用于药物代谢、药物动力学、临床药理学、天然药物开发等领域，其具有高灵敏度、高特异性、重现性好、定量准确、线性范围宽、数据处理简单等优点。高效液相色谱能够有效地将待测物的成分分离，而质谱能够对分开的成分进行逐个分析。液相色谱-质谱分析法是利用试样各组分在色谱柱中的流动相和固定相间的分配和吸附系数不同，由流动相把试样带入色谱柱中进行分离后，经接口装置，不同的离子碎片在不同的电场和/或磁场的运动行为不同，质量分析器把电离子按质荷比(m/z)分开，得到依质量顺序排列的质谱图。通过对质谱图的分析处理，可以得到样品的定性、定量分析结果。
肺癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发病率和死亡率第一位。按照组织学特点可以分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)。小细胞肺癌是一种高度恶性的肺部神经内分泌肿瘤，约占肺癌发病人数的15％，全球每年新发病例约27万人。发病因素复杂，与吸烟关系密切，约98％的病人为吸烟患者。疾病进展迅速，预后较差，病人确诊后的5年生存率不足7％，平均生存期不足一年。
SYHA1807是一种新型的赖氨酸特异性去甲基化酶(Lysine-SpecificDemethylase 1，LSD1，又名KDM1A)小分子激酶抑制剂，目前全球尚无同类产品上市。它可以针对小细胞肺癌低分化和神经内分泌性等特点，通过表观遗传学手段促进肿瘤干细胞分化，下调神经内分泌相关基因的表达，抑制肿瘤生长，同时提升肿瘤对化疗的敏感性。临床前研究显示，该产品具有优异的体内外抗肿瘤活性和良好的安全性，极有希望在临床研究中展现出良好的小细胞肺癌治疗效果。中国国家食品药品监督管理局(NMPA)于2019年7月批准了SYHA1807的临床试验，目前正在进行I期临床研究。
因此亟需开发一种快速、特异、高灵敏度且高稳定性的定量分析方法来定量测定SYHA1807。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量分析SYHA1807的高效液相色谱-串联质谱分析方法，使得能够准确定量SYHA1807，以满足临床药物代谢动力学研究的需求。
为实现上述发明目的，本发明提供了一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析SYHA1807的方法，所述方法包括以下步骤：
1)制备含有SYHA1807的样品溶液；
2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱-串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；
3)根据所述质量色谱图使用内标法对SYHA1807进行定量分析，
其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，
其中所述流动相A选自：乙腈，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的乙腈溶液，以及含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水-乙腈混合液，其中所述水-乙腈混合液中的水与乙腈的体积比在1：99至10：90的范围内，并且
所述流动相B选自：含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的水溶液，含有1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水溶液，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的乙腈-水混合液，其中所述乙腈-水混合液中的乙腈与水的体积比在1：99至10：90的范围内。
在一些实施方案中，所述流动相A为含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的体积比为5：95的水-乙腈混合液；和/或所述流动相B为含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的体积比为5：95的乙腈-水混合液。
在一些实施方案中，所述梯度洗脱程序如下：
0.00分钟至1.00分钟，8体积％至12体积％的流动相A；
1.01分钟至1.99分钟，93体积％至97体积％的流动相A；
