CN102060883B - 克林霉素磷酸酯异构体，其分析制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供克林霉素磷酸酯异构体，其分析制备方法和用途，用于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述克林霉素磷酸酯异构体，包括下列步骤：用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的克林霉素磷酸酯异构体；根据步骤所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析富集该保留时间和/或分子量对应的被分析成分；根据步骤所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的被分析成分。
Description
技术领域
本发明涉及分析化学领域，尤其涉及药物分析化学领域，特别涉及一种克林霉素磷酸酯异构体，及其分析和制备方法.
背景技术
克林霉素磷酸酯在体外无抗菌活性，进入体内后在磷酸酯酶的作用下迅速水解为克林霉素，在体内转化成具有强抗菌活性的N-去甲基克林霉素，主要作用于细菌核糖体的50S亚基，从而阻止肽链的延长而干扰细菌DNA和细菌蛋白的合成，尚可清除细菌表面的A蛋白和绒毛状外衣，使细菌容易被吞噬和杀灭。克林霉素磷酸酯主要对革兰氏阳性球菌及厌氧菌有很强的抗菌活性，其作用及用途与克林霉素盐酸盐相似，但吸收迅速，作用持久，血药浓度较盐酸盐高两倍，是一个兼有抗厌氧菌与需氧菌作用的广谱抗生素。目前市场上已有水针剂、输液剂、注射剂、无菌分装粉针剂、冻干粉针剂等，临床应用以注射剂为主。
任何影响药物纯度的物质均称为杂质，一般而言，杂质是指在生产和储存过程中引进或产生的药物以外的其他化学物质。药品质量标准中的杂质是指在按照经国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品中，由其生产工艺和原辅料带入的杂质，或经稳定性实验确证的在存储过程中产生的降解产物。药品质量标准中的杂质不包括变更生产工艺或变更原辅料而产生的新的杂质，也不包括渗入或污染的外来物质。药品生产企业变更生产工艺或原辅料，并由此带进新的杂质对原质量标准的修订，均应依法向有关药品监督管理部门申报批准。
药物的杂质一般与特定的药物有关，源于以下几个方面：
1.源自于药品生产过程中普遍使用的溶酶、催化剂等；
2.反应不完全而存在的反应原料，反应初始复合物、合成中间产品、副产品等与合成过程相关的物质；
3.贮存过程中的氧化、分解、水解产物；
4.手性化合物中的光学异构体；
5.药物的多种晶型；
6.动植物药物提取物中除有效成分生物碱挥发油、有机酸等小分子外，还存在分子量较大的蛋白质、蹂质、淀粉、树脂等杂质；
7.放射药品中的衰减物质；
8.生物工程制品中异常表达的蛋白质；
9.重金属及无机盐。
药物杂质按化学类别和特性可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。按来源可分为：有关物质(包括化学反应的前体、中间体、副产物和降解产物等)、其他杂质和外来杂质等。按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。按毒性，又可分为毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不良生物作用的杂质，而毒性杂质为具有强烈不良生物作用的杂质。
杂质检测是药品质量控制的一个重要环节，药品质量当中的含量测定是指原料药和制剂中主要成分的含量，有关物质是指原料药和制剂当中的有机杂质。通过有关物质检查，弄清有关物质的来源、性质、检测方法及其限量，可以优化合成路线、实验条件等因素，进而避免其产生有关物质或其降到最低限度，从多方面保证和提高药品质量，减少药物的不良反应。
药物杂质检查分析方法应灵敏、专属。随着科学技术的进步，分离、分析手段的不断提高，药物杂质的检测方法得到了不断的改进。检测药物杂质的方法很多，能较好的进行分离，鉴定药物的杂质，如高效液相色谱、气相色谱、紫外、红外光谱、薄层色谱分析、毛细管区带电泳、薄层毛细管电泳等，这些分析方法广泛应用于药品含量测定和杂质检测。近年来，质谱技术在药物杂质分析方面应用日益广泛，气相色谱联用技术、液相色谱联用技术已经成为药物杂质分析的重要手段。
