CN106970177B

CN106970177B - 帕博西尼中间体及其杂质的分析检测方法

Info

Publication number: CN106970177B
Application number: CN201710417790.7A
Authority: CN
Inventors: 甘兴杰; 王立强
Original assignee: Beijing Yuan Yuan Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Current assignee: Beijing Yuan Yuan Pharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2017-06-06
Filing date: 2017-06-06
Publication date: 2018-05-15
Anticipated expiration: 2037-06-06
Also published as: CN106970177A

Abstract

本发明涉及帕博西尼中间体及其杂质的分析检测方法。具体而言，本发明涉及一种帕博西尼中间体质量分析的方法，该方法包括使用高效液相色谱法对帕博西尼中间体进行质量分析的步骤。本发明方法中使用的色谱柱是C18色谱柱，柱温是28～45℃。本发明用高效液相色谱法，在一定色谱条件下有效分离帕博西尼中间体及其各杂质，通过该方法能准确的测定帕博西尼中间体中各个杂质的含量。

Description

帕博西尼中间体及其杂质的分析检测方法

技术领域

本发明属于药物分析化学领域，涉及对抗肿瘤药帕博西尼的中间体的质量进行分析的方法，具体涉及采用反相高效液相色谱法(HPLC)分离测定帕博西尼的中间体及其相关杂质的分析方法。

背景技术

帕博西尼是一种周期蛋白依赖性激酶(CDK)4和CDK6的抑制剂。周期蛋白D1和CDK4/6是导致细胞增殖信号通路的下游。在体外，帕博西尼通过阻断细胞从细胞周期G1进入S期的进展从而减少雌激素受体(ER)-阳性乳腺癌细胞株的细胞增殖。帕博西尼和抗雌激素联合给药与单独各个药物给药对比，可以减少视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)磷酸化从而导致E2F表达并阻止生长增加。在体外用帕博西尼和抗雌激素联合处理ER-阳性乳腺癌细胞株可导致细胞衰老增加，在药物去除后该作用可持续6天。体内研究用一种患者-分离的ER-阳性乳腺癌异种移植动物模型显示，帕博西尼和来曲唑联合给药与各个药物单独比较，Rb磷酸化，下游信号和肿瘤生长的抑制作用增加。

2015年2月3日FDA加速批准了辉瑞公司帕博西尼(palbociclib，)上市，上市剂型为胶囊剂，规格为75mg、100mg和125mg。帕博西尼联合来曲唑作为内分泌治疗为基础的初始方案，治疗绝经期女性雌激素受体受体(ER)-阳性，人表皮生长因子受体2(HER2)-阴性的绝经后妇女晚期乳腺癌。

帕博西尼的分子式为C24H29N7O2，分子量为447.54，其化学名为：6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基]氨基}吡咯并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮，英文化学名：6-acetyl-8-cyclopentyl-5-methyl-2-{[5-(piperazin-1-yl)pyridin-2yl]amino}pyrido[2,3-d]pyrimidin-7(8H)-one，其化学结构式为：

帕博西尼为黄色至橙色粉末，其在等于或低于pH 4时是高溶解性化合物，但在高于pH 4时该药物溶解性显著降低。辉瑞公司出售的帕博西尼胶囊中的辅料包括微晶纤维素、乳糖一水合物、淀粉羟乙酸钠、胶体二氧化硅、硬脂酸镁。

在帕博西尼的化学合成过程中，涉及到如下式I所示关键中间体：

分子式：C₃₃H₄₅N₇O₄

分子量：603.75

化学名称：4-(6-((6-(1-丁氧基乙烯基)-8-环戊基-5-甲基-7-氧代-7,8-二氢吡啶并[2,3-d]嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯

上述式I所示帕博西尼的中间体，其在本发明中亦可称为“式I化合物”、“式I中间体”、“帕博西尼的中间体”、“帕博西尼中间体”等或类似表述。

式I所示帕博西尼的中间体的质量对最终产物帕博西尼的质量及产率有较大的影响，因此通常将该式I中间体作为关键控制点进行严格控制。

在合成式I的帕博西尼中间体的工艺中，通常会引入如下表1所示的七种杂质。、

表1：

因此，实现式I帕博西尼中间体及其杂质间的有效分离对其准确测定相关杂质的量具有重大的意义。因此，本领域技术人员迫切期待提供一种针对式I帕博西尼中间体中的相关物质的检测、定量测定的有效的新方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于控制帕博西尼中间体质量的有效方法，特别是提供一种针对式I帕博西尼中间体中的相关物质的检测、定量测定的有效的新方法。本发明人已经出人意料的发现，采用特定的反相高效液相色谱分析条件例如C18色谱柱分离测定帕博西尼中间体相关物质的高效液相色谱方法，例如使用乙腈-乙酸铵缓冲液作为流动相，可以有效的实现帕博西尼中间体及其相关杂质的分离及定量测定。本发明基于此发现而得以完成。

为此，本发明第一方面提供了一种帕博西尼中间体质量分析方法，该方法包括使用高效液相色谱法对式I所示的帕博西尼的中间体进行质量分析的步骤：

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的填料粒度为3～10μm，优选填料粒度为5μm。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的内径为3～10mm，优选色谱柱的内径为4.6mm。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的柱长为150～300mm，优选色谱柱的柱长为150mm。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱的填料粒度为5μm，色谱柱的内径为4.6mm，色谱柱的柱长为150mm。以上型号参数可以写简写为5μm，4.6×210mm，或简写为4.6mm×150mm×5μm，或其它类似简写方式。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是C18色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法使用的色谱柱是品牌为waters的C18色谱柱。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法分离分析时色谱柱的柱箱温度是28～45℃，例如30～35℃，例如约30℃。本发明已经发现，在柱温箱温度为30～35℃的范围内具有相当好的分离效果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用A、B两种流动相。流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈。流动相A的摩尔浓度为0.01M～0.05M，例如0.01M～0.02M，例如0.01M，本发明已经发现，在流动相A的摩尔浓度为0.01M～0.02M的范围内具有相当好的分离效果。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法是使用A、B两种流动相。流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈。洗脱方式为梯度洗脱。特定的线性洗脱程序如下：

时间(分钟)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	70	30
5	55	45
			25	52	48
35	15	85
			45	15	85
45.01	70	30
			55	70	30

本发明已经发现，本品按照上述特定的洗脱方式进行线性洗脱，各相关物质均具有相当好的分离效果。在本发明下文具体实验中，如未特别说明，所用的流动相洗脱是照上述线性洗脱程序进行洗脱的。

在一个实施方案中，所述的醋酸铵缓冲液pH值为2.0～8.0，例如pH值为6.0～7.0，例如pH为6.6±0.05。本发明已经发现，在pH值为6.0～7.0的范围内具有相当好的分离效果。0.01M醋酸铵缓冲液pH值即为6.6±0.05，如若需调整缓冲液pH值，调节的酸或碱包括乙酸、甲酸、磷酸、盐酸、酒石酸、草酸、氨水等，优选乙酸。在本发明下文具体实验中，如未特别说明，所用的流动相A为0.01M醋酸铵缓冲液，其pH值为6.6±0.05。

在一个实施方案中，所述的醋酸铵缓冲液是通过以下步骤获得的：称取乙酸铵0.77g，加去离子水1000ml溶解并过滤即得。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中流动相的流速为0.8ml/min～1.2ml/min，流动相的流速优选为0.9ml/min～1.1ml/min，流动相的流速优选1.0ml/min。

根据本发明第一方面的方法，其中所述高效液相色谱法中检测器为紫外检测器。在一个实施方案中，所述检测器所用的检测波长是230nm～240nm,优选的检测波长为235nm。

根据本发明第一方面的方法，帕博西尼中间体的测定浓度为0.1～2.0mg/ml，优选帕博西尼中间体的测定浓度为0.5～1.5mg/ml，优选帕博西尼中间体的测定浓度为1.0mg/ml。

根据本发明第一方面的方法，帕博西尼中间体峰的保留时间为35～45min，优选帕博西尼中间体峰的保留时间为38～42min。

根据本发明第一方面的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试的样品供试液是如下方式配制的：取帕博西尼中间体适量，加二氯甲烷或三氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中含帕博西尼中间体0.1～2.0mg/ml的溶液，特别是配制成0.5～1.5mg/ml，特别是配制成1.0mg/ml。