2.00分钟至3.00分钟，8体积％至12体积％的流动相A，
其中在所述混合流动相中，流动相A和流动相B的总量为100体积％。
优选地，所述梯度洗脱程序如下：
0.00分钟至1.00分钟，10体积％的流动相A；
1.01分钟至1.99分钟，95体积％的流动相A；
2.00分钟至3.00分钟，10体积％的流动相A，
其中在所述混合流动相中，流动相A和流动相B的总量为100体积％。
在一些实施方案中，所述高效液相色谱中的色谱柱为反相色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。优选地，所述色谱柱为ACQUITYBEHC18色谱柱(2.1×50mm，1.7μm)。
在一些实施方案中，所使用的内标标准品为D5-SYHA1807(氘代SYHA1807)。
在一些实施方案中，所述制备含有SYHA1807的样品溶液包括：用二甲基亚砜溶解SYHA1807得到SYHA1807储备溶液，然后用由水和乙腈组成的稀释液稀释所述SYHA1807储备溶液。优选地，所述稀释液中的水与乙腈的体积比在20：80至80：20的范围内，更优选为50：50。
在一些实施方案中，SYHA1807来自受试者的血浆。
在一些实施方案中，所述制备含有SYHA1807的样品溶液包括：向受试者的血浆样品中加入内标工作溶液，将所得混合物振荡，然后离心，取上清液进行干燥得到固体样品，然后用由0.1质量％甲酸水溶液和乙腈组成的复溶液将所述固体样品溶解并且混匀。优选地，所述复溶液中的乙腈与0.1质量％甲酸水溶液的体积比在5：95至20：80的范围内，更优选为10：90。
优选地，所述内标工作溶液通过以下方式制备：用二甲基亚砜溶解内标标准品D5-SYHA1807得到内标储备溶液，然后用乙腈稀释所述内标储备溶液。
优选地，所述血浆样品与所述内标工作溶液的体积比在1：2至1：4的范围内，优选为1：3。
优选地，所述上清液与所述复溶液的体积比在2：1至5：1的范围内，优选地在3：1至4：1的范围内，更优选为3.5：1。
在一些实施方案中，所述样品溶液的进样量为5至20μL，优选5至10μL，更优选10μL。
在一些实施方案中，所述混合流动相的流速为0.2至0.5mL/min，优选0.3至0.5mL/min，更优选0.4mL/min。
在一些实施方案中，所述高效液相色谱中的柱温为35至45℃，优选38至42℃，更优选40℃。
在一些实施方案中，所述检测方法还包括制备SYHA1807储备溶液、标准曲线工作液、标准曲线血浆样品溶液、内标储备溶液、内标工作溶液、质量控制工作液、质量控制血浆样品溶液中的一个或多个。
在一些实施方案中，SYHA1807储备溶液的制备方法为：称量SYHA1807标准品，使用乙腈-水混合液(体积比优选为1∶1)溶解。在一些实施方案中，所述样品储备溶液的浓度为0.5mg/mL。
在一些实施方案中，标准曲线工作液的制备方法为：取适量SYHA1807储备溶液，用由水和乙腈组成的稀释液(其中水与乙腈的体积比在20：80至80：20的范围内，更优选为50：50)进一步稀释以制备不同浓度的标准曲线工作液。在优选的实施方案中，标准曲线工作液的浓度为1、2.5、5、25、50、250、500、1000ng/mL。
在一些实施方案中，标准曲线血浆样品溶液的制备方法为：分别取不同浓度的标准曲线工作液，用空白血浆稀释，最终获得一系列标准曲线血浆样品溶液。在优选的实施方案中，所述标准曲线血浆样品溶液的浓度为10、25、50、250、500、25、2500、5000和10000pg/mL。
在一些实施方案中，质量控制工作液的制备方法为：取适量SYHA1807储备溶液，用由水和乙腈组成的稀释液(其中水与乙腈的体积比在20：80至80：20的范围内，更优选为50：50)进一步稀释以制备不同浓度的质量控制工作液。在优选的实施方案中，所述质量控制工作液的浓度为1、2、80、800ng/mL。
在一些实施方案中，质量控制血浆样品溶液的制备方法为：分别取不同浓度的标准曲线工作液，用空白血浆稀释，制备质量控制样品溶液。在优选的实施方案中，所述质量控制血浆样品溶液的浓度为10、20、800、8000、40000pg/mL。
在一些实施方案中，内标储备溶液的制备方法为：称量内标标准品，使用二甲基亚砜溶解。在优选的实施方案中，内标储备溶液的浓度为0.5mg/mL。
在一些实施方案中，内标工作溶液的制备方法为：取适量内标储备溶液，用乙腈稀释。在一些实施方案中，内标工作溶液的浓度为0.5ng/mL。