开发新原料药和新制剂过程中的杂质研究，应严格按照国家有关新药申报的要求进行研究，也可以参照ICH的文本Q3A(新原料药中的杂质)和Q3B(新制剂中的杂质)进行研究，并对杂质的安全性和降解产物进行安全性评价。其具体要求有如下几点：
1.对合成、纯化和储存中实际存在的杂质和潜在的杂质，应采用有效的分离分析方法进行检测；
2.对于表观含量在0.1％及其以上的杂质以及表观含量在在0.1％以下的具有强烈生物作用的杂质或毒性杂质予以定性或确证其结构；
3.对在稳定性试验中出现的降解产物，也应按上述要求进行研究；
4.新药质量标准中的杂质检查项目应包括经研究和稳定性考察检出的，并在批量生产中出现的杂质和降解产物，并包括相应的限度；
5.除降解产物和毒性杂质外，在原料药中已经控制的杂质，在制剂中一般不再控制；
6.原料药和制剂中的无机杂质，应根据其生产工艺、起始原料情况确定检查项目，但对于毒性无机杂质，应在质量标准中规定其检查项。
在仿制药的研制和生产中，如发现杂质的种类与原始开发药品不同或与已有法定杂质不同，必须增加新的杂质项检查项目，应该严格按照上述方法进行研究，申报新的药品质量标准或对原质量标准进行修订，并报有关药品监督管理部门审批。
共存的异构体和抗生素多组分一般不作为杂质检查项目，作为共存物质，必要时在质量标准中规定其比例，以保证生产用的原料药与申报注册时的一致性。但当共存时的物质为毒性杂质时，该物质就不再认为是共存物质。单一对映体药物，其可能共存的其他对映体应作为杂质检查。消旋药物，当已有其单一对映体药物的法定质量标准时，应在该消旋体的质量标准中设旋光度检查项目。
有机挥发性杂质，应根据生产工艺中所用有机溶剂及其残留情况，确定检查项目。可参考中国药典关于有机挥发性杂质的要求，或参考ICH文本Q3C(残留溶剂指导原则)。对残留的毒性溶剂，应规定其检查项目。
为了保证用药安全，原料药/制剂中的每一个杂质都必须进行安全性评估也就是说必须建立保证安全性的杂质限度，ICH准则要求：药物中杂质的限度为0.1％(对毒性药物限度更低)，高于此水平的所有未知杂质应鉴别出来，而更重要的是，所有高于0.1％的杂质应研究其毒性。ICH在2007年2月7日修订的“新原料药中的杂质”指导原则，根据原料药的每日最大剂量将原料药分为两类，并分别制定了杂质的报告阈值、鉴定阈值与合理限度。其中的报告阈值是指所有高于此阈值的杂质及含量均应记入每批产品的检验报告中，并反应在申报资料中。而鉴定阈值是指所有高于此阈值的杂质均应对其结构进行确证。合理限度是指只要质量标准中制定的杂质限度不高于此限度，就不需要提供该限度的制定依据，均认为该限度是合理的。
对于新制剂，ICH在2003年2月5日修订的“新制剂中的杂质”指导原则中也做了明确规定，该指导原则同样根据不同的用药剂量制订了杂质的报告阈值、鉴定阈值和合理限度。
欧盟药品主管部门要求生产企业：(1)应在稳定性研究中设立未知杂质(0.1％)的限度；(2)应对限度大于或等于0.1％的未知杂质进行结构确定和安全性验证。对于某些抗生素类药物要求更高，例如发酵产品红霉素，该品种已经EP收载，并规定杂质的可忽略限度为0.06％，且任何杂质不得超过3.0％。欧盟药品主管部门要求，任何大于可忽略限度0.06％的未知峰给予结构确定并提出适当的杂质限度建议，当杂质达到该限度即对其进行安全性评价。FDA也尤其关注药物生产中药物的纯度和剂量的安全性，要求药品生产者对杂质进行全面的分析，并尽可能的提供较多的结构信息。通常，超过0.1％的杂质需鉴定出来并且用选择性好的方法进行定量分析，而且对0.01％～0.1％的杂质也表示浓厚的兴趣。
尽管杂质限度的确定对于药品研发非常重要，但国内药品研发的现实情况并不令人乐观。从近几年的新药申报情况分析，在杂质的研究和限度确定方面存在着较多的问题，主要表现为：部分药品研究单位对杂质研究的重要性了解不深；标准中对杂质的控制不够全面和准确；制订杂质限度时考虑问题不够全面，很少考虑杂质对药品安全性的不良影响；即使在杂质的含量明显超出正常工艺所允许的范围时，也不注意对现在的处方和工艺进行必要的优化，以降低杂质的限度。
