CN111443152B - 检测喹诺酮类化合物含量的方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测喹诺酮类化合物含量的方法和试剂盒，其中，检测喹诺酮类化合物含量的方法包括：对样品进行提取处理，以便得到提取液；利用分子印迹膜对提取液中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，以便得到待测液；以及对所述待测液进行高效液相色谱‑串联质谱分析检测，以便获得所述待测液中喹诺酮类化合物的定性/定量检测结果。采用本发明提供的试剂盒，可以对待测样本中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且操作方便，简单快速。

Description

检测喹诺酮类化合物含量的方法和试剂盒

技术领域

本发明涉及分析领域，具体地，涉及检测喹诺酮类化合物含量的方法和试剂盒。

背景技术

喹诺酮类抗生素作为广谱、高效的抗菌药物，被广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗当中，当在畜牧业养殖中用作兽药时，可以有效预防和治疗疾病，促进畜禽类动物生长，但若过量使用会导致牛奶等动源性食品中喹诺酮类抗生素残留，人们长期食用后，可能会造成人体内菌群失衡，产生耐药菌株，或损伤人体中枢神经，甚至有“三致”风险。针对这种情况，我国及一些其他国家和组织纷纷将环丙沙星列入限制使用的兽药名单，并规定了最大残留限量(MRL)。我国农业部235号公告中规定动物源性食品中环丙沙星和恩诺沙星合计的MRL为100μg/kg。

综上可见，对食品中的喹诺酮类抗生素残留进行检测十分必要，目前已有的检测方法有分光光度法，免疫分析法、高效液相色谱法，液相色谱-质谱联用法等，其中，液相色谱-质谱联用方法由于低检出限，高灵敏度、高精密度，成为目前广泛应用的检测方式。然而，由于食品基质比较复杂，而且喹诺酮类抗生素的残留通常为痕量残留，所以对前处理技术要求较高，常见的液液萃取(LLE)、QuEChERS、固相萃取(SPE)等前处理方法，步骤相对繁琐，需经过多次的溶液转移，可能造成目标物的损失，导致定量不准。

由此，检测喹诺酮类化合物含量的方法有待改进。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种检测喹诺酮类化合物含量的方法，该方法利用分子印迹膜对待测样本中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，操作方便，简单快速。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测喹诺酮类化合物含量的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：对样品进行提取处理，以便得到提取液；利用分子印迹膜对提取液中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，以便得到待测液；以及对所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析检测，以便获得所述待测样本中喹诺酮类化合物的定性/定量检测结果。。

根据本发明实施例的检测喹诺酮类化合物含量的方法，该方法利用分子印迹膜对提取液中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，操作方便，简单快速。

另外，根据本发明上述实施例的检测喹诺酮类化合物含量的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，所述样品提取处理方法为利用乙腈和氯化钠进行所述提取处理，所述乙腈的添加量为每克样品添加1-10mL，氯化钠的添加量为每克样品添加0.1-2g。

根据本发明的实施例，所述萃取和富集处理包括：将提取液添加到分子印迹膜上，利用清洗剂对分子印迹膜进行清洗；利用洗脱剂对清洗后的分子印迹膜进行超声洗脱，收集洗脱液；将所述洗脱液干燥后稀释，以便得到待测液。

根据本发明的实施例，所述提取液的体积为40-60μL，优选地，为50μL。

根据本发明的实施例，所述清洗剂为超纯水、丙酮、甲醇、乙腈，优选地，为超纯水。

根据本发明的实施例，所述洗脱剂为甲醇和乙酸的混合液，例如，所述洗脱剂可以为乙醇：乙酸(9：1，v/v)、甲醇：乙酸(9：1，v/v)、丙酮：乙酸(9：1，v/v)、乙腈：乙酸(9：1，v/v)，优选地，为甲醇：乙酸(9：1，v/v)。

根据本发明的实施例，所述洗脱剂的用量为1-5mL，优选地，为3mL。

根据本发明的实施例，所述稀释剂为甲酸水和乙腈的混合液。

根据本发明的实施例，所述分子印迹膜的制备方法包括：将聚偏氟乙烯膜进行活化处理，以便得到活化后的膜；将伪模板分子与功能单体和致孔剂混合，以便得到预聚液；将所述预聚液与交联剂和引发剂混合进行交联处理，以便得到交联液；以及将所述活化后的膜与所述交联液接触，进行除氧处理，并在氮气保护下恒温聚合，以便获得所述分子印迹膜。

