CN108424878A - 乳腺癌及乳腺组织ecm及其制备方法和乳腺癌3d体外培养模型的构建方法 - Google Patents

乳腺癌及乳腺组织ecm及其制备方法和乳腺癌3d体外培养模型的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳腺癌及乳腺组织ECM及其制备方法和乳腺癌3D体外培养模型的构建方法，包括如下步骤：步骤一，使用不同浓度的洗涤剂处理不同时间，采用震荡法充分地去除乳腺癌及乳腺组织的细胞，制备成ECM并对制备的乳腺及乳腺癌ECM进行组织学分析和生化成分分析，优化震荡法去细胞处理条件；步骤二，将去细胞处理后的乳腺癌及乳腺ECM注射MCF‑7细胞后，构建乳腺癌3D体外培养体系，观察细胞迁移情况，并且经组织学染色分析、免疫组学分析、RT‑PCR、凋亡检测等实验方法评定乳腺癌3D体外培养模型。本发明首次成功地制备了乳腺及乳腺癌ECM，并利用其制备了乳腺癌3D体外培养体系，方法简便，无需复杂设备，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。

Description

乳腺癌及乳腺组织ECM及其制备方法和乳腺癌3D体外培养模 型的构建方法
技术领域
本发明涉及组织工程及癌症体外三维培养模型的建立，尤其是乳腺癌及乳腺组织ECM及其制备方法和乳腺癌3D体外培养模型的构建方法。
背景技术
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，主要是由于乳腺导管上皮出现恶性突变而产生，临床主要表现为乳腺肿痛、有肿块、腋窝下淋巴结出现肿大等病情。近年来乳腺癌发病率有上升趋势，且发病年龄逐渐年轻化，据2016年世界卫生组织国际癌症研究中心（TheInternational Agency for Research on Cancer，IARC）最新估计，全世界约350万例女性发生乳腺癌，而且每年新增20万多例病例，居女性恶性肿瘤首位。我国乳腺癌的发病率不断增高，死亡率仅次于肺癌，严重影响我国妇女的健康和生命。降低发病率、提高早诊率、提高生存率、促进均质化是我国肿瘤防控的突破点。在过去的十几年中，由于治疗方法（即化疗，激素治疗和靶向药物）的发展及早期检测技术的进步，女性乳腺癌患者5年生存率有所改善，但效果仍不尽人意。
三维（three-dimensional，3D）细胞培养技术能够把体外二维（two-dimensional，2D）细胞培养与动物模型结合起来，形成一种方便高效的研究体系，在干细胞培养、组织工程和抗癌药物的筛选及评价等很多领域得到广泛应用并取得较大进展。当前，3D细胞培养技术已成为肿瘤发生发展、肿瘤的侵袭转移、中心坏死、肿瘤的耐药基因表达、实验性治疗、肿瘤血管生成、营养供给等模拟研宄的重要平台。
生物材料制备的三维体外肿瘤模型能够用模拟体内肿瘤微环境，进而可研究肿瘤发生发展的分子机制及进行体外肿瘤药物渗透研究微环境条件，对调控肿瘤发生和发展起着至关重要的作用，也为我们进行肿瘤研究提供了一种比应用动物模型更快捷、更简单、更经济的可靠选择。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种乳腺癌及乳腺组织ECM及其制备方法和乳腺癌3D体外培养模型的构建方法。
为了解决上述问题，本发明提供一种乳腺癌及乳腺组织ECM的制备方法，包括以下步骤：
(1) 将患者乳腺癌或乳腺组织取出并置于不同浓度的去除组织细胞的洗涤剂中，处理不同的时间，处理之后使用灭菌水和DPBS溶液充分去除洗涤剂，保证制备的ECM中不含有洗涤剂成分；
（2）对制备的ECM进行组织学分析和生化成分分析，选出最优的ECM制备条件。
所述步骤(1)中洗涤剂为十二烷基硫酸钠(SDS)、月桂基乙醚硫酸钠(SLES)和Triton X-100中的一种。
所述步骤（2）ECM结构进行组织学分析包括石蜡切片制备，进行H&E和DAPI染色，并对ECM成分进行含量的测定以及残留DNA量对比分析。
