CN112816570A - 一种阿奇霉素有关物质的检测方法 - Google Patents

一种阿奇霉素有关物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种阿奇霉素有关物质的检测方法。所述检测方法包括：采用高效液相色谱法进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以流动相A和流动相B的混合液为流动相，通过梯度洗脱的方式对待测样品进行检测；所述流动相A为水相与乙腈的混合溶液，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液。本发明提供的方法能够对阿奇霉素中19个已知杂质进行有效的分离测定，进行严格的质量控制。

Description

一种阿奇霉素有关物质的检测方法
技术领域
本发明涉及药物检测领域，尤其涉及一种阿奇霉素有关物质的检测方法。
背景技术
阿奇霉素是一种大环内酯类药物，于1980年被发现，1981年推出。阿奇霉素是在红霉素结构上修饰后得到的一种广谱抗生素，同罗红霉素一样属于大环内酯类第二代抗生素，适用于敏感菌所致的呼吸道，皮肤软组织感染和衣原体所致的传播疾病。阿奇霉素最先是由克罗地亚普利瓦公司研制合成，并率先在前南斯拉夫上市的。原研发公司将生产和市场开发权进行转让，由美国辉瑞公司和意大利Sigma-Tau公司授让进行全球开发。辉瑞公司在取得了全球开发权后，其获批的阿奇霉素商品名为希舒美。08年希舒美在阿奇霉素的市场占有率达到30.78％。我国市场上阿奇霉素的生产始于1995年SFDA批准北京太洋药业开始，如今阿奇霉素已经是大环内酯类抗生素中剂型最全面的品种，包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射液、粉针剂以及输液剂等，其原料药及制剂已被载入20版药典。
阿奇霉素的作用机制与红霉素相似，通过与敏感菌核糖体的50S亚基结合，RNA的蛋白合成而发挥抗菌作用，保留了典型红霉素的抗菌谱。对衣原体的活性与红霉素相相似，与红霉素相比，对革兰阴性菌的抗菌活性有了明显的对流感杆菌和淋病奈瑟菌的抗菌活性比红霉素强4倍以上，对军团菌的抗菌活性强约2倍，对肠细菌科的抗菌活性也明显强于红霉素。对绝大多数革兰阴性菌MIC小于1μg/ml。金黄色葡萄球菌和化脓性链球菌对本品和红霉素有交叉耐药性，对弓形体、梅毒螺旋体也有良好杀灭作用。口服后迅速吸收，生物利用度为37％。单剂口服0.5g后，达峰时间为2.5～2.6小时，血药峰浓度(Cmax)为0.4～0.45mg/L。本品在体内分布广泛，在各组织内浓度可达同期血浓度的10～100倍，在巨噬细胞及纤维母细胞内浓度高，前者能将阿奇霉素运转至炎症部位。本品单剂给药后的血药浓度消除半衰期为35～48小时，给药量的50％以上以原形经胆道排出，给药后72h内约4.5％以原形尿排出。经尿蛋白结合率随血药浓度的增加而减低，当血药浓度为0.02μg/mL时，血清蛋白结合率为15％；当血药浓度为2μg/mL时，血清蛋白结7％。目前，现有的阿奇霉素杂质检测方法不能对阿奇霉素中19个已知杂质进行有效的分离测定，无法进行严格的质量控制。
发明内容
本发明实施例提供一种阿奇霉素有关物质的检测方法，能够对阿奇霉素中19个已知杂质进行有效的分离测定，进行严格的质量控制。
本发明实施例提供一种阿奇霉素有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以流动相A和流动相B的混合液为流动相，通过梯度洗脱的方式对待测样品进行检测；所述流动相A为水相与乙腈的混合溶液，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液。
本发明中，阿奇霉素中含有的19种相关物质，分别为：
Figure BDA0002856062890000021
Figure BDA0002856062890000031
Figure BDA0002856062890000041
Figure BDA0002856062890000051
以上19种杂质，采用常规的方法极难将其所有杂质完全分离，因此也无法对其含量进行准确地测定。发明人经研究发现，采用高效液相色谱法进行检测(优选205～215nm波长)控制杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q(Q1)、杂质QEP(Q2)、杂质R、杂质S等19个杂质，在选择本发明所述的固定相和流动相的情况下，可实现上述19种杂质的有效分离和检测。
本发明提供的检测方法能够在高效液相色谱图中将阿奇霉素有关物质(包含阿奇霉素和19药典杂质)完全分离开来；并通过对条件的优化，使得对各组分检测满足灵敏性和准确性的测定要求。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，所述梯度洗脱：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％，；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％。本发明中，采用上述梯度洗脱的操作可更理想地对产品进行分离。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，所述流动相A中，所述水相和乙腈的体积比为90～98:10～2，优选为98:2；所述水相的制备：0.05mol/L的磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.10～8.30，优选为8.20；所述流动相B中，乙腈和甲醇的体积比为80～90:20～10。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，在紫外检测波长为205～215nm的条件下进行检测，优选为208～212nm，更优选为210nm。本发明中，在210nm波长下能够更好地对19个已知杂质进行质控测定。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，柱温为45～50℃，优选为45～48℃。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，所述流动相的流速为0.7～0.9mL/min，优选为0.8mL/min。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，所用的色谱柱填料为小粒径十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，色谱柱粒径为1.7～3.5μm；色谱柱规格为4.6mm×50～250mm，优选为：Waters