《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》和《英国药典》均有克林霉素磷酸酯相关物质项的收载，而《英国药典》和《欧洲药典》的收载更为全面，《英国药典》和《欧洲药典》根据生产工艺和克林霉素磷酸酯的降解途径在“可能的杂质”项收载了林可霉素、克林霉素B2-磷酸酯、克林霉素3-磷酸酯、克林霉素4-磷酸酯和克林霉素五个杂质。
《中国药典》中对克林霉素磷酸酯仅仅对杂质的总量进行了限定，对单一杂质研究不具体，而欧盟药品主管部门和FDA均要求对克林霉素磷酸酯原料药中表观含量0.1％及其以上的杂质，进行结构鉴定和安全性验证。
发明内容
本发明目的在于对克林霉素磷酸酯原料药的杂质进行研究，主要在于分离制备杂质的标准品并且鉴定原料药中的杂质结构。根据本发明的方法对原料药中的杂质进行分析、制备和结构鉴定，可以为杂质的毒理学研究和阐明不良反应发生机制提供基础，同时也可以为工艺合成实验条件的选择提供参考，有利于生产过程中药品质量的控制。
根据本发明的第一个方面，其提供了一种结构式如下式I所示的克林霉素磷酸酯异构体：
根据本发明的第二个方面，其提供了如本发明第一方面所述克林霉素磷酸酯异构体的分析和制备方法，用于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述克林霉素磷酸酯异构体，包括下列步骤：
a)用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和/或分子量确定所述原料中的克林霉素磷酸酯异构体；
b)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间和/或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析富集该保留时间和/或分子量对应的被分析成分；
c)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的被分析成分。
优选地，步骤a)中所述的LC-MS法测定所采用的流动相pH值为4.00～5.00；所述的LC-MS法测定所采用的柱温为20℃～40℃；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含15％～25％乙腈；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含0.1％～0.3％氨水；
更优选地，步骤a)中所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：
流动相20％乙腈，0.1％氨水；
pH甲酸调pH至4.90；
柱温25℃；
流速1.0ml/min；
检测波长210nm；
色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm，250×4.6mm柱。
优选地，步骤b)中所述的正相硅胶柱层析法富集采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和正丁醇1∶1混合溶剂。
优选地，步骤b)包括下列步骤：
b 1将样品溶解于去离子水后，湿法上柱；
b2使用乙酸乙酯∶水饱和正丁醇比例1∶1混合溶剂洗脱，每30ml洗脱液接收一批；在第114批时换乙酸乙酯∶水饱和正丁醇＝1∶1.5混合溶剂为淋洗剂，第177批时更换淋洗剂为乙酸乙酯∶水饱和正丁醇＝1∶2，洗至全部组分淋洗出；
b3合并收集140-162批的洗脱液备用。
根据本发明的方法，步骤c)中所述的制备色谱法所采用条件包括：流动相为15％～30％有机相，0.1～0.3％氨水，其中有机相为乙腈和甲醇4∶1的混合溶液；pH为甲酸调pH至4.00～7.00；柱温为20℃～40℃；色谱柱为Waters μBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱，或者AgelaVenusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱。