ECM成分是指胶原蛋白/Collagen、弹性蛋白/Elastin和硫酸盐粘多糖/sGAG三种重成分。
上述的ECM的制备方法制得的乳腺及乳腺癌ECM。
一种乳腺癌3D体外培养模型的构建方法，将上述获得的乳腺及乳腺癌ECM，注射MCF-7细胞后，体外培养，观察其发育情况，并且对注射细胞后的ECM从组织学染色分析、免疫组学分析、RT-PCR、凋亡检测方面进行分析鉴定，评定该3D培养体系。
本发明的有益效果是：首次成功的在体外构建了乳腺癌及乳腺ECM，并建立了乳腺癌3D培养体系，进一步为了解癌症发生提供了新的思路。同时，脱细胞处理后的乳腺组织也在再生医学的领域中具有更广阔的应用前景。本发明的方法简便，成本低廉，实验条件要求低，可操作性强。
附图说明
图1：ECM H&E 染色图
1：1% SLES 6小时处理后乳腺ECM H&E染色
2：1% SLES 12小时处理后乳腺ECM H&E染色
3：1% SLES 18小时处理后乳腺ECM H&E染色
4：1% SLES 6小时处理后乳腺癌ECM H&E染色
5：1% SLES 12小时处理后乳腺癌ECM H&E染色
6：1% SLES 18小时处理后乳腺癌ECM H&E染色
图2：ECM 胶原/Collagen染色图
1：1% SLES 6小时处理后乳腺ECM 胶原/Collagen染色
2：1% SLES 12小时处理后乳腺ECM 胶原/Collagen染色
3：1% SLES 18小时处理后乳腺ECM 胶原/Collagen染色
4：1% SLES 6小时处理后乳腺癌ECM 胶原/Collagen染色
5：1% SLES 12小时处理后乳腺癌ECM 胶原/Collagen染色
6：1% SLES 18小时处理后乳腺癌ECM 胶原/Collagen染色
图3：ECM 弹性蛋白/Elastin染色图
1：1% SLES 6小时处理后乳腺ECM 弹性蛋白/Elastin染色
2：1% SLES 12小时处理后乳腺ECM 弹性蛋白/Elastin染色
3：1% SLES 18小时处理后乳腺ECM 弹性蛋白/Elastin染色
4：1% SLES 6小时处理后乳腺癌ECM 弹性蛋白/Elastin染色
5：1% SLES 12小时处理后乳腺癌ECM 弹性蛋白/Elastin染色
6：1% SLES 18小时处理后乳腺癌ECM 弹性蛋白/Elastin染色
图4：ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色图
1：1% SLES 6小时处理后乳腺ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
2：1% SLES 12小时处理后乳腺ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
3：1% SLES 18小时处理后乳腺ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
4：1% SLES 6小时处理后乳腺癌ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
5：1% SLES 12小时处理后乳腺癌 ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
6：1% SLES 18小时处理后乳腺癌 ECM 硫酸盐粘多糖/sGAG染色
图5：ECM DAPI 染色图
A：1% SLES 6小时处理后乳腺ECM DAPI染色
B：1% SLES 12小时处理后乳腺ECM DAPI染色
C：1% SLES 18小时处理后乳腺ECM DAPI染色
D：1% SLES 6小时处理后乳腺癌ECM DAPI染色
E：1% SLES 12小时处理后乳腺癌ECM DAPI染色
F：1% SLES 18小时处理后乳腺癌ECM DAPI染色
