CN103123342A - 克林霉素的杂质分析制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种克林霉素原料的杂质分析制备方法，该方法用于对克林霉素原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤：a)用LC-MS法测定所述克林霉素原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质；c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的一种或多种杂质。

Description

克林霉素的杂质分析制备方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及克林霉素的杂质分析和制备方法。 

背景技术

盐酸克林霉素(Clindamycin hydrochloride)是盐酸林可霉素7-位羟基被氯原子取代而得的半合成衍生物。抗菌谱与林可霉素相同，抗菌活性较林可霉素强4-8倍，广泛地应用于治疗金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性球菌和各种厌氧菌引起的感染。 

盐酸克林霉素及其注射液在临床应用中出现较多的不良反应。药品在临床使用中产生的不良发应除了与药品本身的药理活性有关外，与药品中存在的杂质也有很大关系。 

任何影响药物纯度的物质均称为杂质，一般而言，杂质是指在生产和储存过程中引进或产生的药物以外的其他化学物质。药品质量标准中的杂质是指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺和原辅料带入的杂质，或经稳定性实验确证的在存储过程中产生的降解产物。药品质量标准中的杂质不包括变更生产工艺或变更原辅料而产生的新的杂质，也不包括渗入或污染的外来物质。药品生产企业变更生产工艺或原辅料，并由此带进新的杂质对原质量标准的修订，均应依法向有关药品监督管理部门申报批准。 

药物的杂质一般与特定的药物有关，源于以下几个方面： 

1.源自于药品生产过程中普遍使用的溶酶、催化剂等； 

2.反应不完全而存在的反应原料，反应初始复合物、合成中间产品、副产品等与合成过程相关的物质； 

3.贮存过程中的氧化、分解、水解产物； 

4.手性化合物中的光学异构体； 

5.药物的多种晶型； 

6.动植物药物提取物中除有效成分生物碱挥发油、有机酸等小分子外，还存在分子量较大的蛋白质、蹂质、淀粉、树脂等杂质； 

7.放射药品中的衰减物质； 

8.生物工程制品中异常表达的蛋白质； 

9.重金属及无机盐。 

药物杂质按化学类别和特性可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按来源可分为：有关物质(包括化学反应的前体、中间体、副产物和降解产物等)、其他杂质和外来杂质等。按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。按毒性，又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不良生物作用的杂质，而毒性杂质为具有强烈不良生物作用的杂质。 

杂质检测是药品质量控制的一个重要环节，药品质量当中的含量测定是指原料药和制剂中主要成分的含量，有关物质是指原料药和制剂当中的有机杂质。通过有关物质检查，弄清有关物质的来源、性质、检测方法及其限量，可以优化合成路线、实验条件等因素，进而避免其产生有关物质或其降到最低限度，从多方面保证和提高药品质量，减少药物的不良反应。 

药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。随着科学技术的进步，分离、分析手段的不断提高，药物杂质的检测方法得到了不断的改进。检测药物杂质的方法很多，能较好的进行分离，鉴定药物的杂质，如高效液相色谱、气相色谱、紫外、红外光谱、薄层色谱分析、毛细管区带电泳、薄层毛细管电泳等，这些分析方法广泛应用于药品含量测定和杂质检测。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。 

开发新原料药和新制剂过程中的杂质研究，应严格按照国家有关新药申报的要求进行研究，也可以参照ICH的文本Q3A(新原料药中的杂质)和Q3B(新制剂中的杂质)进行研究，并对杂质的安全性和降解产物进行安全性评价。其具体要求有如下几点： 

1.对合成、纯化和储存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测； 

2.对于表观含量在0.1％及其以上的杂质以及表观含量在在0.1％以下的具有强烈生物作用的杂质或毒性杂质予以定性或确证其结构； 

3.对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究； 

4.新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度； 

5.除降解产物和毒性杂质外，在原料药中已经控制的杂质，在制剂中一般不再控制； 

6.原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目，但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。 

在仿制药的研制和生产中，如发现杂质的种类与原始开发药品不同或与已有法定杂质不同，必须增加新的杂质项检查项目，应该严格按照上述方法进行研究，申报新的药品质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。 

共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存时的物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体的质量标准中设旋光度检查项目。 

有机挥发性杂质，应根据生产工艺中所用有机溶剂及其残留情况，确定检查项目。可参考中国药典关于有机挥发性杂质的要求，或参考ICH文本Q3C(残留溶剂指导原则)。对残留的毒性溶剂，应规定其检查项目。 

为了保证用药安全，原料药/制剂中的每一个杂质都必须进行安全性评估也就是说必须建立保证安全性的杂质限度，ICH准则要求：药物中杂质的限度为0.1％(对毒性药物限度更低)，高于此水平的所有未知杂质应鉴别出来，而更重要的是，所有高于0.1％的杂质应研究其毒性。ICH在2007年2月7日修订的“新原料药中的杂质”指导原则，根据原料药 的每日最大剂量将原料药分为两类，并分别制定了杂质的报告阈值、鉴定阈值与合理限度。其中的报告阈值是指所有高于此阈值的杂质及含量均应记入每批产品的检验报告中，并反应在申报资料中。而鉴定阈值是指所有高于此阈值的杂质均应对其结构进行确证。合理限度是指只要质量标准中制定的杂质限度不高于此限度，就不需要提供该限度的制定依据，均认为该限度是合理的。 