为了提供更简洁的描述，本文中的定量数据没有使用术语“约”。应当理解，无论明确使用或不明确使用术语“约”，这里给出的每一个数值都不仅包括实际给出的值(给定值)，并且它还意味着包括基于本领域普通技术人员合理推断的对这种给定值的近似值，包括由于实验和/或测量条件而产生这种给定值的等同值和近似值。所述近似值优选在给定值的基础上±20％、±15％、±10％、±8％、±6％、±5％、±4％、±3％、2％、±1％。
在一些实施方式中，阐述本发明一些实施方式的广泛范围的数值范围和数值参数是近似值，应根据所报道的有效位数的数字并通过应用普通的四舍五入技术来解释数值参数。尽管在具体实施例中所提出的数值是尽可能地精确报道，但在本发明一些实施方式中所呈现的数值可能包含某些误差，其是由于测试测量中的标准偏差所必然导致的误差。
本发明取得了以下有益的技术效果：
(1)本发明首次建立了一种快速、稳定、灵敏的UPLC-MS/MS方法来测定人血浆中的化合物SYHA1807。化合物SYHA1807的化学结构中含有氮原子，本发明采用ESI源的正电离模式具有更好的电离性能和稳定的响应。此外，本发明对源/气体和化合物参数(包括毛细管电压、锥体电压等)进行了优化，获得了最合适的电离条件。
(2)由于化合物SYHA1807的化学结构中存在苯环，首选反相色谱法。发明人对各种色谱柱的分离效果进行了探索，相对于其他色谱柱，ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)具有足够的保留和稳定的色谱峰形状，发明人选择该色谱柱进行分离。本发明还对流动相进行了筛选，发现以乙腈作为有机相具有较好的洗脱效果和非常低的背景噪声，水相中添加适量的甲酸、乙酸铵和乙腈可以增加响应。本发明可以在3分钟内完成梯度洗脱，耗时短，且获得了较好的色谱峰形和较高的灵敏度。
(3)制备血浆样品时，发明人首先使用了液-液萃取法，但该方法会导致化学污染，且灵敏度低。发明人还尝试了固相萃取法，但由于操作复杂，该方法会耗费大量时间和成本。对于蛋白沉淀法，虽然通常情况下该方法可能存在基质效应，影响测定准确性；但最终方法学验证表明，在本发明所述的检测条件下，使用蛋白沉淀法制备血浆样品，基质效应可忽略不计，获得了清晰的色谱峰，具有很好的重现性。
附图说明
图1A示出了在本发明的条件下测得的代表性双空白血浆样品(Double Blank，DB)的代表性质量色谱图。
图1B示出了在本发明的条件下测得的定量下限(LLOQ)样品的代表性质量色谱图。
图2示出了在本发明的条件下的SYHA1807的典型标准曲线图。
图3示出了1例小细胞肺癌患者口服6mg SYHA1807后的代表性血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
1.化学品和试剂
化合物SYHA1807(纯度99.6％)和化合物D5-SYHA1807(氘代内标，纯度95.7％)的标准品由石药集团(中国石家庄)提供。
HPLC级乙腈购自Honeywell Burdick&Jackson(ML，美国)。
分析纯级甲酸购自Sigma-Aldrich chemicals(MO，美国)。
分析纯级二甲基亚砜购自北京化学试剂公司(中国北京)。
分析纯级乙酸铵购自国药集团化学试剂有限公司(中国北京)。
空白血浆由北京协和医院(中国北京)提供。
去离子水由Milli-Q系统(Millipore，Bedford，MA，美国)纯化得到。
2.色谱和质谱条件
2.1色谱条件
使用ACQUITY UPLC系统(Waters，MA，美国)进行色谱分离。
色谱柱：ACQUITY UPLCC18柱(2.1×50mm，1.7μm)。
流动相A：含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的水-乙腈(体积比为5：95)溶液；
流动相B：含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的乙腈-水(体积比为5：95)溶液
表1：梯度洗脱程序
柱温：40℃
自动进样器温度：10℃
进样体积：10μL
流速：0.4mL/min
为了减少残留，使用体积比为90：10的乙腈-水溶液(强洗)和体积比为10：90的乙腈-水溶液(弱洗)清洗自动取样器的注射器和注射阀。
2.2质谱条件
使用Xevo TQS三重串联四极杆质谱(Waters，MA，美国)进行质谱分析，选择电喷雾电离(ESI)源的正离子模式。
多反应监测(MRM)扫描检测，化合物SYHA1807的定量离子对：m/z 353.2→228.2；化合物D5-SYHA1807(内标)的定量离子为：m/z 358.2→233.2。