根据本发明第一方面的方法，其中用于进行高效液相色谱法测试时，测试溶液注入液相色谱仪的量为10～50μl，例如10～20μl。

根据本发明第一方面的方法，该方法包括以下步骤：

(1)、取帕博西尼中间体样品适量，加二氯甲烷或三氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中含帕博西尼中间体0.1～2.0mg/ml的溶液，作为供试品溶液；

(2)、精密量取步骤(1)的溶液1.0ml，置200ml容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(浓度相当于供试品溶液的0.5％)；

(3)、取帕博西尼中间体、PB-1A杂质和PB-2D杂质以及任选的其它杂质(例如PB-SM1、PB-SM2、PB-1、PB-2B和PB-2A)适量，加二氯甲烷或三氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中约含5μg的PB-1A、5μg的PB-2D和1000μg的帕博西尼中间体的溶液(在包括其它杂质时其它杂质的浓度亦给为5μg/ml)，作为系统适用性溶液；

(4)、设置流动相的流速0.8ml/min～1.2ml/min；使用紫外检测器，检测波长为：230nm～240nm；使用WatersC18色谱柱(4.6mm×150mm×5μm)；色谱柱的柱箱温度为：30～35℃；流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱；

(5)、取步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)所得的溶液10～50μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积；

(6)、按照步骤(5)读取的杂质信息，按照加校正因子的主成分自身对照法进行计算杂质PB-1A(校正因子为0.71)和杂质PB-2D(校正因子为0.79)的含量；

(7)、杂质PB-1A和杂质PB-2D含量计算公式为：步骤(1)供试品溶液中该杂质的峰面积×该杂质的校正因子/步骤(2)对照溶液主成分的峰面积×0.5；

(8)、未知杂质含量计算公式为：步骤(1)供试品溶液中该未知杂质的峰面积/步骤(2)对照溶液主成分的峰面积×0.5。

根据本发明的方法，其任一实施方案可以与其他方案任意进行组合，只要这种组合不会出现矛盾。

下面对本发明作进一步详细描述。

在本发明中，采用十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱(C18)进行帕博西尼中间体相关物质分析测定，并采用线性梯度进行洗脱，以保证帕博西尼中间体相关物质能够达到有效的分离，相关杂质均能有效的完全被洗脱检测出来，在此条件下能准确、有效的控制帕博西尼中间体的质量。

在本发明中，供试品先采用适量二氯甲烷或三氯甲烷进行溶解，再用乙腈进行稀释至检测所需浓度1.0mg/ml。适量二氯甲烷或三氯甲烷是指在将各种物质溶解时以其基本可以溶解的量或者稍多于可以溶解的量添加二氯甲烷或三氯甲烷；已经发现，本发明涉及的帕博西尼、其式I中间体、表1所示七种杂质在每1ml的二氯甲烷或三氯甲烷中溶解量均可达到50mg的量，并且在此溶解浓度的情况下再加入醋酸铵缓冲液、乙腈或醋酸铵缓冲液-乙腈1：1混合液时这些物质不会析出沉淀，因此，在本发明一个实施方案中，二氯甲烷或三氯甲烷的添加适量均是指：以达到每溶解帕博西尼、其式I中间体和表1所示七种杂质这些物质之一量或任意组合总量为50mg溶质的量添加1ml二氯甲烷或三氯甲烷。采用上述方式用二氯甲烷或三氯甲烷进行溶解供试品，以保证供试品中含有的相关杂质能完全溶解，以保证此方法能准确、有效的控制帕博西尼中间体的质量。

在一个实施方案中，本发明所说的用反相高效液相色谱法分离测定帕博西尼中间体的有关物质的方法，是以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，是以醋酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，采用线性梯度洗脱。

在一个实施方案中，上述所用的色谱柱选自品牌为Waters的C18色谱柱。

在一个实施方案中，本发明所述的质量分析方法，可按以下方法实现：

(1)、取帕博西尼中间体样品适量，加二氯甲烷或三氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中含帕博西尼中间体0.1～2.0mg/ml的溶液，优选是配制成1.5mg/ml的供试品溶液，优选是配制成1.0mg/ml的供试品溶液；

