CN104297383A

CN104297383A - 一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法

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Publication number: CN104297383A
Application number: CN201310068514.6A
Authority: CN
Inventors: 李悦; 许卓妮; 沈舜义
Original assignee: Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry; China State Institute of Pharmaceutical Industry
Current assignee: Jiangsu Weiqida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-03-04
Also published as: CN104297383B

Abstract

本发明公开了一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其包括下述步骤：将阿奇霉素样品溶于乙腈形成样品溶液，用液相色谱-质谱法分离检测阿奇霉素及其杂质，即可；其中，液相色谱-质谱法的条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，流动相A的配制：体积分数为0.3%的甲酸水溶液，用氨水调pH值至8.20；流动相B为乙腈与甲醇的体积比为3∶1的混合溶液，以流动相A与流动相B进行线性梯度洗脱；流速为1.0mL/min；紫外检测器的检测波长为210-215nm；经过紫外检测器后的流份的1/5～1/3进入质谱仪检测。本发明的方法检测灵敏度高，采用的色谱柱所设柱温低，操作简捷方便。

Description

一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法

技术领域

本发明涉及药物检测领域，尤其涉及一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法。

背景技术

阿奇霉素（Azithromycin）是通过红霉素A上9-酮基肟化后经贝克曼重排、还原、N-甲基化反应合成得到的15元氮杂大环内酯类化合物，最初是由普利瓦（Pliva）公司于二十世纪七十年代末开发，后转让给辉瑞（Pfizer）公司，以Zithromax(希舒美)为商品名在全球销售。阿奇霉素的抗菌机理与红霉素相似，通过与细菌细胞中核糖体50S亚基结合，阻碍细菌转肽过程，抑制依赖于RNA的蛋白质的合成而达到抗菌作用。与红霉素比较，阿奇霉素具有更广泛的抗菌谱，能抑制多种革兰阳性球菌、支原体、衣原体及嗜肺军团菌，尤其是对一些重要的革兰阴性杆菌如流感嗜血杆菌等具有良好的抗菌活性，弥补了大环内酯类对嗜血杆菌作用差的不足。

杂质检查是药品安全性评价的一个重要指标。由于阿奇霉素为半合成产品，起始原料以及合成过程中容易产生较多杂质，加之对酸、碱、热、氧化等因素较敏感等原因，使得对其杂质控制较其他抗生素品种更为复杂。目前国内外药典及文献报道，对阿奇霉素及其杂质的测定多采用HPLC-UV（高效液相色谱-紫外检测）的方法，由于其结构属于大环内酯类，紫外仅有末端吸收，因而检测灵敏度较低。美国药典(USP34版)对该项检查应用到了电化学检测器，铝基质色谱柱(USP中L29色谱柱)或氧化锆色谱柱(USP中L49色谱柱)，此试验条件在国内也不易推广使用。欧洲药典（7.0）所采用的方法柱温为60℃，所设柱温较高，对色谱柱的损耗很大，对绝大多数色谱柱来说已达到柱温极限。

阿奇霉素及其杂质的结构如式1及表1所示。

式1

表1阿奇霉素及其11个杂质

其中，二脱氧甲基已糖（即克拉定糖，cladinose）的结构式如下：

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法检测灵敏度低，采用的色谱柱所设柱温较高，对色谱柱的损耗大的缺陷，提供了一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法。该方法检测灵敏度高，采用的色谱柱所设柱温低，操作简捷方便。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供了一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其包括下述步骤：将阿奇霉素样品溶于乙腈中，或溶于流动相A与流动相B按体积比为70:30的溶液中，形成样品溶液，用液相色谱-质谱法分离检测阿奇霉素及其杂质，即可；

其中，液相色谱-质谱法的条件如下：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相A的配制：体积分数为0.3%的甲酸水溶液，用氨水调节其pH值至8.20；流动相B为乙腈与甲醇的体积比为3:1的混合溶液；以流动相A与流动相B按照下述体积比进行线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速为1.0mL/min；紫外检测器的检测波长为210-215nm；经过紫外检测器后的流份的1/5～1/3进入质谱仪检测。

