CN114720572A - 一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法 - Google Patents

一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，包括：在鱼肉样品中依次加入内标物、提取溶液后超声萃取，获得的萃取液加入净化物进行净化后去脂，获得的样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中15种抗生素，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的含量。本发明提供的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测出鱼肉中7类15种抗生素，大大提高了检测效率，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。

Description

一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法
技术领域
本发明属于有机污染物质残留检测的技术领域，，涉及一种检测鱼肉中15种抗生素含量 的方法，具体涉及一种QuEChERS-UPLC-MS/MS同时检测鱼肉中15种抗生素含量的方法。
背景技术
近年来，我国的水产养殖业发展迅速，规模化与集约化成为养殖的趋势，而水生动物疾 病发生的频率也在提高。为了防治水产品疾病和加快水产品生长、繁殖，水产养殖业广泛而 大量地使用抗生素。而养殖技术和病害预防技术没有得到及时的推广和普及，因此出现了兽 药管理不规范、养殖场(户)不按规定用药、水产品质量高低不一等问题。
投入的抗生素可通过生物蓄积作用在水产品中积累，虽然抗生素的半衰期不长，但持续 过量的抗生素在动物体内大多不被畜禽充分吸收，不完全代谢降解的残留物对自然生态的破 坏和人体机能的紊乱都有着潜移默化的作用和影响。复旦大学重点实验室,在国际权威杂志 《Environment International》上阐述了儿童尿液中抗生素的严重性,并认为抗生素的暴露模式 可能是促进脂肪生成并导致儿童肥胖的危险因素之一。
水产品中蛋白质和脂肪等杂质较复杂，容易引起基质效应。研究表明，样品提取方法、 净化方法、同位素标记等对基质效应均有一定影响。目前食品中抗生素检测常用的前处理方 法有固相萃取法、基质分散固相萃取、液液萃取等方法，这些方法操作繁琐，且对于基质复 杂的样品存在净化效果差、样品回收率低等缺点。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective, Rugged and Safe)是由Anastassiades等人于2003年建立的样品前处理技术。此方法结合了液 液萃取法和分散固相萃取法对样品进行提取净化。目前己广泛应用于食品中农药残留的检测， 近年来也逐渐被用于动物性食品中兽药残留的检测。QuEChERS样品前处理方法主要具有以 下优点：可以对含水量较高的样品进行多残留分析，减少样品基质中脂肪酸、蛋白质、水分 等的干扰；方法回收率、精密度和准确度较高，检测结果稳定性好，可对大量挥发性和极性 物质进行检测；分析检测速度快、效率高，分析时间短；该方法有机溶剂使用量少，环境污 染小；方法操作简便，易推广。目前常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)和高效 液相色谱串联质谱法(HPLC–MS/MS)。HPLC–MS/MS兼具HPLC强的分离能力，同时又 具有MS高灵敏度和极强的定性鉴定能力，是目前检测环境复杂基质痕量抗生素残留最有效 的手段之一，具有分析范围广、分离能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快和 自动化程度高等优点。可准确地定性、定量测定复杂混合物的组分。
由于不同种类抗生素理化性质的差异，以及提取和净化过程的特异性，基质复杂性，以 往的研究报道多数是关于单一类别抗生素或少数几个抗生素的检测方法，不能适用于样品快 速筛查分析，有一定的局限性。因此，需要寻求一种快速、高效、灵敏、准确地检测出水产 品中尽可能多的抗生素残留的包括分离富集和共检测的完整可靠的分析方法，以满足日趋严 格的残留限量要求。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种检测鱼肉中15种抗生素含量 的方法，其能够一次性同时检测出鱼肉中15种抗生素的残留情况，检测结果稳定、干扰小、 快速、高效，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检测结果更真实可靠等优点。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法， 包括：在鱼肉样品中依次加入内标物、提取溶液后超声萃取，获得的萃取液加入净化物进行 净化后去脂，获得的样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行测定， 根据保留时间确定样品溶液中15种抗生素，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中 15种抗生素的含量。
