CN115290763A

CN115290763A - 一种阿贝西利有关物质的检测方法

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Publication number: CN115290763A
Application number: CN202210043899.XA
Authority: CN
Inventors: 蔡亮亮; 马晓菲; 韩勇; 吴雯仪
Original assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Current assignee: Affiliated Hospital of Nantong University
Priority date: 2022-01-14
Filing date: 2022-01-14
Publication date: 2022-11-04
Anticipated expiration: 2042-01-14
Also published as: CN115290763B

Abstract

本发明公开了一种阿贝西利有关物质的检测方法，属于医药技术领域。该检测方法采用高效液相色谱法，将待测物在C₁₈反相柱中进行梯度洗脱，采用紫外检测器检测洗脱液；所述梯度洗脱所使用的流动相为流动相A和流动相B，流动相A为磷酸二氢钾溶液和乙腈的混合溶液，流动相B为乙腈。本发明建立了一种有效检测抗乳腺癌新药阿贝西利有关物质检测的高效液相色谱法，该方法专属性好，灵敏度高，线性关系及重复性良好。本发明可为抗乳腺癌新药阿贝西利后续研究提供有价值的参考。

Description

一种阿贝西利有关物质的检测方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种抗乳腺癌药物阿贝西利有关物质的检测方法。

背景技术

乳腺癌是危害女性健康的主要恶性肿瘤，其发病率以每年2.0％的速度增长。多数乳腺癌患者因早期缺乏特异性表现，确诊时多为晚期，5年生存率仅为28.1％。据报道，在所有的乳腺癌患者中，多于70％的乳腺癌患者为激素受体(hormone receptor，HR)阳性和人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)阴性。因此，研究针对HR阳性与HER-2阴性乳腺癌的治疗药物具有重大意义。

细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent，CDK)是调控肿瘤细胞周期的主要因子，而肿瘤细胞周期过程紊乱会影响细胞的增殖、生长。研究表明：CDK4和CDK6是HR阳性与HER-2阴性乳腺癌发生和进展的关键驱动因子，可作为重要的治疗靶点。因此，作为靶向细胞周期的CDK4/6抑制剂已成为治疗晚期乳腺癌的主要研究热点。目前，全球上市的CDK4/6抑制剂包括哌柏西利(Palbociclib)、阿贝西利(Abemaciclib)与Ribociclib，这三款CDK4/6抑制剂的出现，显著提高了HR阳性、HER2阴性乳腺癌患者的疗效，延长了患者生存期。基于CDK4/6抑制剂在临床研究中显示的可靠的疗效和良好的安全性，国内外指南一致推荐CDK4/6抑制剂作为HR阳性HER-2阴性晚期乳腺癌患者的一、二线标准用药。阿贝西利是继哌柏西利、Ribociclib后FDA批准的第三款CDK4/6抑制剂，已于2020年12月在我国批准上市，也是第一个在以中国患者为主的HR阳性、HER-2阴性晚期乳腺癌女性中证实CDK4/6抑制剂临床获益的Ⅲ期研究。

有关物质是指药品中除主成分以外的杂质，药品中的杂质多数具有潜在生物活性，会对药物的稳定性，疗效产生不利的影响，有些杂质不仅对人体有害，甚至产生新的副作用。因此，有关物质的研究与控制是保证药品安全，有效的重要因素。

目前，发现关于阿贝西利质量研究的文献较少，尤其是阿贝西利有关物质的检测方法未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗乳腺癌药物阿贝西利有关物质的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种阿贝西利有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，将待测物在C₁₈反相柱中进行梯度洗脱，采用紫外检测器检测洗脱液；

所述待测物含有阿贝西利和/或阿贝西利有关物质；

所述梯度洗脱所使用的流动相为流动相A和流动相B，流动相A为磷酸二氢钾溶液和乙腈的混合溶液，流动相B为乙腈；

所述梯度洗脱的程序为：0～3min，0％B→0％B；3～10min，0％B→18％B；10～20min，18％B→22％B；20～30min，22％B→45％B；30～40min，45％B→65％B；40～41min，65％B→0％B；41～50min，0％B→0％B。