对于新制剂，ICH在2003年2月5日修订的“新制剂中的杂质”指导原则中也做了明确规定，该指导原则同样根据不同的用药剂量制订了杂质的报告阈值、鉴定阈值和合理限度。 

欧盟药品主管部门要求生产企业：(1)应在稳定性研究中设立未知杂质(0.1％)的限度；(2)应对限度大于或等于0.1％的未知杂质进行结构确定和安全性验证。对于某些抗生素类药物要求更高，例如发酵产品红霉素，该品种已经EP收载，并规定杂质的可忽略限度为0.06％，且任何杂质不得超过3.0％。欧盟药品主管部门要求，任何大于可忽略限度0.06％的未知峰给予结构确定并提出适当的杂质限度建议，当杂质达到该限度即对其进行安全性评价。FDA也尤其关注药物生产中药物的纯度和剂量的安全性，要求药品生产者对杂质进行全面的分析，并尽可能的提供较多的结构信息。通常，超过0.1％的杂质需鉴定出来并且用选择性好的方法进行定量分析，而且对0.01％～0.1％的杂质也表示浓厚的兴趣。 

尽管杂质限度的确定对于药品研发非常重要，但国内药品研发的现实情况并不令人乐观。从近几年的新药申报情况分析，在杂质的研究和限度确定方面存在着较多的问题，主要表现为：部分药品研究单位对杂质研究的重要性了解不深；标准中对杂质的控制不够全面和准确；制订杂质限度时考虑问题不够全面，很少考虑杂质对药品安全性的不良影响；即使在杂质的含量明显超出正常工艺所允许的范围时，也不注意对现在的处方和工艺进行必要的优化，以降低杂质的限度。 

《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》均有克林霉素相关物质项的收载，而《英国药典》和《欧洲药典》的收载更为全面。 

《中国药典》中对克林霉素仅仅对杂质的总量进行了限定，对单一 杂质研究不具体，而欧盟药品主管部门和FDA均要求对克林霉素原料药中表观含量0.1％及其以上的杂质，进行结构鉴定和安全性验证。 

发明内容

本发明目的在于对克林霉素原料药的杂质进行研究，主要在于分离制备杂质的标准品并且鉴定原料药中的杂质结构。根据本发明的方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构鉴定，可以为杂质的毒理学研究和阐明不良反应发生机制提供基础，同时也可以为工艺合成实验条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。 

根据本发明的第一方面，其提供一种克林霉素原料的杂质分析和制备方法，该方法用于对克林霉素原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤： 

a)用LC-MS法测定所述克林霉素原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质； 

b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质； 

c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的一种或多种杂质。 

根据本发明一个优选的实施方式，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为： 

流动相18％乙腈、3％四氢呋喃、79％水和0.2％甲酸； 

pH氨水调至5.43-5.47； 

柱温25℃； 

流速1.0ml/min； 

检测波长210nm； 

色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。 

根据本发明一个优选的实施方式，步骤b)中，所述的正相硅胶柱层析法富集采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和 甲醇混合溶剂。 

根据本发明一个优选的实施方式，步骤b)包括： 

b1)样品∶硅胶＝1∶50，将样品溶于甲醇中，干法上柱； 

b2)使用乙酸乙酯∶甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱顺序如下：(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)1800mL，(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)1680mL，(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇4∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇3∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇2∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇1∶1)600mL，甲醇600mL。 

b3)合并收集(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)、(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)和(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)-甲醇的洗脱液备用。 

根据本发明一个优选的实施方式，步骤c)中，所述的制备色谱法采用二次制备，其中一次制备所采用条件包括： 

流动相为20％乙腈，1.25％四氢呋喃，78.75％水，0.2％甲酸； 

氨水调pH为5.58左右； 

色谱柱μBondapak^TM C18，7.8×300mm，检测波长为210nm，流速为1.0×2.25mL/min； 

收集保留时间为29.525min处的峰相对应的被分析物； 

对所得被分析物进行采用二元泵的二次制备，流动相的条件为：A泵：21％乙腈，3％四氢呋喃，76％水，0.2％甲酸，pH为5.20左右；B泵：乙腈；A∶B＝95∶5；色谱柱Sepax HP-C18，5μm 10.0×250mm，检测波长：210nm，流速：1.5mL/min，柱温：35℃；收集保留时间为25.90min和27.68min处的峰相对应的被分析物，其中25.90min处即得杂质1，27.68min处即得杂质2。 

根据本发明一个优选的实施方式，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件包括： 

流动相：18％乙腈，4.5％四氢呋喃，77.5％水，0.2％甲酸； 

氨水调pH值为5.45左右； 

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，9.4×250mm)；检测波长：210nm；流速：1.0×2.25mL/min； 