图6：ECM 3种蛋白含量分析图
N：正常乳腺组织，DN：正常乳腺ECM；C：乳腺癌组织，DC：乳腺癌ECM
图7：ECM 中DNA含量分析及MMP-9含量图
N：正常乳腺组织，DN：正常乳腺ECM；C：乳腺癌组织，DC：乳腺癌ECM
图8：ECM 注射MCF-7细胞后HE染色及免疫组织化学分析图
A：ECM 注射MCF-7细胞后HE染色（1：乳腺组织ECM 注射细胞10天；2：乳腺组织ECM 注射细胞10天；3：乳腺组织ECM 注射细胞30天；4：乳腺癌组织ECM 注射细胞10天；5：乳腺癌组织ECM 注射细胞10天；6：乳腺癌组织ECM 注射细胞30天）
B: ECM 注射MCF-7细胞后30天，免疫组织化学分析Ki-67的表达水平
图9：ECM 注细胞后EMT相关基因表达图
DN：正常乳腺ECM；DC：乳腺癌ECM
图10：ECM 注细胞后凋亡基因表达图
DN：正常乳腺ECM；DC：乳腺癌ECM。
具体实施方式
以下是对本发明的实施例作详细说明 ：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
1. 乳腺癌及乳腺ECM的制备与分析
步骤一，乳腺癌及乳腺ECM的制备
在获得病人知情同意书签署的前提下，将术后获得的新鲜乳腺及乳腺癌组织放置于无菌的DPBS溶液中，充分震荡清洗，去除血细胞，然后将乳腺及乳腺癌组织分别放于盛有1%SLES溶液的50mL无菌离心管中，在摇床中回旋转动离心管（200 rpm/分钟），充分去除组织中的遗传成分，清洗时间分别为6小时、12小时、18小时。
去细胞完成后，在超净工作台内倒掉离心管中溶液，并加入无菌水，清洗残留在组织支架内的洗涤剂。每隔两个小时更换一次无菌水，总共8次。为维持支架内渗透压，进一步使用无菌DPBS溶液洗涤ECM，以同样的方法清洗8次，整个过程结束时后向溶液中加入2000U/mL的青霉素/链霉素双抗溶液，4℃备用。
步骤二，乳腺癌及乳腺ECM的蜡块制备
将制备好的组织支架放置于10%的中性甲醛中固定24小时后，放至50%的酒精中，过夜处理，然后使用自动脱水机进行脱水、透明和浸蜡。
脱水过程如下：
浸蜡完成后使用包埋机将ECM包埋成蜡块，室温保存。
步骤三，乳腺癌及乳腺ECM组织学形态分析
（1）将制作好的支架蜡块，使用石蜡切片机切成5 mm的组织切片，56℃拷片过夜；
（2）H&E染色，具体染色操作步骤如下
根据镜检结果判断是否有细胞残留在ECM中,如图1所示，经H&E组织学染色后，分别处理6小时、12小时、18小时均能完全去除两种组织中的细胞成分，组织ECM中无完整细胞核的存在，但随着处理时间的延长，组织结构会受到一定程度的损害。
（3）胶原蛋白/Collagen染色，具体操作步骤如下：
胶原蛋白是形成组织、细胞间微环境的重要组成部分，我们采用的Van Gieson（V.G）对胶原蛋白进行染色，评估ECM中胶原蛋白的损伤情况，结果见图2，染色后胶原蛋白呈鲜红色，处理时间18小时后，两种ECM中的胶原蛋白受损严重。
（4）弹性蛋白/Elastin染色，具体操作步骤如下：
弹性蛋白是组织ECM的重要组成部分之一，可维持组织的强度及弹性。ECM 制备完成后，采用地衣红法对两种ECM中的弹性蛋白进行染色，结果见图3，染色后弹性蛋白呈棕红色，其着色深浅可判定弹性蛋白损伤程度，随着处理时间的延长，两种组织中的ECM均有一定程度的损伤，而且SLES处理效果要优于SDS处理组。
（5）硫酸盐粘多糖/sGAG染色，具体操作步骤为：
采用阿尔新蓝染色法评估ECM组织中sGAG的受损情况，结果见图4，随着处理时间的延长，组织中sGAG的含量逐渐下降，18小时后受损最严重。
（6）DAPI 染色，具体操作步骤如下：
DAPI可与细胞核DNA双链结合，产生较强的蓝色荧光，常用于细胞核的染色。我们将不同条件处理后的ECM组织切片用DAPI进行染色，染色结果见图5，在制备的组织ECM中，除组织自发荧光外，无完整的细胞核存在，进一步证实了ECM制备的高效性。