进一步地，所述C₁₈反相柱的柱长为200～300mm，内径为4～5mm，填料粒径为4～6μm。优选色谱柱的规格为4.6mm×250mm，填料粒径为5μm。

进一步地，所述梯度洗脱的流速为0.9～1.1mL·min^-1，优选为1.0mL·min^-1。

进一步地，所述梯度洗脱的进样体积为5～20μL，优选为10μL。

进一步地，所述梯度洗脱的柱温为20～30℃，优选为25℃。

进一步地，所述紫外检测器的检测波长为295～305nm，优选为300nm。

进一步地，所述流动相A中磷酸二氢钾溶液和乙腈的体积比为90∶10，所述磷酸二氢钾溶液为含有0.4％三乙胺的0.025mol·L^-1磷酸二氢钾溶液。

更进一步地，所述磷酸二氢钾溶液的pH为2.4～2.6，优选为2.5。

进一步地，所述待测物的溶剂为50％甲醇水溶液或甲醇。

本发明建立一种有效检测抗乳腺癌新药阿贝西利有关物质检测的高效液相色谱法，并对该检测方法进行验证。结果表明该方法专属性好，灵敏度高，线性关系、重复性、耐用性良好。本发明可为抗乳腺癌新药阿贝西利后续研究提供有价值的参考。

附图说明

图1为液相色谱条件优化的色谱图其中：A为甲醇-水(80∶20)；B为乙腈-水(80∶20)；C为甲醇-水(60∶40)；D为乙腈-水(60∶40)；E为梯度洗脱条件1；F为梯度洗脱条件2。

图2为系统适用性的色谱图。

图3为强降解试验的色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明使用的阿贝西利购于上海麦克林生化科技有限公司；甲醇、乙腈购自Merck公司(色谱纯)；盐酸、磷酸、氢氧化钠、双氧水、三乙胺购自国药集团化学试剂有限公司(分析纯)。

实施例1

检测方法的建立

1、溶剂的选择

取阿贝西利适量，分别用甲醇、乙腈超声溶解制成每1mL约含0.5、1、2mg的溶液。样品制备过程中发现，用乙腈作为溶剂，阿贝西利溶解度差，有沉淀物，未能充分溶解；用甲醇作为溶剂，阿贝西利样品均能充分溶解。秉着减少有机溶剂用量，降低污染，节约成本的原则，后续分别用50％甲醇水溶液、甲醇作为溶剂溶解样品，阿贝西利也可以充分溶解。

进一步考察用50％甲醇水溶液、甲醇作为溶剂样品溶液的稳定性。分别于室温下于0、1、2、5、10d取样检测。样品中有关物质均无明显变化。由此，选择50％甲醇水溶液作为阿贝西利的溶剂。

2、液相色谱条件的优化

本发明所采用的系统适用性溶液是用碱性降解溶液与氧化降解溶液等比例混合制得，这样制得的系统适用性溶液具有杂质个数多、杂质含量高的特点，而且具有较难分离的关键峰对，因此选为阿贝西利有关物质检测方法建立的溶液。

方法建立之初，首先用具有强洗脱能力的流动相：甲醇-水(80∶20)，乙腈-水(80∶20)进行等度洗脱，结果发现样品中各成分出峰时间较早，而且主峰与相邻杂质峰，杂质峰之间分离度均不符合要求(如图1A、B所示)。继而考虑降低有机相的比例，分别用甲醇-水(60∶40)，乙腈-水(60∶40)作为流动相洗脱，结果发现用甲醇-水(60∶40)作为流动相，主峰峰宽较大，柱效低(如图1C所示)，因此选择乙腈作为流动相中有机相。后续乙腈-水(60∶40)作为流动相等度洗脱，结果发现主峰与杂质峰，杂质峰之间的分离度较小，主峰拖尾，且样品中各成分具有较宽的保留值(k)范围(图1D所示)。基于此，采用梯度洗脱，且在流动相中加入三乙胺以改善峰形。经过多次试验，确定流动相A为0.025mol/L磷酸二氢钾溶液(含0.4％三乙胺，用磷酸调pH至2.5)-乙腈(90∶10)；流动相B为乙腈作为阿贝西利梯度洗脱的流动相。首次梯度试验采用较宽的梯度洗脱范围，梯度条件1为：0～3min，0％B→0％B；3～20min，0％B→80％B；20～30min，80％B→80％B；30～31min，80％B→0％B；31～40min，0％B→0％B。如图1E所示，杂质峰之间最小分离度为1.15(＜1.2)，杂质峰与主峰之间的最小分离度为1.45(＜1.5)，不符合要求。考虑降低梯度的变化速率，经过多次调整，确定有关物质检测的色谱条件。色谱图见图1F。系统适用性溶液中杂质峰之间最小分离度为1.42，杂质峰与主峰之间的最小分离度为2.23，符合要求。