收集保留时间为41.080处的峰相对应的被分析物，即杂质3。 

根据本发明一个优选的实施方式，对以上所得杂质3进行纯化，条件如下：仪器：HP 1100，配有Waters 2695 Separation Module，Waters 2487DualλAbsorbance Detector Waters；检测波长：210nm；流速：1.5mL/min；柱温：35℃；流动相：25％乙腈，3％四氢呋喃，72％水，0.2％甲酸，氨水调pH为5.19左右。 

根据本发明的第二方面，其提供根据本发明第一方面的方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质1具有如下结构式I： 

所述杂质2具有如下结构式II： 

所述杂质3具有如下结构式III： 

根据本发明的第三方面，其提供本发明第二方面所述的杂质标准品 在分析克林霉素原料中的用途。 

附图说明

结合本申请所提供的附图，将更容易理解本申请的其它特征、目的和优点。这些附图仅用于示范，不对本发明构成任何限制。 

图1为盐酸克林霉素原料药的LC-MS谱图(左图为UV图，右图为TIC图)； 

图2为三批原料药的总离子流图； 

图3为盐酸克林霉素粗品的TIC谱图； 

图4为一次制备所得杂质1和杂质2的LC谱图； 

图5为粗品和一次制备所得杂质1和杂质2的LC-MS谱图，其中A为S090701批粗品，B为杂质1和杂质2混合组分； 

图6为二次制备所得杂质1和杂质2的LC谱图； 

图7杂质1和杂质2的纯度检测的LC谱图(A：粗品；B：杂质1；C：杂质2)； 

图8为一次制备所得杂质3的LC谱图； 

图9为一次制备所得杂质3的LC-MS谱图； 

图10为杂质3进一步纯化的LC谱图； 

图11为纯化后的杂质3纯度检测的LC谱图(A：S090701批粗品；B：杂质3)； 

图12为对金黄色葡萄球菌的抑菌效果(标号1-4分别为盐酸克林霉素、杂质1、杂质2、杂质3)； 

图13为对枯草芽孢杆菌的抑菌效果(标号1-4分别为盐酸克林霉素、杂质1、杂质2、杂质3)； 

图14为对白色念珠菌的抑菌效果(标号1-4分别为盐酸克林霉素、杂质1、杂质2、杂质3)。 

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但其不限制本发明。 

本实施方式使用的克林霉素原料均采用浙江天台药业有限公司提供的各批原料药。 

实施例1 

LC-MS测定克林霉素原料药及粗品

液质联用仪：HPLC Waters 2486，MS Waters micromass ZQ 4000。色谱柱：Diamonsil C18(5μ250×4.6mm)；流动相为乙腈-四氢呋喃-水-甲酸(18％∶3％∶79％∶0.2％)，氨水调pH值为5.45；柱温为室温；检测波长210nm；流速1.0mL/min，经分流进质谱。质谱条件为电喷雾电离源正离子(ESI+)检测方式；源温80℃；锥孔电压35v。 

原料药的LC-MS检测

取批号为090303×7的原料药用流动相溶解成浓度为2mg/mL的溶液，进样量为20μL。LC-MS检测结果如图1所示。 

液质检测出盐酸克林霉素原料药中除克林霉素外的六个有关物质，按保留时间大小分别为有关物质1(3.95min)，有关物质2(4.20min)，有关物质3(12.39min)，有关物质4(21.89min)，有关物质5(23.25min)，克林霉素(28.24min，主成分)，有关物质6(32.62min)。 

表1、盐酸克林霉素原料药的LC-MS分析 

为了考察不同批次原料药中有关物质的情况，分别取081002×5批、060901×5批和060902×5批原料药，用流动相溶解成浓度为2mg/mL的 溶液，进样量为20μL。进行LC-MS检测，结果如图2所示。 

表2、三批原料药的LC-MS分析结果 

由表2可知，三批原料药中检测到的有关物质与090303×7批原料药相同，各有关物质TIC图积分的含量与090303×7批原料药TIC图积分的含量相近。 

根据ICH规定，需要对含量大于千分之一的杂质进行结构描述。液质检测到原料药中除了有关物质2外其他五个有关物质的含量均超过千分之一，需要对这五个有关物质进行结构鉴定。参考英国药典^[24]，有三个有关物质的结构已知，通过对比分子量确定：有关物质1为林可霉素，有关物质3为克林霉素B。本发明重点研究有关物质4，5，6。命名有关物质4为杂质1，有关物质5为杂质2，有关物质6为杂质3。 

粗品的LC-MS检测

由于原料药中除主成分外的其他各有关物质含量很少，不容易对目标杂质进行富集，因此对目标杂质进行研究时采用的样品为盐酸克林霉素粗品(批号：S090701)。同原料药的检测方法，对粗品进行LC-MS检测的结果如图3所示。 

表3盐酸克林霉素粗品的LC-MS分析 

粗品中除了原料药里检测出的六个有关物质外，另外还有有关物质7和有关物质8，研究中要注意这两个有关物质是否会对目标杂质的富集造成影响。其中两个目标杂质的含量稍有提高：杂质1含量增至7.27％，杂质2含量增至1.26％。杂质3的含量仍然较低。 