优选地，所述15种抗生素包括磺胺类的磺胺嘧啶SD(CAS号为68-35-9)、磺胺甲基嘧 啶SM1(CAS号为127-79-7)、磺胺二甲基嘧啶SM2(CAS号为57-68-1)、磺胺间二甲氧 基嘧啶SDM(CAS号为122-11-2)、磺胺甲噁唑SMX(CAS号为723-46-6)，磺胺类增效 剂的甲氧苄啶TMP(CAS号为738-70-5)，氟喹诺酮类的恩诺沙星ENR(CAS号为93106-60-6)、 环丙沙星盐酸盐CIP(CAS号为93107-08-5)、诺氟沙星NOR(CAS号为70458-96-7)，硝 基呋喃类的呋喃唑酮AOZ(CAS号为67-45-8)，四环素类的盐酸金霉素CTC(CAS号为 64-72-2)、盐酸土霉素OTC(CAS号为2058-46-0)、盐酸多西环素DOX(CAS号为24390-14-5)， 喹恶啉类的喹乙醇OLA(CAS号为23696-28-8)，氯霉素类的氟苯尼考FF(CAS号为 73231-34-2)。
优选地，所述鱼肉样品要进行匀浆。所述匀浆是将采集的鱼体样品洗净，用纱布吸干表 面水分，剖取鱼体背部肌肉，将鱼皮分离，鱼肉样品中添加相同质量的水后匀浆。鱼肉样品 要充分匀浆，防止添加乙腈溶剂后样品紧缩成一团，包裹住目标化合物。匀浆后的鱼肉样品 置于-20℃冷冻。
优选地，所述内标物包括磺胺甲恶唑-D4 SMX-D4(CAS号为1020719-86-1)、甲氧苄啶 -D3 TMP-D3(CAS号为1189923-38-3)、诺氟沙星-D5 NOR-D5(CAS号为1015856-57-1)、 呋喃唑酮-D4 AOZ-D4(CAS号为1217222-76-8)、四环素-D6 TC-D6(CAS号为60-54-8)、 喹乙醇-D4 OLA-D4(CAS号为1189487-82-8)和氟苯尼考-D3 FF-D3(CAS号为73231-34-2)。
更优选地，所述内标物中，磺胺甲恶唑-D4 SMX-D4作为磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、 磺胺二甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX的内标物，甲氧苄啶-D3 TMP-D3作为甲氧苄啶TMP的内标物，诺氟沙星-D5 NOR-D5作为恩诺沙星ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR的内标物，呋喃唑酮-D4 AOZ-D4作为呋喃唑酮AOZ的内标物，四环素 -D6TC-D6作为金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多西环素DOX的内标物，喹乙醇-D4 OLA-D4作为喹乙醇OLA的内标物，氟苯尼考-D3 FF-D3作为氟苯尼考FF的内标物。
考虑到不同种类的抗生素结构和性质存在很大的差别，添加内标物避免前处理过程中可 能会有的损失。
优选地，所述鱼肉样品与7种内标物加入地质量之比为5.00±0.02：1×10-7：1×10-7：1×10-7： 1×10-7：1×10-7：1×10-7：1×10-7。
优选地，所述鱼肉样品加入内标物混匀后要避光静置5-15min，优选为10min。
优选地，所述提取溶液包括酸化乙腈和醋酸钠。
乙腈极性范围宽，分子小，组织穿透能力强，对糖、脂肪、蛋白质类化合物的有较好的 沉淀效果，同时对多数目标化合物均有较好的溶解性和较高的提取率，并且通过盐析乙腈可 以与水相轻松分离。酸能破坏基质的细胞组织结构，使目标化合物更充分地被分离出来，微 量的有机弱酸还能调节体系的pH值，抑制化合物酸性基团的解离，从而改变目标物在水相- 有机相之间的分配比，加强其转移到乙腈层中的效率。醋酸钠用于调节pH，与醋酸形成缓冲 体系，使萃取环境的pH相对稳定。
更优选地，所述酸化乙腈为含有体积百分比浓度为0.5-1.5％的乙酸的乙腈。进一步优选 地，所述酸化乙腈为含有体积百分比浓度为1.0％的乙酸的乙腈。
更优选地，所述鱼肉样品加入质量g、酸化乙腈加入体积mL、醋酸钠加入质量g之比为 5.00±0.02：19-21：0.5-0.7。进一步优选地，所述鱼肉样品加入质量g、酸化乙腈加入体积20mL、 醋酸钠加入质量g之比为5.00±0.02：20：0.6。
优选地，所述提取溶液加入鱼肉样品后涡旋混合0.5-1.5min，优选为1min。
优选地，所述超声萃取的时间为15-25min，优选为20min。
优选地，所述净化物包括Na2SO4、NaCl和C18。
Na2SO4和NaCl用于除去萃取环境中的水分盐析分层，促使目标物从水相转移到有机相； C18含有十八烷基官能团，属于非极性吸附剂，可以吸附吸附脂肪和一些非极性干扰物。
更优选地，所述鱼肉样品与Na2SO4、NaCl、C18加入质量之比为5.00±0.02：4-6：1-3： 0.2-0.4。进一步优选地，所述鱼肉样品与Na2SO4、NaCl、C18加入质量之比为5.00±0.02：5： 2：0.3。
优选地，所述净化物加入萃取液后涡旋混合1.5-2.5min，优选为2min。
优选地，所述净化将要第一次离心后取上清液在水浴中用氮气吹干，加入溶解液溶解残 留物，再加入正己烷涡旋混合后第二次离心，取下层清液过滤，获得样品溶液待测。由于乙 腈是非极性溶剂，能够提取大量脂肪类杂质，因此需要正己烷进一步除脂。
更优选地，所述第一次离心时间为4-6min，所述第一次离心转速为9000-11000r·min-1。 进一步优选地，所述第一次离心时间为5min，所述第一次离心转速为10000r·min-1。
更优选地，所述水浴的温度为35-45℃，优选为40℃。