根据本发明的实施例，所述聚偏氟乙烯膜的直径为10-55mm，孔径为0.2-0.6μm，优选地，直径为13mm，孔径为0.45μm。

根据本发明的实施例，所述伪模板分子为与待测物结构相似的同类喹诺酮类化合物，功能单体为甲基丙烯酸，所述致孔剂为氯仿和甲醇的混合液。

根据本发明的实施例，所述交联剂为丙烯酸乙二醇二甲基酯(EGDMA)，所述引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。

根据本发明的实施例，所述交联剂与所述引发剂的摩尔比为15：(0.5-2)。

根据本发明的实施例，在所述恒温聚合后，进一步包括：洗脱处理，所述洗脱处理包括：对所述分子印迹膜进行第一洗脱，以便得到第一洗脱膜，其中，所述第一洗脱为醇和乙酸的混合液进行所述第一洗脱，醇和所述乙酸的体积比为9：(0.5-2)；对所述第一洗脱膜进行第二洗脱，以便得到第二洗脱膜，其中，所述第二洗脱为水洗脱；以及对所述第二洗脱膜进行洗涤干燥处理，以便得到洗脱后的分子印迹膜。

根据本发明的实施例，所述HPLC-MS/MS分析检测的液相条件包括：色谱柱：ZORBAXSB-Aq，规格：4.6mm×150mm，粒径：3.5μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.5μL/min；流动相：A：0.2％甲酸水、B：0.1％甲酸乙腈。

根据本发明的实施例，所述HPLC-MS/MS分析检测的质谱条件包括：扫描方式：ESI⁺；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：5500V；雾化气压力(GS1)：55psi；辅助气压力(GS2)：50psi；气帘气压力(CUR)：20psi；离子源温度(TEM)：550℃；驻留时间(DT)：100ms。

根据本发明的实施例，所述HPLC-MS/MS分析检测的流动相梯度洗脱条件为：

0-1.5min，90％A；1.5-2min，(90％-50％)A；2-6.5min，(50％-20％)A；6.5-7min，(20％-90％)；7-8min，90％A。

根据本发明的实施例，所述待测喹诺酮化合物为选自氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、司氟沙星、氟罗沙星、奥比沙星、那氟沙星、西诺沙星、克林沙星、沙拉沙星、洛美沙星、吉米沙星、马波沙星、加替沙星、莫西沙星中的至少一种。根据本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：提取剂：乙腈和氯化钠；微孔滤膜；分子印迹膜；以及色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱。

根据本发明实施例的试剂盒利用分子印迹膜对待测样本中的喹诺酮类化合物进行富集处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，操作方便，简单快速。此外，需要说明书的是，该试剂盒具有前述检测喹诺酮类化合物含量的方法的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。

根据本发明的实施例，基于5mL牛奶样品，该试剂盒包括：提取剂：乙腈，10mL，氯化钠，2g；微孔滤膜：孔径为0.22μm；分子印迹膜：直径为13mm，孔径为0.45μm；洗脱液：甲醇－冰乙酸，且甲醇和冰乙酸体积比为9:1；清洗剂：超纯水；稀释剂：乙腈/超纯水(1：9v/v，含0.1％甲酸)；流动相溶液A：0.2％甲酸水；流动相溶液B：0.1％甲酸乙腈；色谱柱：ZORBAXSB-Aq色谱柱，4.6mm×150mm×3.5μm。标准溶液：喹诺酮类化合物混合标准溶液，任选地，所述喹诺酮类化合物为选自氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、司氟沙星、氟罗沙星、奥比沙星、那氟沙星、西诺沙星、克林沙星、沙拉沙星、洛美沙星、吉米沙星、马波沙星、加替沙星、莫西沙星中的至少一种。

进一步地，根据本发明的又一方面，本发明提供了前述的试剂盒用于检测食品中喹诺酮类化合物含量的用途。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明的一个实施例的分子印迹膜的红外表征图；

图2显示了根据本发明一个实施例的环丙沙星的标准曲线示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例的提取液的上样量对待测物回收率的影响的结果示意图。

图4显示了根据本发明一个实施例的不同清洗剂种类对待测物回收率的影响的结果示意图；

图5显示了根据本发明一个实施例的不同洗脱剂条件下环丙沙星总离子流色谱图。

图6显示了根据本发明一个实施例的洗脱剂用量对待测物回收率的影响的结果示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种检测喹诺酮类化合物含量的方法。根据本发明实施例的检测喹诺酮类化合物含量的方法，该方法利用分子印迹膜对待测样本中的喹诺酮类化合物进行富集处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，操作方便，简单快速。

根据本发明的实施例，该待测喹诺酮化合物为选自氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、司氟沙星、氟罗沙星、奥比沙星、那氟沙星、西诺沙星、克林沙星、沙拉沙星、洛美沙星、吉米沙星、马波沙星、加替沙星和莫西沙星中的至少一种。