其中，所述的样品溶液的质量浓度较佳地为0.5-2mg/mL，更佳地为1mg/mL。

其中，所述的样品溶液的进样量较佳地为5～20μL，更佳地为10μL。

其中，所述的样品溶液在进样前较佳地进行超声溶解。

其中，所述的色谱柱较佳地为规格5μm，4.6mm×250mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；更佳地为SHISEIDO XBridge^TM Shield RP18柱、CAPCELL PAK C18MG II柱和Waters XBridge^TM C18色谱柱中的一种，最佳地为Waters XBridge^TM C18色谱柱。

其中，所述的色谱柱的柱温较佳地为35-45℃，更佳地为40℃。

其中，所述的质谱仪可为本领域常规使用的各种类型的质谱仪，较佳地为Waters micromass ZQ质谱仪，其工作参数较佳地为喷雾高压（即毛细管电压）：3kV；锥孔电压：30V；源温100℃；脱溶剂温度250℃；全扫描范围m/z250～1000。

本发明中的阿奇霉素样品可为本领域常规的阿奇霉素待测样品，一般包括阿奇霉素和阿奇霉素杂质。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：本发明的方法检测灵敏度高，阿奇霉素质谱检测限为0.1ng，采用的色谱柱所设柱温低，操作简捷方便。

附图说明

图1为实施例1的阿奇霉素原料药的总离子流色谱图。

图2为实施例2的阿奇霉素及其杂质对照品的总离子流色谱图；其中J为杂质J：去氧糖胺基阿奇霉素(13-O-descladinosylazithromycin)；A为杂质A：氮杂阿奇霉素(6-demethylazithromycin)；E为杂质E：(3'-(N,N-didemethyl)azithromycin)；L为杂质L：(azithromycin-3'-N-oxide)；I为杂质I：N-去甲基阿奇霉素(3'-N-demethylazithromycin)；M为杂质M：(3'-(N,N-didemethyl)-3'-N-formylazithromycin)；AZI为阿奇霉素(azithromycin)；F为杂质F：（3'-(N,N-didemethyl)-3'-N-formylazithromycin）；B为杂质B：阿奇霉素B(3-deoxyazithromycin)；N为杂质N：(3'-de(dimethylamino)-3'-oxoazithromycin)；H为杂质H：阿奇霉素杂质Gx(3'-N-[[4-(acetylamino)phenyl]sulphonyl]3'-N-demethylazithromycin)；G为杂质G：(3'-N-demethyl-3'-N-[(4-methyphenyl)sulphonyl]azithromycin)。

图3为效果实施例1的不同流动相起始比例时，E和L、L和I的分离情况比较图，其中线条1为E和L，线条2为L和I。

图4为效果实施例1的不同流动相起始比例的阿奇霉素及其杂质对照品的总离子流色谱图。

图5为效果实施例2的流动相A的不同pH值时，E和L、L和I的分离情况比较图，其中线条1为E和L，线条2为L和I。

图6为效果实施例2的流动相A的不同pH值时，阿奇霉素及其杂质对照品的总离子流色谱图。

图7为效果实施例3的流动相A的不同浓度时，E和L、L和I的分离情况比较图，其中线条1为E和L，线条2为L和I。

图8为效果实施例3的流动相A的不同浓度时，阿奇霉素及其杂质对照品的总离子流色谱图。

图9为效果实施例4的流动相B中不同乙腈和甲醇比例时，E和L、L和I的分离情况比较图，其中线条1为E和L，线条2为L和I。

图10为效果实施例4的流动相B中不同乙腈和甲醇比例时，阿奇霉素及其杂质对照品的总离子流色谱图。

图11为效果实施例5的阿奇霉素降解产物的总离子流色谱图；其中图11a为酸破坏，图11b为碱破坏，图11c为氧化破坏，图11d为加热破坏。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流动相A的配制：体积分数为0.3%的甲酸水溶液，用氨水调节其pH值至8.20，流动相B为乙腈:甲醇=3:1，线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

取阿奇霉素原料药（批号20120423）10mg，乙腈溶解，配制成浓度为1mg/ml的溶液，进样量为10μL，根据液相色谱-质谱法分离检测，共检测到10个相关杂质（如图1所示）。从图中可以看出，本发明的方法可用于检测阿奇霉素及其杂质，该方法可应用于阿奇霉素原料药合成工艺监控及质量控制。

实施例2

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流动相A为用氨水调节体积分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值至8.20时形成的溶液，流动相B为乙腈:甲醇=3:1，线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

