CN103667441A - 一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用 - Google Patents

一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。一种Hsa-miR-145-5p试剂盒，包括Hsa-miR-145-5p基因定量检测组分：包括Hsa-miR-145-5pPCR引物，10mM浓度的dNTP，RNase抑制剂，microRNA/cDNA逆转录引物，5倍浓度的buffer液，M-MLV，2倍浓度的SYBRGreenPCRMasterMix混合液及去离子水；Hsa-miR-145-5p荧光原位杂交探针：为与Hsa-miR-145-5p碱基互补的碱基序列，用DNA骨架、荧光基团cy3修饰；FSCN1免疫组化组分。本发明可用于喉鳞癌分子靶向治疗药物。

Description

一种 Hsa-miR-145-5p 试剂盒及其成熟体模拟物的应用
技术领域
本发明涉及一种人属微小RNA，具体涉及一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。
背景技术
头颈鳞癌为全世界第六位高发肿瘤，位居欧洲男性高发肿瘤的第4位，而喉鳞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，发病率居头颈鳞癌的第2位。据统计，目前全世界范围内喉鳞癌发病略有上升，且年轻化趋势逐渐显现。
喉解剖结构局限且黏膜下淋巴管丰富，因此喉鳞癌具有局部侵袭及颈淋巴结转移的恶性生物学特性，成为患者治疗后复发及预后不良的重要风险因素，这也是近30年来喉鳞癌5年生存率并未有明显提升的一个重要因素。在喉鳞癌侵袭转移的过程中势必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的异常表达，如抑癌基因的下调表达，癌基因的上调表达。因此探索这些与喉鳞癌侵袭转移相关的基因表达紊乱的分子生物学机制着重要的临床意义。
microRNAs（miRNAs）是目前新发现的一类长度约为22nt的内源性非蛋白编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它能够与其相应靶基因信使RNA（mRNA）的3’端非翻译区（3’-UTR区）结合，从而降解mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNAs与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡、恶性间质转化、干细胞分化等方面发挥重要作用。
目前发现人类基因组编码多达2000多种不同的miRNAs，miRNA调控基因组约30%编码基因的表达。研究显示约50%的miRNA位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点，且不同类型肿瘤中miRNA表达谱存在较大差异。一些miRNA在恶性肿瘤中表达上调，这类miRNAs能通过抑制肿瘤抑制基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因，刺激细胞增殖及血管生成，促进肿瘤发生，这类miRNAs具有癌基因的作用，因此被称为致癌性miRNA。与致癌性miRNA相反，在恶性肿瘤中表达下调的一些miRNAs可能通过负向调控癌基因和/或负向调控抑制细胞分化或凋亡的基因发挥抑癌基因的作用，称为抑癌性miRNA。
越来越多的研究表明，具有致癌或抑癌作用的miRNA分子参与了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑肿瘤及白血病在内的多种肿瘤的发生、发展。迄今，miRNA的功能与癌症形成的相关性研究已成为国内外的热点方向。目前在喉鳞癌的研究中，涉及miRNAs报道或相关研究极少。
发明人通过microRNA芯片（Agilent human 8*15k miRNA V12.0）检测了多名喉鳞癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍，这说明Hsa-miR-145-5p可能在喉鳞癌中充当抑癌基因的角色，发明人进一步通过生物信息学预测及双荧光报告载体系统，结合喉鳞癌侵袭转移的特点，描锭并验证了FSCN1是Hsa-miR-145-5p直接调控靶基因。
发明目的
本发明的目的是提供一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。
本发明是以Hsa-miR-145-5p的前体序列hsa-mir-145 MI0000461为SEQ ID No:1：CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU，为基础进行的发明。
本发明提供了一种Hsa-miR-145-5p试剂盒，是由以下组合试剂构成的：
Hsa-miR-145-5p 基因定量检测组分：包括Hsa-miR-145-5p PCR引物，10mM浓度的dNTP，RNase抑制剂，microRNA/cDNA逆转录引物，5倍浓度的buffer液，M-MLV，2倍浓度的SYBR Green PCR Master Mix混合液及去离子水；
Hsa-miR-145-5p荧光原位杂交探针：为与Hsa-miR-145-5p碱基互补的碱基序列，并采用DNA骨架修饰，同时用荧光基团cy3修饰；
FSCN1免疫组化组分：包括鼠抗人FSCN1单克隆抗体，镶嵌过氧化物酶基团的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍浓度的PBS及1‰ 吐温20混合液，DAB显色色原、底物及缓冲液。
上述的试剂盒在喉鳞癌预后评估中的应用，优选地针对喉鳞癌石蜡包埋样本。
进一步地，本发明还提供Hsa-miR-145-5p成熟体的模拟物在喉鳞癌细胞系Hep-2及TU-177建立的喉鳞癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤治疗，所述的Hsa-miR-145-5p成熟体模拟物hsa-miR-145-5p MIMAT0000437序列为为SEQ ID No:2：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU，特征在于所有核苷酸进行2’-甲氧基修饰，和/或5’端进行硫代修饰，和/或3’端进行硫代修饰，和/或5’或者3’端进行胆固醇修饰。
更进一步地，上述的Hsa-miR-145-5p的成熟体的模拟物对喉鳞癌细胞株Hep-2及TU-177中细胞恶性间质转化标志物，即E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的抑制表达。
本发明的技术路线包括：
Hsa-microRNA-145-5p 及其靶基因 FSCN1 所组成的试剂盒用于喉鳞癌预后评估
（1）发明人基于microRNA芯片（Agilent human 8*15k miRNA V12.0）检测了4例喉鳞癌患者及同一患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍（P<0.05），表明Hsa-miR-145-5p是喉鳞癌中潜在的抑癌基因。
