CN102062758A - 克林霉素磷酸酯的杂质分析制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种克林霉素磷酸酯的杂质分析制备方法，该方法用于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；根据所述杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质。

Description

克林霉素磷酸酯的杂质分析制备方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及克林霉素磷酸酯的杂质分析和制备方法.

背景技术

克林霉素磷酸酯在体外无抗菌活性，进入体内后在磷酸酯酶的作用下迅速水解为克林霉素，在体内转化成具有强抗菌活性的N-去甲基克林霉素，主要作用于细菌核糖体的50S亚基，从而阻止肽链的延长而干扰细菌DNA和细菌蛋白的合成，尚可清除细菌表面的A蛋白和绒毛状外衣，使细菌容易被吞噬和杀灭。克林霉素磷酸酯主要对革兰氏阳性球菌及厌氧菌有很强的抗菌活性，其作用及用途与克林霉素盐酸盐相似，但吸收迅速，作用持久，血药浓度较盐酸盐高两倍，是一个兼有抗厌氧菌与需氧菌作用的广谱抗生素。目前市场上已有水针剂、输液剂、注射剂、无菌分装粉针剂、冻干粉针剂等，临床应用以注射剂为主。

任何影响药物纯度的物质均称为杂质，一般而言，杂质是指在生产和储存过程中引进或产生的药物以外的其他化学物质。药品质量标准中的杂质是指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺和原辅料带入的杂质，或经稳定性实验确证的在存储过程中产生的降解产物。药品质量标准中的杂质不包括变更生产工艺或变更原辅料而产生的新的杂质，也不包括渗入或污染的外来物质。药品生产企业变更生产工艺或原辅料，并由此带进新的杂质对原质量标准的修订，均应依法向有关药品监督管理部门申报批准。

药物的杂质一般与特定的药物有关，源于以下几个方面：

1.源自于药品生产过程中普遍使用的溶酶、催化剂等；

2.反应不完全而存在的反应原料，反应初始复合物、合成中间产品、副产品等与合成过程相关的物质；

3.贮存过程中的氧化、分解、水解产物；

4.手性化合物中的光学异构体；

5.药物的多种晶型；

6.动植物药物提取物中除有效成分生物碱挥发油、有机酸等小分子外，还存在分子量较大的蛋白质、蹂质、淀粉、树脂等杂质；

7.放射药品中的衰减物质；

8.生物工程制品中异常表达的蛋白质；

9.重金属及无机盐。

药物杂质按化学类别和特性可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按来源可分为：有关物质(包括化学反应的前体、中间体、副产物和降解产物等)、其他杂质和外来杂质等。按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。按毒性，又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不良生物作用的杂质，而毒性杂质为具有强烈不良生物作用的杂质。

杂质检测是药品质量控制的一个重要环节，药品质量当中的含量测定是指原料药和制剂中主要成分的含量，有关物质是指原料药和制剂当中的有机杂质。通过有关物质检查，弄清有关物质的来源、性质、检测方法及其限量，可以优化合成路线、实验条件等因素，进而避免其产生有关物质或其降到最低限度，从多方面保证和提高药品质量，减少药物的不良反应。

药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。随着科学技术的进步，分离、分析手段的不断提高，药物杂质的检测方法得到了不断的改进。检测药物杂质的方法很多，能较好的进行分离，鉴定药物的杂质，如高效液相色谱、气相色谱、紫外、红外光谱、薄层色谱分析、毛细管区带电泳、薄层毛细管电泳等，这些分析方法广泛应用于药品含量测定和杂质检测。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。

开发新原料药和新制剂过程中的杂质研究，应严格按照国家有关新药申报的要求进行研究，也可以参照ICH的文本Q3A(新原料药中的杂质)和Q3B(新制剂中的杂质)进行研究，并对杂质的安全性和降解产物进行安全性评价。其具体要求有如下几点：

1.对合成、纯化和储存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测；

2.对于表观含量在0.1％及其以上的杂质以及表观含量在在0.1％以下的具有强烈生物作用的杂质或毒性杂质予以定性或确证其结构；

3.对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究；

4.新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度；

5.除降解产物和毒性杂质外，在原料药中已经控制的杂质，在制剂中一般不再控制；

6.原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目，但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。