根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，具体如下：

S100：提取处理：

根据本发明的实施例，对样品进行提取处理，得到提取液。由此，通过提取处理，从样品中提取喹诺酮类化合物。

发明人对不同提取溶剂进行比较，研究发现，利用乙腈和氯化钠进行所述提取处理，喹诺酮类化合物的回收率高，检测结果的精确度更高。通过提取处理，可以去除样品中的杂质，比如可以去除蛋白对检测的干扰。综合考虑回收率的稳定性，根据本发明的实施例，所述乙腈的添加量为每克样品添加1-10mL，氯化钠的添加量为每克样品添加0.1-2g。其中，优选乙腈的添加量为2mL，氯化钠的添加量为0.4g。

根据本发明的实施例，该提取方法包括：称取样品5mL置于离心管中，然后加入提取试剂，涡旋震荡5min，离心(4℃，8000r/min)10min，得到提取液。

根据本发明的实施例，该样品为牛奶。牛奶作为动物源性食品可能存在抗生素的残留，本发明实施例的检测喹诺酮类化合物的方法尤其适用于牛奶的检测。

S200：萃取和富集处理

根据本发明的实施例，利用分子印迹膜对提取液中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，得到待测液。发明人发现利用分子印迹膜进行萃取处理，与传统的分子印迹聚合物做固相萃取材料相比，无须固相萃取柱的装填及离心、磁性分离等步骤，上样量小，整个萃取过程操作方便，简单快速，既能达到检测牛奶中痕量喹诺酮类抗生素残留的目的，同时检测的精确度、回收率、重现性都较高。

根据本发明的实施例，该分子印迹膜的制备方法包括：将聚偏氟乙烯膜进行活化处理，以便得到活化后的膜；将伪模板分子与功能单体和致孔剂混合，以便得到预聚液；将所述预聚液与交联剂和引发剂混合进行交联处理，以便得到交联液；以及将所述活化后的膜与所述交联液接触，进行除氧处理，并在氮气保护下恒温聚合，以便获得所述分子印迹膜。采用表面聚合方式，可有效防止模板分子填埋过深，模板泄露的问题；另外，避免了传统本体聚合方法所必需的研磨、过筛等操作步骤，操作相对方便，省力。

根据本发明的实施例，该聚偏氟乙烯膜的直径为10-55mm，孔径为0.2-0.6μm。根据本发明的优选实施例，该聚偏氟乙烯膜的直径为13mm，孔径为0.45μm。由此，该聚偏氟乙烯膜在市场上价格便宜，性能优异，大小合适易裁剪。

根据本发明的实施例，伪模板分子为与待测物结构相似的同类喹诺酮类化合物，功能单体为甲基丙烯酸，致孔剂为氯仿和甲醇的混合液。分子印迹技术固有的缺陷就是模板泄露问题，模板很难洗脱完全，使用伪模板分子，避免由待测化合物作为模板所形成的分子印迹膜由于洗脱不完全所造成的模板泄露问题，由此可以避免检测结果不准。所用的致孔剂既能有效溶解模板分子，与功能单体稳定结合，又能充分发挥致孔剂的作用，形成有效的孔穴，利于吸附效率的提高。

根据本发明的实施例，交联剂为丙烯酸乙二醇二甲基酯(EGDMA)，引发剂为偶氮二异丁腈(AIBN)。根据本发明的实施例，该交联剂与引发剂的摩尔比为15：(0.5-2)。由此，在该比例下，交联剂和引发剂结合能有效引发聚合反应，形成的分子印迹膜印迹效果好。根据本发明的实施例，在恒温聚合后，该方法进一步包括洗脱处理，该洗脱处理包括第一洗脱、第二洗脱和洗涤干燥处理。

根据本发明的实施例，对分子印迹膜进行第一洗脱，得到第一洗脱膜，其中，该第一洗脱为利用甲醇和乙酸的混合液进行所述第一洗脱。由此，有利于将分子印迹膜上的奎诺酮类化合物充分洗脱，使检测的回收率更高。根据本发明的实施例，甲醇和乙酸的体积比为9：1。

根据本发明的实施例，对第一洗脱膜进行第二洗脱，得到第二洗脱膜，其中，该第二洗脱为水洗脱。由此，有利于提高喹诺酮类化合物的回收率。由此，既能有效洗脱掉杂质，也不影响喹诺酮类化合物在分子印迹膜上的吸附。

