CN110333302A - 乙酰半胱氨酸溶液中n,n-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了乙酰半胱氨酸溶液中N,N‑二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法,包括,分别采用流动相稀释待测乙酰半胱氨酸溶液和溶解N,N‑二乙酰基羊毛硫氨酸对照品,制得供试品溶液和对照品溶液,随后分别进行高效液相色谱检测,根据检测结果计算得到其含量,色谱条件为,色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱,检测波长:205±2nm,流动相:体积比为97.4%:2.6%‑98.6%:1.4%的6.8g/L磷酸盐缓冲液‑甲醇溶液。本发明可有效检测乙酰半胱氨酸溶液中N,N‑二乙酰基羊毛硫氨酸,且无干扰,专属性强;其检测限和定量限分别为8ng和32ng,可实现定量检测;检测准确度较好;应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明属于分析测试技术领域,涉及乙酰半胱氨酸中杂质的检测方法,具体涉及乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法。
背景技术
乙酰半胱氨酸(Acetylcysteine)从上世纪60年代开始作为祛痰药广泛应用于临床,是临床上作用机制最全面的祛痰药物。由于乙酰半胱氨酸含有巯基(-SH),可使多肽链中的双硫键(-S-S-)断裂,降低痰的粘度,从而使痰容易排出,并能通过刺激气道上皮纤毛运动,增强痰液清除。
目前,乙酰半胱氨酸在国内有颗粒剂、片剂、注射液、滴眼液和吸入溶液等剂型。由于吸入用乙酰半胱氨酸溶液与口服制剂和注射剂相比能更加直接到达上呼吸道及肺部,具有起效迅速和全身不良反应少等优势,尤其适用于儿童患者。
吸入用乙酰半胱氨酸溶液仅收载于美国药典USP40,但是该法定标准没有有关物质检测项,其他如英国药典BP2017、欧洲药典EP9.0和中国药典CP2015均未收载该品种。
关于乙酰半胱氨酸溶液有关物质检测的现有技术较少。申请号为201010297844.9的中国发明专利公开了一种分离测定乙酰半胱氨酸对映异构体的方法,即分离测定杂质对映异构体N-乙酰基-D-半胱氨酸,该专利申请采用柱前衍生化方法,衍生化试剂为Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-氨基酸类化合物,如Nα-(5-氟-2,4-二硝基苯基)-L-丙胺酰胺,所用的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱,流动相为乙酸铵溶液-乙腈体系,且梯度洗脱,以实现对乙酰半胱氨酸原料或制剂中的对映异构体杂质N-乙酰基-D-半胱氨酸进行控制;申请号为201811516127.3的中国发明专利公开了一种乙酰半胱氨酸对映异构体的分离检测方法,该方法同样是采用柱前衍生化方法(衍生化试剂为异氰酸酯类),再使用正相高效液相色谱法进行分离和检测N-乙酰基-D-半胱氨酸。
有关吸入用乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸含量测定的方法在国内外还未见报道。吸入用乙酰半胱氨酸溶液仅控制N-乙酰基-D-半胱氨酸的含量是不合理的,需要根据原料药理化性质、所用辅料、制备工艺和剂型等进行针对性的杂质谱研究和控制,以提高吸入用乙酰半胱氨酸溶液质量控制指标和用药安全性。N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸(杂质E)是吸入用乙酰半胱氨酸溶液中的特有杂质,迄今为止,尚未见到有关吸入用乙酰半胱氨酸溶液对N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸进行控制的报道,也没见到有关乙酰半胱氨酸相关制剂对N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸进行控制的报道。
综上,基于吸入用乙酰半胱氨酸溶液的安全性等角度的考虑,研究开发一种专属性强、灵敏度高且准确度高的乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法显得犹为重要。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法。
本发明采用如下技术方案:
一种乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法,包括,分别采用流动相稀释待测乙酰半胱氨酸溶液和溶解N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品,制得供试品溶液和对照品溶液,随后分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测,根据检测结果计算得到乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的含量;
其中,色谱条件如下:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱;
检测波长:205±2nm;
流动相:6.8g/L磷酸盐缓冲液-甲醇溶液,所述6.8g/L磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为97.4%:2.6%-98.6%:1.4%,且所述6.8g/L磷酸盐缓冲液的pH值为1.8-2.2。
具体地,所述N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸具有如下的化学结构式:
在上述技术方案中,所述色谱柱的规格为:内径3.9mm,长度300mm,填料粒径10μm。
进一步地,在上述技术方案中,所述色谱柱的型号为C18柱。
在上述技术方案中,所述流动相中6.8g/L磷酸盐缓冲液和甲醇的体积比为98%:2%;
优选地,在上述技术方案中,所述6.8g/L磷酸盐缓冲液的制备方法为,称量磷酸二氢钾6.8g,加纯化水1000ml溶解,并用磷酸调节pH值至1.8-2.2。
再进一步地,在上述技术方案中,所述供试品溶液中乙酰半胱氨酸的浓度为3.5-4.8mg/mL,所述对照品溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的浓度为0.007-0.009mg/mL。
又进一步地,在上述技术方案中,所述色谱条件的柱温为20-30℃,优选为25℃。
又进一步地,在上述技术方案中,所述色谱条件的流速为1.4-1.6ml/min,优选为1.5ml/min。
还进一步地,在上述技术方案中,所述色谱条件的检测波长为205nm。