正相硅胶柱层析富集目标杂质

为了对目标杂质进行初步富集，根据克林霉素的结构特点，选用正相硅胶柱层析进行研究。 

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。 

用不同比例的乙酸乙酯和甲醇作为洗脱液选择能达到最佳分离富集的效果的比例。 

层析柱：5×100cm； 

预处理：由于盐酸克林霉素结构中含有多个羟基，性质比较活泼。因此硅胶在使用之前应先使其活性点失活，具体做法为：称取100g100～200目粗硅胶，工业级甲醇浸泡过夜，布氏漏斗将甲醇抽干后置于70℃水浴使硅胶中的残余甲醇挥干，后装柱。 

上样：称取1g盐酸克林霉素粗品(批号：S090701)，甲醇溶解，滴加入装有1g硅胶的坩埚中，置于60℃水浴上拌样，干法上柱。 

正相柱层析条件为：样品∶硅胶＝1∶50，洗脱顺序如下：(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)1800mL，(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)1680mL，(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇4∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇3∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇2∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇1∶1)600mL，甲醇600mL。其中能富集杂质3的为乙酸乙酯∶甲醇9∶1部位，能富集 杂质2的为乙酸乙酯∶甲醇6∶1部位，能富集杂质1的为(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)～甲醇的洗脱部位。 

HPLC法分离制备目标杂质

经过正相柱层析将三个目标杂质进行初步富集后，利用制备色谱法将目标杂质进一步分离纯化，得到纯度较高的目标杂质以便进行结构鉴定。 

杂质1和杂质2的分离制备

杂质1和杂质2均为主要成分克林霉素的同分异构体，两者的分离条件要求比较苛刻。由于受进样量的影响，通过一次制备就得到杂质1和杂质2的纯品耗时较长，成本较高，因此采用二次制备的方法，先通过第一次制备制得大量的杂质1和杂质2的混合物，再通过第二次制备将两者完全分离。实验证明二次制备的方法可行，且制备得到的杂质1和杂质2纯度均达到结构鉴定的标准。 

第一次制备条件

仪器：Waters 510型半制备液相，Waters 484检测器，色谱柱用μBondapakTM C18(7.8×300mm)，检测波长为210nm，流速为1.0×2.25mL/min。 

流动相条件为20％乙腈，1.25％四氢呋喃，78.75％水，0.2％甲酸，氨水调pH值为5.58左右。如图4所示，收集29.525min处的峰即得杂质1和杂质2的混合组分。 

经过一段时间的制备，将得到的杂质1和杂质2的混合组分进行LC-MS检测，如图5所示。与粗品的LC对比，保留时间为19.62min处为杂质1，保留时间为20.87min处为杂质2，保留时间为25.53min处为克林霉素。三个组分含量分别为：杂质1：68.67％，杂质2：16.39％，克林霉素：14.94％。 

第二次制备条件

仪器：HP 1100，配有Waters 2695 Separation Module，Waters 2487DualλAbsorbance Detector Waters。色谱柱：Sepax HP-C18(5μm 10.0×250mm)。 

杂质1和杂质2第二次制备采用二元泵，流动相的条件确定为：A 泵：21％乙腈，3％四氢呋喃，76％水，0.2％甲酸，pH为5.20左右；B泵：乙腈；A∶B＝95∶5。检测波长：210nm，流速：1.5mL/min，柱温：35℃。制备液相图如图6所示，制备样品为第一次制备所得的杂质1和杂质2混合物。收集图中25.90min处即得杂质1，收集27.68min处即得杂质2。 

二次制备得到的杂质1及杂质2纯度检测

按照3.1.2.2的条件进行第二次制备后，分别得到杂质1和杂质2。两组份分别置于50℃水浴中减压旋蒸将流动相蒸出，均得到白色固体(含甲酸铵)。甲醇溶解后，进行LC-MS检测，结果如图7所示。经过与粗品对照及质谱鉴定，3-14B图中保留时间为18.78min的峰确认为杂质1，含量为95.00％；3-14C图中保留时间为21.27min的峰确认为杂质2，含量为94.61％。 

杂质3的分离制备

杂质3在液相色谱图中位于主要成分克林霉素峰之后。由于克林霉素在色谱柱中吸附能力较强，即使在液相图中显示杂质3与主要成分基线分离，第一次制备所得的杂质3中仍然混有部分主要成分，但相比粗品的主要成分含量下降很多，因此需要进一步纯化将残留的主要成分去除，从而得到纯度较高的杂质3纯品。 

仪器：Waters 510型半制备液相，Waters 484检测器。色谱柱用AgilentZORBAX SB-C18(5μm，9.4×250mm)，检测波长为210nm，流速为1.0×2.25mL/min。 

流动相：18％乙腈，4.5％四氢呋喃，77.5％水，0.2％甲酸，氨水调pH值为5.45左右。如图8所示，杂质3与主峰基线分离，38.088min为主峰，41.080min为杂质3。 