(4)、设置流动相的流速0.8ml/min～1.2ml/min，优选流速为1.0ml/min；使用紫外检测器或二极管阵列检测器，优选紫外检测器；检测波长为：230nm～240nm，优选235nm；使用WatersC18色谱柱(4.6mm×150mm×5μm)；色谱柱的柱箱温度为：30～35℃，优选30℃；流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，线性洗脱程序见下表：

(5)、取步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)所得的溶液10～50μl，优选20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积。

在一个实施方案中，高效液相色谱仪可以是使用岛津高效液相色谱仪LC-10ATvp/LC-10AD/LC-20A/LC-2010AHT，也可以采用其它色谱系统。

在一个实施方案中，使用的色谱柱为C18，填料粒度可以是3～10μm，优选5μm；柱内径可以是3～10mm，优选4.6mm；柱长可以是150～300mm，优选150mm。

在一个实施方案中，使用的色谱柱的柱温：30℃。

在一个实施方案中，使用的流动相：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈。流动相A的醋酸铵摩尔浓度为0.01M～0.05M，例如0.01M～0.02M，例如0.01M，。

在一个实施方案中，流动相的流速为1.0ml/min。

在一个实施方案中，洗脱方式为线性梯度洗脱。

在一个实施方案中，使用的检测器的检测波长为235nm。

在一个实施方案中，液相分析进样体积为20μl。

本发明采用C₁₈色谱柱，乙酸铵缓冲液作为流动相A，乙腈作为流动相B，洗脱方式采用特定的线性梯度洗脱，能够有效的分离帕博西尼中间体及其相关杂质。选用二氯甲烷或三氯甲烷先溶解样品，再用乙腈稀释样品，以保证样品中的杂质均能有效的溶解，能够有效的将杂质分离检出。本发明解决了分离测定帕博西尼中间体已知杂质和未知杂质测定问题，从而保证了帕博西尼中间体的质量可控。

附图说明

图1、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图。

图2、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为1.0ml/min时的供试品HPLC图。

图3、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为0.9ml/min时的系统适用性HPLC图。

图4、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为0.9ml/min时的供试品HPLC图。

图5、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为1.1ml/min时的系统适用性HPLC图。

图6、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为30℃，流速为1.1ml/min时的供试品HPLC图。

图7、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为25℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图。

图8、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为25℃，流速为1.0ml/min时的供试品HPLC图。

图9、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的系统适用性HPLC图。

图10、流动相为：流动相A为醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；洗脱方式为特定的线性梯度洗脱，色谱柱为C18柱，柱温为35℃，流速为1.0ml/min时的供试品HPLC图。

具体实施方式

通过以下实例对本发明做进一步说明，但应该理解，以下实例不限于本发明的范围。

以下各实施例和对照例使用的试剂可从市场上容易地购得。

实施例1

仪器及条件：

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪及岛津LC-solution工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(WatersC18，4.6mm×150mm×5μm)；以0.01M醋酸铵缓冲液为流动相A(未经调节其pH值为6.6)，乙腈为流动相B，按上文洗脱梯度表进行线性梯度洗脱；检测波长为235nm；柱温箱柱温为30℃；流动相流速为1.0ml/min；液相分析进样体积为20μl。

试验步骤：

杂质储备液的配制：取PB-SM1、PB-SM2、PB-1A、PB-1、PB-2D、PB-2B和PB-2A对照品适量，精密称定，加二氯甲烷溶解并制成每1ml溶液中含有PB-SM1 0.2mg、PB-SM2 0.2mg、PB-1A0.2mg、PB-1 0.2mg、PB-2D 0.2mg、PB-2B 0.2mg和PB-2A0.2mg的溶液，作为杂质储备液。

系统适用性溶液的配制：取帕博西尼中间体对照品约10mg，加杂质储备液0.25ml，置10ml量瓶中，加二氯甲烷溶解并加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得；[该系统适用性试验溶液中包含式I中间体和另外七种杂质共8种特定添加的物质]

供试品溶液的配制：取帕博西尼中间体约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加二氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果分别见图1和图2。