将阿奇霉素和11种杂质对照品（杂质A、B、E、F、G、H、I、J、L、M、N）溶入乙腈超声使溶解，配制浓度为1mg/ml的溶液，进样量为10μL，根据液相色谱-质谱法分离检测，阿奇霉素与诸杂质均达到较好的分离，且保持较好的峰形，如图2所示。

通过试验，发现其中E和L、L和I之间的分离对流动相的条件较为苛刻，因此分别从调整流动相起始比例、流动相A的pH值、流动相A溶液的浓度以及流动相B中甲醇和乙腈比例这四方面对该方法进行考察。

效果实施例1

流动相起始比例的选择

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；除流动相起始比例外其他条件相同，均为如下条件：流动相A为用氨水调节体积分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值至8.20时形成的溶液，流动相B为乙腈:甲醇=3:1，线性梯度洗脱：0min→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

将阿奇霉素和11种杂质对照品（杂质A、B、E、F、G、H、I、J、L、M、N）溶入乙腈超声使溶解，配制浓度为1mg/ml的溶液，进样量为10μL，根据液相色谱-质谱法分离检测。

选择0min时，流动相A与流动相B的起始配比分别为68:32、69:31、70:30、71:29、72:28(V/V)的情况，结果表明，随着流动相A比例提高，保留时间增加；当A:B为70:30时，E和L、L和I的分离度均为最佳（如图3、图4所示；图4中，A:B为68:32时保留时间为21.11左右处为E、L、I，A:B为69:31时保留时间为24.64左右处为E、L、I，A:B为70:30时保留时间为30.24左右处为E、L、I，A:B为71:29时保留时间为35.21左右处为E、L、I，A:B为72:28时保留时间为38.54左右处为E、L、I），其他峰均分离良好，但当配比高于或低于70:30时，Ｅ和Ｌ的分离效果均明显下降，故流动相起始配比为70:30(V/V)可以实现本发明的发明目的。

效果实施例2

流动相A的pH值的选择

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；除流动相A的pH值外其他条件相同，均为如下条件：流动相B为乙腈:甲醇=3:1，线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

流动相A为用氨水调节体积分数为0.3%的甲酸水溶液，pH分别调至8.10、8.15、8.20、8.22、8.25的情况，结果表明，随着pH增加，保留时间增加，Ｌ和Ｉ的分离度增加，而Ｅ和Ｌ间的分离度则明显降低（如图5、图6所示；图6中，pH为8.10时保留时间为26.04左右处为E、L、I，pH为8.15时保留时间为27.08左右处为E、L、I，pH为8.20时保留时间为30.24左右处为E、L、I，pH为8.22时保留时间为29.85左右处为E、L、I，pH为8.25时保留时间为34.84左右处为E、L、I），综合两者当流动相A的pH为8.20，其他杂质峰以及主峰与杂质峰间均分离良好，可以实现本发明的发明目的。

效果实施例3

流动相A的浓度的选择

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；除流动相A的浓度外其他条件相同，均为如下条件：流动相A为用氨水调节甲酸水溶液的pH值至8.20时形成的溶液，流动相B为乙腈:甲醇=3:1，线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

考察甲酸水溶液的体积分数分别为0.2%、0.25%、0.3%、0.35%、0.4%的情况，结果表明，随着浓度的增加，Ｅ和Ｌ的分离度增加，而Ｌ和Ｉ的分离度则降低（如图7、图8所示；图8中，甲酸水溶液体积分数为0.2%时保留时间为29.94左右处为E、L、I，甲酸水溶液体积分数为0.25%时保留时间为28.80左右处为E、L、I，甲酸水溶液体积分数为0.3%时保留时间为30.24左右处为E、L、I，甲酸水溶液体积分数为0.35%时保留时间为28.91左右处为E、L、I，甲酸水溶液体积分数为0.4%时保留时间为29.17左右处为E、L、I），综合两者当甲酸水溶液的浓度为0.3%（体积分数），其他峰在该浓度下均分离良好，可以实现本发明的发明目的。

效果实施例4

流动相B中乙腈和甲醇比例的选择

色谱柱：XBridge^TM C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；除流动相B中乙腈和甲醇比例外其他条件相同，均为如下条件：流动相A为用氨水调节体积分数为0.3%的甲酸水溶液的pH值至8.20时形成的溶液，流动相B为乙腈-甲醇，线性梯度洗脱：0min:70%A+30%B→30min:70%A+30%B→50min:45%A+55%B→53min:45%A+55%B→65min:30%A+70%B；流速：1.0mL/min；检测波长210nm；进样量：10μL。液相色谱后的流份经紫外检测后以3:1分流进入质谱仪检测。