经过一次制备，得到的杂质3和主峰的混合组分，LC-MS检测结果如图9所示。与粗品的LC对比，保留时间为27.25min处为克林霉素，保留时间为29.95min处为杂质3。各组分含量分别为：克林霉素：57.29％；杂质3：42.71％。 

杂质3的纯化

由于主要成分克林霉素在色谱柱中的吸附能力较强，且杂质3与主峰保留时间相差较小，一次制备所得的杂质3中仍然含有较多的主要成分，因此需要对一次制备的杂质3进行纯化，以便将主要成分完全去除。 

仪器：HP1100，配有Waters 2695 Separation Module，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector Waters；检测波长：210nm，流速：1.5mL/min，柱温：35℃。 

制备杂质3时不需要考虑杂质1和杂质2的分离情况，由于增加乙腈的量使各峰的保留时间提前，因此以杂质1和杂质2二次制备的条件为基础，确定杂质3的纯化条件如下：仪器：HP1100，配有Waters 2695Separation Module，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector Waters；检测波长：210nm；流速：1.5mL/min；柱温：35℃；流动相：25％乙腈，3％四氢呋喃，72％水，0.2％甲酸，氨水调pH为5.19左右。结果如图10所示。 

杂质3的纯度检测

纯化后得到杂质3，置于50℃水浴中减压旋蒸除去流动相后，LC-MS检测结果如图11所示。经过与粗品的对照及质谱鉴定，保留时间为28.17min的峰确认为杂质3，含量达到95.97％。 

实施例2 

目标杂质的结构鉴定

将得到的三个目标杂质的纯品分别用高分辨质谱确定元素组成，再用核磁共振氢谱、碳谱及二维谱DEPT、HMBC、HMQC、COSY和NOESY谱确定三个目标杂质的结构。所用仪器为Micromass Q-TOF质谱仪及美国Varian核磁共振波谱仪(400MHz)。以下结构式为克林霉素的结构，表4为克林霉素核磁共振波谱的数据。 

克林霉素 

表4、克林霉素的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、HMQC谱、COSY谱、NOESY谱归属 

克林霉素结构中共有四个手性中心，其构型分别为6S，7S，1’S，3’R。 

杂质1的结构鉴定

仪器：Micromass Q-TOF质谱仪；美国Varian核磁共振波谱仪(400MHz)； 

高分辨质谱检测杂质1的[M+H]⁺质荷比为425.1879，元素组成确定为C₁₈H₃₃ClN₂O₅S，该杂质为克林霉素的同分异构体。结合核磁共振全套谱鉴定杂质1的结构如下式I所示。 

表5、杂质1的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、HMBC谱、HMQC谱、COSY谱、NOESY谱归属 

盐酸克林霉素和杂质1的碳谱及氢谱图相似，参考盐酸克林霉素的归属，氢谱四个CH₃归属如下：δ_H0.78(3H，t，J＝6.8Hz)归属为H-8’，δ_H1.40(3H，d，J＝6.8Hz)归属为H-8，δ_H2.07(3H，s)归属为H-9，δ_H2.87(3H，s)归属为H-5’，对应HMQC谱图将δ_C15.7归属为C-8’，δ_C20.5归属为C-8，δ_C16.0归属为C-9，δ_C43.6归属为C-5’。 

碳谱及DEPT谱对比可知，δ_C171.9处为季碳，归属为C-10。δ_C为22.9、36.2、38.3和64.1为四个CH₂信号。 

COSY谱中H-8’与δ_H1.27～1.19相关，因此δ_H1.27～1.19处归属为H-7’，HMQC对应δ_C22.9归属为C-7’，DEPT谱确证δ_C22.9为CH₂峰。H-8与δ_H4.47相关，因此δ_H4.47处归属为H-7，HMQC对应δ_C60.5归属为C-7。 

C-1直接与S原子相连，根据化学位移值和耦合规律，低场的δ_H5.27(1H，d，J＝6.0Hz)归属为H-1，δ_C91.2归属为C-1。COSY谱中δ_H4.02(1H，q，J＝6.0，10.4Hz)与H-1相关，归属为H-2。δ_H3.52(1H，dd，J＝3.2，10.4Hz)与H-2相关，归属为H-3。由HMQC谱，δ_C70.3、δ_C73.0分别归属为C-2和C-3。 

HMBC中H-8’分别与δ_C22.9和δ_C36.2相关，且DEPT谱显示为两个CH₂信号峰。δ_C22.9已归属为C-7’，则δ_C36.2归属为C-6’，HMQC对应 δ_H1.37～1.34(2H，m)归属为H-6’。H-8分别与δ_C56.2和δ_C60.5相关，δ_C60.5已归属为C-7，则δ_C56.2归属为C-6，根据HMQC谱δ_H4.60～4.57(1H，m)归属为H-6。COSY谱中H-6与δ_H4.12(1H，d，J＝10.0Hz)相关，归属为H-5，根据HMQC谱，δ_C71.7归属为C-5。 