更优选地，所述溶解液选自甲醇或体积百分比浓度为70-80％的甲醇水溶液中的一种。由 于正己烷与乙腈存在一定程度的互溶，定容溶剂不建议使用乙腈。
更优选地，所述溶解液的用量为0.5-1.5mL，优选为1.0mL。
更优选地，所述正己烷的用量为1.5-2.5mL，优选为2.0mL。
更优选地，所述涡旋混合的时间为20-40s，优选为30s。
更优选地，所述第二次离心时间为4-6min，所述第二次离心转速为9000-11000r·min-1。 进一步优选地，所述第二次离心时间为5min，所述第二次离心转速为10000r·min-1。
更优选地，所述过滤采用针式过滤器进行过滤，所述针式过滤器的滤膜为孔径为0.22μm 的有机相(尼龙)滤膜。
优选地，所述样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行测定，包 括以下步骤：
1)配制标准溶液：取15种抗生素标准品，加入内标物和甲醇溶液，配成标准溶液；
2)样品检测：采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法的正离子模式和负离子 模式分别检测样品溶液和步骤1)中的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图， 与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根 据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗 生素的浓度。
更优选地，步骤1)中，所述标准溶液由15种抗生素的储备液加入甲醇逐级稀释获得。
进一步优选地，所述15种抗生素的储备液中15种抗生素的浓度均为1000mg·L-1。
进一步优选地，所述15种抗生素的储备液在-20℃避光冷藏保存。
进一步优选地，所述15种抗生素的储备液中诺氟沙星用1mL 0.5mol·L-1盐酸溶解后用甲 醇定容。
更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中7种内标物的浓度为100.0μg·L-1。
更优选地，步骤1)中，所述甲醇溶液为体积百分比浓度为65-75％的甲醇水溶液，体积 百分比浓度为优选为70％。
更优选地，步骤1)中，所述标准溶液中15种抗生素的浓度范围均为1.37-500μg·L-1。
更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法中，采用负离子模式检测氟苯尼考，采用正离子模式检测除氟苯尼考外其它14种抗生素。
更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法中，正离子模式采用Waters AcquityUPLCIclass超高效液相色谱串联Waters TQ-XS质谱仪进行检测。
进一步优选地，所述正离子模式进行检测时，所述超高效液相色谱(UPLC)的测定条件 为：
色谱柱：C18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μL；流速：0.3-0.4mL·min-1；流动相A相为体积百分比浓度为0.4-0.6％的甲酸水溶液；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
最优选地，所述超高效液相色谱(UPLC)的测定条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(内径2.1×柱长50mm，粒径0.7μm)；柱温： 40℃；进样量：1.5μL；流速：0.35mL·min-1；流动相A相为体积百分比浓度为0.5％的甲酸水 溶液；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-1min，A相：B相体积比为92：8-92：8；
1-1.2min，A相：B相体积比为92：8-80：20；
1.2-2.5min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
2.5-2.7min，A相：B相体积比为80：20-5：95；
2.7-4.5min，A相：B相体积比为5：95-5：95；
4.5-4.7min，A相：B相体积比为5：95-92：8；
4.7-7.5min，A相：B相体积比为92：8-92：8。
进一步优选地，所述正离子模式进行检测时，所述质谱(MS/MS)的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式： 多反应监测模式MRM；扫描时间为0.1s；碰撞气为氩气；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气 流流量为1000L·Hr-1；锥孔电压为3500v。
最优选地，所述除氟苯尼考外其它14种抗生素和对应内标物的母离子质荷比、子离子质 荷比、锥孔电压、碰撞能量见表1。
表1 14种抗生素和内标的质谱检测条件
Figure BDA0002851512050000061
注：*表示定量离子；**表示定量离子对应的碰撞能量。
更优选地，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法中，负离子模式采用岛津30A超高效液相色谱串联AB 5500Q-trap质谱仪(美国AB公司)进行检测。