其他优化参数在以下表2中示出：
表2：串联质谱参数
3.储备溶液、校准标准和质量控制样品的制备方法
(1)化合物SYHA1807储备溶液(0.5mg/mL)：精密称取SYHA1807标准品粉末6.047mg，转移至10mL容量瓶中，加入适量二甲基亚砜(DMSO)溶解后定容至刻度，得到0.5mg/mL储备液。用于制备标准曲线工作液和质量控制(QCs)工作液。
(2)标准曲线工作液：根据下表，使用水：乙腈混合液(体积比为50：50)与标准品母液来配制SYHA1807标准曲线工作液(浓度分别为1、2.5、5、25、50、250、500和1000ng/mL)。
表3：标准曲线工作液的制备
WS9*：仅用于配制工作液
(3)标准曲线血浆样品溶液：根据下表，使用空白血浆配制标准曲线(浓度分别为0.0100、0.0250、0.0500、0.250、0.500、2.50、5.00和10.0ng/mL)。
表4：标准曲线血浆样品溶液的制备
(4)质量控制(QCs)工作液：根据下表，使用水：乙腈混合液(体积比为50：50)配制SYHA1807质控工作液(浓度分别为1、2、80、800、4000ng/mL)。
表5：质量控制工作液的制备
质控工作液 浓度(ng/mL) 体积(μL) 水：乙腈混合液
WQ4* 5000 QC母液：10 990μL
WDQC 4000 QC母液：8 992μL
WQ3 800 WQ4：160 840μL
WQ2 80.0 WQ3：100 900μL
WQ1 2.00 WQ2：25 975μL
WLLOQ 1.00 WQ1：300 300μL
WQ4*：仅用于配制工作液
(5)质量控制血浆样品溶液：根据下表，使用空白血浆配制质控样品，浓度分别为0.0100、0.0200、0.800、8.00和40.0ng/mL，分别记为定量下限(LLOQ)、低浓度质控(LQC)、中浓度质控(MQC)、高浓度质控(HQC)和稀释质控(DQC)。
表6：质量控制血浆样品溶液的制备
(6)内标储备溶液(0.5mg/mL)：称取内标SYHA1807-D5标准品6.290mg，转移至10mL容量瓶中，加入适量DMSO溶解后定容至刻度，得到0.5mg/mL母液，使用二甲基亚砜(DMSO)溶解，即得。
(7)内标工作溶液：取10μL内标储备溶液，用乙腈稀释以获得浓度为0.5ng/mL的内标工作溶液。
以上溶液和血浆样品在-80℃的温度下冷冻保存。
4.血浆样本预处理方法
取100μL血浆样品加入EP管中，加入300μL内标溶液(0.5ng/mL，溶剂为乙腈)沉淀蛋白，振荡1分钟，随后在13300rpm条件下离心10分钟。取上清液350μL置于新的EP管中，室温下氮气吹干，加入100μL复溶液(乙腈：0.1％甲酸水溶液＝1∶9，v：v)复溶，混匀后进样。
实施例一：选择性
1.方法
取来自六个不同个体的人血浆样品空白基质，每一个来源的空白基质分别配制1个双空白血浆样品(Double Blank，DB)和1个定量下限(LLOQ)样品，一共12个样品。比较通过本发明的方法获得的双空白血浆样品(DB)样品与定量下限(LLOQ)样品的检测结果，评估方法的选择性。
接受标准：空白样品在分析物相应保留时间处如果存在有一定的干扰，此干扰不大于LLOQ样品分析物峰面积平均值的20％；在采用内标法定量时，内标相应保留时间处色谱峰面积应不大于标准曲线和质控样品中内标峰面积平均值的5％。
2.结果
本发明的方法符合接受标准，结果见以下表7。
表7：选择性考察
按选定的LC-MS/MS条件，测得6个不同来源的双空白血浆样品(DB)的质量色谱图；代表性图参见图1A。由图可见，人血浆中不存在内标的内源性干扰峰，所以在本实验条件下血浆基质对待测物和内标的分离和测定无干扰。代表性LLOQ图谱在图1B中示出。
实施例二：线性关系
1.方法
处理并测定包含8个浓度点的2套标准曲线样品，分别放置在分析批次的首、尾。以SYHA1807与内标的峰面积之比为Y，浓度为X，进行拟合。权重系数1/X2，标准曲线的曲线回归方程为Y＝aX+b。每个分析批包括1个双空白样品(DB)和1个空白样品(BK)，以确保空白基质和所加入的试剂对化合物的检测没有干扰。
接受标准：线性良好，r≥0.990或r2≥0.980；校正标样回算的浓度应在标示值的85％-115％以内，定量下限处应在80％-120％以内。至少75％的校正标样(最少6个有效浓度)的测定准确度，应满足上述要求；相同浓度点的校正标样，至少50％满足上述要求。
2.结果