根据本发明的实施例，对第二洗脱膜进行洗涤干燥处理，得到洗脱后的分子印迹膜。其中，利用乙腈进行洗涤。

根据本发明的实施例，上样体积为25-125μL，也就是提取液进行萃取处理的上样量为25-125μL，优选地，为50μL。如果上样量过低，分子印迹膜吸附未达到饱和，而上样量过高，样品基质过多，有限的清洗剂不足以完全清洗，样品基质可能会占据一些分子印迹膜上化合物的空穴，导致目标化合物的吸附量反而减少。由此，上述提取液的上样体积为25-125μL，尤其是50μL时，分子印迹膜的吸附量充分，基质的干扰作用小。

根据本发明的实施例，所用清洗剂的种类为超纯水、乙腈、丙酮、甲醇四种不同的清洗溶剂，也就是洗脱液进行富集处理的清洗剂为超纯水、乙腈、丙酮、甲醇，优选地，为超纯水，使用超纯水清洗，检测得到待测物回收率在95％以上，以丙酮为清洗剂时，回收率最低，仅为22％。使用甲醇和乙腈做清洗剂时，回收率也下降到33％左右。因此，超纯水作为清洗剂，既能有效洗掉杂质，也不影响待测物在分子印迹膜上的吸附。

根据本发明的实施例，所用洗脱剂的种类为乙醇：乙酸(9：1，v/v)、甲醇：乙酸(9：1，v/v)、丙酮：乙酸(9：1，v/v)、乙腈：乙酸(9：1，v/v)，也就是洗脱液进行萃取处理的清洗剂为乙醇：乙酸(9：1，v/v)、甲醇：乙酸(9：1，v/v)、丙酮：乙酸(9：1，v/v)、乙腈：乙酸(9：1，v/v)，优选地，选用甲醇：乙酸(9：1，v/v)做洗脱液时，目标物的回收率最高，可以达到97％左右，使用乙醇：乙酸(9：1，v/v)做洗脱剂时，回收率最低，仅有14.7％，使用丙酮：乙酸(9：1，v/v)和乙腈：乙酸(9：1，v/v)作洗脱剂时，由于洗脱强度过大，可能会把一些其他干扰物也洗脱下来，导致目标物总离子流图峰型变化，而且出现杂质，导致回收率存在较大偏差，因此，甲醇：乙酸(9：1，v/v)作为洗脱剂，可以最大程度地将目标物从分子印迹膜上洗脱下来，并保证实验结果的准确度。

根据本发明的实施例，所用洗脱剂的用量为1-5mL，也就是待测样本进行富集处理的洗脱剂种类为1-5mL，优选地，洗脱剂用量为3mL，当洗脱剂用量较少(1-2mL)时，回收率较低，小于56％，当洗脱剂用量为3mL及其以上时，回收率较高，大于92％，因此，选择3mL甲醇：乙酸(9：1，v/v)作为洗脱条件，既能有效地把目标物从分子印迹膜上洗掉，又减少有机溶剂的消耗，保护环境。

根据本发明的实施例，该萃取和富集处理包括：将所述提取液添加到所述分子印迹膜上，利用清洗剂对所述分子印迹膜进行清洗；利用洗脱剂对清洗后的分子印迹膜进行超声洗脱，收集洗脱液；将所述洗脱液干燥后稀释，以便得到待测液。具体地，根据本发明的一些实施例，该萃取和富集处理包括：将提取液加在一张分子印迹膜上，平衡20min，之后，200μL去离子水清洗膜表面，最后用1mL甲醇－乙酸(9:1，v/v)超声洗脱，重复三次，收集洗脱液，N₂吹干，用1mL稀释剂复溶，过0.22μm微孔滤膜，得到待测液，以便进行HPLC-MS/MS分析。

S300：分析检测

根据本发明的实施例，对待测液进行HPLC-MS/MS分析检测，获得样本中喹诺酮类化合物的定性/定量检测结果。在此，该分析检测的方法不受特别的限制，本领域技术人员可以根据待测化合物选择适宜的分析检测方法。

根据本发明的实施例，该喹诺酮类化合物可以为环丙沙星。

进一步地，根据本发明的实施例，以环丙沙星为例，该HPLC-MS/MS分析检测的液相条件包括：色谱柱：ZORBAX SB-Aq，规格：4.6mm×150mm，粒径：3.5μm；进样量：3μL；柱温：30℃；流速：0.5μL/min；流动相A：0.2％甲酸水；流动相B：0.1％甲酸乙腈。根据本发明的实施例，该HPLC-MS/MS分析检测的质谱条件包括：扫描方式：ESI⁺；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：5500V；雾化气压力(GS1)：55psi；辅助气压力(GS2)：50psi；气帘气压力(CUR)：20psi；离子源温度(TEM)：550℃；驻留时间(DT)：100ms。