进一步优选地，所述负离子模式进行检测时，所述超高效液相色谱(UPLC)的测定条件 为：
色谱柱：C18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μL；流速：0.3-0.4mL/min；流动相A相为水；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
最优选地，所述超高效液相色谱(UPLC)的测定条件为：
色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(内径2.1×柱长100mm，粒径0.7μm)；柱温： 40℃；进样量：1.5μL；流速：0.35mL/min；流动相A相为水；流动相B相为乙腈；分析时 间为7.5min；梯度洗脱。
最优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-1min，A相：B相体积比为90：10-90：10；
1-1.2min，A相：B相体积比为90：10-60：40；
1.2-3min，A相：B相体积比为60：40-60：40；
3-3.5min，A相：B相体积比为60：40-10：90；
3.5-5min，A相：B相体积比为10：90-10：90；
5-5.2min，A相：B相体积比为10：90-90：10；
5.2-7.5min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
进一步优选地，所述负离子模式进行检测时，所述质谱(MS/MS)的测定条件为：
电离方式：电喷雾离子源(ESI)，负离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式： 多反应监测模式MRM；碰撞气为氮气；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气 CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi。
最优选地，所述氟苯尼考和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰 撞能量见表2。
表2氟苯尼考和内标的质谱检测条件
Figure BDA0002851512050000071
注：*表示定量离子；**表示定量离子对应的碰撞能量。
优选地，步骤2)中，所述内标标准曲线法包括以下步骤：
A1)将含有一系列不同浓度的15种抗生素的标准溶液，分别进行高效液相色谱质谱联 用法的正离子模式和负离子模式分析，获得15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内 标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的标 准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到15种抗生素成分的标准曲线的回归方程；
A2)将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的15种抗生素成分在不同 浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值，代入步骤A1)中相应成分的标准工作曲线 的回归方程，并根据内标的已知浓度，计算得到样品溶液中15种抗生素成分的浓度。
更优选地，步骤A1)或A2)中，所述标准工作曲线中，以15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值为纵坐标(Y轴)，其相应成分的不同浓度/内标的 浓度的比值为横坐标(X轴)。
本发明中使用的水均为超纯水。
如上所述，本发明提供的一种检测鱼体中15种抗生素的方法，采用 QuEChERS-UPLC-MS/MS法，通过对提取溶剂、净化材料、液质检测条件进行优化，同时通 过选用合适的内标物，经酸化乙腈缓冲体系提取，改进的QuEChERS净化，经超高效液相色 谱串联三重四级杆质谱仪检测，可一次性同时检测出鱼肉中15种抗生素的残留情况。该种方 法采用QuEChERS净化，操作便捷，吸附剂可根据目标化合物进行调整，应用范围广。该种 方法能够实现快速、高效、灵敏、准确地同时检测出鱼肉中7类15种抗生素，大大提高了检 测效率，并且检测结果稳定、干扰小，具有高回收率、高灵敏度、高稳定性、低检测限、检 测结果更真实可靠等优点。对于水产品中多类别、多组分的兽药抗生素的检测具有较高的参 考价值。
附图说明
图1为本发明中使用不同提取溶剂对15种抗生素的加标回收率图。
图2为本发明中使用不同提取溶剂对15种抗生素的绝对回收率图。
图3为本发明中使用不同吸附剂及用量对15种抗生素的加标回收率图。
图4为本发明中使用不同吸附剂及用量对15种抗生素的绝对回收率图。
图5为本发明中使用不同脱水剂对15种抗生素的加标回收率图。
图6为本发明中使用不同脱水剂对15种抗生素的绝对回收率图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露 的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加 以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精 神下进行各种修饰或改变。