（2）发明人结合喉鳞癌有易发生颈淋巴结转移及侵润生长的特点，利用生物信息学预测到靶基因FSCN1，FSCN1mRNA全序列为,SEQ ID No:3。FSCN1与上皮源性肿瘤转移及预后相关，是一种潜在的癌基因。发明人通过双荧光报告载体系统验证了Hsa-miR-145-5p与其靶基因FSCN1存在直接调控关系。
（3）发明人提取了188例喉鳞癌石蜡样本总RNA，利用颈环引物法，经qRT-PCR检测发现Hsa-miR-145-5p表达水平与喉鳞癌患者不良临床参数呈负相关，且表达水平越低，喉鳞癌患者的预后越差。
（4）发明人利用免疫组化技术观察了188例喉鳞癌石蜡样本切片中FSCN1的表达，发现FSCN1表达与喉鳞癌患者的不良临床参数呈正相关，且表达水平越高，喉鳞癌患者的预后越差。
（5）发明人通过进一步统计学分析，发现在Hsa-miR-145-5p低表达喉鳞癌中，FSCN1蛋白高表达占53.2%，低表达占16.0%；而Hsa-miR-145-5p高表达喉鳞癌中，FSCN1蛋白低表达占84.0%，高表达占46.8%，呈现相反趋势（P<0.001）。秩和检验显示在123例FSCN1蛋白高表达样本中，Hsa-miR-145-5p表达强度低于其在65例FSCN1蛋白高表达样本中的表达强度（P<0.001）。两者表达情况行相关性分析，秩相关系数r=-0.391（P<0.001），显示两者表达为负相关趋势。同时发明人通过荧光原位杂交技术，利用DNA骨架修饰合成Hsa-miR-145-5p互补的镶嵌cy3荧光基团的RNA探针对喉癌石蜡切片进行孵育，共聚焦荧光显微镜下观察不同Hsa-miR-145-5p表达状态下FSCN1免疫组化的表达情况，同时用U6作为对照探针。发明人观察到Hsa-miR-145-5p低表达肿瘤灶内，FSCN1蛋白高表达。
（6）发明人经KM法行生存分析并进行Log-rank检验，Hsa-miR-145-5p低表达患者总的平均时间为（85.01±5.24）个月，短于Hsa-miR-145-5p高表达患者总的平均时间（106.09±4.12）个月（χ 2=9.504，P=0.002）；而FSCN1蛋白高表达患者总的平均时间为（79.74±4.43）个月，短于FSCN1蛋白低表达患者总的平均时间（122.83±1.77）个月（χ 2=33.712，P<0.001）。根据Hsa-miR-145-5p及FSCN1蛋白表达情况将患者进一步分类，其中miR-145低表达且FSCN1蛋白高表达患者总的平均生存时间为（76.98±5.59）个月，明显低于miR-145高表达且FSCN1低表达患者总的平均生存时间（123.16±2.03）个月（χ 2=27.614，P<0.001）。
（7）发明人进一步通过Cox模型，发现Hsa-miR-145-5p低表达/FSCN1蛋白高表达的相对危险度为12.69（95%CI为2.83～56.91，P=0.001），是喉鳞癌患者预后的独立影响因素。
本部分取得的有益技术效果是Hsa-miR-145-5p及FSCN1可作为喉鳞癌患者预后评估的分子生物学指标，并可应用于喉鳞癌预后评估的试剂盒。
成熟体模拟物在喉鳞癌细胞系 Hep-2 及 TU-177 建立的喉鳞癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤治疗。
2.1 发明人通过细胞培养技术对喉鳞癌细胞系Hep-2及TU-177进行培养，收集细胞后采用2×106/100μL注射浓度，注射剂量为100μL进行造模，成瘤标准0.5mm3。
2.2发明人利用化学修饰合成Hsa-miR-145-5p成熟体模拟物，目的是让药物其特征是所有核苷酸进行2’-甲氧基修饰，和/或5’端两个核苷酸进行硫代修饰，和/或3’端四个核苷酸进行硫代修饰，和/或5’或者3’端进行胆固醇修饰。目的是使药物在体内发挥时效延长（如图5）。结合药物说明书及以往文献参考剂量，注射浓度为10nmol/0.1mL，注射量为0.1 mL，2次/周/部位（每周第1天、第4天注射），连续注射4周。注射起始点为成瘤伊始，标准0.5mm3。折射采用“十”多点注射。实验终止后处死裸鼠，取瘤体并称重。经统计学分析，两个细胞系的裸鼠移植瘤在接受药物注射后，其肿瘤生长速度及终末肿瘤重量明显慢于及低于NC组（注射无义序列）和Mock组（注射无菌PBS液）。
本部分取得的有益技术效果是Hsa-miR-145-5p成熟体模拟物经过上述修饰，具备喉鳞癌裸鼠模型的抗肿瘤效果，可应用于喉鳞癌分子靶向治疗药物。
成熟体的模拟物用于抑制细胞恶性间质转化标记物 E-cadherin 、 N-cadherin 、 MMP-2 及 MMP-9 的表达。
通过细胞转染恢复Hsa-miR-145-5p的表达水平，检测喉鳞癌细胞株Hep-2、TU-177中细胞恶性间质转化（EMT）关键分子E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表达。发明人发现，当恢复Hep-2及TU-177中Hsa-miR-145-5p表达后，E-cadherin表达上调，而N-cadherin表达下调，说明E-cadherin及N-cadherin是Hsa-miR-145-5p-FSCN1轴上的下游效应分子；而MMP-2、MMP-9都发生下调表达，亦是Hsa-miR-145-5p-FSCN1轴上的下游效应分子。这提示Hsa-miR-145-5p模拟物可以干扰喉鳞癌细胞EMT过程中，从而发挥抗肿瘤的生物学效应，有望成为喉鳞癌治疗的分子靶向药物。
本发明取得的有益技术效果是通过体外转染技术，上调喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177中Hsa-miR-145-5p的表达，可有效抑制细胞恶性间质转化标记物E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9的表达，干扰喉鳞癌细胞EMT过程中，从而发挥抗肿瘤的生物学效应，有望成为喉鳞癌治疗的分子靶向药物。
附图说明
图 1 ：FSCN1蛋白在喉鳞癌中免疫组化染色；
A：FSCN1在喉鳞癌中阴性表达；B：FSCN1在高分化喉鳞癌中高表达；C：FSCN1在低分化喉鳞癌中高表达；D：FSCN1在声门上型喉鳞癌中高表达；E：FSCN1在声门型鳞癌中高表达；F：FSCN1在声门下型鳞癌中高表达；G：PBS代替一抗的阴性对照。（放大倍数400倍）。
图 2 ：FSCN1蛋白在不同TNM分期喉鳞癌中免疫组化染色； A：FSCN1在N+期喉鳞癌中的高表达；B：FSCN1在N0期鳞癌中低表达；C：FSCN1在T4期喉鳞癌中的高表达；D：FSCN1在T1期喉鳞癌中的低表达。（放大倍数400倍）
图 3 ：Hsa-miR-145-5p不同表达状态与FSCN1蛋白免疫组化显色；