根据本发明的实施例，该质谱的其他质谱参数如下表：

注：*为定量离子

根据本发明的实施例，该HPLC-MS/MS分析检测的洗脱条件为：0-1.5min，90％A；1.5-2min，(90％-50％)A；2-6.5min，(50％-20％)A；6.5-7min，(20％-90％)；7-8min，90％A。也就是说，0-1.5min内，A相降为50％；2-6.5min内，A相降为20％；6.5min-7min，A相升到90％。由此，在该梯度洗脱条件下，可是实现目标化合物在7min内出峰，提高了检测的速度，并且色谱峰的峰型好，检测的精确度、回收率和重现性好。

进一步地，本发明实施例的分析检测还包括分析化学中常规的检测步骤，例如绘制标准曲线等，本领域技术人员可以根据具体情况进行操作，在此不再一一赘述。例如环丙沙星标准曲线的制备方法如下：分别准确量取适量10μg/mL环丙沙星标准溶液，用稀释剂：乙腈/超纯水(1：9v/v，含0.1％甲酸)稀释成浓度为0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200ng/mL。用前述的HPLC-MS/MS系统进行分析检测，得到环丙沙星的定量标准曲线。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：提取剂：乙腈和氯化钠；微孔滤膜；分子印迹膜；以及色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱。

根据本发明实施例的试剂盒利用分子印迹膜对待测样本中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，降低样品复杂基质对后续检测的干扰，并且，操作方便，简单快速。此外，需要说明书的是，该试剂盒具有前述检测喹诺酮类化合物含量的方法的全部技术特征和技术效果，在此不再一一赘述。

根据本发明的一些实施例，基于5mL牛奶样品，该试剂盒包括：提取剂：乙腈，10mL，氯化钠，2g；微孔滤膜：孔径为0.22μm；分子印迹膜：直径为13mm，孔径为0.45μm；洗脱液：甲醇－冰乙酸(9:1，v/v)；清洗剂：超纯水；流动相溶液A：0.2％甲酸水；流动相溶液B：0.1％甲酸乙腈；稀释剂：乙腈/超纯水(1：9v/v，含0.1％甲酸)；色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱，4.6mm×150mm×3.5μm。标准溶液：环丙沙星标准溶液，10μg/mL。

进一步地，根据本发明的又一方面，本发明提供了前述的试剂盒用于检测食品中喹诺酮类化合物含量的用途。其中，该食品为复杂基质，含有多种成分，检测困难，发明人通过分子印迹膜对喹诺酮类化合物进行萃取，避免复杂基质的干扰，尤其适于食品里复杂基质的检测，检测结果更准确。根据本发明的实施例，该食品可以为牛奶。由于奶牛养殖过程中可能会使用环丙沙星作为兽药，用来预防和治疗疾病，促进奶牛生长导致牛奶中通常会有痕量环丙沙星的残留，本发明实施例的试剂盒尤其适用于牛奶样品的检测。另外，食品中喹诺酮类抗生素上的残留通常是痕量残留，分子印迹膜表面交联形成的特体性孔穴可以选择性富集食品复杂基质中的痕量残留物，表明分子印迹膜在在食品安全监管及检测方面具有独特的优势。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1

本实施例以牛奶样品中痕量环丙沙星进行检测，具体如下：

1、实验方法

(1)分子印迹膜的制备：

首先将聚偏氟乙烯膜浸入纯水10min，再浸入乙腈10min，之后浸入含有0.15mol/L偶氮二异丁腈的乙腈溶液中20min，取出后晾干。活化好的膜应迅速放入分子印迹预聚液中。称取1mmol的伪模板分子恩诺沙星标准品于棕色试剂瓶中，随后量取6mmol的甲基丙烯酸，然后加入15mL的氯仿：甲醇(5:1v/v)混合液，涡旋使之充分混匀，密封，室温预聚合1h。完成之后量取30mmol的丙烯酸乙二醇二甲基酯和2mmol的偶氮二异丁腈加入到预聚液中，充分混匀后，加入上述活化好的聚偏氟乙烯膜，超声除氧10min，密封，室温吸附2h。反应结束后将膜分装在玻璃瓶中，氮气保护下恒温65℃聚合24h。随后用甲醇：乙酸(9:1v/v)混合液做洗脱液，反复洗脱洗去膜上结合的模板分子，至平衡之后用纯水洗涤膜表面至中性，然后用乙腈洗涤并干燥，保存于干燥器备用。

(2)样品的提取：

称取样品5mL置于离心管中，加10mL乙腈，2g氯化钠混合，涡旋震荡5min，离心(4℃，8000r/min)10min，得到提取液。

(3)分子印迹膜萃取提取液中的环丙沙星残留

50μL提取液加在一张分子印迹膜上，平衡20min后，加200μL超纯水清洗膜表面，然后用1mL甲醇-乙酸(9:1，v/v)超声洗脱，重复三次，收集洗脱液。N₂吹干，用1mL稀释剂复溶，过0.22μm微孔滤膜，得到待测液。