优选地，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件为：
流动相25.5％有机相，0.1％氨水，其中有机相为乙腈和甲醇4∶1的混合溶液；
pH甲酸调pH至6.64；
流速1.0ml/min；
检测波长210nm
色谱柱Agela Venusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱。
柱温25℃
进样量120μl；
收集保留时间为28.467分钟处的峰相对应的被分析物。
根据本发明的第三个方面，其提供如本发明第一个方面所述的克林霉素磷酸酯异构体用于制备抗革兰氏阳性菌药物的用途。
优选地，所述革兰氏阳性菌包括抗枯草杆菌和金黄色葡萄球菌。
根据本发明的第四个方面，其提供了根据本发明第二个方面所述的方法制备的杂质标准品，所述杂质具有如下结构式I：
根据本发明的第五个方面，其提供了如本发明第四个方面所述的杂质标准品用于分析克林霉素磷酸酯原料的用途。
附图说明
结合本申请所提供的附图，将更容易理解本申请的其它特征、目的和优点。这些附图仅用于示范，不对本发明构成任何限制。
图1为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的pH值和分离度关系图；
图2为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的柱温和分离度的关系图；
图3为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的乙腈比例和主峰保留时间关系图；
图4为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的氨水比例和主峰保留时间关系图；
图5为考察LC-MS法条件过程中在不同数值下的氨水比例和分离度关系图；
图6a和图6b分别显示了克林霉素磷酸酯C-7R构型的两种优势构象。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但其不限制本发明。
本实施方式使用的克林霉素磷酸酯原料均采用浙江天台药业有限公司提供的同名原料药。
LC-MS测定克林霉素磷酸酯原料药
为了研究克林霉素磷酸酯原料药杂质，利用液质联用仪对原料药的主要杂质进行研究，目的是为了确定杂质的分子量和色谱保留行为。
克林霉素磷酸酯分子结构中有酸性基团，也有碱性基团，属于两性的物质。各国药典中HPLC检测均选择离子抑制色谱法(ion suppressionchromatography，ISC)进行分析。由于本实施方式选择的质谱仪为电喷雾(electrospray ionization，ESI)离子化方式，为了减小离子对抑制剂对测定的影响，也为了保护仪器，本实施方式采用挥发性的氨水、甲酸缓冲盐系统进行检测。由于克林霉素磷酸酯分子中没有共轭结构，而含有N、O、S杂原子，分子中价电子n-σ*跃迁的机率较高，因此分子末端吸收比较强，选择210nm作为检测波长。流动相首先选择20％的乙腈，考察pH值对测定的影响。
流动相pH值的选择
仪器为HP1100，色谱柱Diamonsil ODS C18(5μm，250×4.6mm)柱，检测波长210nm，柱温25℃，流速1.0ml/min，检测波长210nm。称取克林霉素磷酸酯原料药溶解于20％乙腈pH值4.00的缓冲溶液，配置成20mg/ml的溶液，进样量20μl。配置多个pH值的流动相，分别进行测定。
在本实施方式中，考察了流动相pH值为4.00、4.50、4.75、4.90、5.00时HPLC测定原料药的情况，当流动相pH值由4.00升高至5.00，克林霉素磷酸酯由离子状态转换成分子状态的比例增加，组分在固定相中溶解度增加，容量因子增大，主峰的保留时间随着pH值的增高而增大。流动相pH值4.00时，只能测定4个杂质，比其他四个pH的流动相少测定一个杂质，因此，该方法不适合作为测定原料药的条件。按照保留时间由小到大将色谱图中的六个峰依次编为第1峰、第2峰、......第6峰，其中主峰为第5峰，流动相pH值4.00时没有第4峰。