以下实施例中所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。
实施例1
1、样品前处理
将采集的鱼体样品洗净，用纱布吸干表面水分，剖取鱼体背部肌肉，将鱼皮分离，鱼肉 样品中添加相同质量的水后匀浆，尽量充分匀浆，防止添加乙腈溶剂后样品紧缩成一团，包 裹住目标化合物。处理后的样品迅速置于-20℃冷冻，待进一步提取。
称取5.00g匀浆的鱼肉样品于30mL玻璃离心管中，分别加入100ng的磺胺甲恶唑-D4、 甲氧苄啶-D3、诺氟沙星-D5、呋喃唑酮-D4、四环素-D6、喹乙醇-D4和氟苯尼考-D3这7种内标物，充分混匀后，避光静置10min。再向离心管中加入20mL酸化乙腈(1％乙酸)和0.6g 醋酸钠，漩涡混合1min，超声萃取20min。然后，加入5gNa2SO4、2gNaCl和0.3g C18涡旋 混匀2min，10000r·min-1离心5min。取上清液于40℃的水浴中氮气吹干，加1.0mL体积百分 比浓度为70％的甲醇水溶液溶解残留物，转入4mL离心管中，再加入2.0mL正己烷涡旋混合 30s，以10000r·min-1离心5min，弃上层正己烷层，取下层清液，经孔径为0.22μm的有机相 (尼龙)针式过滤器进行过滤至棕色进样瓶中，获得样品溶液待测。
2、标准溶液
取15种抗生素标准品，加入7种内标物和体积百分比浓度为70％的甲醇水溶液，配成一 系列不同浓度标准溶液。其中，15种抗生素包括磺胺嘧啶SD、磺胺甲基嘧啶SM1、磺胺二 甲基嘧啶SM2、磺胺间二甲氧基嘧啶SDM、磺胺甲噁唑SMX、甲氧苄啶TMP、恩诺沙星 ENR、环丙沙星CIP、诺氟沙星NOR、呋喃唑酮AOZ、金霉素CTC、土霉素OTC、盐酸多 西环素DOX、喹乙醇OLA、氟苯尼考FF。标准溶液中7种内标物的浓度为100.0μg·L-1。一 系列不同浓度标准溶液中15种抗生素的浓度分别为1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、 500μg·L-1。
3、检测
采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法的正离子模式和负离子模式分别检测 样品溶液和标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较， 根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲 线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的浓度。
具体来说，将含有一系列不同浓度的15种抗生素的标准溶液，分别进行高效液相色谱质 谱联用法的正离子模式和负离子模式分析，获得15种抗生素成分在不同浓度下的色谱峰面积 /内标的色谱峰面积的比值与相应成分的不同浓度/内标的浓度的比值的线性关系，绘制相应的 标准曲线，用加权最小二乘法进行回归运算，得到15种抗生素成分的标准曲线的回归方程。 再将样品溶液进行高效液相色谱质谱联用法分析，将获得的15种抗生素成分在不同浓度下的 色谱峰面积/内标的色谱峰面积的比值，代入相应成分的标准工作曲线的回归方程，并根据内 标的已知浓度，计算得到样品溶液中15种抗生素成分的浓度。
其中，超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法中，采用负离子模式检测氟苯尼考， 采用正离子模式检测除氟苯尼考外其它14种抗生素。
正离子模式采用Waters AcquityUPLCIclass超高效液相色谱串联Waters TQ-XS质谱仪进 行检测。
超高效液相色谱(UPLC)的测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(内 径2.1×柱长50mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μL；流速：0.35mL·min-1；流动相A相为体积百分比浓度为0.5％的甲酸水溶液；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min； 梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-1min，A相：B相体积比为92：8-92：8；
1-1.2min，A相：B相体积比为92：8-80：20；
1.2-2.5min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
2.5-2.7min，A相：B相体积比为80：20-5：95；
2.7-4.5min，A相：B相体积比为5：95-5：95；
4.5-4.7min，A相：B相体积比为5：95-92：8；
4.7-7.5min，A相：B相体积比为92：8-92：8。
质谱(MS/MS)的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源(ESI)，正离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式MRM；扫描时间为0.1s；碰撞气为氩气； 脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流流量为1000L·Hr-1；锥孔电压为3500v。除氟苯尼考外其它14种抗生素和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表1。