Figure BDA0002856062890000061
Shield RP18，4.6mm×250mm，3.5μm或Waters
Figure BDA0002856062890000062
Shield RP18，4.6mm×150mm，2.5μm。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，所述待测样品用溶剂稀释液为磷酸盐、甲醇和乙腈的混合液，磷酸盐、甲醇和乙腈的体积比为25～45：25～45：20～40，优选为35:35:30；所述稀释液的pH为9～11，优选为10.0；所述磷酸盐为磷酸二氢铵溶液，优选由磷酸二氢铵加水溶解、稀释，用氨试液调节pH值为10.0配制，磷酸二氢铵与水的质量体积比优选为1.73g：1000ml。本发明中，采用上述溶剂不干扰供试品溶液中19个已知杂质的有关物质测定。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，供试样品的制备包括：将阿奇霉素溶于所述稀释液中形成浓度为10mg/mL的溶液；对照溶液的制备包括：将所述供试样品稀释100～200倍，优选为100倍。
根据本发明实施例提供的一种阿奇霉素有关物质的检测方法，系统适用性溶液的制备方法为：将19种相关已知杂质物质和阿奇霉素配制成混合溶液；优选的，所述混合溶液中19种相关物质的浓度中，杂质G、D、K、QEP的浓度均为20μg/mL，杂质A、F、J、N、O、P、Q、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
根据本发明优选实施例提供的阿奇霉素有关物质的检测方法，包括如下步骤：
色谱柱：用小粒径十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择色谱柱填料粒径在1.7μm～3.5μm之间，规格在4.6×50mm～250mm之间，优选的色谱柱规格为：Waters
Figure BDA0002856062890000071
Shield RP18，4.6mm×250mm，3.5μm或Waters
Figure BDA0002856062890000072
Shield RP18，4.6mm×150mm，2.5μm；
流动相A：水相(0.05mol/L磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.20～8.25)和乙腈的体积比为90～98:10～2；
流动相B：流动相B为乙腈和甲醇的混合液，其比例为乙腈和甲醇的体积比为80～90:20～10；
柱温：45～50℃；
检测波长：208～212nm；
流速：0.7～0.9mL/min；
溶剂：磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值至10.0±0.05)-甲醇-乙腈(25～45％：25～45％：20～40％)；
梯度洗脱的程序为：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
供试样品的制备方法为，将阿奇霉素溶于所述溶剂中形成浓度为10mg/mL的溶液；对照品溶液的配制方法为将所述供试样品稀释100倍；
系统适用性溶液的制备方法为：将19种相关已知杂质物质和阿奇霉素配制成混合溶液，所述混合溶液中19种相关物质的浓度除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
根据本发明优选实施例提供的阿奇霉素有关物质的检测方法，包括如下步骤：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择规格Waters
Figure BDA0002856062890000081
ShieldRP18，4.6mm×250mm，3.5μm的色谱柱；
流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用20％磷酸溶液调节pH值至8.20～8.25)-乙腈(98:2)；
流动相B：乙腈-甲醇(90:10)；
柱温：45～48℃；
检测波长：210nm；
流速：0.8mL/min；
溶剂：取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30)；
采用梯度洗脱。
梯度洗脱的程序为：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
供试样品的制备方法为，将阿奇霉素溶于所述溶剂中形成浓度为10mg/mL的溶液；对照品溶液的配制方法为将所述供试样品稀释100倍；
系统适用性溶液的制备方法为：将19种相关已知杂质物质和阿奇霉素配制成混合溶液，所述混合溶液中19种相关物质的浓度除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
本发明的有益效果至少在于：本发明提供的方法可在高效液相色谱图中将阿奇霉素有关物质(包含阿奇霉素和19种杂质)完全分离开来；并通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏性和准确性进一步得到提升。该方法能够更好的控制阿奇霉素的质量，同时准确测定，分析专属性好、重现性高，便于对阿奇霉素的质量检测与监控，有利于阿奇霉素的安全推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种阿奇霉素系统适用性色谱图；
图2为本发明对比例提供的一种阿奇霉素系统适用性色谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径而得。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。