步骤四，乳腺及乳腺癌ECM生化含量指标分析
（1）胶原蛋白/Collagen含量测定：按照差量法称重称取10-20mg ECM组织及新鲜组织，放于预先加入1.2 mL冷酸-胃蛋白酶液的离心管中，4 ℃过夜，取1 mL上清作检测液，并加入100 µL酸中和溶液混匀，再向其加入200 µL分离浓缩试剂混匀后12000 rpm离心10分钟，弃上清，对照组为100µL纯水，标准组添加5µL、10µL和15 µL的标准试剂，并用纯水定容至100 µL。加入1 mL Sircol染料，轻轻混匀并放置在恒温摇床上震荡30分钟，12000 rpm离心10分钟；移除染料，并加入预冷的酸性盐洗涤剂750 µL，12000 rpm离心10分钟，弃洗涤剂；向每个样品中加入250 µL碱性试剂，倒置混匀后吸取200 µL样品液于96孔板中，555 nm下测定OD值。
通过试剂盒测定ECM处理前后组织中的胶原蛋白含量，结果见图6 A，ECM制备过程可损伤组织内胶原蛋白含量（P<0.05），在乳腺ECM的制备过程中,6小时及12小时间无显著性差异（P>0.05），而在乳腺癌ECM的制备过程中，12小时及18小时间无显著性差异（P>0.05），同样的处理时间下，乳腺癌ECM中的胶原蛋白的含量低于乳腺组。
（2）弹性蛋白/Elastin含量测定：差量法定量称重ECM组织及新鲜组织，每管中加入750µL 0.25M草酸，置于95℃-100℃的水浴锅中1小时，自然冷却至室温，10000rpm离心10分钟，收集上清液，重复该过程一次，并收集两次的上清液，混匀。向实验组样品上清液中加入500µL α-弹性蛋白结合试剂；空白试剂加入100µL去离子水；标准试剂加入12.5、25、50µL标准样品。向离心管中加入等同体积的弹性蛋白沉淀试剂，涡旋混合后静置15分钟，11000g离心10分钟后倒去上清液，向沉淀中加入1mL Sircol染料，置于摇床中90分钟，11000g离心10分钟，弃上清后，向沉淀中加入250µL解离试剂，涡旋混合，吸取200µL检测试样于96孔板中，513nm下测定OD值。
通过试剂盒测定ECM处理前后组织中的弹性蛋白含量，结果见图6 B，ECM制备过程可损伤组织内弹性蛋白的含量（P<0.05），结果与组织学染色结果符合，而且在乳腺ECM的制备过程中，6小时及12小时间无显著性差异（P>0.05），而在乳腺癌ECM的制备过程中，随着处理的延长，ECM中弹性蛋白的含量逐渐下降，具有显著性差异（P<0.05）。
（3）硫酸盐粘多糖/sGAG含量的测定：按照差量法称重称取20 mg的ECM组织及新鲜组织，加入1mL木瓜蛋白酶，65℃水浴3小时，10000g离心10分钟，取出10µL上清液于一新离心管中，补加去离子水至至100µL（空白组只加入100µL去离子水），并向样品中分别加入1、2、3、4、5ug的标准试剂。向离心管中加入1mL Blyscan染料试剂，倒置混匀，摇床震荡30分钟，12000rpm离心10分钟，去除未结合的染料，加入250µL解离试剂，充分涡旋混合，12000rpm离心5分钟。吸取200µL试样于96孔板中，656nm下测定OD值。
通过试剂盒测定ECM处理前后组织中的sGAG含量，结果见图6 C，ECM制备过程可损伤组织内sGAG的含量（P<0.05），在乳腺ECM的制备过程中，6小时及12小时间无显著性差异（P>0.05），而在乳腺癌ECM的制备过程中， 随着处理的延长，ECM中弹性蛋白的含量逐渐下降，具有显著性差异（P<0.05）,与弹性蛋白趋势一致。
（4）DNA含量测定：按照差量法称重称取10 mg ECM组织及新鲜组织，将组织切碎，加入1 mL预冷的0.85%生理盐水，用匀浆仪将组织打碎至组织悬液，瞬时离心后，按照Tiangen DNA提取试剂盒的基本流程提取ECM 中DNA，260nm下测定吸光值；