负离子模式采用岛津30A超高效液相色谱串联AB 5500Q-trap质谱仪(美国AB公司) 进行检测。
超高效液相色谱(UPLC)的测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱(内 径2.1×柱长100mm，粒径0.7μm)；柱温：40℃；进样量：1.5μL；流速：0.35mL·min-1；流动相A相为水；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-1min，A相：B相体积比为90：10-90：10；
1-1.2min，A相：B相体积比为90：10-60：40；
1.2-3min，A相：B相体积比为60：40-60：40；
3-3.5min，A相：B相体积比为60：40-10：90；
3.5-5min，A相：B相体积比为10：90-10：90；
5-5.2min，A相：B相体积比为10：90-90：10；
5.2-7.5min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
质谱(MS/MS)的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源(ESI)，负离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式MRM；碰撞气为氮气；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi。氟苯尼考和对应内标物的母离子质荷比、子离子质荷比、锥孔电压、碰撞能量见表2。
实施例2
鱼肉样品的基质复杂，含有蛋白质、脂肪、糖类、无机盐、水分等化合物。这些样品基 质会影响待测物的提取效率，使检测结果产生误差，同时也会污染仪器，直接影响检测效率 和准确率。因此，在兽药残留分析中，样品的前处理技术非常关键，主要目的是将目标化合 物与样品基质分离，去除干扰杂质。同时，目标抗生素的种类多，物化性质差异大，为了实 现鱼肉中多种抗生素提取效率的最大化，本发明采用单因素实验分别优化了QuEChERS方法 的提取溶剂和吸附剂。
1、提取溶剂
分别考察了乙腈、1％甲酸乙腈、1％乙酸乙腈、1％乙酸乙腈-醋酸钠几种提取体系，加标 回收率结果如图1所示，除乙腈外，其余提取溶剂均有较好的回收率。1％甲酸乙腈和1％乙 酸乙腈作为提取溶剂时，各抗生素的加标回收率差异大，范围分别为54.70-124.70％和 52.73-115.32％，内标物的校正能力受到影响，重复性差。溶剂中添加缓冲试剂醋酸钠后回收 率趋于稳定，部分抗生素的回收率有所提高。本发明考虑到不同种类抗生素在前处理过程中 有不同程度的损失，对同类抗生素选用同种内标物指示回收率，因此有较好的回收率结果。
为了更真实的反应前处理过程对抗生素的损失，评价优化方法，本方法同时考察了各抗 生素的绝对回收率，如图2所示。乙腈无法有效提取多种抗生素，如氟喹诺酮类和四环素类， 添加酸后回收率得到明显改善，本方法同时测试了甲酸和乙酸两种有机酸，甲酸更利于四环 素类的提取，乙酸则更利于磺胺类、甲氧苄啶和呋喃唑酮的提取，其余抗生素的回收率相差 不大。由于甲酸酸性强于乙酸，磺胺类属于碱性化合物，随着酸性增加，溶液中的H+更容易 造成磺胺类抗生素芳伯氨基结合成配位键-NH3+，使其失活。四环素类十分容易和蛋白质和金 属离子配合，在酸性较强的环境中可抑制配合作用。综合考虑，选用1％乙酸乙腈-醋酸钠作 为提取溶剂。
2、吸附剂
提取后不经净化直接进样会污染仪器，导致色谱柱堵塞，离子源污染，影响目标物的离 子化，最终影响目标物的准确定性、定量。因此，需要对吸附剂进行选择和优化。
PSA和C18是QuEChERS最常用的吸附剂，其中PSA作为极性吸附剂主要去除有机酸、色素、金属离子和酚类等极性成分，C18具有明显的去脂效果。MgSO4和Na2SO4为主要的脱 水剂，我们对这两种吸附剂和两种脱水剂进行实验，分别以加标回收率和绝对回收率作为评价指标，结果如图3、4所示。添加PSA后，磺胺类和甲氧苄啶的回收率稍有提高，其余抗 生素的回收率下降，说明PSA在吸附杂质的同时对目标物也造成一定损失，从色谱峰来看， 添加PSA后峰型和基线无明显改善，未能减小基质效应。添加C18后，各类抗生素的回收率 均有提高，说明脂肪会带来严重的基质效应，导致回收率降低，C18吸附剂可减少脂肪对目 标物的干扰。将C18的添加量提高至0.6g时，回收率降低，推测原因是高剂量的吸附剂包裹 目标物，导致其有一定的损失，因此过高吸附剂用量存在一定的弊端。如图5、6所示，MgSO4的添加对四环素类抗生素有负面影响，推测可能是四环素与Mg2+形成螯合物。综上，我们选 用0.2-0.4g、优选为0.3gC18作为吸附剂，Na2SO4作为脱水剂，由于Na2SO4的吸水性相对较 弱，需要提高Na2SO4的用量，本方法经多次试验，确定Na2SO4的添加量为4-6g，优选为5g。
实施例3
按实施例1的步骤2，将15种抗生素混合标准溶液用70％的甲醇-水溶液稀释成一系列 浓度梯度(1.37、4.12、12.35、37.04、111.11、333.33、500μg·L-1)，内标以100.0μg·L-1的浓 度添加到标准品中，用内标法以成分与内标的浓度比为横坐标，响应值(响应值＝目标物峰面 积/内标物峰面积)为纵坐标绘制7点标准曲线，得到标准曲线和相关系数(R2)。同时，采 用信噪比法(S/N)确定仪器的检出限和定量限，以3倍信噪比估算检出限(LOD)，10倍信 噪比估算定量限(LOQ)。15种抗生素的标准曲线、相关系数、检出限和定量限如表3所示。