实施例2

本实施所采用的色谱条件如下：

色谱柱：Phenomenon Gemini C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A：0.025mol·L^-1磷酸二氢钾溶液(含0.4％三乙胺，用磷酸调pH至2.5)-乙腈(90∶10)；流动相B：乙腈，梯度洗脱(0～3min，0％B→0％B；3～10min，0％B→18％B；10～20min，18％B→22％B；20～30min，22％B→45％B；30～40min，45％B→65％B；40～41min，65％B→0％B；41～50min，0％B→0％B)；检测波长：300nm；流速：1.0mL·min^-1；进样量：10μL。

供试品溶液的配制如下：

取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1、系统适用性试验

发明人在前期的预实验中发现阿贝西利在碱性条件与氧化条件下不稳定，生成的杂质较多，且有较难分离的杂质对。因此，采用碱降解样品与氧化降解样品混合，制备系统适用性溶液。具体制备方法如下：

碱降解样品：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用5mL甲醇溶解，再加入2mol·L^-1氢氧化钠溶液2.5mL，80℃水浴反应24h，反应完成后，用2mol·L^-1盐酸溶液调至中性，并用50％甲醇水溶液稀释至刻度。

氧化降解样品：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用5mL甲醇溶解样品，再加入2.5mL过氧化氢溶液(3％)，并用50％甲醇水溶液稀释至刻度。室温放置20h，接着用氮吹仪吹干样品，再用50％甲醇水溶液溶解并定容至刻度。

系统适用性溶液的制备：分别量取上述碱降解、氧化降解溶液5mL置于10mL量瓶中，摇匀，即得。照上述色谱条件进样分析。

如图2所示。阿贝西利与相邻杂质峰之间分离度分别为2.23，4.42，均大于1.5，各个杂质峰之间的最小分离度为1.42，大于1.2，结果符合系统适用性要求。

2、强制降解试验

(1)未降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度。

(2)酸降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用5mL甲醇溶解，加入2mol·L^-1盐酸溶液2.5mL，80℃水浴反应36h，反应完成后冷却至室温，用2mol·L^-1氢氧化钠溶液调至中性，并用50％甲醇水溶液稀释至刻度。同时制备酸性降解空白溶液。

(3)碱降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用5mL甲醇溶解样品，加入2mol·L^-1氢氧化钠溶液2.5mL，80℃水浴反应9h，反应完成后冷却至室温，用2mol·L^-1盐酸溶液调至中性，并用50％甲醇水溶液稀释至刻度。同时制备碱性降解空白溶液。

(4)氧化降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置10mL量瓶中，用5mL甲醇溶解样品，加入3％过氧化氢溶液2.5mL，再用50％甲醇水溶液稀释至刻度，室温反应1.5h。同时制备氧化降解空白溶液。

(5)高温降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置于称量瓶中，置于150℃的恒温箱中降解12h，冷却至室温，用适量的50％甲醇水溶液溶解样品，再将溶液转移至10mL量瓶中，稀释至刻度。

(6)光降解：取阿贝西利约10mg，精密称定，置于10mL量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度。将样品溶液置于4 500lx光强的日光灯下照射28d。

分别精密量取上述降解溶液及空白对照溶液，照上述色谱条件进样分析，试验结果见表1，色谱图见图3。

表1强制降解试验结果

以上结果表明：阿贝西利在高温，光照，酸性条件下比较稳定，在碱性，氧化条件下易降解。在各降解条件下，主峰与杂质峰间最小分离度2.11，大于1.5。杂质峰之间的最小分离度为1.37，大于1.2，分离度符合要求。物料平衡率为95.7％～102.4％，物料基本平衡。