图1为pH值和分离度关系图，从图中可以看出，流动相pH值主要影响第3峰和第4峰、第4峰和主峰的分离度，对第4峰和主峰的分离度的影响最大。流动相pH值4.50时比流动相pH值4.00时，主峰前面出现一个小峰(第4峰，保留时间17.307min)，但是峰形很差，色谱峰对称因子接近0。流动相pH值4.75时，第4峰的保留时间为18.467min，峰对称因子为2.09，和主峰的分离度为1.44。流动相pH值4.90时，第4峰的保留时间为18.942min，峰对称因子为1.264，和主峰的分离度为1.55，峰形和分离度优于流动相pH为4.75时的情况。当流动相pH为5.00时，第4峰的保留时间为19.782min，峰对称因子为0.77，和主峰的分离度为1.97，分离度优于流动相pH为5.00时，但是第3峰(保留时间18.640min)和第4峰的分离度为0.90，分离度太低，而流动相pH值4.90时，两峰的分离度为1.53。因此，综合考虑分离度和峰形两个因素后，选择pH4.90作为原料药测定时流动相pH值。
柱温的选择
仪器同上，流动相选择上述的流动相4即20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.90，流速1.0ml/min，检测波长210nm，样品配置和进样量同上。
图2为柱温和分离度的关系图，本实施方式中选择了20℃、25℃、30℃和40℃四个柱温，考察了原料药在相同的流动相不同的柱温下的色谱保留行为，按照色谱图中保留时间由小到大，将6个峰依次编为第1峰、第2峰......第6峰，主峰为第5峰，柱温40℃时，色谱图中未出现第4峰。柱温升高的过程中，分子热运动加剧，溶质分子和键合相的烃基之间的疏水缔合作用减弱，主峰的保留时间提前，柱压降低。柱温对分离度的影响没有流动相pH值的影响显著，柱温40℃时，色谱图中只出现了四个杂质，比另外三个柱温下少检测出一个杂质，因此，40℃不适宜作为检测原料药的条件。柱温20℃时，第4峰保留时间为19.678min，色谱峰的对称因子为1.841，和主峰的分离度为1.39，峰形和分离度都不及柱温25℃(25℃时第4峰的峰对称因子为1.264，和主峰分离度为1.55)。柱温30℃时第4峰和主峰的分离度为1.62，但是保留时间17.391min的峰和保留时间18.677min的峰的分离度只有1.17。为了保证所有的杂质均能被检测，在保证分离度的前提下，选择25℃作为HPLC检测的条件。
有机相比例的选择
仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量同上，柱温25℃，分别配置15％乙腈、18％乙腈、20％乙腈、25％乙腈的流动相。
图3为乙腈比例和主峰保留时间关系图。乙腈的比例升高的过程中，流动相的极性减小，洗脱能力增大，溶质的k增大，保留时间提前。从图中可以看出，主峰的保留时间随着流动相乙腈比例的提高而提前。四个比例乙腈的流动相均能检测出5个杂质，但是流动相为15％乙腈、18％乙腈时，分析时间太长。流动相为25％乙腈时，峰的分离不够理想，因此也不适宜做为检测的HPLC条件。确定20％乙腈作为流动相的条件比较合适。
缓冲盐比例的选择
仪器、色谱柱、流速、检测波长、进样量同上，柱温25℃。分别配置以下流动相：20％乙腈，0.05％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.2％氨水，甲酸调pH值至4.90；20％乙腈，0.3％氨水，甲酸调pH值至4.90。
同上，按照保留时间顺序，6个峰依次命名为第1峰、第2峰......第6峰。缓冲盐的比例主要影响第2峰与第3峰之间、第3峰于第4峰之间的分离度。
结果显示，流动相氨水比例为0.3％时，只能检测出4个杂质，因此0.3％氨水不适宜作为检测条件。流动相中氨水比例为0.05％和0.2％时，第3峰和第4峰之间的分离度不及流动相中氨水比例为0.1％氨水时，所以选择氨水比例为0.1％作为HPLC条件流动相条件。参见图4所示的氨水比例和主峰保留时间关系图，以及图5所示的氨水比例和分离度关系图。
以上考查了pH值、有机相比例、柱温、缓冲盐比例四个因素对于原料药中杂质的保留时间和分离度的影响，本实施方式据此选择HPLC检测原料药的HPLC条件为：流动相条件为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH至4.90；柱温25℃；流速1.0ml/min；检测波长210nm；色谱柱DiamonsilODS C18(5μm，250×4.6mm)柱。