在仿制药的研制和生产中，如发现杂质的种类与原始开发药品不同或与已有法定杂质不同，必须增加新的杂质项检查项目，应该严格按照上述方法进行研究，申报新的药品质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。

共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存时的物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体的质量标准中设旋光度检查项目。

有机挥发性杂质，应根据生产工艺中所用有机溶剂及其残留情况，确定检查项目。可参考中国药典关于有机挥发性杂质的要求，或参考ICH文本Q3C(残留溶剂指导原则)。对残留的毒性溶剂，应规定其检查项目。

为了保证用药安全，原料药/制剂中的每一个杂质都必须进行安全性评估也就是说必须建立保证安全性的杂质限度，ICH准则要求：药物中杂质的限度为0.1％(对毒性药物限度更低)，高于此水平的所有未知杂质应鉴别出来，而更重要的是，所有高于0.1％的杂质应研究其毒性。ICH在2007年2月7日修订的“新原料药中的杂质”指导原则，根据原料药的每日最大剂量将原料药分为两类，并分别制定了杂质的报告阈值、鉴定阈值与合理限度。其中的报告阈值是指所有高于此阈值的杂质及含量均应记入每批产品的检验报告中，并反应在申报资料中。而鉴定阈值是指所有高于此阈值的杂质均应对其结构进行确证。合理限度是指只要质量标准中制定的杂质限度不高于此限度，就不需要提供该限度的制定依据，均认为该限度是合理的。

对于新制剂，ICH在2003年2月5日修订的“新制剂中的杂质”指导原则中也做了明确规定，该指导原则同样根据不同的用药剂量制订了杂质的报告阈值、鉴定阈值和合理限度。

欧盟药品主管部门要求生产企业：(1)应在稳定性研究中设立未知杂质(0.1％)的限度；(2)应对限度大于或等于0.1％的未知杂质进行结构确定和安全性验证。对于某些抗生素类药物要求更高，例如发酵产品红霉素，该品种已经EP收载，并规定杂质的可忽略限度为0.06％，且任何杂质不得超过3.0％。欧盟药品主管部门要求，任何大于可忽略限度0.06％的未知峰给予结构确定并提出适当的杂质限度建议，当杂质达到该限度即对其进行安全性评价。FDA也尤其关注药物生产中药物的纯度和剂量的安全性，要求药品生产者对杂质进行全面的分析，并尽可能的提供较多的结构信息。通常，超过0.1％的杂质需鉴定出来并且用选择性好的方法进行定量分析，而且对0.01％～0.1％的杂质也表示浓厚的兴趣。

尽管杂质限度的确定对于药品研发非常重要，但国内药品研发的现实情况并不令人乐观。从近几年的新药申报情况分析，在杂质的研究和限度确定方面存在着较多的问题，主要表现为：部分药品研究单位对杂质研究的重要性了解不深；标准中对杂质的控制不够全面和准确；制订杂质限度时考虑问题不够全面，很少考虑杂质对药品安全性的不良影响；即使在杂质的含量明显超出正常工艺所允许的范围时，也不注意对现在的处方和工艺进行必要的优化，以降低杂质的限度。

《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》均有克林霉素磷酸酯相关物质项的收载，而《英国药典》和《欧洲药典》的收载更为全面，《英国药典》和《欧洲药典》根据生产工艺和克林霉素磷酸酯的降解途径在“可能的杂质”项收载了林可霉素、克林霉素B2-磷酸酯、克林霉素3-磷酸酯、克林霉素4-磷酸酯和克林霉素五个杂质。

《中国药典》中对克林霉素磷酸酯仅仅对杂质的总量进行了限定，对单一杂质研究不具体，而欧盟药品主管部门和FDA均要求对克林霉素磷酸酯原料药中表观含量0.1％及其以上的杂质，进行结构鉴定和安全性验证。

发明内容

本发明目的在于对克林霉素磷酸酯原料药的杂质进行研究，主要在于分离制备杂质的标准品并且鉴定原料药中的杂质结构。根据本发明的方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构鉴定，可以为杂质的毒理学研究和阐明不良反应发生机制提供基础，同时也可以为工艺合成实验条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。。

根据本发明的第一个方面，其提供了一种克林霉素磷酸酯原料的杂质分析和制备方法，该方法用于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤：

a)用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；

c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述保留时间相对应的一种或多种杂质。

可选地，所述步骤a)和c)之间还包括下列步骤：

b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用反相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质；

