CN106866790A - 达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法 - Google Patents

达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法 Download PDF

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张洪兰
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Peking University Founder Group Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种制备达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的方法，该方法采用达托霉素碱破坏，转换成含较高纯度达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的料液，再通过制备色谱，得到色谱纯度大于95％的高纯度的达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质。该方法简单易行，成本低廉。

Description

达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法
技术领域
本发明涉及药物制备领域，特别涉及达托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法，具体的说涉及一种采用达托霉素一定条件转换及制备色谱方法制备高纯度达托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b杂质。
背景技术
随着抗生素的发展及抗生素的滥用，病原菌对抗生素的耐药性是当今社会面临的最严峻挑战。除了控制抗生素滥用外，目前寻找一种有效的对抗耐药菌的抗生素成了解决这一问题的最佳途径，万古霉素曾被认为是对抗革兰氏阳性菌的最后一道防线，但现在全世界临床已发现越来越多的耐此药菌。
达托霉素(Daptomycin)是由Lilly(礼来)公司最初研究，Cubist制药公司开发的一环脂肽类抗生素。应病人对新型耐药抗生素的迫切需求，2003年底，美国食品与药物管理局(FDA)经过快速审理程序批准注射用达托霉素(Daptomycin)(商品名cubicin)用于治疗由一些革兰氏阳性敏感菌株引起的并发性皮肤及皮肤结构感染，如脓肿、手术切口感染和皮肤溃疡。达托霉素的作用机制与其他抗生素不同，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质；另外，它还能通过破坏细菌的细胞膜，使其内容物外泄而达到杀菌的目的，因此细菌对达托霉素产生耐药性可能会比较困难。
达托霉素虽然已经在美国实现工业化生产，但在达托霉素产品中常包含有脱水达托霉素、异构达托霉素、达托霉素内酯水解物等杂质，严重影响产品质量，为此能够单独分离纯化出达托霉素中的杂质并进行研究是非常必要的。
现有的达托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b杂质提取方法，例如欧洲专利1586580A2所描述的达托霉素杂质归属，并未具体涉及达托霉素杂质分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉且能快速得到高纯度达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法。
根据欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586 580A2)公开的方法对达托霉素进行检测，结合欧洲专利1586580A2所描述的达托霉素杂质归属，对达托霉素杂质归属命名和定位情况如图1所示，图1中DT代表达托霉素，并标示出了达托霉素RS-5/6杂质峰、RS-7杂质峰和RS-7a/7b杂质峰的位置。
本发明提供的达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法，包括如下步骤：
1)将达托霉素用碱溶液溶解，放置8小时到4天，得到含较高浓度达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的溶液；
2)该溶液经过制备色谱柱分离纯化，得色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质的制备液；
3)分别将步骤2)所得达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质的制备液冻干，得到固体达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质。
上述步骤1)中采用的达托霉素色谱纯度>80％，优选>90％。
上述步骤1)所述碱溶液的碱可选自NaOH、Na2CO3、NaHCO3、NH4HCO3等一系列无机碱，所述碱溶液的pH>8。在本发明的实施例中，采用了这些无机碱的饱和水溶液作为所述碱溶液。
上述步骤1)中优选将达托霉素用碱溶液溶解成30～50mg/mL的溶液；放置温度一般在4～30℃，优选为4～20℃；放置时间8小时到4天，优选8～24小时。
上述步骤2)采用制备色谱分离系统分离纯化达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质，流动相采用乙腈和三氟乙酸溶液的混合液，具体色谱条件是：
色谱柱：Ib-SitC8/6045-1、250×10.00mm
波长：214nm
流动相：乙腈、三氟乙酸溶液
流速：5mL/min
柱温：20～30℃室温
其中，三氟乙酸溶液浓度为0.01％～0.2％，优选0.01％～0.05％；
流动相比例为乙腈:三氟乙酸溶液＝40:60～60:40(体积比，下同)，优选50:50～60:40。
在本发明方法中，达托霉素破坏液制备色谱分离系统处理后，得到的达托霉素RS-5/6杂质及RS-7和RS-7a/7b杂质其色谱纯度在95％以上。该方法简单易行，成本低廉。
附图说明
图1是达托霉素HPLC检测图谱，其中显示了达托霉素各杂质的归属和定位情况。
具体实施方式
以下通过实施例进一步描述本发明，但不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和氢氧化钠溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保温8h，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度98％，RS-7杂质的色谱纯度98％和RS-7a/7b纯度99％。