A-D：Hsa-miR-145-5p低表达喉癌病例中，癌组织中FSCN1蛋白呈高表达；其中A为细胞核DAPI显像，B为肿瘤组织中Hsa-miR-145-5p荧光探针原位杂交低信号显像，C为融合图，D为肿瘤组织中FSCN1免疫组化染色呈高表达。E-H：Hsa-miR-145-5p低表达喉癌病例中，癌组织FSCN1蛋白呈高表达；其中E为细胞核DAPI显像，F为肿瘤组织中Hsa-miR-145-5p荧光探针原位杂交呈低信号显像，G为融合图，H为该肿瘤组织中FSCN1免疫组化强着色。I-L：Hsa-miR-145-5p高表达喉癌病例中，癌组织FSCN1免疫组化染色强着色；其中I为细胞核DAPI显像，J为肿瘤组织中Hsa-miR-145-5p荧光探针原位杂交呈高信号，K为融合图，L为该肿瘤组织中FSCN1免疫组化弱着色。M-P：Hsa-miR-145-5p在正常喉黏膜上皮呈明显阳性表达，而FSCN1在喉黏膜上皮组织中呈阴性表达。其中M为细胞核DAPI显像，N为Hsa-miR-145-5p荧光探针原位杂交高信号，O为融合图，P为FSCN1免疫组化阴性着色。
图 4 ：A-C：Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中原位杂交荧光显像弱信号；D-F：U6在喉鳞癌组织中原位杂交荧光显像强信号；G-I：Hsa-miR-145-5p在癌旁正常黏膜组织中原位杂交荧光显像强信号；J-L：U6在癌旁正常黏膜中原位杂交荧光显像强信号。
图 5 ：A：Hsa-miR-145-5p不同表达水平喉鳞癌患者生存曲线；B：FSCN1不同表达水平喉鳞癌患者生存曲线；C：Hsa-miR-145-5p与FSCN1不同表达组合分类的喉鳞癌患者生存曲线。
图 6 ：Hsa-miR-145-5p成熟体模拟物化学修饰示意图。（1）2’-甲氧基修饰，（2）硫代修饰，（3）胆固醇修饰。
图 7 ：裸鼠移植瘤注射经化学修饰的Hsa-miR-145-5p 成熟体模拟物后的抑瘤效果。A：TU-177裸鼠移植瘤注射药物4周期间肿瘤生长曲线；B：A：Hep-2裸鼠移植瘤注射药物4周期间肿瘤生长曲线；C：剥离后的移植瘤；D：各组移植瘤重量。（* P<0.05）
图 8 ：A：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后E-cadherin变化蛋白印迹图；B：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5表达后E-cadherin蛋白相对变化量；C：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后N-cadherin变化蛋白印迹图；D：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后N-cadherin蛋白相对变化量。
图 9 ：A：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后E-cadherin蛋白变化印迹图；B：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后E-cadherin蛋白相对变化量；C：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后N-cadherin蛋白变化印迹图；D：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后N-cadherin蛋白相对变化量。
图 10 ：A：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-2变化蛋白印迹图；B：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-2蛋白相对变化量；C：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-9变化蛋白印迹图；D：Hep-2细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-9蛋白相对变化量。
图 11 ：A：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-2蛋白变化印迹图；B：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-2蛋白相对变化量；C：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-9蛋白变化印迹图；D：TU-177细胞中恢复Hsa-miR-145-5p表达后MMP-9蛋白相对变化量。
图12：实施例PCR反应条件。
具体实施方式
实施例 1
Hsa-microRNA-145-5p及其靶基因FSCN1所组成的试剂盒用于喉鳞癌预后评估。
标本来源及入选标准
（1）石蜡样本来源于2000~2006年期间在山西医科大学第一医院耳鼻咽喉头颈外科初诊并行手术的喉鳞癌患者。
（2）患者入院前未行放化疗、生物治疗；患者除喉部原发肿瘤外，经B超、CT、MRI、PET等检查排除其他部位原发肿瘤；患者无乙肝、梅毒、结核等感染病史，无家族遗传性疾病史。术后病理诊断为喉鳞状细胞癌，癌旁切缘黏膜经病理证实为正常黏膜组织；临床资料记录详实。
（3）本实验经山西医科大学科学研究伦理委员会批准，并遵循患者知情同意原则。
石蜡切片中总 RNA 提取及 qRT -PCR 检测
切片机的切片刀经去RNA酶处理，切不同样本时，注意要用不同的接触点去切，必要时更换新的切片刀。切片过程中，操作员带帽子口罩。适度修剪组织石蜡包埋组织边缘多余的石蜡，正式收集样本前应切除2-3片，除去暴露在空气中的样本。选择厚度为20μm，每个样本共切4片，放入去RNA酶的EP管中，共计2份，其中1份用于实验，1份备用。
试剂盒为美国Ambion®公司针对石蜡样本设计的总RNA提取试剂盒：RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE（AM1975）。按照说明书进行操作，操作步骤简要概括如下：
（1）向装有样本的EP管中加入1 mL 100%二甲苯，充分混合并在50℃下孵育3 min；
（2）4℃下以最大速度离心2 min，小心倒掉上层的二甲苯溶液；
（3）用1mL 100%无水乙醇洗两遍；
（4）样品管置于超净台中，空气下干燥样品管内残留的无水乙醇；
（5）样品管中加入试剂盒附带的蛋白水解酶4μL及缓冲液200 μL，50℃下水浴锅中孵育15 min，80℃下再次孵育15 min；
（6）加入混有无水乙醇的分离液，将混合液体加入试剂盒附带的滤柱中，离心；
（7）过滤柱中加入700 μL洗涤液1，10000×g下离心30 sec；
（8）过滤柱中加入500 μL洗涤液2/3，10000×g下离心30 sec；最后短暂离心一下，以尽量去除残留液体；
（9）向滤柱中加入60μL DNase混合液（6 μL 10X DNase Buffer + 4 μL DNase + 50 μL Nuclease-free Water）孵育30 min；
（10）过滤柱中加入700 μL洗涤液1，10000×g下离心30 sec；
（11）过滤柱中加入500 μL洗涤液2/3，10000×g下离心30 sec；最后短暂离心一下，以尽量去除残留液体；本次洗涤共计2次；
（12）室温下加入60 μL 洗脱液对滤柱中的核酸进行洗脱；
（13）收集样品置于-20℃下保存备用；