(4)上机测定

色谱柱：Aglient ZORBAX SB-Aq(4.6mm×150mm，3.5μm,美国安捷伦科技公司)；进样量3μL；柱温30℃；流速：0.5μL/min；流动相：A：0.2％甲酸水、B：0.1％甲酸乙腈，梯度洗脱条件为0-1.5min，90％A；1.5–2min内，A相降为50％；2-6.5min内，A相降为20％；6.5min-7min，A相升到90％；7-8min，90％A。

质谱条件:

扫描方式：ESI⁺；检测方式：多反应监测(MRM)；电喷雾电压(IS)：5500V；雾化气压力(GS1)：55psi；辅助气压力(GS2):50psi；气帘气压力(CUR):20psi；离子源温度(TEM)：550℃；驻留时间(DT):100ms；其他质谱参数如表1：

表1

注：*为定量离子

(5)标准溶液的配制与标准曲线、检测限与定量限的测定

分别准确量取适量10μg/mL环丙沙星标准溶液，用稀释剂：乙腈/超纯水(1：9v/v，含0.1％甲酸)稀释成0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20，50，100，200ng/mL系列浓度，利用高效液相色谱-串联三重四级杆质谱对各标准曲线溶液进行检测，工作站软件进行分析，绘制标准曲线。

采用稀释法检测环丙沙星，以峰高为基线噪音3倍时的质量浓度为分析方法的检出限(LOD)，以峰高为基线噪音10倍时的质量浓度为分析方法的定量限(LOQ)。

在空白基质中添加环丙沙星标准溶液，使添加量中低高三个质量浓度(10、50、100ng/mL)的添加水平，每个添加浓度做5个平行样品，按上述以萃取方法对痕量环丙沙星残留进行处理分析，计算回收率和日内、日间精密度。

2、实验结果：

(1)分子印迹膜傅里叶红外表征

根据本发明的实施例，以恩诺沙星为模板，制备了分子印迹膜，并对空白聚偏氟乙烯膜(PVDF)、分子印迹膜(MIM)和非分子印迹膜(NIM)进行傅里叶红外光谱(Fouriertransform-infrared spectroscopy,FT-IR)表征。如图1显示，NIM和MIM的FT-IR光谱中均存在1733(1719)cm^-1附近的羰基(-C＝O)伸缩振动峰和2982(2981)cm^-1处羧基的伸缩振动峰。一般来说，1733cm^-1处的红外吸收为-C＝O的振动吸收峰。然而，在MIM的红外吸收光谱中，这个波段被红移到了1719cm^-1，这是由于MIM中存在的模板分子恩诺沙星，使得功能单体甲基丙烯酸(MAA)中的-C＝O与恩诺沙星中的质子给体C-H或O-H形成氢键，导致MAA中的-C＝O减弱，吸收峰红移。并且，空白PVDF的FT-IR光谱在1719(1733)cm-1和2981(2982)cm-1上未见明显吸收，说明有分子印迹层交联在MIM和NIM膜表面。此外，在MIM上存在的1636cm-1处4-吡啶酮的羰基伸缩振动峰，进一步证实了在MIM膜表面成功交联上恩诺沙星分子印迹层。

(2)标准曲线的制备以及检测限与定量限的测定

按照上述所述方式制备环丙沙星标准品溶液，进液相色谱-串联质谱仪按照上述的检测色谱质谱条件检测，得到以环丙沙星峰面积(A)对应浓度(c)的线性回归方程A＝28454c+2489.9(R²＝0.9999)，在0.1-200ng/mL内线性良好，详见图2。采用稀释法检测环丙沙星的检出限(S/N＝3)和定量限(S/N＝10)，得到环丙沙星的LOD和LOQ分别为0.005ng/mL和0.05ng/mL。

(3)提取液上样量的选择

分别考察25、50、75、100、125μL上样量对分子印迹膜吸附量的影响，平行做三份，以上述的萃取步骤检测平均回收率。结果如图3所示，当上样量小于50μL时，环丙沙星的回收率随着上样量的增加而增加，但当大于50μL时，环丙沙星的回收率随着上样量的增加而降低，这可能是由于当上样量小于50μL时，MIM吸附未达到饱和，而当上样量大于50μL时，样品基质过多，清洗不完全，可能会占据一些环丙沙星的空穴，导致环丙沙星的吸附量反而减少。因此，25-125μL作为上样体积，尤其是50μL作为上样体积，在达到更大的环丙沙星吸附的同时，基质的干扰作用最小。