实施例1
本实施例提供一种高效液相色谱法测定阿奇霉素有关物质的方法，采用色谱条件方法进行测定：
色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，选择规格Waters
Figure BDA0002856062890000111
ShieldRP18，4.6mm×250mm，3.5μm的色谱柱；
流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用20％磷酸溶液调节pH值至8.20～8.25)-乙腈(98:2)；
流动相B：乙腈-甲醇(90:10)；
柱温：45～48℃；
检测波长：210nm；进样量：50μL
流速：0.8mL/min；
溶剂：取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30)；
采用梯度洗脱。
梯度洗脱的程序为：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％。
供试样品的制备方法为：将阿奇霉素溶于所述溶剂中形成浓度为10mg/mL的溶液；
对照品溶液的配制方法为：将所述供试样品稀释100倍。
系统适用性溶液的制备方法为：将将19种相关已知杂质物质和阿奇霉素配制成混合溶液，所述混合溶液中19种相关物质的浓度除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
各溶液的具体配置过程及本发明方法的试验验证过程及结果见实验例1～4。
实验例1系统适用性试验
各杂质定位溶液的配制：精密称取阿奇霉素杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q1、杂质Q2、杂质R、杂质S等19个杂质和阿奇霉素对照品各适量，分别加溶剂(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30))溶解并稀释制成除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
供试品溶液的配制：取阿奇霉素约100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30))使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
对照溶液的配制：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，加稀释液稀释(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30))至刻度，摇匀，即得(0.2％)；
系统适用性溶液的配制：取阿奇霉素杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q1、杂质Q2、杂质R、杂质S等19个杂质和阿奇霉素对照品各适量，分别加溶剂(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:35:30))溶解并稀释制成除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，阿奇霉素的浓度为10mg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
测定：流动相A：0.05mol/L磷酸氢二钾溶液(用20％磷酸溶液调节pH值至8.20～8.25)-乙腈(98:2)；
流动相B：乙腈-甲醇(90:10)；
柱温：45～48℃；
检测波长：210nm；进样量：50μL
流速：0.8mL/min；
采用梯度洗脱。
梯度洗脱的程序为：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％。
精密量取上述各杂质定位溶液及系统适用性溶液各50μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1～2，系统适用性色谱图见附图1。Result表示检测结果，RT表示保留时间，Area表示峰面积，Height表示峰高，％Area表示峰面积百分比，Resdution表示分离度，Plate court表示理论塔板数，Tailing表示拖尾因子。
表1专属性-定位试验结果
Figure BDA0002856062890000141
表2系统适用性试验结果
Figure BDA0002856062890000142
Figure BDA0002856062890000151
结论：210nm波长条件下，溶剂不干扰供试品溶液中各已知杂质的有关物质测定，各杂质之间，杂质与主峰之间均分离良好，各拖尾因子，理论踏板数均满足有关物质测定的要求。
实验例2线性与范围试验
溶剂：(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:15:50))。
线性样品溶液：精密称取阿奇霉素杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q1、杂质Q2、杂质R、杂质S和阿奇霉素对照品各适量，分别加溶剂溶解制成各贮备溶液，精密量取适量，用溶剂稀释成一系列线性样品溶液，摇匀，即得。
精密量取上述各溶液50μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表3。
表3线性与范围试验结果
Figure BDA0002856062890000161
Figure BDA0002856062890000171
Figure BDA0002856062890000181
Figure BDA0002856062890000191
结论：(1)阿奇霉素对照品在1.90μg/mL～18.95μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝47,709.1483x+12,199.1809R2＝0.9998，线性回归显著。
(2)杂质A在10.15μg/mL～101.50μg/mL的范围内，线性回归方程为Y＝2712.2880x+28,667.1213R2＝0.9994，线性回归显著。