所有批次样品浓度在0.01-10.0ng/mL范围内与峰面积的比值具有良好的线性关系。表8给出了标准曲线血浆样品反算浓度结果。
表8：标准曲线的回算浓度
％CV：精密度(变异系数)
％Bias：准确度偏差
在方法学验证期间共制备标准曲线20条，R2值均在0.990至1.000之间，详见表9。典型标准曲线图参见图2。
表9：标准曲线参数汇总
实施例三：精密度和准确度
1.方法
精密度和准确度验证的每个批次均应使用独立配制、且新鲜配制的标准曲线和质控(QC)样品；精密度和准确度不得连续失败两个分析批，且至少连续通过两个分析批，并至少在两天进行。在定量下限(LLOQ)、低浓度质控(LQC)、中浓度质控(MQC)、高浓度质控(HQC)浓度水平，各取六个质控样品，以评估批内和批间的精密度和准确度。在单个批次中评估批内精密度和准确度，并在连续三批之间评估批间精密度和准确度。
批内/批间准确度接受标准：低、中、高3个浓度水平质控样品测定值的均值应在其标示值的85％-115％范围内，且每个浓度水平的6个质控样品，应满足至少67％的样品测定值在其标示值的85％-115％的范围内。对于LLOQ样品，测定值的均值应在其标示值的80％-120％范围内，且应满足至少67％的样品测定值在其标示值的80％-120％范围内。
批内/批间精密度接受标准：批内及批间的变异系数(CV)一般不得超过15％，定量下限的变异系数不得超过20％。
2.结果
表10总结了批内和批间的精密度和准确度。质控样品的变异系数小于等于8.6％，各浓度水平的批间/批内的定量下限的变异系数小于等于17.7％。结果表明，准确度和精密度值符合规定的验收标准，这表明该方法对于化合物SYHA1807的测定可靠且可重现。
表10：SYHA1807血浆QC样品的批内、批间准确度和精密度
实施例四：萃取回收率
1.方法
于一定量空白血浆基质中加入不同量的标准品配成低、中、高三种浓度(分别为0.0200ng/mL，0.800ng/mL，8.00ng/mL)的验证样品，并进行萃取；萃取空白血浆基质，以溶液作为溶剂配制相同浓度对照品溶液，将两者测定响应值进行比较，计算方法的萃取回收率。
内标萃取回收率：于空白血浆基质中加入一定量内标对照品(加入量等同于样品制备过程中的用量)配成验证样品，并进行萃取。与以空白血浆基质萃取后溶液做为溶剂配制相同浓度的内标对照品溶液的响应值进行比较，计算内标的萃取回收率。
接受标准：低、中、高浓度质控样品的萃取回收率绝对值不大于115％，各浓度水平峰面积的％CV应分别小于15％，三个浓度水平萃取回收率的％CV应不大于20％。
2.结果
符合接受标准，结果详见表11和表12。血浆中待测物从低至高三个浓度质控样品的平均萃取回收率分别为92.5％，92.3％，90.3％，各浓度水平峰面积的％CV均不大于4.5％，三个浓度水平萃取回收率的％CV不大于1.3％，结果详见表11。内标的平均萃取回收率为103.3％，峰面积的％CV不大于3.3％，结果详见表12。
表11：待测物萃取回收率
表12：内标回收率
实施例五：基质效应：
1.方法
使用六种不同来源的空白血浆在LQC、MQC和HQC浓度水平上评估不同基质来源对测定的影响。通过计算基质存在下的峰面积(由空白基质提取后加入分析物和内标测得)，与不含基质的相应峰面积(分析物和内标的纯溶液)比值，计算每一分析物和内标的基质因子；进一步通过待测物的基质因子(Analyte MF％)除以内标的基质因子(IS MF％)，计算经内标归一化的基质因子(Absolute MF％)。化合物与内标的基质效应在个体间的变异小于15％，符合要求。
考虑到溶血和高脂血症样本在临床上也会发生，进一步评估溶血血浆(加入2％完全破裂血细胞的正常血浆)和高脂血症血浆(300mg/dL)的基质效应。％CV和％Bias应保持在≤15％。
2.结果
化合物SYHA1 807的内标归一化基质效应范围为105.5％至105.8％，％CV小于1.8％。这些结果(见表13)表明，基质效应符合要求。
表13：化合物SYHA1807在空白血浆中的基质效应
高脂血及溶血基质精密度和准确度验证结果：符合接受标准。结果详见表14。
表14：化合物SYHA1807在或高脂血症血浆或溶血性血浆中的基质效应
300mg/dL(3.40mM)高脂质控样本的％CV为1.4％至4.9％，％Bias范围为2.2％至4.6％；使用2％溶血基质配制的三个浓度水平质控样本的％CV为2.1％至6.8％，Bias％范围为-2.8％至-9.8％。
实施例六：稳定性
1.方法