本领域技术人员应当理解，上述各项HPLC条件的组合可以按照实际需要而更改，前述4个因素考查过程中确定的各项参数或者参数范围可以进行任意形式的组合，这些组合都应当视为本发明已经公开的内容。
确定了HPLC测定原料药的条件后，利用LC-MS测定，可以确定原料药杂质分子量。
使用的液质联用仪HPLC Waters 2486，MS为WatersmicromassQ-TOF。色谱柱为Capcell pak ODS C18柱(5μm，4.6×250mm)，柱温25℃，流速1.0ml/min，流动相为20％乙腈，0.1％氨水，甲酸调pH值至4.90。质谱条件为电喷雾电离源正离子检测方式；源温80℃；锥孔电压35v。将原料药用流动相溶解后，分别注入液质联用仪，进样量10μl。
LC-MS测定结果表明，主峰的保留时间为18.94min，原料药中有保留时间分别为8.42min、11.32min、15.62min、16.95min、31.32min的五个杂质。MS图谱显示，五个杂质的[M+H]+m/z依次为491、585、503、505和425。其中保留时间31.32min处的杂质分子量为424，为克林霉素磷酸酯工业合成的起始原料克林霉素。其余的四个杂质的保留时间和分子量分别为8.42min、490；11.32min、584；15.62min、502和16.95min、504，依次定义为杂质1、杂质2、杂质3和杂质4。
HPLC测定各批次粗品
根据以上确定的四个杂质的属性，在原料药中4个未知杂质的总含量1.5％不到，直接从原料药中分离制备杂质是相当困难的，因此利用HPLC测定原料药和五个批次的粗品，利用峰面积归一法测定了目标杂质的含量，为后面的柱层析和制备分离工作提供向导。
柱层析法富集目标杂质
由于乙酸乙酯极性较正丁醇弱，在使用乙酸乙酯后TLC分离效果显著增加，进行柱层析分离时使用正丁醇和乙酸乙酯混合后作为洗脱剂，有可能达到分离富集的作用。
取30g硅胶(100～200目)，溶解于乙酸乙酯和水饱和正丁醇比例为1∶1溶剂中，湿法装柱后待其沉降完全。称取克林霉素原料药样品约1g溶解于3ml去离子水，湿法上样。使用乙酸乙酯∶水饱和正丁醇比例1∶1混合溶剂洗脱，每30ml洗脱液接收一瓶。在第114瓶时换乙酸乙酯∶水饱和正丁醇＝1∶1.5混合溶溶剂做淋洗剂，第177瓶时更换淋洗剂为乙酸乙酯∶水饱和正丁醇＝1∶2，洗至全部组分淋洗出。每瓶洗脱液60℃水浴加热减压蒸干后，使用少量甲醇溶解后，硅胶板(3.5cm×5cm)点样检测。TLC检测条件，展开剂为水∶冰醋酸∶正丁醇∶乙酸乙酯＝1∶1∶2∶3，展开两次，碘蒸气显色。
TLC检测结果显示，第1至第6瓶没有组分出现，第7至第82瓶在Rf值0.27、0.36和0.53处均有组分出现，第83至第115瓶中以Rf值0.27和0.53处的组分为主，第116至第205瓶组分以Rf值0.27组分为主，第206至第215瓶主要组分是Rf值0.09、0.27处也显色。正相硅胶柱层析富集部位以TLC检测Rf值0.09、0.27、0.36、0.53四个点为主。
利用LC-MS检测富集部位，追踪各目标杂质，仪器和条件同前述LC-MS测定。为了节省成本，选择01-82、93-103、140-162三个有代表性的部位进行检测。
总离子流图和紫外检测结果显示，柱层析61-82瓶部位主要是色谱柱保留时间17.60min和保留时间23.39min处两个分子量504([M+H]+505)的两个组分，峰面积归一法测得含量分别为47.93％和36.99％，其中杂质1(M490)的含量为1.08％，此外还有分子量为520、560、584、424和544的组分，为上柱前总样里面没有的组分。柱层析93-103瓶主要成分以保留时间29.37min分子量504的组分为主，含量91.24％。其中还含有分子量为470、520和560的组分，没有目标杂质。柱层析140-162瓶中色谱保留时间16.95min的杂质4(M504)和保留时间17.45min的主峰(M504)的含量比较高，杂质4含量为32.50％，主峰含量为25.93％。保留时间14.07min、分子量584的组分可能是杂质2，但是含量仅仅只有0.47％。此外还含有分子量520、566的组分。