优选地，步骤a)中所述的LC-MS法测定所采用的流动相pH值为4.00～5.00；所述的LC-MS法测定所采用的柱温为20℃～40℃；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含15％～25％乙腈；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含0.1％～0.3％氨水。

更优选地，步骤a)中所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：

流动相20％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.90；

柱温25℃；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。

优选地，步骤b)中所述的反相硅胶柱层析法富集采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相为甲醇。

更优选地，步骤b)包括下列步骤：

b1-将样品溶解于去离子水后，湿法上柱；

b2-依次用10％甲醇200ml、20％甲醇200ml、30％甲醇200ml、40％甲醇200ml、50％甲醇200ml、60％甲醇200ml、70％甲醇200ml、80％甲醇200ml、90％甲醇200ml、100％甲醇200ml洗脱；每个浓度梯度分4批接收，每批接收约50ml；

b3-合并收集40％甲醇第4批和50％甲醇第1批的洗脱液备用。

根据本发明的方法，步骤c)中所述的制备色谱法所采用条件包括：流动相15％～25％乙腈，0.1～0.3％氨水；pH甲酸调pH至4.00～5.00；柱温：20℃～40℃；色谱柱Waters μBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱，或者Agela Venusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱。

优选地，步骤c)中所述的制备色谱法所采用条件为：

流动相20％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.00；

流速1.0ml/min；

进样量160μl；

检测波长210nm；

色谱柱Waters μBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱；

收集保留时间为12.848分钟处的峰相对应的被分析物。

优选地，步骤c)中所述的制备色谱法所采用条件为：

流动相22％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.00；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Agela Venusil ODS XBP C18柱，5μm，10mm×250mm柱；

进样量120μl；

收集保留时间为14.9分钟处的峰相对应的被分析物。

根据本发明的第二个方面，其提供了结构式如下式II所示的2，4-克林霉素双磷酸酯：

根据本发明的第三个方面，其提供了如本发明第二个方面所述的2，4-克林霉素双磷酸酯用于制备抗革兰氏阳性菌药物的用途。

优选地，所述革兰氏阳性菌包括抗枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。

根据本发明的第四个方面，其提供了根据本发明第一个方面所提供的方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式I。

根据本发明的第五个方面，其提供了根据本发明第一个方面所提供的方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式II。

根据本发明的第六个方面，其提供了根据本发明第四或第五方面所提供的杂质标准品用于分析克林霉素磷酸酯原料的用途。

附图说明

结合本申请所提供的附图，将更容易理解本申请的其它特征、目的和优点。这些附图仅用于示范，不对本发明构成任何限制。

图1为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的pH值和分离度关系图；

图2为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的柱温和分离度的关系图；

图3为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的乙腈比例和主峰保留时间关系图；

图4为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的氨水比例和主峰保留时间关系图；

图5为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的氨水比例和分离度关系图；

图6所示为柱层析法处理后样品上ODS柱后各梯度洗脱后用制备LC检测的结果；

具体实施方式

为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但其不限制本发明。

本实施方式使用的克林霉素磷酸酯原料均采用浙江天台药业有限公司提供的同名原料药。

LC-MS测定克林霉素磷酸酯原料药

为了研究克林霉素磷酸酯原料药杂质，利用液质联用仪对原料药的主要杂质进行研究，目的是为了确定杂质的分子量和色谱保留行为。

克林霉素磷酸酯分子结构中有酸性基团，也有碱性基团，属于两性的物质。各国药典中HPLC检测均选择离子抑制色谱法(ion suppressionchromatography，ISC)进行分析。由于本实施方式选择的质谱仪为电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子化方式，为了减小离子对抑制剂对测定的影响，也为了保护仪器，本实施方式采用挥发性的氨水、甲酸缓冲盐系统进行检测。由于克林霉素磷酸酯分子中没有共轭结构，而含有N、O、S杂原子，分子中价电子n-σ*跃迁的机率较高，因此分子末端吸收比较强，选择210nm作为检测波长。流动相首先选择20％的乙腈，考察pH值对测定的影响。

流动相pH值的选择

仪器为HP1100，色谱柱Diamonsil ODS C18(5μm，250×4.6mm)柱，检测波长210nm，柱温25℃，流速1.0ml/min，检测波长210nm。称取克林霉素磷酸酯原料药溶解于20％乙腈pH值4.00的缓冲溶液，配置成20mg/ml的溶液，进样量20μl。配置多个pH值的流动相，分别进行测定。