(4)清洗剂种类的选择

清洗剂的作用是洗去分子印迹膜的非特异性吸附，清洗剂的种类取决于杂质的种类以及膜对目标物的吸附强度。按照实验方法中的萃取步骤，考察了超纯水、乙腈、丙酮、甲醇四种不同的清洗溶剂，待吸附完成后，取200μL冲洗MIM表面，检测环丙沙星的回收率，结果如图4所示，结果表明，使用超纯水清洗，检测得到环丙沙星回收率在95％以上，以丙酮为清洗剂时，回收率最低，仅为22％。使用甲醇和乙腈做清洗剂时，回收率也下降到33％左右。因此，选用200μL超纯水作为清洗剂，既能有效洗脱掉杂质，也不影响环丙沙星在分子印迹膜上的吸附。

(5)洗脱剂的种类的选择

洗脱剂的作用是洗去分子印迹膜上特异性吸附的环丙沙星，破坏环丙沙星与分子印迹聚合物形成的氢键，考察了乙醇：乙酸(9：1，v/v)、甲醇：乙酸(9：1，v/v)、丙酮：乙酸(9：1，v/v)、乙腈：乙酸(9：1，v/v)对回收率的影响，结果表示，用甲醇：乙酸(9：1，v/v)做洗脱液时，环丙沙星的回收率最高，可以达到97％左右，使用乙醇：乙酸(9：1，v/v)做洗脱剂时，回收率最低，仅有14.7％，使用丙酮：乙酸(9：1，v/v)和乙腈：乙酸(9：1，v/v)作洗脱剂时，由于洗脱强度过大，可能会把一些其他干扰物也洗脱下来，导致峰型变化，而且出现杂质，如图5所示，回收率数据与实际结果存在偏差，其中，乙醇作为洗脱剂回收率最低，未在附图中展示。因此，选用甲醇：乙酸(9：1，v/v)做洗脱剂效果更佳。

(6)洗脱剂用量的选择

洗脱剂的用量多少决定了是否把吸附在分子印迹膜上的环丙沙星完全洗脱，直接影响回收率。以甲醇：乙酸(9：1，v/v)作为洗脱液，考察了1mL,2mL,3mL,4mL,5mL的用量对回收率的影响，结果如图6所示，可以看出，当洗脱剂用量较少(1mL,2mL)时，回收率较低，为分别为43.2％和55.2％，当洗脱剂用量为3mL及其以上时，回收率较高，大于92％，表明环丙沙星已完全从分子印迹膜上被洗脱下来。因此，选择3mL甲醇：乙酸(9：1，v/v)作为洗脱条件，可以把环丙沙星从分子印迹膜上完全洗脱。

(7)检测方法的回收率

回收率评价通过加标回收率表示，制备含环丙沙星10、50、100ng/mL的空白牛奶样品，每个浓度平行3次，按照上述步骤处理，进液相色谱串联质谱检测，带入标准曲线方程计算加标样品中环丙沙星的浓度，并分别与实际加入量比较，分别求得各浓度的回收率。结果如表2所示，回收率在92.6％-119.1％之间，证明回收率良好。

(8)检测方法的精密度

精密度是指在同样的实验条件下，多次重复试验检测值之间符合的程度，使用相对标准偏差(RSD％)作为指标，RSD值越小，表明试验的精密度越好。首先制备含环丙沙星10、50、100ng/mL的空白牛奶样品，每个浓度平行5次，按照上述步骤处理，然后进液相色谱串联质谱检测，连续测定3d，计算得到日内精密度和日间精密度。结果如表2所示，可以看到日内精密度在在4.78％-7.94％之间，日间精密度在3.34％-7.71％之间，精密度良好。

表2

(9)实际样品的测定

使用本实施例的检测试剂盒和检测方法对4种品牌的牛奶样品进行环丙沙星的含量测定，结果显示，4个品牌的牛奶样品中测得环丙沙星含量均低于100ng/mL，符合欧盟要求。结果表明，本发明可成功用于牛奶中痕量环丙沙星残留的快速检测。

综上所述，本发明实施例的方法对食品(例如牛奶)中痕量环丙沙星残留快速检测，能够简单快速完成样品的前处理和检测。本发明实施例的方法通过优化萃取条件能消除基质效应，具有较高的精密度和回收率及重现性，可应用于牛奶或其他复杂食品基质中痕量环丙沙星残留量的准确测定。并且，环丙沙星在线性范围内线性关系良好，相关系数大于0.999，回收率在可接受范围内，本发明实施例的检测试剂盒及检测方法能够有效快速检测样品中的痕量喹诺酮类化合物(例如环丙沙星)，为食品，尤其是牛奶的安全检测提供一种灵敏、准确、方便、快捷的手段。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (16)