通过在各种储存、加工和分析条件下对LQC样品(n＝6)和HQC样品(n＝6)进行分析，评估分析物的稳定性。通过比较新制备溶液和储存溶液(室温24小时和在-80℃下230天)的峰面积，评估储备溶液的稳定性。通过比较新制备溶液和工作溶液(室温24小时和在-80℃下108天)的峰面积，评估工作液的稳定性。在不同条件下测试了分析物在血浆中的稳定性。为了评估短期稳定性和长期稳定性，样品分别在室温下放置24小时、-30℃保存112天、在-80℃下放置217天。将提取的样品置于自动取样器(10℃)中96小时，随后使用新制备的标准曲线进行分析，以评估自动取样器的稳定性。此外，已制备的样品在冰箱(10℃)中储存46小时，然后重新进样，以评估重复进样的稳定性。对于冻融稳定性，将试样在-80℃下冷冻超过12小时，然后在室温下解冻至少2小时，共5个循环。
对于全血稳定性评估，使用新鲜采集的全血制备LQC和1/4HQC浓度的样本，然后分为两组(A组和B组)。A组通过立即离心QC样品获得血浆样品，B组在室温下放置2h后离心。A组中各浓度的样品分析物峰面积与IS峰面积之比的平均值被视为标示值。B组的平均值必须在A组平均值的±15％范围内，RSD％不得超过15％。
2.结果
本实验考察了在常规分析期间不同的储存和操作条件下，待测物SYHA1807在溶液和血浆中的稳定性。
1)母液稳定性：-80℃条件下储存230天的待测物和内标母液稳定性良好；室温条件下放置24h的待测物和内标母液稳定性良好。
2)工作液稳定性：-80℃冻存108天的待测物和内标工作液稳定性良好；室温条件下储存24h的待测物和内标工作液稳定性良好。
3)生物样品前处理过程中的稳定性(短期稳定性)：血浆中的待测物在室温下放置24小时后，仍然保持稳定。
4)冻融稳定性：血浆中的待测物至少可以耐受5次反复冻融(-80℃至室温)。
5)制备后样品稳定性：经过样本预处理的血浆中的待测物在自动进样器(10℃)中储存96小时后用新鲜制备的标准曲线定量，准确度和精密度符合要求。
6)重复进样重现性：经过样本预处理的血浆中的待测物在10℃下储存46小时后重复进样，准确度和精密度符合要求。
7)长期冻存稳定性：血浆中的待测物在-80℃下放置416天、以及在-30℃下放置112天后均保持稳定。
8)样品离心分离前基质中待测物稳定性：全血中的待测物在室温条件下放置1小时后仍然保持稳定。
实施例七：稀释可靠性
1.方法
对稀释可靠性进行评估，以确定可以对浓度高于标准曲线范围的样品进行稀释并准确测量。配制高浓度稀释质控样品(浓度为400ng/mL)，以相同的空白生物基质稀释将该样品稀释10倍(n＝6)，以随行标准曲线定量测定，稀释倍数即为稀释因子。稀释后样品浓度应在标线浓度范围内，测定浓度，与标示值进行比较。6个稀释质控样品％CV小于15％，测定值乘以稀释因子后得到的浓度结果，应在稀释质控标示值的85％-115％以内。
2.结果
符合接受标准，将血浆样品稀释10倍至40ng/mL后，六个稀释质控样品的％CV和％Bias分别为0.8％和10.4％。这些结果表明，浓度高于定量上限(ULOQ)的样品可以可靠地稀释10倍。结果详见表15。
表15：稀释可靠性
实施例八：残留效应
1.方法
至少在每个分析批第一条标准曲线ULOQ后，随之进样测定至少1个DB，评价空白血浆样品中是否存在高浓度样品的残留。
接受标准：ULOQ之后在DB中的待测物峰面积应不超过LLOQ待测物峰面积均值的20％，DB中的内标峰面积应不超过LLOQ内标峰面积均值的5％。
2.结果
符合接受标准。高浓度样本(S8)后的空白样品中，待测物保留时间存在的残留小于所在批次S1峰面积均值的20.0％，结果详见表16。
表16：批量样本检测过程的残留
实施例九：药代动力学应用
本发明方法在一项临床I期研究中用于检测化合物SYHA1807在中国广泛期小细胞肺癌患者中的血浆药代动力学。共计12位受试者入选本研究。在单次给药剂量递增研究中，对于0.5mg、1.5mg、3mg和6mg组(01006受试者除外)，在给药前以及给药后第1天的1h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、72h、96h、120h、144h，第8天的0h，第15天的0h，第22天的0h、1h、4h、8h、12h、24h、30h、36h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，收集受试者的血浆。对于01006受试者的6mg组，在给药前以及给药后第1天的1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h，第8天的0h，第15天的0h，第22天的0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，收集受试者的血浆。采用本发明所提供的血浆预处理方法和高效液相色谱-串联质谱定量方法分析人血浆中SYHA1807的药物代谢动力学特征(N＝299)，以研究该创新药物的临床药理学。1例小细胞肺癌患者口服6mg SYHA1807后的代表性血药浓度-时间曲线见图3。