3、检测下限、定量下限

取供试品溶液，经逐步稀释，取样品10μL进样，计算主峰峰高与基线噪音的比值(S/N)。以比值为3时的浓度计为检测下限浓度；以比值为10时的浓度计为定量下限浓度。结果阿贝西利的检测下限与定量下限分别为0.02、0.06μg·mL^-1。

4、溶液稳定性

取供试品溶液，分别在室温下于0、1、2、4、6、8、12、24、48h取样检测，记录色谱图。以杂质个数，主成分及杂质含量变化为指标，考察阿贝西利溶液的稳定性。试验结果见表2。

表2溶液稳定性试验结果

以上结果表明：阿贝西利溶液室温下放置48h，杂质个数及总杂质含量均无明显变化，这说明阿贝西利溶液室温放置48h，稳定性良好。

5、线性与范围

以阿贝西利供试品溶液浓度(1mg·mL^-1)为100％，分别考察阿贝西利在0.01％～2.0％浓度范围内的线性关系。取阿贝西利约10mg，精密称定，置于100mL量瓶中，用50％甲醇水溶液溶解并稀释至刻度，作为线性试验的储备溶液。分别精密量取储备溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20mL，置于100mL量瓶中，用50％甲醇水溶液稀释至刻度。分别量取上述各溶液10μL进样分析，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。回归方程为：Y＝10.614X-0.716 2r＝0.999 9。阿贝西利在质量浓度为在0.10～20.26μg·mL^-1范围内，与峰面积线性关系良好，符合试验要求。

6、系统精密度试验

取供试品溶液，以上述色谱条件连续测定6次，记录色谱图。结果阿贝西利供试品溶液中各成分(相对保留时间为0.82、0.89、0.92、0.97、1.00、1.31、2.35)的保留时间的RSD值分别为0.04％、0.06％、0.04％、0.03％、0.04％、0.07％、0.02％；峰面积的RSD分别为1.64％、0.45％、1.85％、1.13％、0.41％、1.91％、1.73％，均小于2％，表明仪器精密度良好。

7、重复性试验

取供试品溶液，精密量取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见表3。

表3重复性实验结果

6次测定的含量在0.02％以上的杂质个数一致；最大单个杂质与总杂质含量的最大绝对偏差分别为0.01％、0.05％，结果符合试验要求，说明方法重复性良好。

8、耐用性试验

分别考察流动相的初始有机相比例、检测波长、柱温、流速、流动相的pH、不同型号的色谱柱对本法色谱行为的影响。耐用性试验条件见表4。取系统适用性样品溶液，于表4中的条件进行检测。

表4耐用性试验条件

结果显示：在可接受的变动条件下阿贝西利与其相邻杂质峰的最小分离度为2.16大于1.5，其他杂质峰之间最小分离度为1.35大于1.2，杂质个数及含量无明显变化。

其中流速、色谱柱、流动相初始比例对相邻杂质的保留时间及分离度影响稍大些；柱温、流动相pH值和检测波长对有关物质检测几乎没有影响。上述检测参数的微小调整，对测定结果基本不会产生显著性影响。说明本方法耐用性良好。

Claims

1.一种阿贝西利有关物质的检测方法，其特征在于：采用高效液相色谱法，将待测物在C₁₈反相柱中进行梯度洗脱，采用紫外检测器检测洗脱液；

所述待测物含有阿贝西利和/或阿贝西利有关物质；

所述梯度洗脱的程序为：0~3 min，0%B→0%B；3~10 min，0%B→18%B；10~20 min，18%B→22%B；20~30min，22%B→45%B；30~40 min，45%B→65%B；40~41 min，65%B→0%B；41~50 min，0%B→0%B。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述C₁₈反相柱的柱长为200~300 mm，内径为4~5 mm，填料粒径为4~6 μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的流速为0.9~1.1 mL·min^-1。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的进样体积为5~20 μL。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的柱温为20~30 ℃。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述紫外检测器的检测波长为295~305 nm。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述流动相A中磷酸二氢钾溶液和乙腈的体积比为90∶10，所述磷酸二氢钾溶液为含有0.4%三乙胺的0.025 mol∙L^-1磷酸二氢钾溶液。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾溶液的pH为2.4~2.6。

9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述待测物的溶剂为50%甲醇水溶液或甲醇。