由图1可知，系统适用性溶液中各已知杂质、未知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；另外，该系统适用性试验溶液中包含式I中间体和另外七种杂质共8种特定添加的物质，这8种物质在图1中均有体现并且可通过配制单一的杂质溶液而不是配制上述7种物质全体的形式的杂质储备液来容易的对它们进行归属，例如图1中RT28.784为已知杂质PB-1A，RT36.204为已知杂质PB-2D，RT39.209为式I中间体。下文其它实例亦可容易的对各物质进行归属。

由图2可知，供试品溶液中共检出6个杂质，其中RT28.893为已知杂质PB-1A，RT36.246为已知杂质PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5。供试品先采用二氯甲烷进行溶解样品，再用乙腈稀释，能使帕博西尼中间体中各杂质能有效的分离检出。

实施例2

仪器及条件：

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪及岛津LC-solution工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(WatersC18，4.6mm×150mm×5μm)；以0.01M醋酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，按上表进行线性梯度洗脱；检测波长为235nm；柱温箱柱温为30℃；流动相流速为0.9ml/min；液相分析进样体积为20μl。

试验步骤：

系统适用性溶液的配制：取帕博西尼中间体对照品约10mg，加杂质储备液0.25ml，置10ml量瓶中，加二氯甲烷溶解并加乙腈稀释至刻度，摇匀，即得

精密量取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果分别见图3和图4。

由图3可知，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；由图4可知，供试品溶液中共检出6个杂质，其中RT30.194为已知杂质PB-1A，RT37.024为已知杂质PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5。供试品先采用二氯甲烷进行溶解样品，再用乙腈稀释，能使帕博西尼中间体中各杂质能有效的分离检出。

实施例3

仪器及条件：

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪及岛津LC-solution工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(Waters C18，4.6mm×150mm×5μm)；以0.01M醋酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，按上表进行线性梯度洗脱；检测波长为235nm；柱温箱柱温为30℃；流动相流速为1.1ml/min；液相分析进样体积为20μl。

试验步骤：

精密量取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果分别见图5和图6。

由图5可知，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；由图6可知，供试品溶液中共检出6个杂质，其中RT27.240为已知杂质PB-1A，RT35.533为已知杂质PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5。供试品先采用二氯甲烷进行溶解样品，再用乙腈稀释，能使帕博西尼中间体中各杂质能有效的分离检出。

实施例4

仪器及条件：

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪及岛津LC-solution工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(WatersC18，4.6mm×150mm×5μm)；以0.01M醋酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，按上表进行线性梯度洗脱；检测波长为235nm；柱温箱柱温为25℃；流动相流速为1.0ml/min；液相分析进样体积为20μl。

试验步骤：

精密量取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果分别见图7和图8。

由图7可知，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.2，达到有效分离，系统适用性良好；由图8可知，供试品溶液中共检出6个杂质，其中RT29.245为已知杂质PB-1A，RT36.637为已知杂质PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5。供试品先采用二氯甲烷进行溶解样品，再用乙腈稀释，能使帕博西尼中间体中各杂质能有效的分离检出。

实施例5

仪器及条件：

岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪及岛津LC-solution工作站；十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(WatersC18，4.6mm×150mm×5μm)；以0.01M醋酸铵缓冲液为流动相A，乙腈为流动相B，按上表进行线性梯度洗脱；检测波长为235nm；柱温箱柱温为35℃；流动相流速为1.0ml/min；液相分析进样体积为20μl。

试验步骤：

精密量取系统适用性溶液和供试品溶液各20μl，按上述色谱条件进行色谱分析，记录色谱图，结果分别见图9和图10。

由图9可知，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于2.0，达到有效分离，系统适用性良好；由图10可知，供试品溶液中共检出6个杂质，其中RT28.474为已知杂质PB-1A，RT35.883为已知杂质PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5。供试品先采用二氯甲烷进行溶解样品，再用乙腈稀释，能使帕博西尼中间体中各杂质能有效的分离检出。

实施例6

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在配制流动相A相时，配制成不同的pH值，然后照实施例1的方法对系统适用性溶液进行检测，以检测可分开的杂质个数以及全部的色谱峰中任意相邻两峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同pH值条件的流动相A在梯度洗脱中的分离效果，进样体积为20μl。结果如下：