（14）样品进行质检，于紫外分光光度计中读取A260/A280 OD值。
（15）逆转录；Hsa-miR-145-5p使用茎环法，逆转录引物为广州莱德尔生物科技有限公司产品，货号：LP-mir145-has；在去RNase的PCR管中配置以下溶液：
将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随后立即置于冰上，以防止RNA复性再次恢复二级结构；在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：
Figure 2013104087550100002DEST_PATH_IMAGE004
上述溶液混匀后42℃孵育60min；85℃孵育10min灭活逆转录酶。
（16）定量PCR
内参片段：U6-94bp，上下游引物分别为U6-F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’及U6-R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’
目的片段：Hsa-miR-145-5p-73bp（MIMAT0000437），上下游引物分别为hsa-miR-145-F：5’-ACACTCCAGCTGGGGTCCAGTTTTCCCAGGAA-3’及miR RNA-R：5’-CTCAACTGGTG
TCGTGGA-3’。引物均有生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
反应体系：
Figure 985388DEST_PATH_115321DEST_PATH_IMAGE003
反应条件如图12所示，
融解曲线分析：温度60℃-95℃。每样设三个复孔，并重复3次。
3 、石蜡切片中 FSCN1 免疫组化染色
（1）石蜡包埋组织行4μm连续切片，60℃烤箱中烘烤3-4h；
（2）二甲苯溶液脱蜡3次，梯度酒精（100%~70%）逐级水化，每次3min；
（3）去离子水中浸洗3次，每次3min；
（4）置pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高压修复2'15''后，磷酸盐缓冲液（PBS）中浸洗3次，每
次3min；
（5）3%过氧化氢甲醇溶液封闭10 min，PBS洗3次，每次3min。
（6）滴加非免疫山羊血清（武汉博士德）15 min，而后滴加鼠抗人FSCN1一抗（mMAb
IM20，1:200；Vector Laboratories），4℃孵育过夜；
（7）37℃下复温30min，PBS+1‰ Tween 20液洗3次，每次3min；
（8）室温下，滴加二抗（Max VisionTM HRP-Polymer anti-Mouse IHC kit；福州迈新）孵
育15～20 min，PBS+1‰ Tween 20洗3次，每次3min；
（9）滴加二氨基联苯胺（DAB，Vector Laboratories），显微镜下观察显色，及时进行终止；
（10）苏木素复染，流水适当冲洗，氨水碱化；
（11）梯度酒精（70%~100%）逐级进行脱水，每级3min；
（12）二甲苯过片3次，每次3min；
（13）风干二甲苯，滴加中性树胶进行封片；
（14）以PBS代替一抗作阴性对照；
（15）用已知阳性标本即肺鳞癌作阳性对照，血管内皮细胞作内对照。
免疫组化评价标准
采用半定量方法，即阳性细胞百分数及着色程度评分相加。FSCN1阳性着色部位主要定位于细胞质。阳性细胞＜10%，计1分；11%～50%，计2分；51%～80%，计3分；＞81%，计4分。浅着色计1分；中等着色计2分；强着色计3分。两者分数相加（2～7分），共分为3组：阴性表达（不着色或＜10%细胞阳性着色，不考虑着色强度），低表达（3分），高表达（4～7分）。其中将阴性表达及低表达合并为低表达。
所有切片经我院两名病理专家交叉盲式阅片，40×10倍光镜下观察≥10个视野，每个视野≥100个癌细胞。典型图像由MShot Digital CCD Transducer Imaging System （Microshot Technology Co.）采集并保存。
荧光原位杂交
（1）实验主要试剂、溶液和仪器
耐高温器皿180℃烘烤8 h以上，其它器皿用氯仿冲洗，溶液用0.1%焦碳酸二乙脂(DEPC)
处理或DEPC-H2O（DEPC处理过的蒸馏水）配制。
主要试剂：Hsa-miR-145-5p荧光探针（DNA骨架合成，cy3基团）、去离子甲酰胺、DEPC-H2O、醋酸酐、三乙醇胺、浓盐酸、20×SSC、Tween-20、酵母tRNA、肝素等。
主要溶液：PBS、DEPC-PBS、20×SSC、醋酸酐和三乙醇胺溶液、预杂交液、杂交液、封闭液；
其中：DEPC-PBS：DEPC-H2O配制的PBS，灭菌；20×SSC（100mL）：NaCl 17.53g、柠檬酸钠 8.82g，NaOH调pH为7.0（DEPC-H2O配制），TBST：0.1M Tris pH7.5，0.15MNaCl，0.1%Tween-20；醋酸酐和三乙醇胺溶液：每毫升含6.25μl醋酸酐、5.2μl的12N盐酸、14μl三乙醇胺；预杂交溶液：60%去离子甲酰胺、5×SSC、9.2mM柠檬酸溶液(pH6.0)、50μg/mL肝素、500μg/mL酵母tRNA、0.1%Tween-20；杂交液：含 mirRNA探针的预杂交液，探针工作浓度 20nM；100mM柠檬酸溶液(pH6.0)：柠檬酸3g、柠檬酸钠0.4g，调pH为6.0，定容100mL（DEPC-H2O配制）；封闭液：2%正常山羊血清、2mg/mL BSA的PBST。
（2）原位杂交：
5.2.1 脱蜡和水化：二甲苯2次，每次10分钟；依次经100%、95%、80%、75%乙醇和
DEPC-H2O各一次，每次5分钟。
5.2.2 0.2M HCl室温处理5分钟。
5.2.3 PBS洗3次，每次5分钟。
5.2.4 蛋白酶K（40μg/mL）室温孵育20分钟。
5.2.5 含0.2%甘氨酸的PBS洗3次，每次5分钟。
5.2.6 4%多聚甲醛固定10分钟。
5.2.7 PBS洗2次，每次5分钟。
5.2.8 醋酸酐和三乙醇胺溶液室温孵育10分钟。
5.2.9 PBS洗2次，每次5分钟；
5.2.10 37℃预杂交2小时；
5.2.11 37℃杂交过夜；
5.2.12 5×SSC洗2次，每次20分钟；
5.2.13 50%去离子甲酰胺/2×SSC 50℃洗3次，每次20分钟；
5.2.14 TBST洗5次，每次5分钟；
5.2.15核复染和抗荧光淬灭剂封片；
将1.25 uL 5 mg/mL的DAPI加入50 mL 2×SSC中（终浓度为125 ng/mL，避光保存于4℃），混匀；将玻片置于其中，避光复染5min；2×SSC中洗涤5min；梯度乙醇脱水晾干；每张玻片滴加10 uL抗荧光淬灭剂封片，盖上22mm×22mm盖玻片，-20℃避光保存。
（3）荧光显微镜检测杂交信号
以荧光显微镜观察，先在可见光源下找到实验区视野，然后打开荧光激发光源，DAPI激发波长为345nm，为蓝色荧光，cy3激发波长为515 nm，为红色荧光，分别摄像并合成最终图像。
统计学方法