(3)杂质B在10.21μg/mL～102.13μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝4,873.3894x+8,033.1617R2＝1.0000，线性回归显著。
(4)杂质C在4.06μg/mL～40.56μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝10,104.9430x-13,092.8691R2＝0.9994，线性回归显著。
(5)杂质D在3.90μg/mL～39.01μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝76,382.7246x-32,028.7936R2＝0.9995，线性回归显著。
(6)杂质E在0.06μg/mL～24.72μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝70673.2858x+2327.7480R2＝1.0000，线性回归显著。
(7)杂质F在9.73μg/mL～97.31μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝23,809.3820x+12,258.7968R2＝0.9999，线性回归显著。
(8)杂质G在4.07μg/mL～40.73μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝30,667.5193x+9,291.9798R2＝0.9999，线性回归显著。
(9)杂质H在9.93μg/mL～99.27μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝61,708.8349x-22,712.1798R2＝0.9998，线性回归显著。
(10)杂质I在10.04μg/mL～100.40μg/mL(的范围内，线性回归方程为y＝2,114.5730x+3,612.0957R2＝0.9998，线性回归显著。
(11)杂质J在9.32μg/mL～93.23μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝5,257.1277x+7,045.2660R2＝0.9996，线性回归显著。
(12)杂质K在3.96μg/mL～39.61μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝10,848.8293x-25,876.1947R2＝0.9997，线性回归显著。
(13)杂质L在3.96μg/mL～39.61μg/mL(的范围内，线性回归方程为y＝4,729.9061x+1,938.8681R2＝0.9993，线性回归显著。
(14)杂质M在9.77μg/mL～97.72μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝7,894.0359x-2,551.1798R2＝0.9998，线性回归显著。
(15)杂质N在9.88μg/mL～98.83μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝9,101.6113x-13,879.2947R2＝0.9999，线性回归显著。
(16)杂质O在10.14μg/mL～101.44μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝17,084.5679x+11,797.6447R2＝0.9999，线性回归显著。
(17)杂质Q1在4.15μg/mL～41.54μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝8,151.9946x+2,852.3106R2＝0.9995，线性回归显著。
(18)杂质Q2在10.02μg/mL～100.19μg/mL(相当于供试品浓度的0.00079％～0.2％)的范围内，线性回归方程为y＝61,482.8333x-20,573.9043R2＝0.9999，线性回归显著。
(19)杂质R在3.96μg/mL～39.57μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝8,639.2499x-6,525.5181R2＝0.9997，线性回归显著。
(20)杂质S在3.87μg/mL～38.72μg/mL的范围内，线性回归方程为y＝5,608.5166x+16,653.6617R2＝0.9999，线性回归显著。
实验例3回收率试验
溶剂：磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值至10.0±0.05)-甲醇-乙腈(35:35:30)。
系统适用性试验溶液：取阿奇霉素对照品50mg，精密称定，置5ml量瓶中，精密加入杂质A、B、D、E、F、H、I、J、L、M、N、O、Q2储备液(均为1mg/ml)各0.25ml，杂质C、G、K、Q1、R、S(均为1mg/ml)各0.1ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得；
杂质对照品储备液1：取杂质A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、O1、Q2、R、S对照品适量，加稀释液溶解并稀释制成每1ml含有2mg的溶液，即得。
杂质对照品储备液2：取杂质A、B、D、E、F、H、I、J、L、M、N、O、Q2储备液1各5ml，杂质C、G、K、Q1、R、S贮备液1各2ml，同置100ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得。
杂质对照品液：精密量取5ml杂质对照品贮备液2，置10mL量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为杂质对照品混合溶液1。
准确度溶液的配制：
R1-50％溶液的配制：精密称取阿奇霉素约100mg，置10ml量瓶中，精密加入2.5ml杂质对照品储备液2使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