在本实施方式中，考察了流动相pH值为4.00、4.50、4.75、4.90、5.00时HPLC测定原料药的情况，当流动相pH值由4.00升高至5.00，克林霉素磷酸酯由离子状态转换成分子状态的比例增加，组分在固定相中溶解度增加，容量因子增大，主峰的保留时间随着pH值的增高而增大。流动相pH值4.00时，只能测定4个杂质，比其他四个pH的流动相少测定一个杂质，因此，该方法不适合作为测定原料药的条件。按照保留时间由小到大将色谱图中的六个峰依次编为第1峰、第2峰、......第6峰，其中主峰为第5峰，流动相pH值4.00时没有第4峰。

图1为pH值和分离度关系图，从图中可以看出，流动相pH值主要影响第3峰和第4峰、第4峰和主峰的分离度，对第4峰和主峰的分离度的影响最大。流动相pH值4.50时比流动相pH值4.00时，主峰前面出现一个小峰(第4峰，保留时间17.307min)，但是峰形很差，色谱峰对称因子接近0。流动相pH值4.75时，第4峰的保留时间为18.467min，峰对称因子为2.09，和主峰的分离度为1.44。流动相pH值4.90时，第4峰的保留时间为18.942min，峰对称因子为1.264，和主峰的分离度为1.55，峰形和分离度优于流动相pH为4.75时的情况。当流动相pH为5.00时，第4峰的保留时间为19.782min，峰对称因子为0.77，和主峰的分离度为1.97，分离度优于流动相pH为5.00时，但是第3峰(保留时间18.640min)和第4峰的分离度为0.90，分离度太低，而流动相pH值4.90时，两峰的分离度为1.53。因此，综合考虑分离度和峰形两个因素后，选择pH4.90作为原料药测定时流动相pH值。

柱温的选择

仪器同上，流动相选择上述的流动相4即20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.90，流速1.0ml/min，检测波长210nm，样品配置和进样量同上。

图2为柱温和分离度的关系图，本实施方式中选择了20℃、25℃、30℃和40℃四个柱温，考察了原料药在相同的流动相不同的柱温下的色谱保留行为，按照色谱图中保留时间由小到大，将6个峰依次编为第1峰、第2峰......第6峰，主峰为第5峰，柱温40℃时，色谱图中未出现第4峰。柱温升高的过程中，分子热运动加剧，溶质分子和键合相的烃基之间的疏水缔合作用减弱，主峰的保留时间提前，柱压降低。柱温对分离度的影响没有流动相pH值的影响显著，柱温40℃时，色谱图中只出现了四个杂质，比另外三个柱温下少检测出一个杂质，因此，40℃不适宜作为检测原料药的条件。柱温20℃时，第4峰保留时间为19.678min，色谱峰的对称因子为1.841，和主峰的分离度为1.39，峰形和分离度都不及柱温25℃(25℃时第4峰的峰对称因子为1.264，和主峰分离度为1.55)。柱温30℃时第4峰和主峰的分离度为1.62，但是保留时间17.391min的峰和保留时间18.677min的峰的分离度只有1.17。为了保证所有的杂质均能被检测，在保证分离度的前提下，选择25℃作为HPLC检测的条件。

有机相比例的选择

仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量同上，柱温25℃，分别配置15％乙腈、18％乙腈、20％乙腈、25％乙腈的流动相。

图3为乙腈比例和主峰保留时间关系图。乙腈的比例升高的过程中，流动相的极性减小，洗脱能力增大，溶质的k增大，保留时间提前。从图中可以看出，主峰的保留时间随着流动相乙腈比例的提高而提前。四个比例乙腈的流动相均能检测出5个杂质，但是流动相为15％乙腈、18％乙腈时，分析时间太长。流动相为25％乙腈时，峰的分离不够理想，因此也不适宜做为检测的HPLC条件。确定20％乙腈作为流动相的条件比较合适。

缓冲盐比例的选择

仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量同上，柱温25℃。分别配置以下流动相：20％乙腈，0.05％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.2％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.3％氨水，甲酸调pH值至4.90。