使用SPSS21.0软件。率的比较用χ 2检验。等级资料用秩和检验。相关性用Spearman秩相关检验。生存分析用Kaplan-Meier法。多因素生存分析用Cox回归模型。所有检验均为双侧，P＜0.05认为差异有统计学意义。
结果
（1）石蜡包埋组织的人口学资料
本次调取2000-2006年期间216例喉鳞癌患者石蜡包埋样本。入组患者由于个人经济、放化疗副作用等原因，初次手术前后均未接受放化疗及生物治疗。鉴于蜡块本身条件，结合石蜡总RNA提取要求、质检情况以及qRT-PCR数据，最终188个样本纳入分析。其中TNM分期按第7版UICC TNM分期标准。吸烟个体按WHO 1997年定义：到个体年龄为止，每天吸烟1支以上并连续或累计6个月。入选样本人口学资料以及临床病理参数详见表1。
表1：石蜡包埋组织样本的人口学资料
（2）Hsa-miR-145-5p与喉鳞癌恶性进展及侵袭转移呈负相关
通过qRT-PCR检测，计算2- ΔΔ ct法计算Hsa-miR-145-5p在188例喉鳞癌组织中的相对表达量，平均表达量为1.873±1.867，中位数为0.980。将样本中相对表达量≤0.980的患者定义为“低表达”个体，相对表达量＞0.980的患者则定义为“高表达个体”。低表达和高表达例数各为94例。通过卡方检验，发现在中低分化、T3+T4期、N+期以及临床中晚期（III+ IV）组中Hsa-miR-145-5p低表达例数所占百分比显著增高（P<0.05），相反，在高分化、T1+T2期、N0期以及临床早期（I+ II）组中Hsa-miR-145-5p低表达例数所占百分比显著降低（P<0.05）。同时，在声门上型喉鳞癌中Hsa-miR-145-5p低表达例数所占百分比分别高于声门下型及声门型（P<0.05）。Hsa-miR-145-5p的表达情况与年龄、性别、远处转移及术前吸烟均无统计学差异（P>0.05），见表2。通过秩和检验发现，Hsa-miR-145-5p在声门上型、中低分化、T3+T4期、N+期以及临床中晚期（III+IV）的喉鳞癌中表达程度均降低（P<0.05）；在伴有远处转移（M1）的病例中，Hsa-miR-145-5p的表达程度也降低（P=0.024），见表3。
（3）FSCN1与喉鳞癌恶性进展及侵袭转移呈正相关
免疫组化观察FSCN1蛋白在188例喉鳞癌中的表达情况。FSCN1蛋白阳性表达主要定位于肿瘤细胞的胞质区，在癌巢中呈弥漫表达，尤其在肿瘤边缘及浸润灶中凸显；而在角化细胞或角化株中常表达缺失。散在淋巴或炎性细胞中可见阳性表达，间质内则呈阴性表达。FSCN1蛋白亦在血管内皮细胞胞质中见阳性表达（图1-2）。
通过卡方检验，发现在>60岁、中低分化、T3+T4期、N+期、临床中晚期（III+ IV）以及术前吸烟组中FSCN1蛋白高表达例数所占百分比显著增高（P<0.05）；相反，在≤60岁、高分化、T1+T2期、N0期、临床早期（I+ II）以及术前非吸烟组中，FSCN1蛋白高表达例数所占百分比显著降低（P<0.05）。同时，FSCN1蛋白在声门上型及声门下型喉鳞癌中高表达例数所占百分比分别高于声门型（P<0.05）。FSCN1蛋白的表达情况与性别、远处转移无关（P>0.05），见表4。通过秩和检验发现，FSCN1蛋白在>60岁、中低分化、T3+T4期、N+期、临床中晚期（III+ IV）以及术前吸烟组中的表达程度增高（P<0.05）。FSCN1蛋白表达强度依次为声门下型＞声门上型＞声门型（P＜0.001）。见表5。
表4：Hsa-miR-145-5p及FSCN1表达分布与喉鳞癌临床病理参数的关系
Figure DEST_PATH_IMAGE012
*Fisher's Exact Test.
表5：Hsa-miR-145-5p及FSCN1表达强度与喉鳞癌临床病理参数的关系
Figure DEST_PATH_IMAGE013
注：两组用Mann-Whitney U 检验，三组用Kruskal-Wallis H检验
（4）Hsa-miR-145-5p与FSCN1蛋白表达在喉鳞癌中呈负相关
在Hsa-miR-145-5p低表达喉鳞癌中，FSCN1蛋白高表达占53.2%，低表达占16.0%；而Hsa-miR-145-5p高表达喉鳞癌中，FSCN1蛋白低表达占84.0%，高表达占46.8%，呈现相反趋势（P<0.001）。秩和检验显示在123例FSCN1蛋白高表达样本中，Hsa-miR-145-5p表达强度低于其在65例FSCN1蛋白高表达样本中的表达强度（P<0.001）。两者表达情况行相关性分析，秩相关系数r=-0.391（P<0.001），显示两者表达为负相关趋势。我们利用荧光原位杂交技术，共聚焦荧光显微镜下观察不同Hsa-miR-145-5p表达状态下FSCN1免疫组化的表达情况，同时用U6作为对照探针。见图3-4。
（5）Hsa-miR-145-5p低表达及FSCN1高表达提示喉鳞癌患者预后不良
7.5.1单因素分析
随访截止于2011年11月，中位随访时间64.0（4～126）个月，失访12例，随访率93.6%。以主动复查及被动随访结合，数据录入我科随访系统。患者5年总DFS率为（66.01±4.00）%。经KM法行生存分析并进行Log-rank检验，Hsa-miR-145-5p低表达患者总的平均时间为（85.01±5.24）个月，短于Hsa-miR-145-5p高表达患者总的平均时间（106.09±4.12）个月（χ 2=9.504，P=0.002）；而FSCN1蛋白高表达患者总的平均时间为（79.74±4.43）个月，短于FSCN1蛋白低表达患者总的平均时间（122.83±1.77）个月（χ 2=33.712，P<0.001）。根据Hsa-miR-145-5p及FSCN1蛋白表达情况将患者进一步分类，其中miR-145低表达且FSCN1蛋白高表达患者总的平均生存时间为（76.98±5.59）个月，明显低于miR-145高表达且FSCN1低表达患者总的平均生存时间（123.16±2.03）个月（χ 2=27.614，P<0.001）。见图5。
（6）多因素生存分析
将有统计学意义的单因素：年龄分组、T分期、颈淋巴转移、分化程度、喉癌分型、术前吸烟、Hsa-miR-145-5p表达及FSCN1蛋白表达引入Cox回归模型，结果见表4。除年龄分组、颈淋巴转移、远处转移、术前吸烟为影响独立的预后影响因子外，FSCN1蛋白表达（RR=12.27，95%CI为3.49～43.19，P=0.001）是患者预后独立影响因子（见表6）。而Hsa-miR-145-5p表达未进入Cox模型。进一步进行分层分析，发现Hsa-miR-145-5p低表达/FSCN1蛋白高表达的相对危险度为12.69（95%CI为2.83～56.91，P=0.001），是喉鳞癌患者预后的独立影响因素。（见表7）
表6：纳入Hsa-miR-145-5p及FSCN1蛋白表达的Cox 回归模型分析
Figure DEST_PATH_IMAGE015
表7：纳入Hsa-miR-145-5p及FSCN1蛋白表达组合分类的Cox 回归模型分析
Figure DEST_PATH_IMAGE017
实施例二： Hsa-miR-145-5p 成熟体模拟物在喉鳞癌细胞系 Hep-2 及 TU-177 建立的喉鳞癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤治疗。