R2-100％溶液的配制：精密称取阿奇霉素约100mg，置10ml量瓶中，精密加入5ml杂质对照品储备液2使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
R3-200％溶液的配制：精密称取阿奇霉素约100mg，置10ml量瓶中，精密加入10ml杂质对照品储备液2使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制3份。
本底溶液的配制：
临用新制。精密称取本品适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，即得。
精密量取上述溶液各50μL，分别注入液相色谱仪，结果见表4～23。
表4有关物质方法验证-准确度本底溶液结果
Figure BDA0002856062890000221
Figure BDA0002856062890000231
本品本底溶液中19个已知杂质除杂质B、F、H、J、K、有检出本底含量外，其他已知杂质均未检出，故在本品分析方法准确度计算时，勿需扣除本底量。
表5有关物质方法验证-杂质A回收率结果
Figure BDA0002856062890000232
表6有关物质方法验证-杂质B回收率结果
Figure BDA0002856062890000233
Figure BDA0002856062890000241
表7有关物质方法验证-杂质C回收率结果
Figure BDA0002856062890000242
表8有关物质方法验证-杂质D回收率结果
Figure BDA0002856062890000243
Figure BDA0002856062890000251
表9有关物质方法验证-杂质E回收率结果
Figure BDA0002856062890000252
表10有关物质方法验证-杂质F回收率结果
Figure BDA0002856062890000253
表11有关物质方法验证-杂质G收率结果
Figure BDA0002856062890000254
Figure BDA0002856062890000261
表12有关物质方法验证-杂质H收率结果
Figure BDA0002856062890000262
表13有关物质方法验证-杂质I收率结果
Figure BDA0002856062890000263
Figure BDA0002856062890000271
表14有关物质方法验证-杂质J收率结果
Figure BDA0002856062890000272
表15有关物质方法验证-杂质K收率结果
Figure BDA0002856062890000273
表16有关物质方法验证-杂质L率结果
Figure BDA0002856062890000281
表17有关物质方法验证-杂质M率结果
Figure BDA0002856062890000282
表18有关物质方法验证-杂质N率结果
Figure BDA0002856062890000283
Figure BDA0002856062890000291
表19有关物质方法验证-杂质O率结果
Figure BDA0002856062890000292
表20有关物质方法验证-杂质Q1率结果
Figure BDA0002856062890000293
表21有关物质方法验证-杂质Q2率结果
Figure BDA0002856062890000301
表22有关物质方法验证-杂质R率结果
Figure BDA0002856062890000302
表23有关物质方法验证-杂质S率结果
Figure BDA0002856062890000303
Figure BDA0002856062890000311
结论：杂质回收率试验结果显示，杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q1、杂质Q2、杂质R、杂质S回等19个已知杂质回收率测定的均值在95.3％～103.7％之间，平均回收率分别为101.1％、101.3％、97.5％、99.7％、96.4％、101.8％、99.4％、96.2％、100.5％、101.1％、102.2％、98.3％、99.6％、102.0％、100.5％、101.6％、100.0％、100.7％、101.5％，上述试验结果数据表明，各杂质测定的回收率结果均符合相关规定的要求，满足本品对各已知杂质的有关物质测定，表明本方法准确度良好。
实验例4耐用性试验
采用本方法测定19个已知杂质，受多种因素测定影响，尤其是其中杂质D和杂质I，以及杂质A和Q2几个杂质受温度以及流动相pH影响比较大，该方法会因仪器设备以及室内温度变化要调整流动相柱子温度在46℃～50℃范围内，将系统适用性调至符合分离度要求的条件才可以进行进一步进行测定，故本方法除了波长变化外，其他的条件变化均不能准确测定全部已知杂质，耐用性不够好。
空白溶剂(稀释剂)：磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值至10.0±0.05)-甲醇-乙腈(35:35:30)。
系统适用性溶液：取阿奇霉素杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I、杂质J、杂质K、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质Q1、杂质Q2、杂质R、杂质S等19个杂质和阿奇霉素对照品各适量，分别加溶剂(磷酸二氢铵1.73g，加水溶解并稀释至1000ml，用氨试液调节pH值为10.0)-甲醇-乙腈(35:15:50))溶解并稀释制成除G、D、K、QEP(Q2)四中已知杂质均为20μg/mL外，其他杂质A、F、J、N、O、P、Q(Q1)、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，阿奇霉素的浓度为10mg的混合溶液，作为系统适用性溶液；
供试品溶液：精密称取本品适量，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，即得。