综上所述，总样5上正相硅胶柱进行柱层析140-162部位能将杂质4富集到含量高达32.50％，此部位的还有分子量520、566的新组分。在93-103部位和1-82部位，未能富集到目标杂质，但是也引入了分子量470、520、544、560和566的新杂质，是上柱前总样里没有的组分。
HPLC法分离制备目标杂质
本实施方式以杂质4为制备对象，杂质4和主峰为同分异构体，色谱保留行为十分接近。在前面正相硅胶柱层析的过程当中，得到杂质4含量高达30％以上的富集部位，由于含量较高，要使二者实现色谱分离，难度很大。而且该样品中引入了新的杂质(分子量为566)使得使用该样品制备分离的难度增加。
本实施方式中制备杂质4的条件为：25.5％有机相，所述有机相为乙腈和甲醇4∶1的混合溶液，0.1％氨水，甲酸调pH值至6.64，流速1.0ml/min，进样量120μl，色谱柱用Agela Venusil ODS XBP C18柱(5μm，10mm×250mm)。制备分离仪器选择Waters510，检测波长210nm。
HPLC图谱显示主峰前面代表杂质4的小峰保留时间为28.467min，主峰保留时间为32.373min。基本实现了基线分离，虽然主峰出现明显的拖尾，但是使用交叉进样可以消除由于主峰拖尾带来的制备分离时的时间较长的问题。
按照上述条件，将保留时间28.467min处的小峰收集约10针后，将收集液浓缩后高分辨MS测定分子量为504，因此可以确定此峰为杂质4。按此法制备，收集若干针后，按照常规方法对收集液进行后处理，得到白色晶体状固体。
HPLC检测显示，样品纯度为85％，16.011min处的峰含量较高，该组分可能是杂质3。
杂质4的结构鉴定
杂质4和克林霉素磷酸酯为同分异构体，通过对表1所示的1H-NMR(500MHz，D2O)谱、NOESY谱和HSQC谱的解析，结合结构的现实可能性，初步鉴定其结构如下式I所示：
表1：杂质41H-NMR谱、13C-NMR谱、NOESY谱、HSQC谱归属
| 位置 | δH(ppm) | NOESY | δC(ppm) |
| 1 | 5.36 | H-6、H-9 | 87.3 |
| 2 | 4.46 | / | 71.871.7 |
| 3 | 3.72 | / | 70.5 |
| 4 | 3.98 | / | 68.5 |
| 5 | 4.11 | H-8 | 69.1 |
| 6 | 4.55(J＝2.50Hz，J＝10.00Hz) | / | 53.5 |
| 7 | 4.42(J＝2.50Hz， | H-8 | 57.9 |
| J＝6.50Hz) | |||
| 8 | 1.29 | H-5、H-7 | 21.9 |
| 9 | 2.01 | / | 12.9 |
| 10 | / | / | 169.5 |
| 1′ | 4.21 | H-5′ | 68.7 |
| 2′ | 2.07 | H-3′ | 35.6 |
| 3′ | 2.26 | H-2′ | 36.6 |
| 4′ | 2.78；3.79 | H-3′ | 61.5 |
| 5′ | 2.80 | H-1′ | 40.9 |
| 6′ | 1.28 | H-6′ | 33.8 |
| 7′ | 1.16 | H-8′ | 20.6 |
| 8′ | 0.73 | H-6′、H-7′ | 13.6 |
结合前述分析过程中杂质1的峰归属和《克林霉素磷酸酯的波谱学研究》[J].波谱学杂志2008 Vol.25 No.4：523-529袁金伟，陈晓岚等.，δH和δC的归属如上表所述。根据NOESY谱，H-8同时和H-5、H-7相关，说明H-8和H-5的空间位置比较靠近。
图6a和图6b分别显示了C-7R构型的两种优势构象，通过对比这两种优势构象，可以认为第一种构象比较合理。克霉素磷酸酯的NOESY谱中H-8和H-6、H-7相关，说明H-6和H-8的空间距离较小，从而证实了图中描述的H-6和H-8空间位置。
综上所述杂质4的H-6、H-7和C-8的空间位置关系如图6a所示，即初步鉴定杂质4的结构中C-7的构型为R型。而克林霉素磷酸酯C-7的构型为S型。