细胞培养。
喉鳞癌细胞株Hep-2（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）、TU-177（Bioleaf Biotech Co.）、正常人口腔黏膜角化细胞HOK（SCIEN CELL）。其中Hep-2培养条件为RPMI-1640（Hyclone） + 10%胎牛血清（Hyclone），TU-177培养条件为DMEM/F12 （Hyclone）+ 10%胎牛血清（Hyclone）。所有细胞都在37℃，5% CO2环境下置细胞培养箱中培养。传代用0.25% 含EDTA胰蛋白酶溶液。
裸鼠饲养。
BALB/C裸鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，SPF级，雌性，7周龄（合格证号：HNASLKJ20120391）。SPF级鼠料饲购自广东省医学实验动物中心（合格证号0088859）。动物实验经山西医科大学科学研究伦理委员会批准。
化学修饰药物。
为了避免化合物体内降解，增加其作用时间，Hsa-miR-145-5p成熟体模拟物（Hsa-miR-145-5p agomir）所有核苷酸进行2’-甲氧基修饰，和5’端进行硫代修饰，和3’端进行硫代修饰，和 5’或3’端进行胆固醇修饰。见图6。
移植瘤模型构建方法。
4.1 裸鼠饲养于智能型独立通气笼IVC系统（型号：IS7，苏州市苏杭科技器材有限公司生产），实验开始前正常饲养一周，无异常后开展实验。
4.2收集细胞注射造模细胞量及浓度：Hep-2细胞总量为7×107，细胞注射浓度为2×106/100 uL，注射剂量100 uL/部位；TU-177细胞总量为3.8×107，细胞浓度为2×106/100 uL，注射剂量100 uL/部位。
4.3 接种部位为：裸鼠背部中点靠颈侧，左、右侧大腿上方背部皮下。其中背部中点处移植瘤注射目的药物，左、右侧大腿上方背部皮下分别为Mock组（注射无菌PBS液）及NC组（注射无义序列）注射组。每种细胞接种裸鼠3只，共分2组，分别为Hep-2注射Hsa-miR-145-5p agomir组；TU-177注射Hsa-miR-145-5p agomir组。
药物注射。
结合药物说明书及以往文献参考剂量，注射浓度为10nmol/0.1mL，注射量为0.1 mL，2次/周/部位（每周第1天、第4天注射），连续注射4周。注射起始点为成瘤伊始，标准0.5mm3。折射采用“十”多点注射。
肿瘤生长曲线。
肿瘤体积=长径*短径2/2，每周测量一次（第7天），每次重复3遍。测量使用电子数显卡尺，分辨力为0.01mm（桂制03000002，桂林广陆数字测控股份有限公司）。
肿瘤称重。
实验结束后立即处死裸鼠，剥取肿瘤，PBS快速冲洗，滤纸吸干表面液体，进行称重。称重用精密电子体天平（上海精密科学仪器有限公司，FA2104）。每个肿瘤称重3次。
结果
Hep-2及TU-177均在7-10天成瘤。经过4周的注射，绘制肿瘤生长曲线。两个细胞系的裸鼠移植瘤在接受药物注射后，其肿瘤生长速度及终末和瘤体重量明显慢于及低于NC组和Mock组，见图7。
实施例三： Hsa-miR-145-5p 成熟体的模拟物用于抑制细胞恶性间质转化标记物 E-cadherin 、 N-cadherin 、 MMP-2 及 MMP-9 的表达。
实验材料
1.1 细胞株：人喉鳞癌细胞株Hep-2、TU-177。
1.2 细胞培养试剂、方法及条件同前。
实验方法
2.1 转染前一天，细胞按2×104个/孔接种于24孔板上，培养基为含10%FBS的DMEM
高糖；
2.2 转染当天，细胞汇合度约为50-60%，吸去旧的培养基，用PBS洗涤两次，然后每孔
加入300μL OPTI-MEM（Invitrogen公司）培养基，置于5% CO2、37°C培养箱中；
2.3 每个孔用OPTI-MEM培养基稀释Lipofectamine2000（Invitrogen公司）1μL，终体积为
50μL，室温下静置5min；
2.4 每个孔用加入20uM浓度的Hsa-miR-145-5p mimics 1μL和0.5ug质粒，再加入OPTI-MEM
至总体积50μL，室温下静置5min；最终孵育液中的Hsa-miR-145-5p mimics浓度为50nM。
2.5 复合(3)和(4)中的稀释液，室温下静置20min；
2.6 每孔加入100μL(5)中的转染复合液，晃动24孔板稍加混匀；
2.7 在5% CO2、37°C培养箱中孵育5h，用新鲜的完全培养基（含血清）替换含有转染复
合物的培养基。注：所用Tip头已做去Rnase处理。
总蛋白抽提
3.1.1 1000 rpm离心10分钟，弃培养液， PBS清洗；再1000rpm离心5分钟，弃上清，PBS清洗；1000rpm离心5分钟，吸去PBS溶液；
3.1.2根据细胞量加入相应的提取缓冲液，4°C轻摇15min；
3.1.3收集裂解液到EP管中，14000rpm离心15min.；
3.1.4取上清到新的EP管中。
蛋白样品初步定量
BCA法测量蛋白浓度。
电泳
3.3.1准备蛋白上样缓冲液：将提取好样品的蛋白溶液和上样缓冲液按2：1混合，煮沸
5min；
3.3.2凝胶电泳前，每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液，
上层槽中缓冲液面需超过上样孔顶端；
3.3.3电泳：80V恒压50min，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。
蛋白质转移
3.4.1 PVDF膜甲醇预处理3～5sec，放至转印液浸润0.5h；
3.4.2取出凝胶，将其放至滤纸上，形成凝胶转印堆积层，滤纸，凝胶，PVDF膜，滤纸，
凝胶转印堆积为“三明治”结构。此操作必须将气泡完全去除；
3.4.3按正负极方向放置转印夹；
3.4.4低温条件下，100V恒压60～120min。
免疫印记
3.5.1取出杂交膜，TBST漂洗5min，三次；
3.5.2 5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h或4°C过夜；
3.5.3 TBST洗膜5min，三次；
3.5.4合适的一抗稀释浓度4°C过夜或37°C孵育2h；注：Factor IX和Factor VIII稀释比
例（1：1000）
3.5.5 TBST洗膜5 min，三次；
3.5.6相应二抗稀释液37°C孵育1h；
3.5.7 TBST洗膜5 min，三次；
3.5.8蒸馏水漂洗膜2 min，弃去液体。共洗三次；
3.5.9将杂交膜置于透明塑料板上，避免膜干燥；
3.5.10用干净移液器将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，使反应持续5 min；
3.5.11用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒。
显影
3.7 主要试剂配制方法
3.7.1 10×电泳缓冲液
144g Glycine
30g Tirs-Base
10g SDS
加800mL纯水溶解后溶至1L室温保存。使用时100mL10*缓冲液加900mL纯水稀释至1×使用。
3.7.2 10*转膜缓冲液
154g Glycine