流动相A的pH值	可分开的杂质个数	最小分离度
			7.0	6	1.68
6.6	6	1.69
			6.0	6	1.57
5.5	5	1.44
			5.0	5	1.36
4.0	5	1.25
			3.5	4	1.26
3.0	4	1.21

对于药物的高效液相色谱分析而言，本领域技术人员清楚，通常而言，对于杂质与杂质之间，可接受的分离度为大于1.2。主成分与杂质之间，可接受的分离度为大于1.5。通常认为分离度大于1.5时认为可以满足质量控制方法的要求的标准。本发明出人意料的发现，在使用梯度洗脱的过程中，当流动相A的pH值在6.0～7.0的范围内，各色谱峰与相邻峰之间的分离度均大于1.5，有良好的系统适用性，对于供试品而言，可以准确的测定各杂质的含量；在低的pH值范围时，有些杂质出峰时间重合，不能有效的分离，不能满足一般分析测定的要求，对于化学药品严格的质量控制是不可取的，因为本品作为帕博西尼的关键中间体，对帕博西尼纯度和产率有着很大的影响。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的流动相A的pH值在6.0～7.0范围内，而0.01M乙酸铵溶液pH值即在6.6±0.05左右，因此本发明的实施方案中采用0.01M乙酸铵缓冲溶液。

实施例7

基本上与实施例1相同的方法，不同的是在进行分离测定时采用不同的色谱柱温度，照实施例1的方法对系统适用性溶液进行检测，以检测可分开的杂质个数以及全部的色谱峰中任意相邻两峰之间的分离度的最小值为指标，考察不同的色谱柱温度在梯度洗脱中的分离效果，进样体积为20μl。结果如下：

色谱柱柱温(℃)	可分开的杂质个数	最小分离度
			25	5	1.18
28	6	1.51
			30	6	1.69
32	6	1.71
			35	6	2.11
38	6	2.22
			40	6	2.35
42	6	2.41
			45	6	2.54

本发明人出人意料的发现，在使用梯度洗脱的过程中，当色谱柱的柱温在28～45℃的范围内时，系统适用性溶液中各杂质峰与相邻峰之间峰分离度均大于1.5，能准确、有效的检出供试品的相关杂质。但在低于此温度时，系统使用性溶液中杂质的分离度明显降低，不能准确的测定供试品溶液各杂质。因此在本发明一个特别优选的实施方案中，使用的柱温为28～45℃，优选的柱温为30℃。

实施例8

基本上与实施例1相同的方法，不同的是使用230nm、235nm、240nm三种波长进行检测，照实施例1的方法对系统适用性溶液和供试品溶液进行检测，以检测可分开的杂质个数以及全部的色谱峰中任意相邻两峰之间的分离度的最小值为指标，以及供试品溶液中检测的各杂质的含量为指标，考察不同检测波长在梯度洗脱中的分离效果和各杂质含量测定结果，进样体积为20μl。结果与实施例1的结果基本相同，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；供试品溶液中共检出6个杂质，其中已知杂质检出PB-1A和PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5，供试品溶液中各杂质的含量与实施例1中结果一致。表明帕博西尼中间体中各杂质在230nm～240nm之间响应因子未有明显变化，因此在此波长范围内测定均可满足要求。

实施例9

基本上与实施例1相同的方法，不同的是配制系统适用性溶液及供试品溶液的浓度为0.5mg/ml、1.0mg/ml或2.0mg/ml的溶液进行检测。结果与实施例1的结果基本相同，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；供试品溶液中共检出6个杂质，其中已知杂质检出PB-1A和PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5，供试品溶液中各杂质的含量与实施例1中结果一致。表明帕博西尼中间体供试品浓度在0.5mg/ml～2.0mg/ml范围内测定均可满足要求。