杂质4抑菌试验
取前述实施方式中制备的杂质4样品，由于样品粘到烧瓶壁上，药匙刮出来的样品估计重量加入容量瓶中甲醇定容，约1mg/ml。
采用抑菌环试验法对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)等致病细菌进行了抑菌试验。结果显示杂质4对革兰氏阳性菌，以及枯草杆菌、金黄色葡萄球菌等呈现明显的抑菌环。而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)不呈现抑菌环。由此可知杂质1在体外对革兰氏阳性菌，尤其是枯草杆菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用；而对白色念珠菌、大肠杆菌、耐药菌(MRSA)则没有抗性。
Claims (4)
1.下式的克林霉素磷酸酯异构体的分析制备方法，
其特征在于对克林霉素磷酸酯原料进行分析，并从中分离制备所述克林霉素磷酸酯异构体，包括下列步骤：
a)用LC-MS法测定所述克林霉素磷酸酯原料，根据被分析成分的相对保留时间和／或分子量确定所述原料中的克林霉素磷酸酯异构体；
b)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间和／或分子量确定柱层析法的条件，使用正相硅胶柱层析富集该保留时间和／或分子量对应的被分析成分；
c)根据步骤a)中所述克林霉素磷酸酯异构体的相对保留时间所显示的色谱保留行为确定制备色谱法的条件，用制备色谱法收集所述相对保留时间对应的被分析成分；
其中，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用的流动相pH值为4.00～5.00；所述的LC-MS法测定所采用的柱温为20℃～40℃；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含15％～25％乙腈；所述的LC-MS法测定所采用的流动相包含0.1％～0.3％氨水；
步骤b)中，所述的正相硅胶柱层析法富集采用的固定相为100～200目硅胶，流动相为乙酸乙酯和水饱和正丁醇1∶1混合溶剂；
步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件包括：
流动相15％～30％有机相，0.1～0.3％氨水；其中有机相为乙腈和甲醇4∶1的混合溶液；
pH甲酸调pH至4.00～7.00；
柱温：20℃～40℃；
色谱柱WatersμBondapak ODS C18，5μm，7.8mm×300mm柱，或者Agela Venusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a)中，所述的LC-MS法测定所采用HPLC条件为：
流动相20％乙腈，0.1％氨水；
pH甲酸调pH至4.90；
柱温25℃；
流速1.0ml／min；
检测波长210nm；
色谱柱Diamonsil ODS C18，5μm,250×4.6mm柱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤b)包括：
b1将样品溶解于去离子水后，湿法上柱；
b2使用乙酸乙酯∶水饱和正丁醇比例1∶1混合溶剂洗脱，每30ml洗脱液接收一批；在第114批时换乙酸乙酯∶水饱和正丁醇=1∶1.5混合溶剂为淋洗剂，第177批时更换淋洗剂为乙酸乙酯∶水饱和正丁醇=1∶2，洗至全部组分淋洗出；
b3合并收集140-162批的洗脱液备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤c)中，所述的制备色谱法所采用条件为：
流动相25.5％有机相，0.1％氨水，其中有机相为乙腈和甲醇4∶1的混合溶液；
pH甲酸调pH至6.64；
流速1.0ml／min；
检测波长210nm；
色谱柱Agela Venusil ODS XBP C18，5μm，10mm×250mm柱；
柱温25℃；
进样量120μl；
收集保留时间为28.467分钟处的峰相对应的被分析物。
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