同上，按照保留时间顺序，6个峰依次命名为第1峰、第2峰......第6峰。缓冲盐的比例主要影响第2峰与第3峰之间、第3峰于第4峰之间的分离度。

结果显示，流动相氨水比例为0.3％时，只能检测出4个杂质，因此0.3％氨水不适宜作为检测条件。流动相中氨水比例为0.05％和0.2％时，第3峰和第4峰之间的分离度不及流动相中氨水比例为0.1％氨水时，所以选择氨水比例为0.1％作为HPLC条件流动相条件。参见图4所示的氨水比例和主峰保留时间关系图，以及图5所示的氨水比例和分离度关系图。

以上考查了pH值、有机相比例、柱温、缓冲盐比例四个因素对于原料药中杂质的保留时间和分离度的影响，本实施方式据此选择HPLC检测原料药的HPLC条件为：流动相条件为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.90；柱温25℃；流速1.0ml/min；检测波长210nm；色谱柱DiamonsilODS C18(5μm，250×4.6mm)柱。

本领域技术人员应当理解，上述各项HPLC条件的组合可以按照实际需要而更改，前述4个因素考查过程中确定的各项参数或者参数范围可以进行任意形式的组合，这些组合都应当视为本发明已经公开的内容。

确定了HPLC测定原料药的条件后，利用LC-MS测定，可以确定原料药杂质分子量。

使用的液质联用仪HPLC Waters 2486，MS为WatersmicromassQ-TOF。色谱柱为Capcell pak ODS C18柱(5μm，4.6×250mm)，柱温25℃，流速1.0ml/min，流动相为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH值至4.90。质谱条件为电喷雾电离源正离子检测方式；源温80℃；锥孔电压35v。将原料药用流动相溶解后，分别注入液质联用仪，进样量10μl。

LC-MS测定结果表明，主峰的保留时间为18.94min，原料药中有保留时间分别为8.42min、11.32min、15.62min、16.95min、31.32min的五个杂质。MS图谱显示，五个杂质的[M+H]⁺m/z依次为491、585、503、505和425。其中保留时间31.32min处的杂质分子量为424，为克林霉素磷酸酯工业合成的起始原料克林霉素。其余的四个杂质的保留时间和分子量分别为8.42min、490；11.32min、584；15.62min、502和16.95min、504，依次定义为杂质1、杂质2、杂质3和杂质4。

HPLC测定各批次粗品

根据以上确定的四个杂质的属性，在原料药中4个未知杂质的总含量1.5％不到，直接从原料药中分离制备杂质是相当困难的，因此利用HPLC测定原料药和五个批次的粗品，利用峰面积归一法测定了目标杂质的含量，为后面的柱层析和制备分离工作提供向导。

柱层析法富集目标杂质

各批次粗品中杂质含量均比较低，首先采用柱层析的方法对样品进行分离，希望能达到去除主峰，提高杂质含量将杂质富集的目的。

本实施方式采用反相硅胶柱层析富集样品，反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小的分子移动速度快而先从柱中流出。最常用的″万能柱″填料为″C18″，简称″ODS″柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料(Octadecylsilyl，简称ODS)，具备非常优良的色谱分离性能，因此选择ODS反相柱层析的方法，希望能得到比正相硅胶柱层析更好的富集效果。

反相硅胶柱的预处理：使用分析纯乙酸乙酯将ODS反相柱(2.5cm×20cm)洗至颜色纯白后，依次使用100ml100％甲醇、100ml80％甲醇、100ml60％甲醇、100ml40％甲醇、100ml20％甲醇、100ml10％甲醇洗脱。

将0.8g总样1溶解于2ml去离子水后，湿法上柱。依次用10％甲醇200ml、20％甲醇200ml、30％甲醇200ml、40％甲醇200ml、50％甲醇200ml、60％甲醇200ml、70％甲醇200ml、80％甲醇200ml、90％甲醇200ml、100％甲醇200ml洗脱。每个浓度梯度分4瓶接收，每瓶接收约50ml。每瓶接收液60℃水浴加热减压浓缩后，少量去离子水溶解，过滤后制备LC检测。

检测仪器使用Waters 510 HPLC pump，Waters 484 TunableAbsorbance Detector，色谱柱为Waters μBondapak ODS C18(7.8mm×300mm，5μm)，检测波长210nm，流动相为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.90。