对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：精密量取上述溶液各50μL，分别在检测波长变化±2nm、流动相pH值变化±0.1、流速变化±0.1下，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表24～25。
表24有关物质方法验证-耐用性分离度结果
Figure BDA0002856062890000321
Figure BDA0002856062890000331
表25有关物质方法验证-耐用性测定结果
Figure BDA0002856062890000332
Figure BDA0002856062890000341
结论：由试验结果可知，本品不同的流动相pH值变化、流速变化均不能达到良好的分离效果，在变换仪器及色谱柱是都需要微调柱子温度在45～48℃之间，在不同的波长耐用性良好，有关物质检测结果基本一致。由于本品已知杂质受温度、pH值，以及流动相配制等多种因素影响，本方法的耐用性不够好，需要专门的色谱柱测定。
对比例1
本对比例采用较大填料粒径5μm(Waters
Figure BDA0002856062890000343
Shield RP18，4.6mm×250mm，5μm)进行，以与实施例1相同方法测定，结果采用超出粒径3.5μm以上的色谱柱测定阿奇霉素有关物质，不能将全部19个已知杂质全部达最佳分离状态(≥1.5)，有部分杂质不能完全分离，尤其是杂质D和I重合一起，大部分杂质理论塔板数及分离度低于实施例1中数据。结果见表26，系统适用性色谱图见附图2。
表26对比例系统适用性测定结果
Figure BDA0002856062890000342
Figure BDA0002856062890000351
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种阿奇霉素有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法进行检测，其特征在于，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以流动相A和流动相B的混合液为流动相，通过梯度洗脱的方式对待测样品进行检测；所述流动相A为水相与乙腈的混合溶液，所述流动相B为乙腈和甲醇的混合液。
2.根据权利要求1所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱：以所述流动相的总体积为100％计，
0～5min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％；
5～45min，所述流动相A的体积分数由65％降低至32％，所述流动相B的体积分数由35％增加至68％；
45～65min，所述流动相A的体积分数维持在32％，所述流动相B的体积分数维持在68％；
65～70min，所述流动相A的体积分数由32％增加至65％，所述流动相B的体积分数由68％降低至35％；
70～80min，所述流动相A的体积分数维持在65％，所述流动相B的体积分数维持在35％。
3.根据权利要求1或2所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相A中，所述水相和乙腈的体积比为90～98:10～2，优选为98:2；所述水相的制备：0.05mol/L的磷酸氢二钾溶液用20％磷酸溶液调节pH值至8.10～8.30，优选为8.20；所述流动相B中，乙腈和甲醇的体积比为80～90:20～10。
4.根据权利要求1～3任一项所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，在紫外检测波长为205～215nm的条件下进行检测，优选为208～212nm，更优选为210nm。
5.根据权利要求1～4任一项所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，柱温为45～50℃，优选为45～48℃。
6.根据权利要求1～5任一项所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.7～0.9mL/min，优选为0.8mL/min。
7.根据权利要求1～6任一项所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所用的色谱柱填料为小粒径十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，色谱柱粒径为1.7～3.5μm；色谱柱规格为4.6mm×50～250mm，优选为：Waters
Figure FDA0002856062880000021
Shield RP18，4.6mm×250mm，3.5μm或Waters
Figure FDA0002856062880000022
Shield RP18，4.6mm×150mm，2.5μm。
8.根据权利要求1～7任一项所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，所述待测样品用溶剂稀释液为磷酸盐、甲醇和乙腈的混合液，磷酸盐、甲醇和乙腈的体积比为25～45：25～45：20～40，优选为35:35:30；所述稀释液的pH为9～11，优选为10.0；所述磷酸盐为磷酸二氢铵溶液，优选由磷酸二氢铵加水溶解、稀释，用氨试液调节pH值为10.0配制，磷酸二氢铵与水的质量体积比优选为1.73g：1000ml。
9.根据权利要求8所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，供试样品的制备包括：将阿奇霉素溶于所述稀释液中形成浓度为10mg/mL的溶液；对照溶液的制备包括：将所述供试样品稀释100～200倍，优选为100倍。
10.根据权利要求8或9所述的阿奇霉素有关物质的检测方法，其特征在于，系统适用性溶液的制备方法为：将19种相关已知杂质物质和阿奇霉素配制成混合溶液；优选的，所述混合溶液中19种相关物质的浓度中，杂质G、D、K、QEP的浓度均为20μg/mL，杂质A、F、J、N、O、P、Q、S、C、E、H、I、L、M、R的浓度均为50μg/mL，所述阿奇霉素的浓度为10mg。
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