按照计算公式：DNA的干重含量（ng/mg）=OD260×50×(10/0.52) ×体积/组织重量，即每毫克组织中含有的DNA含量，并采用凝胶分析对组织支架中的残留DNA进行电泳分析，紫外光下鉴定DNA片段的长度。
在组织ECM制备过程中，ECM中DNA含量是衡量ECM质量的重要指标之一，而且决定ECM是否符合体内移植的标准，分别以乳腺及乳腺癌组织作为对照组，分析各组ECM中DNA含量，并以百分比的形式比较不同处理条件下DNA的残留量，结果见图7。结果显示，ECM支架的制备过程可显著地去除组织中的DNA成分（P<0.05）,去除率超过85%，达到体内移植的标准。
（5）MMP-9蛋白含量检测：按照差量法称重称取10mg ECM组织及新鲜组织，将组织切碎，加入1mL预冷的0.85%生理盐水，用匀浆仪将组织打碎至组织悬液，瞬时离心后，按照Neobioscience MMP-9试剂盒的基本流程分析新鲜组织、ECM 中MMP-9表达水平，在450nm波长处测定各孔的OD值。
采用ELISA检测的方法，检测ECM中MMP-9蛋白的表达水平，结果见图7，如图所示，ECM的制备过程会导致乳腺ECM的MMP-9蛋白水平下降，但无显著性差异（P>0.05）,而乳腺癌ECM的制备过程可显著性降低织中的MMP-9水平。
乳腺癌体外3D培养模型的建立及鉴定
步骤五，乳腺癌3D体外培养模型的建立
（1）ECM细胞注射
将制备好的乳腺癌及乳腺ECM分别放于24孔板中，每个孔中加入1 mL完全培养基，放于37 ℃培养箱中过夜；将MCF-7细胞悬液用1 mL注射器注入ECM中，静置2 分钟；再将注细胞后的ECM组织放于24孔培养皿中，进行培养，2天换一次液。
（2）注细胞后ECM组织学的分析
ECM注细胞后，在培养后10天、20天、30天3个时间点分别回收ECM组织，利用上面所述的蜡块制作方法，制备蜡块。使用石蜡切片机，制作5 mm的石蜡切片，经过二甲苯Ⅰ10分钟-二甲苯Ⅱ10分钟-二甲苯Ⅲ10分钟-无水乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-95%乙醇5分钟-95%乙醇5分钟-苏木素染色液5分钟-蒸馏水水洗2分钟-伊红染色液20s-95%乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-二甲苯Ⅰ5分钟-二甲苯Ⅱ5分钟-二甲苯Ⅲ5分钟-封片-镜检，检查在细胞注射后不同时间后ECM内的组织学变化。
HE染色结果见图8 A，结果显示将MCF-7细胞接种于两种ECM后，随着培养时间的延长，两种ECM培养体系均可支持MCF-7细胞迁移、增殖，与乳腺癌ECM体系相比，MCF-7细胞在正常乳腺ECM中增殖速度受到抑制。
（3）注细胞后ECM免疫组织化学分析
根据上述所制作的石蜡切片， 52℃烘片2 小时，进行免疫组织化学实验，检测Ki-67蛋白在注细胞支架中的表达情况。操作如下：二甲苯Ⅰ10分钟-二甲苯Ⅱ10分钟-二甲苯Ⅲ10分钟-无水乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-95%乙醇5分钟-95%乙醇5分钟-流水冲洗2分钟-PBS 5分钟-0.01M的柠檬酸缓冲液抗原修复-10%的血清封闭两小时-一抗孵育4℃过夜-PBS清洗3次，每次5分钟-37℃二抗孵育2小时-PBS清洗3次，每次5分钟-DAB显色2-5分钟-PBS清洗3次，每次5分钟-苏木素复染1分钟-2分钟-流水冲洗3遍-5%乙醇5分钟-无水乙醇5分钟-二甲苯Ⅲ5分钟-二甲苯Ⅱ5分钟-二甲苯Ⅰ5分钟-封片-镜检。
为了进一步检测细胞在ECM中的增殖情况，采用免疫组织化学法检测Ki-67蛋白在组织中的表达情况，染色结果见图8 B，结果显示两种ECM均可支持MCF-7细胞增殖，表达Ki-67蛋白（棕色为阳性增殖细胞），而且在乳腺癌ECM中Ki-67阳性细胞比例显著高于乳腺ECM组（P<0.05）。
（4）注细胞后ECM组织中EMT相关基因表达