实施例10

基本上与实施例1相同的方法，不同的是流动相A的摩尔浓度为0.01M、0.02M或0.05M，照实施例1的方法对系统适用性溶液和供试品溶液进行检测，以检测可分开的杂质个数以及全部的色谱峰中任意相邻两峰之间的分离度的最小值为指标，以及供试品溶液中检测的各杂质的含量为指标，考察不同检测波长在梯度洗脱中的分离效果和各杂质含量测定结果，进样体积为20μl。结果与实施例1的结果基本相同，系统适用性溶液中各已知杂质与主成分之间，杂质与杂质之间分离度均大于1.5，达到有效分离，系统适用性良好；供试品溶液中共检出6个杂质，其中已知杂质检出PB-1A和PB-2D，其它杂质均为未知杂质，供试品溶液中各杂质与主成分之间，杂质与杂质之间的分离度均大于2.5，供试品溶液中各杂质的含量与实施例1中结果一致。表明流动相A的摩尔浓度为0.01M～0.05M范围内均可满足要求。

实施例11

使用实施例1的方法，测定6批帕博西尼中间体。按照药物分析领域对药品及帕博西尼原料药对本品控制的要求进行测定。结果表明，6帕博西尼中间体均能检出6～11个杂质，其中已知杂质为PB-1A和PB-2D，其它杂质均为未知杂质。因此实施例1方法能对帕博西尼中间体质量进行有效的控制。

实施例12

参照以上实施例1，另外精密量取实施例中所配的供试品溶液1.0ml，置200ml容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(浓度相当于供试品溶液的0.5％)，该对照溶液与供试品溶液一样注入色谱仪进行试验，得到对照溶液色谱图。读取供试品溶液色谱图中各杂质信息，按照加校正因子的主成分自身对照法进行计算杂质PB-1A(校正因子为0.71)和杂质PB-2D(校正因子为0.79)的含量。杂质PB-1A和杂质PB-2D含量计算公式为：供试品溶液色谱图中该杂质峰面积×该杂质的校正因子/对照溶液色谱图中主成分峰面积×0.5。未知杂质含量计算公式为：供试品溶液色谱图中该未知杂质峰面积/对照溶液色谱图中主成分峰面积×0.5。表1中的其它5种杂质(若在供试品溶液中出现)的含量亦可照未知杂质含计算公式进行计算。类似的，分别参照上文实施例2至实施例11，照以上方式，可以计算出供试品中各种已知杂质的含量和未知杂质的含量。对于同一批式I中间体供试品，经计算，在用上述实施例1至实施例11方法对该批供试品测试时，除了检测到杂质PB-1A和杂质PB-2D外，其它杂质均未检测到。该批供试品中上述11个实施例中测定的杂质PB-1A的含量均在0.243～0.251％范围内，测定的杂质PB-2D的含量均在0.028～0.036％范围内，不同试验之间的区别不明显。上述实施例1至实施例5中的各供试品溶液色谱图是针对不同批次式I中间体进行测定的结果。

由于杂质PB-1A和杂质PB-2D在供试品溶液中的含量是非常低的，因此对它们的测定精密度也希望要相对的高。上述杂质PB-1A和杂质PB-2D含量介于0.01～0.5％范围时，药物分析方法领域技术人员通常要求这种含量的杂质其本身在测定时的精密度以相对标准偏差RSD表征时要求RSD小于2％，如果对于供试品溶液中的式I中间体这样的浓度则通常要求RSD小于1％。该RSD是指对于同一瓶供试品溶液在连续进样6次时所得6个色谱图中某物质峰面积6个数值之间经计算所得的相对标准偏差。已经发现，上述实施例1至实施例11方法中，式I中间体的RSD均在0.23～0.27％范围内，杂质PB-1A的RSD均在1.85～1.94％范围内，杂质PB-2D的RSD均在1.81～1.96％范围内，显示式I中间体具有优良的精密度，而另外两种杂质的精密度虽然基本满足要求但是接近于不可接受的范围。本发明人在补充的试验中，照上述实施例1至实施例11，不同的仅是分别在流动相A中再添加1μmol/L的D型酒石酸钾钠并在必要时用醋酸或氨水调节pH值至与各实施例试验中相同时，突人意料的发现，其不但各项测定参数与相应的实施例1至实施例11各试验结果基本相同(例如保留时间、分离度、杂质PB-1A和杂质PB-2D的含量、式I中间体的RSD等)，而且杂质PB-1A和杂质PB-2D的RSD显著的得到改善，杂质PB-1A的RSD均在0.327～0.341％范围内，杂质PB-2D的RSD均在0.183～0.197％范围内。但是在另外的补充试验中，如果将上述D型酒石酸钾钠改用L型酒石酸钾钠或者其DL型酒石酸钾钠时，却无法有效降低杂质PB-1A和杂质PB-2D二者的RSD，二者RSD在这些情况下均大于1.6％甚至个别还超过2％(例如用DL型酒石酸钾钠时杂质PB-2D的RSD达2.24～2.51％)。因此根据本发明任一实施方案的方法，其中所述流动相A中还添加1μmol/L的D型酒石酸钾钠并任选的用醋酸或氨水调节pH值至规定值(实施例1-5中的规定值为pH6.6)。上述改善两种杂质的RSD的效果是非常具有实践意义的，例如由于两种杂质在供试品中的含量非常低，更高的以RSD表征的测定精密度对于提高测定它们在供试品中含量的准确度是有极重要意义的。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不能以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。