通过对色谱柱、流动相(包括其pH值的调整)、温度和流速等条件反复筛选,探索出了合适的色谱条件。研究发现,采用USP40乙酰半胱氨酸溶液液相色谱条件时,在pH值为4.0,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸在主峰前洗脱且未与主峰分离;流动相pH值为2.0时,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸在主峰后洗脱且能与邻近峰分离,同时也会导致N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸出峰时间延长的不利现象。因此,为了兼顾主成分与N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的分离要求,选择了合适的缓冲溶液体系、流动相的比例等以上关键色谱条件。
还进一步地,在上述技术方案中,所述色谱条件的进样量为20μL。
在供试品溶液中乙酰半胱氨酸的浓度和对照品溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的浓度分别为3.5-4.8mg/mL和0.007-0.009mg/mL,且进样量为20μL时,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的信噪比、分离度和理论塔板数等均达到定量检测要求。
此外,采用流动相稀释、溶解制备供试品溶液和对照品溶液,能减小色谱系统中因洗脱液的波动差异导致的溶剂效应,使色谱图基线平缓,积分定量准确。
具体地,在上述技术方案中,所述乙酰半胱氨酸溶液为吸入用乙酰半胱氨酸溶液。
详细地,在本发明所提供的检测方法中,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸与相邻峰分离度不小于3.0,理论塔板数不低于1500。N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸与相邻峰具有很好的分离度,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸与乙酰半胱氨酸主峰的分离度为4.7,与后面未知峰的分离度为7.6,良好的分离度可以准确的对N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸进行定量测定;N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的理论塔板数在3000以上,在色谱柱中有保留,随流动相逐渐流出,色谱峰呈正态分布,定量准确;此外,本发明所提供的检测方法中,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测限为8ng,定量限为32ng。
与现有技术相比,本发明具有如下优点:
(1)本发明首次建立并验证了乙酰半胱氨酸溶液中的特定杂质N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的分析方法,可有效检测乙酰半胱氨酸溶液中特定杂质N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸,且空白溶液和辅料空白溶液均无干扰,方法专属性强;
(2)本发明的N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测限为8ng,定量限为32ng,灵敏度高,可实现对N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸进行定量检测;
(3)本发明所提供的检测方法中,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的线性范围为1.603-24.040μg/ml(占乙酰半胱氨酸主成分的0.04-0.6%),相关系数r=0.9999,可实现较大浓度范围内的定量检测,同时,其加标回收率为98.24%,RSD为1.36%,具有较好的检测准确度;
(4)本发明通过分析方法对乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的监控,结合制剂工艺和制剂稳定性研究结果获得了N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸产生的途径,通过工艺的控制可减少N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的生成;
(5)本发明首次分离并鉴定了乙酰半胱氨酸溶液中一个未知杂质,即N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸,使得吸入用乙酰半胱氨酸制剂中杂质谱更为清晰和明确,同时通过对N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的质量控制以达到提高相应制剂质量的目的。
附图说明
图1所示为本发明实施例1中空白溶液、辅料空白溶液及系统适用性溶液的液相色谱叠加图;
图2所示为本发明实施例1中系统适用性溶液的液相色谱图;
图3所示为本发明实施例1中专属性实验中供试品溶液的液相色谱图;
图4所示为本发明实施例1中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的标准曲线图;
图5所示为本发明实施例8色谱条件下的液相色谱图;
图6所示为本发明实施例9色谱条件下的液相色谱图;
图7所示为本发明实施例10色谱条件下的液相色谱图;
图8所示为本发明实施例11色谱条件下的液相色谱图;
图9所示为乙酰半胱氨酸注射液进口注册标准有关物质项下液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。
以下实施例仅用于说明本发明,并不用来限制本发明的保护范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
以下实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中所用的吸入用乙酰半胱氨酸溶液为自研品,规格为3ml:0.3g;所用N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品为自制对照品,纯度为97.2%;所用乙酰半胱氨酸对照品为购自中国食品药品检定研究院,纯度为99.8%。
实施例1
1、高效液相色谱的检测条件:
流动相:6.8g/L磷酸盐缓冲液-甲醇,体积比为98:2,其中,6.8g/L磷酸盐缓冲液的配置方法为,称量磷酸二氢钾6.8g,加纯化水1000ml溶解,用磷酸调pH值至2.0;