HMQC谱中δ_C64.1处对应两个H，这两个H在COSY谱中相关，应该为4’位的两个H，因此δ_C64.1归属为C-4’，δ_H3.80～3.77(1H，m)和δ_H2.84～2.79(1H，m)归属为H-4’。对照克林霉素结构，最后一个CH₂的峰δ_C38.3归属为C-2’，根据HMQC谱δ_H2.29～2.24(2H，m)归属为H-2’。COSY谱中H-2’与δ_H4.24(1H，t，J＝8.0Hz)相关，由于C-1’连有羰基，H-1’的化学位移值应大于H-3’，因此δ_H4.24(1H，t，J＝8.0Hz)归属为H-1’，根据HMQC谱δ_C71.2归属为C-1’。 

碳谱中δ_C39.1和δ_C71.0为CH信号峰，对应化学位移还未确定的C-4和C-3’。根据两者化学环境的差异归属δ_C39.1为C-3’，δ_C71.0为C-4。根据HMQC谱δ_H3.80(1H，d，J＝3.2Hz)归属为H-4，δ_H2.29～2.24(1H，m)归属为H-3’。 

对比盐酸克林霉素和杂质1的NOESY谱，杂质1在C-6、C-1’和C-3’的构型与盐酸克林霉素相同，即6S，1’S，3’R。NOESY谱显示，杂质1的H-8与H-5和H-6相关，说明杂质1的H-8与H-5的空间位置比较接近。克林霉素的H-8与H-6和H-7相关，与H-5无相关峰，说明H-8与H-5位置较远。因此杂质1在7位碳原子处发生异构，克林霉素7位碳原子为S构型，杂质1的7位碳原子为R构型。鉴定杂质1为7-表克林霉素，该杂质为药典已收载的有关物质。 

杂质2的结构鉴定

仪器：Micromass Q-TOF质谱仪；美国Varian核磁共振波谱仪(400MHz)； 

高分辨质谱检测杂质2的[M+Na]⁺质荷比为447.1694，元素组成确定为C₁₈H₃₃ClN₂O₅S，该杂质也为克林霉素的同分异构体。结合核磁共振全套谱鉴定杂质2的结构如下式II所示。 

表6、杂质2的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、HMBC谱、HMQC谱、COSY谱、NOESY谱归属 

杂质2也为盐酸克林霉素的同分异构体，因此两者应具有相同的母核结构，只是手性碳的构型不同。碳谱及DEPT谱显示，δ_C171.1为季碳，归属为C-10。氢谱四个CH₃归属如下：δ_H0.66(3H，t，J＝7.2Hz)归属为H-8’，δ_H1.22(3H，d，J＝7.2Hz)归属为H-8，δ_H1.98(3H，s)归属为H-9，δ_H2.24(3H，s)归属为H-5’，对应HMQC谱图将δ_C13.5归属为C-8’，δ_C21.9归属为C-8，δ_C12.9归属为C-9，δ_C40.9归属为C-5’。 

COSY谱显示，H-8’与δ_H1.12～1.04(2H，m)相关，归属为H-7’。H-8与δ_H4.36～4.43(1H，m)相关，归属为H-7。根据HMQC谱，δ_C20.8归属为C-7’，δ_C58.3归属为C-7。 

参考盐酸克林霉素和杂质1，δ_H5.18(1H，d，J＝5.6Hz)归属为H-1，δ_C88.1归属为C-1。COSY谱中H-1与δ_H3.91(1H，dd，J＝5.6，10.2Hz)相关，归属为H-2。H-2与δ_H3.44(1H，dd，J＝3.2，10.2Hz)相关，归属为H-3。H-3与δ_H3.64(1H，d，J＝3.2Hz)相关，归属为H-4。对照HMQC谱，δ_C68.0归属为C-2，δ_C70.6归属为C-3，δ_C68.4归属为C-4。 

HMBC谱显示，H-8’与δ_C20.8和δ_C36.9相关。δ_C20.8已归属为C-7’，且δ_C36.9在DEPT谱上为CH₂信号，因此δ_C36.9归属为C-6’。对照HMQC谱，δ_H1.19～1.14(2H，m)归属为H-6’。H-8与δ_C52.6和δ_C58.3相关，δ_C58.3已归属为C-7，δ_C52.6归属为C-6。对照HMQC谱，δ_H4.21(1H，dd，J＝10.0，1.6Hz)归属为H-6。由耦合常数可将δ_H4.10(1H，d，J＝10.4Hz)归属为H-5，对照HMQC谱，δ_C69.4归属为C-5。 

DEPT谱显示，δ_C37.4和δ_C61.0为CH₂信号峰，由化学结构可归属δ_C37.4为C-2’，δ_C61.0为C-4’。根据HMQC谱，H-2’和H-4’均裂分为 两组峰，δ_H2.33～2.26(1H，m)和1.36～1.29(1H，m)归属为H-2’，δ_H2.77～2.75(1H，m)和2.58～2.53(1H，m)归属为H-4’。HMBC谱中H-2’与δ_C69.6相关，由于C-1’的去屏蔽效应强于C-3’，因此归属δ_C69.6为C-1’。最后δ_C36.3归属为C-3’。 