ECM注细胞后，在培养后10天、20天、30天3个时间点分别回收ECM组织，提取RNA并反转录为cDNA，然后分别进行PCR和qPCR，检测E-cadherin、 Vimentin、ZEB-1、Snail及GAPDH各个基因在支架中的表达。
采用Trizol法提取ECM中 RNA：切碎组织，加入500uL Trizol，置于室温下消化组织5-10分钟，再加入100uL的氯仿，14000rpm离心5分钟，取上清液，然后加入2.5倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2小时。取出后14000rpm离心10分钟，然后用75%乙醇清洗一遍，无酶水混匀后-20℃保存待用。下一步进行反转录，使用Takara反转录试剂盒（RR047A），根据试剂盒说明书反转录得到cDNA，PCR扩增上述5个基因。
PCR反应条件：预变性95℃，5分钟；变性95℃，30s，复性52℃，30s，延伸72℃，30s，30个循环；最后延伸72℃，7分钟。
实时定量qPCR是选择相对定量的方法。RT-qPCR反应条件：预变性95℃，5分钟；变性95℃，10s，复性55℃，20s，延伸72℃，30s，40个循环。
采用RT-PCR的方法检测了EMT关键基因（E-cadherin、Vimentin、ZEB-1 、Snail）的mRNA在培养后ECM的表达情况，结果见图9，结果显示在体外培养30天后，乳腺ECM中MCF-7的EMT过程受到抑制（P<0.05），而乳腺癌ECM促进了MCF-7的EMT过程（P<0.05）。
（5）注细胞后ECM组织中凋亡水平检测
接种细胞培养30天后，抽取1mL 培养上清液，按照Abcam VEGF、bFGF、Caspase-3Elisa试剂盒的流程分析MCF-7细胞、接种细胞后ECM 中VEGF、bFGF、Caspase-3表达水平，进一步分析ECM对于乳腺癌细胞凋亡的影响。
该部分结果见图10，结果显示，在体外培养的过程中，乳腺ECM可促进乳腺癌细胞凋亡，而乳腺癌ECM则抑制了细胞凋亡因子的表达，进而促进癌症的发生。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (6)

1.一种乳腺癌及乳腺组织ECM的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 将患者乳腺癌或乳腺组织取出并置于不同浓度的去除组织细胞的洗涤剂中，处理不同的时间，处理之后使用灭菌水和DPBS溶液充分去除洗涤剂，保证制备的ECM中不含有洗涤剂成分；
（2）对制备的ECM进行组织学分析和生化成分分析，选出最优的ECM制备条件。
2.根据权利要求1所述乳腺癌及乳腺组织ECM的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中洗涤剂为十二烷基硫酸钠、月桂基乙醚硫酸钠和Triton X-100中的一种。
3.根据权利要求1所述乳腺癌及乳腺组织ECM的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）ECM结构进行组织学分析包括石蜡切片制备，进行H&E和DAPI染色，并对ECM成分进行含量的测定以及残留DNA量对比分析。
4.根据权利要求1所述乳腺癌及乳腺组织ECM的制备方法，其特征在于，ECM成分是指胶原蛋白/Collagen、弹性蛋白/Elastin和硫酸盐粘多糖/sGAG三种重成分。
5.如权利要求1所述的ECM的制备方法制得的乳腺及乳腺癌ECM。
6.一种乳腺癌3D体外培养模型的构建方法，其特征在于，将权利要求5获得的乳腺及乳腺癌ECM，注射MCF-7细胞后，体外培养，观察其发育情况，并且对注射细胞后的ECM从组织学染色分析、免疫组学分析、RT-PCR、凋亡检测方面进行分析鉴定，评定该3D培养体系。
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