图6所示为样品上ODS柱后各梯度洗脱后用制备LC检测的结果。检测结果显示，40％甲醇部位第4瓶和50％甲醇部位第1瓶在保留时间12min有一个拖尾的大峰，主要成分是杂质1(M490)，50％甲醇部位第1瓶、50％甲醇部位第4瓶和60％甲醇部位第1瓶，组分均较多，富集作用有限，之后便没有组分被淋洗出。40％甲醇部位至60％甲醇部位有组分依次被洗脱出来。将40％甲醇第4瓶和50％甲醇第1瓶合并后，利用LC-MS对此部位进行检测。。

根据总离子流图和紫外检测结果，可以知道富集部位杂质1(M490)的含量高达88％。其中分子量410([M+H]⁺441)含量11.44％。

将富集的杂质1使用90％甲醇溶解后，5℃放置重结晶。5天后，有颗粒状晶体析出，使用漏斗将结晶晶体过滤，晶体使用去离子水溶解，母液保留。

晶体部位和母液部位用HPLC检测含量，结果表明，重结晶母液中杂质1的含量比较高，达93％以上，将其60℃水浴减压蒸干后，减压烘箱40℃，烘6小时，称量得约300mg白色晶体状物质。

HPLC法分离制备目标杂质

杂质1的制备分离及其后处理

杂质1的分子量为490，色谱保留行为和主峰差别明显，HPLC制备分离的条件的相对容易。使用Waters510制备液相，Waters μBondapakODS C18柱(5μm，7.8mm×300mm)，检测波长210nm。本实施方式中选择流动相为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.00，流速1.0ml/min。将前述柱层析法富集得到的样品溶解于流动相(至浓度200mg/ml，)注入制备液相，进样量160μl。

收集保留时间12.848的峰约10针后浓缩，高分辨MS测定分子量为490，因此确认组分为杂质1。

收集若干针后，按照常规方法对收集液进行后处理，得到白色结晶状固体。

HPLC检测结果显示制备样品的保留时间和原料药中杂质1的保留时间一致，从而确证制备的样品为杂质1，使用峰面积归一法测得样品中杂质1的含量高达96％。

杂质2的制备分离及其后处理

杂质2的分子量为584，与主峰的分子量相差80，有可能为克林霉素的双磷酸酯结构。制备分离仪器选择Waters510，检测波长210nm。其制备条件为：22％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.00，流速1.0ml/min，色谱柱换用Agela Venusil ODS XBP C18柱(5μm，10mm×250mm)，进样量120μl。使用的样品为不经过柱层析法富集的样品水溶液，浓度约200mg/ml。

收集保留时间14.9min处的峰约10针，浓缩后高分辨MS确定分子量为584，因此可以确定此组分即目标杂质2。

收集若干针后，按照常规方法对收集液进行后处理，得到白色结晶状固体。

HPLC检测样品纯度为89％，为了得到纯度更高的样品，将制备的样品用2ml90％甲醇溶解后，5℃放置重结晶，2天后析出颗粒状结晶，过滤后，再次HPLC检测晶体部位纯度达92.192％。样品的保留时间和原料药中杂质2的保留时间一致，进一步证实了得到的样品为杂质2。

杂质1的结构鉴定

高分辨质谱测定[M+H]⁺质荷比为491.1386，元素组成为C₁₇H₃₃N₂O₈PSCl，参考克林霉素磷酸酯的结构，结合表1所示的¹H-NMR(500MHz，D₂O)谱、¹³C-NMR谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱的解析鉴定其结构如下式I所示：

表1：杂质1的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、DEPT谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱归属