实施例2
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和Na2CO3溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保温1天，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度97％，RS-7杂质的色谱纯度97％和RS-7a/7b纯度98％。
实施例3
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和NH4HCO3溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保温1天，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度96％，RS-7杂质的色谱纯度94％和RS-7a/7b纯度97％。
实施例4
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和NaHCO3溶液溶解成50mg/mL溶液，20℃保温1天，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝53:47)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度95％，RS-7杂质的色谱纯度95％和RS-7a/7b纯度97％。
实施例5
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和氢氧化钠溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保温8h，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝55:45)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度96％，RS-7杂质的色谱纯度95％和RS-7a/7b纯度98％。
实施例6
色谱纯度90％达托霉素成品用饱和氢氧化钠溶液溶解成50mg/mL溶液，4℃冰箱保温8h，得到主要含达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的破坏液。
该溶液经制备色谱(流动相为乙腈:0.01％三氟乙酸＝50:50)分离纯化，并用高效液相跟踪检测(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP1 586 580 A2)公开的方法相同)，分别收集色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质制备液、RS-7杂质制备液和RS-7a/7b杂质制备液。
制备液真空冻干，所得固体达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质采用高效液相色谱法(检测条件与欧洲专利“PROCESS FOR THE PURIFICATION OF DAPTOMYCIN”(EP 1 586580 A2)公开的方法相同)检测达托霉素RS-5/6杂质纯度97％，RS-7杂质的色谱纯度96％和RS-7a/7b纯度97％。
本发明采用碱破坏方法及制备色谱技术提供一种快速简便、成本低廉的制备高纯度达托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b杂质的工艺技术。碱破坏方法及制备流动相中乙腈和三氟乙酸溶液比例及三氟乙酸浓度更是高纯度达托霉素RS-5/6及RS-7和RS-7a/7b杂质制备的关键工艺控制点。虽然本文已经对该发明进行了详尽的描述，但可以理解，在不违背本发明精神和实质的基础上，本领域技术人员可以做一些修改或变动，这些修改或变动均在本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的制备方法，包括如下步骤：
1)将达托霉素用碱溶液溶解，放置8小时到4天，得到含较高浓度达托霉素RS-5/6、RS-7和RS-7a/7b杂质的溶液；
2)步骤1)所得溶液经过制备色谱柱分离纯化，得色谱纯度>90％的达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质的制备液；
3)分别将步骤2)所得达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质的制备液冻干，得到固体达托霉素RS-5/6杂质、RS-7杂质和RS-7a/7b杂质。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中采用的达托霉素色谱纯度>80％，用碱溶液溶解成30～50mg/mL的溶液。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为无机碱溶液，所述碱选自NaOH、Na2CO3、NaHCO3和NH4HCO3中的一种或多种。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中达托霉素用碱溶液溶解后在4～30℃放置8小时到4天。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)放置温度为4～20℃，时间为8～24小时。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)的制备色谱柱分离纯化中，流动相采用乙腈和三氟乙酸溶液的混合液。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸溶液的浓度为0.01％～0.2％。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述三氟乙酸溶液的浓度为0.01％～0.05％。
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述流动相的乙腈:三氟乙酸溶液的体积比为40:60～60:40，优选为50:50～60:40。
10.如权利要求6～9任一所述的制备方法，其特征在于，步骤2)制备色谱的色谱条件是：
色谱柱：Ib-SitC8/6045-1、250×10.00mm；
波长：214nm；
流动相：乙腈和三氟乙酸溶液的混合液；
流速：5mL/min；
柱温：20～30℃室温。
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