由表3可知，15种抗生素成分具有良好的线性关系，相关系数(R2)均大于0.98。
表3
Figure BDA0002851512050000131
实施例4
按实施例1中步骤1获得匀浆的鱼体样品，设立两组用于对比实验的鱼肉样品，一组为 标准样品组，另一组为空白样品组，每组设3个平行。准确称取5.00g的鱼肉样品于30mL 玻璃离心管中，分别向鱼肉样品中加入50、100、200ng的15种抗生素的混合标准溶液作为 标准样品组，使添加到鱼肉中的15种抗生素的最终浓度分别为20ng·g-1、40ng·g-1、80ng·g-1。 空白样品组不添加任何抗生素。每种样品中分别加入100ngSMX-D4、TMP-D3、NOR-D5、 AOZ-D4、TC-D6、OLA-D4和FF-D3这7种指示回收率的内标物，计算加标回收率(RE)和相对标准偏差(RSD)。按实施例1的步骤3，计算加标回收率(RE)和相对标准偏差(RSD)。
加标回收率(RE％)的计算公式如下：
Figure BDA0002851512050000132
其中，C0为混合标准溶液 的浓度，μg·L-1；C1为未加入混合标准溶液样品的检测浓度，μg·L-1；C2为加入混合标准溶液 样品的检测浓度，μg·L-1；V0为混合标准溶液的体积，L；V1为未加入混合标准溶液样品的上 机前定容体积，L；V2为加入混合标准溶液样品的上机前定容体积，L。
本方法考察了鱼肉中15种抗生素3个浓度的加标回收率，结果如4表所示。各抗生素的 加标回收率在70.89-122.13％，相对标准偏差均低于10％，加标回收率存在差异，说明不同抗 生素存在不同的基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正， 可以降低基质干扰带来的影响。
表4鱼肉样品中不同加标浓度的加标回收率及相对标准偏差
Figure BDA0002851512050000141
实施例5
采集上海某水产养殖区青鱼和蟹，按实施例1的步骤1对样品进行提取和富集净化，按 实施例1的步骤3对样的实际浓度进行检测分析，以考察本方法对不同种类水产品的适用性。 实际检测得到的草鱼和蟹肌肉样品中15种抗生素含量如表5所示。实验结果表明，本方法可 以同时应用于不同种类水产品肌肉中多种抗生素含量的测定，具有良好的适用性。
表5水产品肌肉样品中15种抗生素的含量
Figure BDA0002851512050000142
Figure BDA0002851512050000151
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当 指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干 改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不 脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修 饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实 施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，包括：在鱼肉样品中依次加入内标物、提取溶液后超声萃取，获得的萃取液加入净化物进行净化后去脂，获得的样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法进行测定，根据保留时间确定样品溶液中15种抗生素，采用内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述15种抗生素包括磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑，甲氧苄啶，恩诺沙星、环丙沙星盐酸盐、诺氟沙星，呋喃唑酮，盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸多西环素，喹乙醇，氟苯尼考。
3.根据权利要求1所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述内标物包括磺胺甲恶唑-D4、甲氧苄啶-D3、诺氟沙星-D5、呋喃唑酮-D4、四环素-D6、喹乙醇-D4和氟苯尼考-D3；所述内标物中，磺胺甲恶唑-D4作为磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺间二甲氧基嘧啶、磺胺甲噁唑的内标物，甲氧苄啶-D3作为甲氧苄啶的内标物，诺氟沙星-D5作为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的内标物，呋喃唑酮-D4作为呋喃唑酮的内标物，四环素-D6作为金霉素、土霉素、盐酸多西环素的内标物，喹乙醇-D4作为喹乙醇的内标物，氟苯尼考-D3作为氟苯尼考的内标物。
4.根据权利要求1所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述样品溶液的获得包括以下条件中任一项或多项：
A1)所述鱼肉样品与7种内标物加入地质量之比为4.98-5.02：1×10-7：1×10-7：1×10-7：1×10-7：1×10-7：1×10-7：1×10-7；