考察乙腈：甲醇的体积配比分别为2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1的情况，结果表明，乙腈比例提高，出峰快，保留时间减少，当配比为2.5:1时，Ｅ和Ｌ的分离度最佳，但Ｌ和Ｉ却不能分离；而当配比为4:1时，Ｌ和Ｉ的分离最好，但Ｅ和Ｌ的分离并不理想（如图9、图10所示；图10中，体积配比为2:1时保留时间为39.35左右处为E、L、I，体积配比为2.5:1时保留时间为33.99左右处为E、L、I，体积配比为3:1时保留时间为30.24左右处为E、L、I，体积配比为3.5:1时保留时间为24.99左右处为E、L、I，体积配比为4:1时保留时间为24.21左右处为E、L、I），综合两者考虑，当乙腈和甲醇的体积配比为3:1，其他峰也均分离良好，可以实现本发明的发明目的。

效果实施例5

方法专属性实验（强制降解实验）

强制降解试验是指将原料药或制剂置于比较剧烈的试验条件下，考察其稳定性的一系列试验。一般而言，该试验的目的主要有以下两方面：一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关杂质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。

取阿奇霉素原料药约10mg(4份)，1份加0.1mol/L盐酸溶液1ml，室温（20℃）放置30分钟，氢氧化钠溶液中和，加乙腈稀释至10ml，作为酸破坏溶液；1份加1mol/L氢氧化钠溶液1ml，置60℃水浴中1小时，盐酸溶液中和，加乙腈稀释至10ml，作为碱破坏溶液；1份加10%过氧化氢1ml，室温（20℃）放置10分钟后加乙腈稀释至10ml，作为氧化破坏溶液；1份加乙腈1ml，置沸水浴（95℃）中2小时，加乙腈稀释至10ml，作为加热破坏溶液。

除样品外，该试验条件均与实施例2的试验条件相同。

该试验即通过强酸、强碱、氧化、加热条件加速阿奇霉素原料药的破坏，测定降解产物，考察本发明的方法的专属性。通过本试验方法，共检出6个有关杂质，且均与阿奇霉素主峰良好分离（图11中保留时间在42～44分钟处的峰为阿奇霉素主峰）。其中确定酸破坏以及加热破坏主要产物为杂质J（去氧糖胺基阿奇霉素）（图11a、图11d所示），氧化降解产物为杂质L（阿奇霉素-N-氧化物）（如图11c所示）。

本发明所建立的液相色谱-质谱法经一系列色谱条件的筛选优化，能有效的分离杂质，保证各峰峰形，同时高灵敏度的检出微量杂质。该方法不仅能将主峰与11个已知杂质良好分离，而且能将强制降解（酸、碱、氧化、加热）实验中产生的降解产物与主成分良好分离。本方法为阿奇霉素及其杂质的检测和鉴定提供更简捷灵敏的方法，且为阿奇霉素未知杂质的研究奠定了良好的基础。

Claims

1.一种分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，其包括下述步骤：将阿奇霉素样品溶于乙腈中，或溶于流动相A与流动相B按体积比为70:30的溶液中，形成样品溶液，用液相色谱-质谱法分离检测阿奇霉素及其杂质，即可；

2.如权利要求1所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的样品溶液的质量浓度为0.5-2mg/mL，所述的样品溶液的进样量为5～20μL。

3.如权利要求2所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的样品溶液的质量浓度为1mg/mL，所述的样品溶液的进样量为10μL。

4.如权利要求1所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的样品溶液在进样前进行超声溶解。

5.如权利要求1所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱为规格5μm，4.6mm×250mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。

6.如权利要求5所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱为SHISEIDO XBridge^TM Shield RP18柱、CAPCELL PAKC18MG II柱和Waters XBridge^TM C18色谱柱中的一种。

7.如权利要求1所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱的柱温为35-45℃。

8.如权利要求7所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的色谱柱的柱温为40℃。

9.如权利要求1所述的分离检测阿奇霉素及其杂质的方法，其特征在于，所述的质谱仪为Waters micromass ZQ质谱仪，其工作参数为喷雾高压：3kV；锥孔电压：30V；源温100℃；脱溶剂温度250℃；全扫描范围m/z250～1000。