CN104829660B

CN104829660B - 一种克林霉素磷酸酯的同分异构体

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Publication number: CN104829660B
Application number: CN201510277016.1A
Authority: CN
Inventors: 李雪; 李睿; 郭钱浩; 陈佳江
Original assignee: CHONGQING YAOYOU PHARMACEUTICAL Co Ltd; Chongqing Carelife Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: CHONGQING YAOYOU PHARMACEUTICAL Co Ltd; Chongqing Carelife Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2015-05-27
Publication date: 2018-04-10
Anticipated expiration: 2035-05-27
Also published as: CN104829660A

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体地说提供了一种新的克林霉素磷酸酯的同分异构体，即克林霉素磷酸酯杂质M及其制备方法，以及其在克林霉素磷酸酯有关物质检测中用作杂质对照品的用途。该杂质的获得，可以准确有效地检测该杂质在克林霉素磷酸酯原料中的含量、更严格的控制克林霉素磷酸酯的质量，从而进一步提高克林霉素磷酸酯临床使用的安全性。

Description

一种克林霉素磷酸酯的同分异构体

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及克林霉素磷酸酯同分异构体，即克林霉素磷酸酯杂质M及其制备方法，以及其在克林霉素磷酸酯有关物质测定中作为杂质对照品方面的应用。

背景技术

克林霉素磷酸酯作为一种广谱性抗生素，结构式如下：

克林霉素磷酸酯为林可霉素的半合成衍生物，属于林可酰胺类抗生素，在临床上应用极为广泛。作为克林霉素的前药，它在体外不具有抗菌活性，进入人体后迅速水解为克林霉素，水解后大部分被吸收，几乎很少从尿中排出。有良好的脂溶性和渗透性，骨骼中药物浓度高，生物利用度高于盐酸克林霉素。克林霉素磷酸酯通过抑制细菌细胞壁蛋白质的合成而达到抑菌的作用，对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血性链球菌、草绿色链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌等革兰氏阳性菌以及消化球菌、消化链球菌、脆弱类杆菌、梭杆菌属、真杆菌、丙酸杆菌等厌氧菌有抗菌作用。临床上主要用于由敏感菌所致的呼吸道感染、泌尿道感染、骨及关节感染、盆腔感染、腹腔感染、皮肤软组织感染等。

克林霉素磷酸酯的水溶性好，可口服，也可肌肉注射或静脉滴注给药，抗菌作用比林可霉素强4～8倍，吸收好，骨组织浓度高。克林霉素磷酸酯以高效、广谱、低毒的抗菌特性，副作用少而被国内外广泛应用于临床。

克林霉素磷酸酯有4个(6、7、12和14位）手性中心，可能的同分异构体较多；其还有2个羟基可被酯化，或者分子内或分子间缩合；而且其为林可霉素的半合成衍生物，发酵提取也可能带来其他的杂质。

药品中的杂质按化学类别和性质一般分为三类：有机杂质、无机杂质及残留溶剂。有机杂质包括工艺中引入的杂质(如反应起始物料、合成中间体、副产物等）和降解产物(如氧化、分解、水解等），可能是已知的或未知的、挥发性的或不挥发性的，这类杂质的化学结构与活性成分的分子式类似或具渊源关系，故通常又可称为有关物质。

药物不良反应除了与药品本身的药理活性有关外，有时与药品中存在的杂质也有很大关系，因此杂质检测是药品质量控制的一个重要环节。通过对杂质进行规范地的研究，弄清有关物质的来源、性质、检测方法及其限量，进而通过优化合成工艺路线，将杂质控制在一个安全、合理的限度范围之内，避免其产生或降至可接受的限度，从多方面保证和提高药品质量，减少药物由于杂质引起的不良反应。

目前《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》均有克林霉素磷酸酯有关物质的收载，其中欧洲药典EP8.3收载最为全面，包含杂质A~L共计12个杂质，如下所示。

欧盟药品主管部门和FDA均要求对克林霉素磷酸酯原料药中含量在0.1%及其以上的杂质进行结构鉴定；对含量在0.15%及其以上的杂质进行安全性验证。

采用已知杂质对照品法能对杂质进行定位并能准确测定其含量。因此，尽可能地获得克林霉素磷酸酯的杂质，将其作为对照，能够准确有效地检测该杂质在克林霉素磷酸酯原料中的含量，为毒理学研究和不良反应发生机制研究提供基础，为合成工艺条件的选择提供参考，对克林霉素磷酸酯原料及制剂的质量控制、提高药品的安全性具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的克林霉素磷酸酯同分异构体，即克林霉素磷酸酯杂质M，其结构式如下：