Claims

1.测定帕博西尼中间体的方法，该帕博西尼中间体为以下式I化合物：

I；

该方法包括使用反相高效液相色谱法对帕博西尼中间体进行如下步骤的测定：

(1)取帕博西尼中间体样品适量，加二氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中含帕博西尼中间体0.1~2.0mg/ml的供试品溶液；

(2)精密量取步骤(1)的溶液1.0ml，置200ml容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

(3)取帕博西尼中间体、PB-1A杂质和PB-2D杂质适量，加二氯甲烷适量使溶解，再加乙腈稀释并制成每1ml中含PB-1A杂质5µg、PB-2D杂质5µg和帕博西尼中间体1000µg的溶液，作为系统适用性溶液；其中所述PB-1A杂质具有如下化学结构式：

，

所述PB-2D杂质具有如下化学结构式：

；

(4)设置流动相的流速为0.8ml/min~1.2ml/min；使用紫外检测器或二极管阵列检测器；检测波长为：230nm~240nm；使用Waters Symmetry® C18色谱柱，色谱柱规格为4.6 mm×150mm×5μm；色谱柱的柱箱温度为：25~35℃；流动相A为0.01M ~0.02M醋酸铵缓冲液，流动相B为乙腈；采用如下线性梯度进行洗脱：0分钟时70%流动相A和30%流动相B，5分钟时55%流动相A和45%流动相B，25分钟时52%流动相A和48%流动相B，35分钟时15%流动相A和85%流动相B，45分钟时15%流动相A和85%流动相B，45.01分钟时70%流动相A和30%流动相B，55分钟时70%流动相A和30%流动相B；

(5)取步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)的溶液各10~50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，从中读取杂质的以下至少一个信息：杂质数量、杂质种类、杂质相对量、各色谱峰之间的分离度、各色谱峰的峰面积；

(6)按照步骤(5)读取的杂质信息，按照加校正因子的主成分自身对照法计算杂质PB-1A和杂质PB-2D的含量，其中杂质PB-1A的校正因子为0.71，杂质PB-2D的校正因子为0.79；

(7)杂质PB-1A和杂质PB-2D含量计算公式为：步骤(1)供试品溶液中该杂质的峰面积×该杂质的校正因子/步骤(2)对照溶液主成分的峰面积×0.5；

(8)未知杂质含量计算公式为：步骤(1)供试品溶液中该未知杂质的峰面积/步骤(2)对照溶液主成分的峰面积×0.5。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中将帕博西尼中间体配制成1.5mg/ml的供试品溶液。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中将帕博西尼中间体配制成1.0mg/ml的供试品溶液。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中设置流动相的流速为0.9ml/min~1.1ml/min。

5.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中设置流动相的流速为1.0ml/min。

6.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中使用紫外检测器。

7.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中检测波长为235nm。

8.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中色谱柱的柱箱温度为30℃。

9.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中取步骤(1)、步骤(2)、步骤(3)的溶液各20μl，注入液相色谱仪。

10.根据权利要求1的方法，其中醋酸铵缓冲液的摩尔浓度为0.01M。

11.根据权利要求1的方法，所述醋酸铵缓冲液的pH值为6.4~6.7。

12.根据权利要求1的方法，所述醋酸铵缓冲液的pH值为6.6。