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱,内径为3.9mm,长度为300mm,填料粒径为10μm;
检测波长:205nm;
柱温:25℃;
流速:1.5ml/min;
进样量:20μl。
2、溶液的配制:
供试品溶液:精密移取吸入用乙酰半胱氨酸溶液(规格为3ml:0.3g)1ml,用流动相稀释成每1ml中乙酰半胱氨酸的含量为4mg,具体参考,精密移取吸入用乙酰半胱氨酸溶液1ml置25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀即得。
对照品溶液:精密称量N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸,用流动相溶解并稀释成每1ml中含N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸0.008mg,具体地,对照品溶液也可由对照品储备液稀释得到,如精密移取对照品储备液1ml,置于50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀即得。
其中,对照品储备液的制备如下:称量N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品20mg,置于50ml量瓶中,加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀即得。
空白溶液:称量磷酸二氢钾6.8g,加纯化水1000ml溶解,用磷酸调pH值至2.0,得到6.8g/L磷酸盐缓冲液,然后6.8g/L磷酸盐缓冲液与甲醇以98:2混合均匀。
系统适用性溶液:精密称取乙酰半胱氨酸对照品40mg,置于10ml量瓶中,加入0.2ml对照品储备液,再加流动相溶解并稀释至刻度,摇匀即得。
3、方法学验证:
(1)系统适用性
称取依地酸二钠0.1g,置烧杯中,用100ml纯化水溶解并稀释至刻度,再用20%氢氧化钠溶液调节pH至6.2-7.2范围内,移取上述溶液1ml,置25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为辅料空白溶液;分别精密取空白溶液、辅料空白溶液与系统适用性溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
图1所示为本发明实施例1中空白溶液、辅料空白溶液及系统适用性溶液的液相色谱叠加图;分析图1可知,空白溶液与辅料空白溶液在N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸峰位置无干扰峰。
图2所示为本发明实施例1中系统适用性溶液的液相色谱图;分析图2可知,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸峰与相邻峰分离度为4.9,达到完全分离,理论塔板数为3721,大于拟定质量标准1500,且系统适用性良好。
(2)专属性
精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。
表1供试品溶液的高效液相色谱测试结果
结果如图3和表1所示,综合分析以上结果可知,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸峰与乙酰半胱氨酸峰的分离度为4.7,与后面未知峰的分离度为7.6,且N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸峰的峰纯度角度小于峰纯度阈值,表明其专属性良好。
(3)检测限/定量限
取对照品溶液,用流动相逐步稀释后再量取20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,当目标峰的信噪比接近3和10时,其浓度即为检测限、定量限浓度。
结果表明,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测限为8ng(信噪比为5,n=2针),占乙酰半胱氨酸主成分的0.01%;定量限为32ng(信噪比为21,n=2针),占乙酰半胱氨酸主成分的0.04%。
(4)线性试验
0.6%线性溶液:移取对照品储备液3ml置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;
0.4%线性溶液:移取对照品储备液1ml,置25ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;
0.2%线性溶液:移取对照品储备液1ml,置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;
0.1%线性溶液:移取对照品储备液1ml,置100ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;
0.05%线性溶液:精密移取0.2%线性溶液5ml,置20ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀;
0.04%线性溶液:精密移取0.4%线性溶液5ml,置50ml量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。
分别取上述0.04%线性溶液、0.05%线性溶液、0.1%线性溶液、0.2%线性溶液、0.4%线性溶液与0.6%线性溶液各20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,以峰面积与对应的浓度作线性回归,结果见下表2;标准曲线见图4。
表2 N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的标准曲线测试结果
结果表明,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸在1.603-24.040μg/ml范围内(占乙酰半胱氨酸主成分的0.04-0.6%)呈良好的线性。
(5)准确度/回收率
0.05%回收率溶液:精密移取对照品储备液5ml,置20ml量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,再精密移取1ml,置50ml量瓶中,加入吸入用乙酰半胱氨酸溶液2ml,用流动相稀释至刻度,摇匀。
0.2%回收率溶液:精密移取对照品储备液1ml,置50ml量瓶中,加入吸入用乙酰半胱氨酸溶液2ml,用流动相稀释至刻度,摇匀。
0.6%回收率溶液:精密移取对照品储备液3ml,置50ml量瓶中,加入吸入用乙酰半胱氨酸溶液2ml,用流动相稀释至刻度,摇匀,作为。