30g Tris-Base
加800mL纯水溶解后溶至1L室温保存。使用时100mL 10*转膜缓冲液加入200mL甲醇再用纯水定容至1L使用。
3.7.3 5×Loading Buffer
1.25mL 1M Tris-HCL (PH6.8)
0.5g SDS
25mg BPB（溴酚蓝）
2.5mL 甘油
加2mL去离子水溶解后定溶至5mL。使用时每1mL Loading Buffer加入50uL β-巯基乙醇。
3.7.4 Tis缓冲液配方（0.5M pH7.6）
Tris-Base 60.57g
加800mL纯水溶解后，浓盐酸调pH至7.6，定容至1L。
3.7.5 1×TBS(TBST)
先用少量纯水溶解8.5gNaCl，后加入0.5MTis缓冲液100mL，定容至1L，即为1*TBS。加入0.1%的Tween-20。
3.7.6 RIPA裂解液
50mM Tris-HCL PH7.4 ------------ 2mL 1M Tris-HCL PH7.4
150mM NaCL ------------ 1.2mL 5M NaCL
1mM EDTA -------------80uL 0.5M EDTA
1% Triton X-100 ------------- 400uL Triton X-100
0.5% 脱氧胆酸钠 ------------- 0.2g 脱氧胆酸钠
0.1% SDS -------------400uL 10%SDS
使用时1：100加入100mM PMSF、100*Cocktail、磷酸酶抑制剂
3.7.7 定影液
240g 硫代硫酸钠
25g 无水亚硫酸钠
48mL 冰乙酸
加纯水溶解后定容至1L。
主要试剂及耗材
5. 抗体
抗体E-cadherin、N-cadherin均购自美国Cell signaling 公司，抗体孵育浓度为1：1000；抗体MMP-2、MMP-9均购自美国Abcam公司，抗体孵育浓度1:1000。
结果
通过细胞转染恢复Hsa-miR-145-5p的表达水平，检测细胞间质转化（EMT）关键分子E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9的表达。我们发现，当恢复Hep-2及TU-177中Hsa-miR-145-5表达后，E-cadherin表达上调，而N-cadherin表达下调，说明E-cadherin及N-cadherin是Hsa-miR-145-5p的下游效应分子；而MMP-2、MMP-9都发生下调表达，亦是Hsa-miR-145-5p的下游效应分子。这提示Hsa-miR-145-5p调控紊乱在喉鳞癌细胞EMT过程中发挥了生物学效应。见图8-11。
终上所述，本发明涉及的试剂、耗材均可购买到，化学修饰利用现有技术均可实现。本发明的有益技术效果在于提供了一种人属微小RNA，即Hsa-microRNA-145-5p或Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌领域中的应用，具体体现在Hsa-miR-145-5p及其靶基因FSCN1所组成的喉鳞癌预后评估试剂盒，Hsa-miR-145-5p成熟体的模拟物在喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177构建的喉鳞癌裸鼠移植瘤模型中的抗肿瘤治疗以及Hsa-miR-145-5p成熟体的模拟物用于抑制喉鳞癌细胞系Hep-2、TU-177中细胞恶性间质转化（EMT）标记物E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9的表达。所属技术领域的技术人员按照说明书记载内容，能够实现本发明的技术方案，解决技术问题并产生预期技术效果。
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
<120>一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用
<160>3
<210>1
<211>88
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223> hsa-mir-145前体序列
<400>1
CACCU UGUCC UCACG GUCCA GUUUU 25
CCCAG GAAUC CCUUA GAUGC UAAGA 50
UGGGG AUUCC UGGAA AUACU GUUCU 75
UGAGG UCAUG GUU 88
<210>2
<211>23
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223> hsa-miR-145-5p成熟体的模拟物
<400>2
GUCCA GUUUU CCCAG GAAUC CCU 23
<210>3
<211>88
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> FSCN1mRNA序列
<400>3
1 gctgcggagg gtgcgtgcgg gccgcggcag ccgaacaaag gagcaggggc gccgccgcag
61 ggacccgcca cccacctccc ggggccgcgc agcggcctct cgtctactgc caccatgacc
121 gccaacggca cagccgaggc ggtgcagatc cagttcggcc tcatcaactg cggcaacaag
181 tacctgacgg ccgaggcgtt cgggttcaag gtgaacgcgt ccgccagcag cctgaagaag
241 aagcagatct ggacgctgga gcagccccct gacgaggcgg gcagcgcggc cgtgtgcctg
301 cgcagccacc tgggccgcta cctggcggcg gacaaggacg gcaacgtgac ctgcgagcgc
361 gaggtgcccg gtcccgactg ccgtttcctc atcgtggcgc acgacgacgg tcgctggtcg
421 ctgcagtccg aggcgcaccg gcgctacttc ggcggcaccg aggaccgcct gtcctgcttc
481 gcgcagacgg tgtcccccgc cgagaagtgg agcgtgcaca tcgccatgca ccctcaggtc
541 aacatctaca gcgtcacccg taagcgctac gcgcacctga gcgcgcggcc ggccgacgag
601 atcgccgtgg accgcgacgt gccctggggc gtcgactcgc tcatcaccct cgccttccag
661 gaccagcgct acagcgtgca gaccgccgac caccgcttcc tgcgccacga cgggcgcctg
721 gtggcgcgcc ccgagccggc cactggctac acgctggagt tccgctccgg caaggtggcc
781 ttccgcgact gcgagggccg ttacctggcg ccgtcggggc ccagcggcac gctcaaggcg