NOESY谱显示，克林霉素的H-1’与H-5’相关，而杂质2的H-1’与H-5’无相关峰，说明克林霉素中H-1’与H-5’位置较近，杂质2中H-1’与H-5’位置较远。因此推断杂质2与克林霉素差别主要在1’位的碳原子构型不同，克林霉素1’位碳原子为S构型，杂质2的1’位碳原子为R构型。 

杂质3的结构鉴定

仪器：Micromass Q-TOF质谱仪；美国Varian核磁共振波谱仪(400MHz)； 

高分辨质谱检测杂质3的[M+Na]⁺质荷比为445.1537，元素组成确定为C₁₈H₃₁ClN₂O₅S，该杂质分子量比克林霉素少2，为克林霉素的去氢物。结合核磁共振全套谱鉴定杂质3的结构如下式III所示。 

表7、杂质3的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、HMQC谱、HMBC谱、COSY谱、NOESY谱归属 

氢谱四个CH₃归属如下：δ_H0.94(3H，t，J＝7.2Hz)归属为H-8’，δ_H1.45(3H，d，J＝6.8Hz)归属为H-8，δ_H2.19(3H，s)归属为H-9，δ_H2.49(3H，s)归属为H-5’，对应HMQC得到δ_C15.7归属为C-8’，δ_C24.6归属为C-8，δ_C15.5归属为C-9，δ_C42.8归属为C-5’。 

碳谱出现18个碳的信号，分别对应杂质3的18个碳。其中化学位移为174.0ppm，DEPT谱中不出峰，应为季碳，由母核结构式可将δ_C174.0归属为C-10。¹HNMR中未发现类似克林霉素中3’位氢原子的信号，且在低场δ_H5.48ppm处增加了一个烯氢质子，推测结构中存在一个双键。碳谱δ_C135.1和δ_C128.2进一步表明双键的存在。HMBC谱表明H-7’与C-3’，C-6’，C-8’远程相关，说明杂质3在3’碳原子和6’碳原子处有双键。 

HMBC谱中H-8与C-6，C-7远程相关，对应δ_C55.3和δ_C61.0，COSY 谱显示H-8与H-7相关，可知δ_H4.67～4.59归属为H-7，由HMQC推断δ_C61.0为C-7，δ_C55.3为C-6，δ_H4.45为H-6。因为δ_H4.32与δ_H4.42耦合，因此δ_H4.32归属为H-5，δ_C72.0归属为C-5。 

DEPT谱可以确证δ_C35.8和δ_C62.9为亚甲基碳，HMQC显示分别对应两个氢。因为C-4’与N相连，C-4’位上的两个氢化学不等价，COSY谱中表现出相互的耦合裂分。C-2’上的两个H由于化学键翻转受限制，化学位移值也不相同。化学位移值表明δ_C62.9归属为C-4’，δ_C35.8归属为C-2’。C-2’对应氢位于δ_H3.02～2.96ppm和δ_H～2.57ppm，C-4’对应氢位于δ_H3.77～3.74ppm和δ_H3.26～3.23ppm。 

COSY中H-1与H-2相关，因此δ_H4.13处归属为H-2，对应HMQC中δ_C70.6为C-2。COSY中H-2与H-3相关，因此δ_H4.13处归属为H-3，对应HMQC中δ_C70.6为C-3。COSY中δ_H3.87与H-2相关，因此δ_H3.87归属为H-4，COSY中δ_H3.51与H-2’和H-5’相关，因此δ_H3.506归属为H-1’。 

因此，三个目标杂质都具有与克林霉素相同的母核结构，其中杂质1和杂质2分子量与克林霉素相同，均为克林霉素的同分异构体，杂质3为克林霉素的去氢物。 

克林霉素结构中有四个手性碳，分别为C-6，C-7，C-1’和C-3’，构型分别为6S，7S，1’S，3’R。杂质1与克林霉素的¹HNMR和¹³CNMR数据相似，两者的区别在于7位构型有差异，杂质1四个手性碳的构型分别为6S，7R，1’S，3’R，鉴定为7-表克林霉素。杂质2也与克林霉素的¹HNMR和¹³CNMR数据相似，与克林霉素结构的差异在1’位，杂质2的四个手性碳构型分别为6S，7S，1’R，3’S。杂质3分子量比克林霉素小2，由NMR数据推断为克林霉素在H-3’和H-6’处发生消除反应所得。由于C-3’为sp2杂化的不饱和碳原子，C-2’，C-3’和C-4’为一平面结构，C-2’和C-4’上相连的两个C-H化学键翻转受到限制，导致C-2’和C-4’上的两个H化学位移值不同。 

杂质1为《英国药典》和《欧洲药典》在可能的杂质的收载项中收载的杂质7-表克林霉素，杂质2和杂质3均未有药典及文献收载。 

实施例3 

盐酸克林霉素及本发明杂质1、2和3的抑菌实验

用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。本实验考察了盐酸克林霉素原料药中表观含量超过0.1％的三个相关物质的抑菌活性，将制备得到的三个相关物质的纯品同盐酸克林霉素原料药进行抑菌活性对照。 