筛选例1：质谱条件优化
使用Xevo TQS三重串联四极杆质谱(Waters，MA，USA)调谐优化参数，选择电喷雾电离(ESI)源的正离子模式。调节脱溶气体流量、离子源温度、毛细管电压、碰撞气体流量、锥形电压，碰撞电压后经多反应监测(MRM)扫描检测，最终确定以下条件，SYHA1807的定量离子对：m/z 353.2→228.2；D5-SYHA1807(内标)的定量离子为：m/z 358.2→233.2。其他优化参数如下：脱溶气体流速1000L/h，离子源温度500℃；毛细管电压3.50kV，碰撞气体流量0.25mL/min；SYHA1807和内标锥孔电压分别为30V和35V；SYHA1807和内标的碰撞电压为25V。
筛选例2：色谱柱筛选试验
参照以上“2.色谱和质谱条件”部分，选择不同类型的色谱柱，并根据检测效果综合调整流动相种类、梯度条件、流速等方法参数，考察了待测物溶液在不同类型的色谱柱中的检测情况。色谱柱的具体信息如下：
表17：色谱柱信息
型号 规格
XBridgepheyl C18色谱柱 2.0×50mm，3.5μm
Phenomenex Gemini 5u C18 110A色谱柱 2.0×50mm，5μm
ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 2.1×50mm，1.7μm
结果表明，ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)色谱柱，峰形较好，保留时间合适，检测效果良好。
筛选例3：不同流动相组分的筛选试验
1.流动相A(有机相)的筛选
参照“2.色谱和质谱条件”，当选用含有0.1％甲酸的水溶液作为流动相B(水相)时，分别选择乙腈和甲醇作为流动相A(有机相)进行检测，记录色谱图。
结果，以乙腈作为流动相A(有机相)具有较好的洗脱效果和非常低的背景噪声，而以甲醇作为流动相A(有机相)保留效果较差，因此选择乙腈体系作为流动相A。在向流动相A中混入流动相B的情况下，发现当混合流动相中的流动相B在7体积％以下时，流动相B中含有的缓冲盐不会析出；而当流动相B的量超出7体积％时，流动相B中含有的缓冲盐将会析出。
2.流动相B(水相)的筛选
参照“2.色谱和质谱条件”，当选择乙腈作为流动相A(有机相)时，分别选择2mM乙酸铵溶液、5mM乙酸铵溶液、0.1质量％甲酸水溶液、0.2质量％甲酸水溶液、0.5质量％甲酸水溶液和含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的水溶液作为流动相B(水相)进行检测，记录色谱图。
结果可见，当选择甲酸水溶液体系作为流动相B时，有明显的拖尾现象，选择同时含有乙酸铵和甲酸的水溶液体系时色谱峰较好；以甲酸和乙酸铵浓度对响应的影响差别不大。因此选择0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的体系作为流动相B。在向流动相B中混入流动相A的情况下，发现当混合流动相中的流动相A在12体积％以下时，流动相B中含有的缓冲盐不会析出；而当流动相A的量超出12体积％时，流动相B中含有的缓冲盐将会析出。
筛选例4：血浆样品处理方式筛选
参照“4.血浆样本预处理方法”，分别使用甲醇和乙腈作为蛋白沉淀试剂，制备血浆样品，使用“2.色谱和质谱条件”进行检测。
结果使用乙腈为沉淀剂时色谱峰良好，故选择乙腈作为沉淀剂。
筛选例5：流速筛选试验
参照“2.色谱与质谱条件”，考察流速对检测效果的影响。分别选择流速为0.3mL/min和0.4mL/min进行检测，其他试验条件均相同。
结果显示流速0.3mL/min出峰时间较晚，色谱柱保留效果较强；流速0.4mL/min出峰时间为1分钟，保留效果较好，因此，优选流速0.4mL/min。
筛选例6：柱温筛选试验
参照“2.色谱与质谱条件”，考察柱温对检测效果的影响。分别选择柱温35℃、40℃和45℃进行检测，其他试验条件均相同。