其次，本发明提供了克林霉素磷酸酯杂质M的制备方法。

最后，本发明还提供了克林霉素磷酸酯杂质M在克林霉素磷酸酯有关物质检测中用作杂质对照品的用途。

本发明人在进行克林霉素磷酸酯杂质研究过程中，意外地发现了一个含量约为0.10%的新杂质M，在《欧洲药典》8.3版克林霉素磷酸酯个论有关物质控制项下所列色谱条件中，色谱峰的相对保留时间约为0.72。该杂质在《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》等现有药典中均未收载。为了更好地控制克林霉素磷酸酯的质量，得到该杂质的对照品，本发明人制备了克林霉素磷酸酯杂质M，并进行了结构确证，证明克林霉素磷酸酯杂质M为一个未见文献报道的新化合物，是克林霉素磷酸酯同分异构体。

本发明人先用LC-MS分析所述克林霉素磷酸酯样品，以确定目标化合物的保留时间。LC-MS法所采用HPLC 条件如下：

流动相：10mM乙酸铵(乙酸调节pH值为6.0）水溶液：乙腈80:20

柱温：30℃

流速：1ml/min

检测波长：210nm

色谱柱：C18， 4.6mm×150mm，5μm

按照LC-MS条件进行分析，结果发现，保留时间为13min的峰为目标化合物，其[M-H]^-为503，[M+H]⁺为505，故分子量为504，确定其为克林霉素磷酸酯的同分异构体，命名为克林霉素磷酸酯杂质M。

根据LC-MS中所述的克林霉素磷酸酯杂质M的保留时间，确定制备色谱法的条件，用制备色谱制备该杂质的方法如下：

1) 取克林霉素磷酸酯样品，加水溶解，以C18为固定相(21.2mm×250mm，7μm），10mM乙酸铵水溶液(乙酸调节pH值为6.0）-乙腈(体积比80:20）为流动相，进行第一次制备纯化，接收RT16-20min洗脱液，得到含有克林霉素磷酸酯杂质M的洗脱液。

2) 将步骤1)所得洗脱液水浴浓缩后，以C18为固定相(9.4mm×250mm，5μm），10mM乙酸铵水溶液(乙酸调节pH值为6.0）-乙腈(体积比80:20）为流动相，进行第二次制备纯化，接收RT16~18min的洗脱液。

3) 将步骤2)所得洗脱液水浴浓缩后，用固相萃取小柱 (填料C18，载样量500mg)，进行第三次制备纯化，即得到克林霉素磷酸酯杂质M。

基于以上的制备思路，本领域的技术人员也可采用其他制备条件或者根据该物质结构的特点，设计合成路线得到克林霉素磷酸酯杂质M。

本发明所述的克林霉素磷酸酯杂质M，其物理常数和光谱数据如下：

克林霉素磷酸酯杂质M：白色油状液体，易溶于水、DMSO；ESI-MS：m/z 505.3 [M+H]⁺， (calcd for 505.2）；¹H- NMR(D₂O）、¹³C-NMR(D₂O）、HSQC(D₂O）见图1~3，核磁信号及归属见表1。

表1 克林霉素磷酸酯杂质M核磁数据

其二维核磁信号关系如下：

综合解析可知，H-12与H-19相关，与克林霉素一致，故C-12构型为S构型；另外H-12和H-14相关，则两个H均位于五元环同侧，故C-14为S构型，这与目前收载的所有杂质中五元环上的两个H均在五元环的异侧有显著区别，是一个全新的克林霉素磷酸酯杂质。

制得克林霉素磷酸酯杂质M后，在进行克林霉素磷酸酯有关物质检测时，将克林霉素磷酸酯杂质M作为杂质对照品，采用HPLC法测定克林霉素磷酸酯中克林霉素磷酸酯杂质M的含量。

测定方法如下：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D）测定。

色谱条件：以C18硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm×150mm，5μm）；检测波长：210nm；

柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.1ml/min。

流动相A：13.6g/L磷酸二氢钾(450g/L氢氧化钾调节pH值为6.0）:乙腈 79:21；流动相B：13.6g/L磷酸二氢钾(450g/L氢氧化钾调节pH值为6.0）:乙腈 40:60。按照以下梯度进行洗脱：

Time(min）	A(%）	B(%）
			0	100	0
13	100	0
			18	50	50
39	50	50

溶液配制方法：取本品适量，加流动相A制成每1ml中约含克林霉素磷酸酯3mg的溶液，作为供试品溶液。另取精密称取克林霉素磷酸酯杂质M适量，用流动相A制成每1ml中约含克林霉素磷酸酯杂质M 3μg的溶液，作为对照品溶液。照上述色谱条件，分别取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算克林霉素磷酸酯杂质M的含量。