供试溶液的配制

盐酸克林霉素(090303×7批，浙江天台药业有限公司)：1.091mg，1mL水溶解； 

杂质1(即7-表克林霉素)：1.049mg，0.5mL水溶解； 

杂质2：1.200mg，0.5mL水溶解； 

杂质3：1.139mg，0.4mL水溶解。 

实验菌株

金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、枯草芽孢杆菌(细菌)、白色念珠菌(真菌)；由上海医药工业研究院生物部提供。 

培养基的配制

白色念珠菌培养基(％) 

葡萄糖      0.1        酵母膏        0.25 

KCl         0.18       NaAc          0.82 

还脂        1.5        pH            7.0 

121℃灭菌30min 

金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌(％) 

蛋白胨      0.6        牛肉膏        0.15 

酵母膏      0.6        葡萄糖        0.1 

琼脂        1.5        pH            6.5 

121℃灭菌30min 

滤纸片的制备 

选择吸水性强的优质滤纸，用打孔器打成直径为6mm的圆形滤纸片，经干热灭菌后备用。 

实验方法 

琼脂扩散纸片法^[30]：吸取0.1mL菌液，均匀涂布与M-H琼脂表面皿上。分别将10μL的盐酸克林霉素及三个杂质的溶液均匀加到灭菌的纸片上，待干燥后用无菌镊子分别夹取纸片等距离放置于含菌的表面皿上。将表面皿盖上，平置于37℃温箱中培养24h后取出。观察抑菌效果。 

实验结果 

盐酸克林霉素及三个杂质对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有抑菌效果。对金黄色葡萄球菌的抑菌效果如图12所示，杂质1和杂质3抑菌圈大小与盐酸克林霉素相似，杂质2的抑菌圈小于另外三者。因此杂质2的抑菌效果较盐酸克林霉素差。对于枯草芽孢杆菌的抑菌效果如图13所示，四者的抑菌圈均较大，说明盐酸克林霉素及三个杂质对枯草芽孢杆菌有好的抑制作用。图14显示盐酸克林霉素及三个杂质的滤纸片周围没有出现抑菌圈，说明均对白色念珠球菌没有抗菌活性。 

Claims (11)

1.克林霉素原料的杂质分析制备方法，该方法用于对克林霉素原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤：

a)用LC-MS法测定所述克林霉素原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；

b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质；

c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的一种或多种杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：

流动相18％乙腈、3％四氢呋喃、79％水和0.2％甲酸；

pH氨水调至5.43-5.47；

柱温25℃；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的正相硅胶柱层析法富集采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和甲醇混合溶剂。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：

b 1)样品∶硅胶＝1∶50，将样品溶于甲醇中，干法上柱；

b2)使用乙酸乙酯∶甲醇混合溶剂梯度洗脱，洗脱顺序如下：(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)1800mL，(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)1680mL，(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇4∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇3∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇2∶1)600mL，(乙酸乙酯∶甲醇1∶1)600mL，甲醇600mL；

b3)合并收集(乙酸乙酯∶甲醇9∶1)、(乙酸乙酯∶甲醇6∶1)和(乙酸乙酯∶甲醇5∶1)-甲醇的洗脱液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法采用二次制备，其中一次制备所采用条件包括：

流动相为20％乙腈，1.25％四氢呋喃，78.75％水，0.2％甲酸；

氨水调pH为5.58左右；

色谱柱μBondapak^TM C18，7.8×300mm，检测波长为210nm，流速为1.0×2.25mL/min；

收集保留时间为29.525min处的峰相对应的被分析物；

对所得被分析物进行采用二元泵的二次制备，流动相的条件为：A泵：21％乙腈，3％四氢呋喃，76％水，0.2％甲酸，pH为5.20左右；B泵：乙腈；A∶B＝95∶5；色谱柱Sepax HP-C18，5μm 10.0×250mm，检测波长：210nm，流速：1.5mL/min，柱温：35℃；收集保留时间为25.90min和27.68min处的峰相对应的被分析物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件包括：

流动相：18％乙腈，4.5％四氢呋喃，77.5％水，0.2％甲酸；

氨水调pH值为5.45左右；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5μm，9.4×250mm)；检测波长：210nm；流速：1.0×2.25mL/min；

收集保留时间为41.080处的峰相对应的被分析物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所得被分析物进行纯化，条件如下：仪器：HP 1100，配有Waters 2695 Separation Module，Waters 2487 DualλAbsorbance Detector Waters；检测波长：210nm；流速：1.5mL/min；柱温：35℃；流动相：25％乙腈，3％四氢呋喃，72％水，0.2％甲酸，氨水调pH为5.19左右。

8.根据权利要求1-5中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式I：

9.根据权利要求1-5中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式II：

10.根据权利要求1-4、6-7中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式III：

11.根据权利要求8-10任一项所述的杂质标准品在分析克林霉素原料中的用途。

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