结果显示试验的三个柱温水平对色谱峰峰型和响应影响不大，仅保留时间略有差异。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本公开揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种利用高效液相色谱-串联质谱联用装置定量分析SYHA1807的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)制备含有SYHA1807的样品溶液；
2)将所述样品溶液注入到高效液相色谱-串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；
3)根据所述质量色谱图使用内标法对SYHA1807进行定量分析，
其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，
其中所述流动相A选自：乙腈，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的乙腈溶液，以及含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水-乙腈混合液，其中所述水-乙腈混合液中的水与乙腈的体积比在1：99至10：90的范围内，并且
所述流动相B选自：含有0.05质量％至0.5质量％甲酸的水溶液，含有1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的水溶液，含有0.05质量％至0.5质量％甲酸和1mmol/L至5mmol/L乙酸铵的乙腈-水混合液，其中所述乙腈-水混合液中的乙腈与水的体积比在1∶99至10∶90的范围内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相A为含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的体积比为5∶95的水-乙腈混合液；和/或所述流动相B为含有0.1质量％甲酸和2mmol/L乙酸铵的体积比为5∶95的乙腈-水混合液。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度洗脱程序如下：
0.00分钟至1.00分钟，8体积％至12体积％的流动相A；
1.01分钟至1.99分钟，93体积％至97体积％的流动相A；
2.00分钟至3.00分钟，8体积％至12体积％的流动相A，
其中在所述混合流动相中，流动相A和流动相B的总量为100体积％。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述梯度洗脱程序如下：
0.00分钟至1.00分钟，10体积％的流动相A；
1.01分钟至1.99分钟，95体积％的流动相A；
2.00分钟至3.00分钟，10体积％的流动相A，
其中在所述混合流动相中，流动相A和流动相B的总量为100体积％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述高效液相色谱中的色谱柱为反相色谱柱，优选以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述制备含有SYHA1807的样品溶液包括：用二甲基亚砜溶解SYHA1807得到SYHA1807储备溶液，然后用由水和乙腈组成的稀释液稀释所述SYHA1807储备溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中SYHA1807来自受试者的血浆。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述制备含有SYHA1807的样品溶液包括：向受试者的血浆样品中加入内标工作溶液，将所得混合物振荡，然后离心，取上清液进行干燥得到固体样品，然后用由水和乙腈组成的复溶液将所述固体样品溶解并且混匀。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述内标工作溶液通过以下方式制备：用二甲基亚砜溶解内标标准品D5-SYHA1807得到内标储备溶液，然后用乙腈稀释所述内标储备溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述上清液与所述复溶液的体积比在2∶1至5∶1的范围内。
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