1.一种检测喹诺酮类化合物含量的方法，其特征在于，包括：

利用乙腈和氯化钠对样品进行提取处理，以便得到提取液；

利用分子印迹膜对所述提取液中的喹诺酮类化合物进行萃取和富集处理，以便得到待测液；以及

对所述待测液进行高效液相色谱-串联质谱分析检测，以便获得所述待测液中喹诺酮类化合物的定性/定量检测结果，

其中，所述分子印迹膜的制备方法包括：

将聚偏氟乙烯膜进行活化处理，以便得到活化后的膜，其中，所述聚偏氟乙烯膜的直径为10-55mm，孔径为0.2-0.6μm；

将伪模板分子与功能单体和致孔剂混合，以便得到预聚液，其中，所述伪模板分子为恩诺沙星；

将所述预聚液与交联剂和引发剂混合进行交联处理，以便得到交联液；以及

将所述活化后的膜与所述交联液接触，进行除氧处理，并在氮气保护条件下，进行恒温聚合，以便获得所述分子印迹膜，

其中，HPLC-MS/MS分析检测的液相条件包括：

色谱柱：ZORBAX SB-Aq，规格：4.6mm×150mm，粒径：3.5μm；

进样量：3μL；

柱温：30℃；

流速：0.5μL/min；

流动相：A：0.2％甲酸水，B：0.1％甲酸乙腈；

其中，所述HPLC-MS/MS分析检测的质谱条件包括：

扫描方式：ESI⁺；

检测方式：多反应监测；

电喷雾电压：5500V；

雾化气压力：55psi；

辅助气压力：50psi；

气帘气压力：20psi；

离子源温度：550℃；

驻留时间：100ms；

其中，所述萃取和富集处理包括：

将所述提取液添加到所述分子印迹膜上，利用清洗剂对所述分子印迹膜进行清洗，其中，所述清洗剂为超纯水；

利用洗脱剂对清洗后的分子印迹膜进行超声洗脱，收集洗脱液，所述洗脱剂为甲醇和乙酸的混合液，且甲醇和冰乙酸体积比为9:1；

将所述洗脱液干燥后稀释，以便得到待测液，

并且，所述喹诺酮类化合物为环丙沙星。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乙腈的添加量为每克样品添加1-10mL，氯化钠的添加量为每克样品添加0.1-2g。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取液的体积为40-60μL。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述提取液的体积为50μL。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂的用量为1-5mL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱剂的用量为3mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，稀释剂为甲酸水和乙腈的混合液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚偏氟乙烯膜的直径为13mm，孔径为0.45μm。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述致孔剂为氯仿和甲醇的混合液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂为丙烯酸乙二醇二甲基酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述交联剂与所述引发剂的摩尔比为15：(0.5-2)。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述恒温聚合后，进一步包括：洗脱处理，所述洗脱处理包括：

对所述分子印迹膜进行第一洗脱，以便得到第一洗脱膜，其中，所述第一洗脱为醇和乙酸的混合液进行所述第一洗脱，醇和乙酸的体积比为9：(0.5-2)；

对所述第一洗脱膜进行第二洗脱，以便得到第二洗脱膜，其中，所述第二洗脱为水洗脱；以及

对所述第二洗脱膜进行洗涤干燥处理，以便得到洗脱后的分子印迹膜。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述HPLC-MS/MS分析检测的流动相梯度洗脱条件为：0-1.5min，90％A；1.5-2min，90％A-50％A；2-6.5min，50％A-20％A；6.5-7min，20％A-90％A；7-8min，90％A。

14.一种检测喹诺酮类化合物的试剂盒，其特征在于，包括：

提取剂：乙腈和氯化钠；

洗脱液：甲醇－冰乙酸，且甲醇和冰乙酸体积比为9:1；

清洗剂：超纯水；

微孔滤膜；

权利要求1所述的分子印迹膜；以及

色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱，

并且，所述喹诺酮类化合物为环丙沙星。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其特征在于，基于5ml牛奶样品，包括：提取剂：乙腈，10mL，氯化钠，2g；

微孔滤膜：孔径为0.22μm；

分子印迹膜：直径为13mm，孔径为0.45μm；

流动相溶液A：0.2％甲酸水；

流动相溶液B：0.1％甲酸乙腈；

稀释剂：乙腈水溶液，其中，乙腈与水的体积比为1：9，且含0.1％甲酸；

色谱柱：ZORBAX SB-Aq色谱柱，4.6mm×150mm×3.5μm；

标准溶液：喹诺酮类化合物标准溶液。

16.权利要求14或15所述的试剂盒用于检测食品中环丙沙星含量的用途。

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