克林霉素磷酸酯杂质M的测定可参照以上方法，本领域的技术人员也可根据具体情况，对色谱条件等进行调整。

本发明首次分离且通过制备得到了一种新的克林霉素磷酸酯的同分异构体，由此可以准确有效地检测该杂质在克林霉素磷酸酯原料中的含量。因此该杂质的获得对更严格的控制克林霉素磷酸酯的质量，进一步提高克林霉素磷酸酯临床使用的安全性具有重大意义。

附图说明

图1 克林霉素磷酸酯杂质M的¹H-NMR图

图2 克林霉素磷酸酯杂质M的¹³C-NMR图

图3 克林霉素磷酸酯杂质M的HSQC图

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更加全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1 LC-MS法测定克林霉素磷酸酯样品

流动相：10mM乙酸铵(乙酸调节pH值为6.0）水溶液:乙腈80:20

柱温：30℃

流速：1ml/min

检测波长：210nm

色谱柱：C18， 4.6mm×150mm，5μm

取克林霉素磷酸酯样品50mg，置50ml量瓶，加流动相溶解并稀释至刻度，按照LC-MS条件进行分析，保留时间为13min的杂质[M-H]^-为503，[M+H]⁺为505，故分子量为504，确定其为克林霉素磷酸酯的同分异构体，命名为克林霉素磷酸酯杂质M。

实施例2 克林霉素磷酸酯杂质M的制备方法

取克林霉素磷酸酯样品10g，加去离子水100ml溶解，制成每1ml约含100mg的溶液，以C18为固定相(21.2mm×250mm，7μm），10mM乙酸铵水溶液(乙酸调节pH值为6.0）-乙腈(体积比80:20）为流动相，进行第一次制备纯化，接收RT16-20min洗脱液，得到含有克林霉素磷酸酯杂质M的混合物洗脱液。将混合洗脱液在60℃水浴旋干，加水1ml溶解，以C18为固定相(9.4mm×250mm，5μm），10mM乙酸铵水溶液(乙酸调节pH值为6.0）-乙腈(体积比80:20）为流动相，进行第二次制备纯化，接收RT16~18min洗脱液，得到克林霉素磷酸酯杂质M洗脱液。将洗脱液在60℃水浴旋干，加水2ml溶解，用固相萃取小柱 (填料C18，载样量500mg)，进行第三次制备纯化，氮气吹干溶剂后，得到克林霉素磷酸酯杂质M 10mg，HPLC纯度为98.2%。

相关的结构解析见发明内容部分。

实施例3 测定克林霉素磷酸酯样品中杂质M含量

测定方法：

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录Ⅴ D）测定。

色谱条件：以C18硅胶为填充剂的色谱柱(4.6mm×150mm，5μm）；检测波长：210nm；柱温：30℃；进样量：20μL；流速：1.1ml/min。

Time(min）	A(%）	B(%）
			0	100	0
13	100	0
			18	50	50
39	50	50

溶液配制方法：取克林霉素磷酸酯样品约30mg，置10ml量瓶，加流动相A制成每1ml中约含克林霉素磷酸酯3mg的溶液，作为供试品溶液。另取精密称取克林霉素磷酸酯杂质M适量，用流动相A制成每1ml中约含克林霉素磷酸酯杂质M 3μg的溶液，作为对照品溶液。按照上述色谱条件，分别取供试品溶液和对照品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算克林霉素磷酸酯杂质M的含量，测得结果如下。

以上结果表明，克林霉素磷酸酯杂质M作为外标，可以准确检测克林霉素磷酸酯中该杂质的含量。

Claims

1.一种克林霉素磷酸酯杂质M，结构式如下：

2.权利要求1所述克林霉素磷酸酯杂质M的制备方法，包括以下步骤：

1)取克林霉素磷酸酯原料，加水溶解；以C18为固定相，乙酸铵水溶液-乙腈为流动相，进行第一次制备纯化，接收保留时间为16-20min的洗脱液；

2)将步骤1)所得洗脱液浓缩后，以C18为固定相，乙酸铵水溶液-乙腈为流动相，进行第二次制备纯化，接收保留时间为16～18min的洗脱液；

3)将步骤2)所得洗脱液浓缩后，以载样量为500mg的C18固相萃取小柱为固定相，进行第三次制备纯化，即得到克林霉素磷酸酯杂质M；

其中，乙酸铵水溶液浓度为10mM，以乙酸调节pH值为6.0；流动相中乙酸铵水溶液-乙腈体积比为80:20。

3.权利要求1所述克林霉素磷酸酯杂质M在HPLC法测定克林霉素磷酸酯有关物质时用作杂质对照品的用途。