841 ggcaaggcca ccaaggtggg caaggacgag ctctttgctc tggagcagag ctgcgcccag
901 gtcgtgctgc aggcggccaa cgagaggaac gtgtccacgc gccagggtat ggacctgtct
961 gccaatcagg acgaggagac cgaccaggag accttccagc tggagatcga ccgcgacacc
1021 aaaaagtgtg ccttccgtac ccacacgggc aagtactgga cgctgacggc caccgggggc
1081 gtgcagtcca ccgcctccag caagaatgcc agctgctact ttgacatcga gtggcgtgac
1141 cggcgcatca cactgagggc gtccaatggc aagtttgtga cctccaagaa gaatgggcag
1201 ctggccgcct cggtggagac agcaggggac tcagagctct tcctcatgaa gctcatcaac
1261 cgccccatca tcgtgttccg cggggagcat ggcttcatcg gctgccgcaa ggtcacgggc
1321 accctggacg ccaaccgctc cagctatgac gtcttccagc tggagttcaa cgatggcgcc
1381 tacaacatca aagactccac aggcaaatac tggacggtgg gcagtgactc cgcggtcacc
1441 agcagcggcg acactcctgt ggacttcttc ttcgagttct gcgactataa caaggtggcc
1501 atcaaggtgg gcgggcgcta cctgaagggc gaccacgcag gcgtcctgaa ggcctcggcg
1561 gaaaccgtgg accccgcctc gctctgggag tactagggcc ggcccgtcct tccccgcccc
1621 tgcccacatg gcggctcctg ccaaccctcc ctgctaaccc cttctccgcc aggtgggctc
1681 cagggcggga ggcaagcccc cttgcctttc aaactggaaa ccccagagaa aacggtgccc
1741 ccacctgtcg cccctatgga ctccccactc tcccctccgc ccgggttccc tactcccctc
1801 gggtcagcgg ctgcggcctg gccctgggag ggatttcaga tgcccctgcc ctcttgtctg
1861 ccacggggcg agtctggcac ctctttcttc tgacctcaga cggctctgag ccttatttct
1921 ctggaagcgg ctaagggacg gttgggggct gggagccctg ggcgtgtagt gtaactggaa
1981 tcttttgcct ctcccagcca cctcctccca gccccccagg agagctgggc acatgtccca
2041 agcctgtcag tggccctccc tggtgcactg tccccgaaac ccctgcttgg gaagggaagc
2101 tgtcgggtgg gctaggactg acccttgtgg tgtttttttg ggtggtggct ggaaacagcc
2161 cctctcccac gtggcagagg ctcagcctgg ctcccttccc tggagcggca gggcgtgacg
2221 gccacagggt ctgcccgctg cacgttctgc caaggtggtg gtggcgggcg ggtaggggtg
2281 tgggggccgt cttcctcctg tctctttcct ttcaccctag cctgactgga agcagaaaat
2341 gaccaaatca gtattttttt taatgaaata ttattgctgg aggcgtccca ggcaagcctg
2401 gctgtagtag cgagtgatct ggcggggggc gtctcagcac cctccccagg gggtgcatct
2461 cagccccctc tttccgtcct tcccgtccag ccccagccct gggcctgggc tgccgacacc
2521 tgggccagag cccctgctgt gattggtgct ccctgggcct cccgggtgga tgaagccagg
2581 cgtcgccccc tccgggagcc ctggggtgag ccgccggggc ccccctgctg ccagcctccc
2641 ccgtccccaa catgcatctc actctgggtg tcttggtctt ttattttttg taagtgtcat
2701 ttgtataact ctaaacgccc atgatagtag cttcaaactg gaaatagcga aataaaataa
2761 ctcagtctgc agccccaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa

Claims (4)

1.一种Hsa-miR-145-5p试剂盒，其特征在于，是由以下组合试剂构成的：
Hsa-miR-145-5p 基因定量检测组分：包括Hsa-miR-145-5p PCR引物，10mM浓度的dNTP，RNase抑制剂，microRNA/cDNA逆转录引物，5倍浓度的buffer液，M-MLV，2倍浓度的SYBR Green PCR Master Mix混合液及去离子水；
Hsa-miR-145-5p荧光原位杂交探针：为与Hsa-miR-145-5p碱基互补的碱基序列，并采用DNA骨架修饰，同时用荧光基团cy3修饰；
FSCN1免疫组化组分：包括鼠抗人FSCN1单克隆抗体，镶嵌过氧化物酶基团的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍浓度的PBS及1‰ 吐温20混合液，DAB显色色原、底物及缓冲液。
2.权利要求1所述的试剂盒在喉鳞癌预后评估中的应用。
3.Hsa-miR-145-5p的成熟体的模拟物质，序列为GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU，其特征在于，所有核苷酸进行2’-甲氧基修饰，和/或5’端进行硫代修饰，和/或3’端进行硫代修饰，和/或在5’或者3’端连接胆固醇修饰。
4.权利要求3所述的Hsa-miR-145-5p的成熟体的模拟物对喉鳞癌细胞株Hep-2及TU-177中细胞恶性间质转化标志物，即E-cadherin、N-cadherin、MMP-2及MMP-9蛋白的抑制表达。
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