依据DEPT谱中可以确定碳原子中4个伯碳信号、3个仲碳信号和9个叔碳信号，δ172.0，根据化学位移归属为10位羰基的碳。

在¹H-NMR谱中，低场区的δ5.72(d，1H，J＝6.00Hz)根据化学位移和耦合裂分规律，归属为H-1；在¹H-¹H COSY谱中，δ4.70(m，1H)与H-1相关，应归属为H-2；δ3.97(dd，1H，J＝3.00Hz，J＝10.00Hz)与H-2相关，应归属为H-3。根据HSQC谱，δ89.369、δ73.980、δ73.943分别归属为C-1、C-2和C-3。在¹H-¹H COSY谱中，δ4.10(dd，1H，J＝6.00Hz，J＝10.00Hz)与H-3，相关HMBC谱中，C-3同时和H-1、H-2和δ4.10相关，因此将δ4.10归属为H-4，根据HSQC，δ_C71.0归属为C-4。δ_H1.62(d，3H，J＝6.50Hz)，根据化学位移和耦合裂分规律归属为H-8。在¹H-¹H COSY谱中H-8与δ4.80(q，1H，J＝6.50Hz)相关，δ4.80应归属为H-7，根据HSQC，δ60.8归属为C-7。¹H-¹H COSY谱中，H-7与H-8、δ_H4.66(m，1H)相关，因此将δ4.66(m，1H)归属为H-6，根据HSQCδ56.1归属为C-6。¹H-¹H COSY谱中，H-6同时和δ4.56(m，1H)相关，因此将δ4.56归属为H-5，根据HSQC将71.7归属为C-5。根据化学位移，δ2.37(s，3H)、δ3.14(s，3H)分别归属为H-9和H-5′，根据耦合裂分规律δ_H1.10(t，3H，J＝7.00Hz)归属为H-7′。根据HSQCδ15.6、δ43.4、δ14.3分别归属为C-9、C-5′和C-7′。在¹H-¹H COSY谱中H-7′和δ1.69(m，2H)相关，因此δ1.69归属为H-6′。根据¹H-¹H COSY谱H-6′和δ2.53(m，1H)相关，δ2.53归属为H-3′。根据HSQCδ27.9、δ_C41.3分别归属为C-6′和C-3′。根据HMBC中，C-10同时和H-7、H-6和δ4.51(t，1H)相关，因此δ4.51归属为H-1′。根据¹H-¹H COSY谱H-1′和δ2.53(m，1H；m，1H)相关，δ2.53归属为H-2′。根据HSQC，δ_C71.2、δ_C38.2分别归属为C-1′、C-2′。由于¹H-¹H COSY谱中H-3′分别和H-2′、δ3.11(m，1H)、δ4.10(m，1H)相关，根据HSQC和DEPT谱δ_H3.11和δ_H4.10同时和仲碳δ_C63.896相关，因此将δ_H3.110和δ_H4.095归属为H-4′，δ_C63.9归属为C-4′。综上所述，鉴定杂质1结构为上述结构，为英国药典和欧洲药典收载的克林霉素B-2-磷酸酯。

杂质2的结构鉴定

高分辨质谱测定[M+H]⁺质荷比为585.1210，其元素组成为C₁₈H₃₆N₂O₁₁P₂SCl，结合¹H-NMR(500MHz，D₂O)谱、¹³C-NMR谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱的解析鉴定杂质2结构如下式II所示：

表1：杂质2的¹H-NMR谱、¹³C-NMR谱、COSY谱、HSQC谱和HMBC谱归属

根据化学位移，δ_C169.5归属为C-10，δ_H5.77为H-1，δ_H2.38(s，3H)为H-9，3.19(s，3H)为H-5′，1.62(m，3H)为H-8，1.06(q，3H，J＝3.00Hz)为H-8′，根据HSQC谱，δ87.2、22.3、13.1、42.1、13.5分别归属为C-1、C-8、C-9、C-5′和C-8′。

由于COSY谱中δ4.80(m，3H)与H-1相关，因此δ4.80归属为H-2。H-2同时与H-1、δ4.05(m，1H)相关，δ4.05归属为H-3。H-3同时和H-2、δ4.73(m，1H)相关，δ4.73应归属为H-4。根据HSQC，δ_C73.6、70.6、69.5分别归属为C-2、C-3和C-4。C-2和C-4均有裂分的峰出现，这是由于C-2和C-4受到相连磷酸根中³¹P耦合的作用，从而进一步证实了2位和4位双磷酸酯的结构。

根据COSY谱，H-8与δ4.80(m，3H)相关，因此δ4.80应归属为H-7。H-7同时和H-8、δ4.73相关，因此δ4.73应归属为H-6。H-6和δ_H4.80(m，3H)相关，而且H-4和δ4.80(m，3H)也相关，因此δ4.80(m，3H)归属为H-5。根据HSQCδ71.8、53.6、59.0分别归属为C-5、C-6和C-7。