A2)所述鱼肉样品加入内标物混匀后要避光静置5-15min；
A3)所述提取溶液包括酸化乙腈和醋酸钠；所述酸化乙腈为含有体积百分比浓度为0.5-1.5％的乙酸的乙腈；所述鱼肉样品加入质量、酸化乙腈加入体积、醋酸钠加入质量之比为4.98-5.02：19-21：0.5-0.7，g/mL/g；
A4)所述超声萃取的时间为15-25min；
A5)所述净化物包括Na2SO4、NaCl和C18；所述鱼肉样品与Na2SO4、NaCl、C18加入质量之比为4.98-5.02：4-6：1-3：0.2-0.4；
A6)所述净化将要第一次离心后取上清液在水浴中用氮气吹干，加入溶解液溶解残留物，再加入正己烷涡旋混合后第二次离心，取下层清液过滤，获得样品溶液待测；所述溶解液选自甲醇或体积百分比浓度为70-80％的甲醇水溶液中的一种。
5.根据权利要求1所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述样品溶液采用超高效液相色谱串联质谱法进行测定，包括以下步骤：
1)配制标准溶液：取15种抗生素标准品，加入内标物和甲醇溶液，配成标准溶液；
2)样品检测：采用超高效液相色谱串联质谱法的正离子模式和负离子模式分别检测样品溶液和步骤1)中的标准溶液，将获得的样品溶液的液相色谱图，与标准溶液的液相色谱图进行比较，根据相对保留时间指认出共有特征峰定性，再根据共有特征峰的色谱峰面积通过内标标准曲线法进行定量，确定样品溶液中15种抗生素的浓度。
6.根据权利要求5所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，步骤1)中，包括以下条件中任一项或多项：
B1)所述标准溶液中7种内标物的浓度为100.0μg·L-1；
B2)所述甲醇溶液为体积百分比浓度为65-75％的甲醇水溶液；
B3)所述标准溶液中15种抗生素的浓度范围均为1.37-500μg·L-1。
7.根据权利要求5所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱法中，采用正离子模式检测除氟苯尼考外其它14种抗生素，正离子模式采用Waters AcquityUPLCIclass超高效液相色谱串联Waters TQ-XS质谱仪进行检测；
所述超高效液相色谱的测定条件为：色谱柱：C18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μL；流速：0.3-0.4mL·min-1；流动相A相为体积百分比浓度为0.4-0.6％的甲酸水溶液；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱；
所述质谱的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源ESI，正离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式MRM；扫描时间为0.1s；碰撞气为氩气；脱溶剂气温度为500℃；脱溶剂气流流量为1000L·Hr-1；锥孔电压为3500v。
8.根据权利要求7所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-1min，A相：B相体积比为92：8-92：8；1-1.2min，A相：B相体积比为92：8-80：20；1.2-2.5min，A相：B相体积比为80：20-80：20；2.5-2.7min，A相：B相体积比为80：20-5：95；2.7-4.5min，A相：B相体积比为5：95-5：95；4.5-4.7min，A相：B相体积比为5：95-92：8；4.7-7.5min，A相：B相体积比为92：8-92：8。
9.根据权利要求5所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，步骤2)中，所述超高效液相色谱串联质谱法中，采用负离子模式检测氟苯尼考，负离子模式采用岛津30A超高效液相色谱串联AB 5500Q-trap质谱仪进行检测；
所述超高效液相色谱的测定条件为：色谱柱：C18柱；柱温：35-45℃；进样量：1-2μL；流速：0.3-0.4mL/min；流动相A相为水；流动相B相为乙腈；分析时间为7.5min；梯度洗脱；
所述质谱的测定条件为：电离方式：电喷雾离子源ESI，负离子检测模式，三重四级杆质量分析器；扫描方式：多反应监测模式MRM；碰撞气为氮气；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi。
10.根据权利要求9所述的一种检测鱼肉中15种抗生素含量的方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-1min，A相：B相体积比为90：10-90：10；1-1.2min，A相：B相体积比为90：10-60：40；1.2-3min，A相：B相体积比为60：40-60：40；3-3.5min，A相：B相体积比为60：40-10：90；3.5-5min，A相：B相体积比为10：90-10：90；5-5.2min，A相：B相体积比为10：90-90：10；5.2-7.5min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
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