根据¹H-¹H COSY谱，δ1.52(m，2H)和H-8′相关，归属为H-7′，根据HSQC，δ20.7为C-7′，¹H-¹H COSY谱中H-7′和δ1.65(m，2H)相关，因此δ1.65(m，2H)归属为H-6′，根据HSQC，δ34.0归属为C-6′。¹H-¹HCOSY谱中，δ2.60(q，1H)和H-6′相关，因此δ2.60(q，1H)归属为H-3′，根据HSQC，δ37.2归属为C-3′。¹H-¹HCOSY谱中，δ3.08(m，1H)、δ2.50(t，2H)同时和H-3′相关，根据化学位移，C-4′连接电负性强的N，化学位移在低场，因此δ3.08(m，1H)归属为H-4′，δ2.50(t，2H)归属为H-2′。根据HSQC，δ35.9、61.9分别归属为C-2′、C-4′。HSQC谱中C-4′还和δ_H4.08(m，1H)相关，而且¹H-¹HCOSY谱中δ3.08和δ_H4.08(m，1H)相关，因此δ_H4.08(m，1H)也归属为H-4′。由于¹H-¹H COSY谱中，H-2′和δ4.49(t，3H)相关，因此δ_H4.49(t，3H)归属为H-1′。根据HSQC，δ69.0为C-1′。

杂质1抑菌试验

取前述实施方式中制备的杂质1样品2.109mg定容于2ml的容量瓶中，甲醇定容至刻度。

采用抑菌环试验法对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)等致病细菌进行了抑菌试验。结果显示杂质1对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等呈现明显的抑菌环。而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)不呈现抑菌环。由此可知杂质1在体外对革兰氏阳性菌，尤其是枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用；而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)则没有抗性。

杂质2抑菌试验

采用和杂质1同样的方法，用杂质2对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)等致病细菌进行了抑菌试验。结果显示杂质2对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等呈现明显的抑菌环。而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)不呈现抑菌环。由此可知杂质1在体外对革兰氏阳性菌，尤其是枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用；而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)则没有抗性。

Claims (18)

1.一种克林霉素磷酸酯的杂质分析制备方法，其特征在于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述杂质，包括下列步骤：

a)用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的一种或多种杂质；

c)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的一种或多种杂质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)和c)之间还包括下列步骤：

b)根据步骤a)中所述的一种或多种杂质的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用反相硅胶柱层析法富集该相对保留时间和/或分子量对应的一种或多种杂质。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的流动相pH值为4.00～5.00。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的柱温为20℃～40℃。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含15％～25％乙腈。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含0.1％～0.3％氨水。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：

流动相20％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.90；

柱温25℃；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)中，所述的反相硅胶柱层析法富集采用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶填料，流动相为甲醇。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：

b1-将样品溶解于去离子水后，湿法上柱；

b2-依次用10％甲醇200ml、20％甲醇200ml、30％甲醇200ml、40％甲醇200ml、50％甲醇200ml、60％甲醇200ml、70％甲醇200ml、80％甲醇200ml、90％甲醇200ml、100％甲醇200ml洗脱；每个浓度梯度分4批接收，每批接收约50ml；

b3-合并收集40％甲醇第4批和50％甲醇第1批的洗脱液备用。

10.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件包括：

流动相15％～25％乙腈，0.1～0.3％氨水；

pH甲酸调pH至4.00～5.00；

柱温：20℃～40℃；

色谱柱Waters μBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱，或者Agela Venusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件为：

流动相20％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.00；

流速1.0ml/min；

进样量160μl；

检测波长210nm；

色谱柱Waters μBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱；

收集保留时间为12.848分钟处的峰相对应的被分析物。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件为：

流动相22％乙腈，0.1％氨水；

pH甲酸调pH至4.00；

流速1.0ml/min；

检测波长210nm；

色谱柱Agela Venusil ODS XBP C18柱，5μm，10mm×250mm柱；

进样量120μl；

收集保留时间为14.9分钟处的峰相对应的被分析物。

13.4-克林霉素双磷酸酯，其结构式如下式II所示：

14.如权利要求13所述的2，4-克林霉素双磷酸酯用于制备抗革兰氏阳性菌药物的用途。

15.如权利要求14所述用途，其中所述革兰氏阳性菌包括抗枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。

16.根据权利要求1～12中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式I：

17.根据权利要求1～12中任一项所述方法制备的杂质标准品，其特征在于，所述杂质具有如下结构式II：

18.如权利要求16或者17所述的杂质标准品用于分析克林霉素磷酸酯原料的用途。

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