精密量取0.05%回收率溶液、0.2%回收率溶液和0.6%回收率溶液各20μl,依次注入色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面计算,结果见下表3。
表3 N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的回收率测试结果
结果显示,N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的平均回收率为98.24%,RSD为1.36%,表明其含量测定的准确度高。
(6)精密度
平行制备6份供试品溶液,并精密移取对照品溶液与供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得重复性结果;同时,另一测试人员同样按照上述方法,平行制备6份供试品溶液,并精密移取对照品溶液与供试品溶液20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以峰面积计算,得中间精密度结果。重复性结果和中间精密度结果见下表4。
表4重复性结果和中间精密度结果
结果显示,上述N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸含量测定的精密度良好。
(7)溶液稳定性
取放置于室温的对照品溶液与供试品溶液,分别在0h、4h、8h、12h和24h精密取样20μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,与0h峰面积比较,结果见下表5。
表5溶液稳定性测试结果
结果显示,供试品溶液与对照品溶液在室温放置24小时内,稳定性良好。
(8)样品检测
精密量取对照品溶液与供试品溶液各20μl,分别注入液相色谱仪,记录色谱图。按外标法以峰面积计算乙酰半胱氨酸中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的含量。
式中:
Aspl表示供试品溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸峰面积;
Astd表示N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品峰面积;
Wstd表示N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品称样量,mg;
Vspl表示供试品溶液稀释倍数;
Vstd表示N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品溶液稀释倍数;
P表示N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品含量;
100表示供试品标示量100mg/ml。
不同生产批次的吸入用乙酰半胱氨酸溶液自研品中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸含量的检测结果如下表6所示。
表6不同生产批次自研品的检测结果
实施例2
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的流速由1.5ml/min调整为1.4ml/min,溶液的配制与实施例1相同。
实施例3
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的流速由1.5ml/min调整为1.6ml/min,溶液的配制与实施例1相同。
实施例4
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的柱温由25℃调整为23℃,溶液的配制与实施例1相同。
实施例5
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的柱温由25℃调整为27℃,溶液的配制与实施例1相同。
实施例6
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的波长由205nm调整为203nm,溶液的配制与实施例1相同。
实施例7
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的波长由205nm调整为207nm,溶液的配制与实施例1相同。
实施例8
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的甲醇比例由2%调整为2.6%,溶液的配制与实施例1相同。
实施例9
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的甲醇比例由2%调整为1.4%,溶液的配制与实施例1相同。
实施例10
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的流动相pH值由2.0调整为1.8,溶液的配制与实施例1相同。
实施例11
仅将实施例1中的液相色谱检测条件中的流动相pH值由2.0调整为2.2,溶液的配制与实施例1相同。
在实施例2-11液相色谱条件下分别对空白溶液、辅料空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液以及供试品溶液进样(20μl)分析,记录液相色谱图,实施例2-11中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的分离度、拖尾因子、理论塔板数以及含量的结果见下表7。
表7实施例2-11中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的测定结果
图5-8所示分别为本发明实施例8-11色谱条件下的液相色谱图。
分析图5-8和表7的结果可知,较小的分离度为N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸与主峰(乙酰半胱氨酸)的分离度,如实施例2中的3.7;较大的分离度为N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸与后面未知峰的分离度,如实施例2中的6.7;综合上数据可知,实施例2-11色谱条件均满足N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的分离与定量检测。
图9所示为乙酰半胱氨酸注射液进口注册标准有关物质项下液相色谱图,分析可知,采用该进口注册标准对乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸无法实现有效分离,其与辅料依地酸二钠存在干扰。
最后,以上仅为本发明的较佳实施方案,并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的检测方法,其特征在于,包括,分别采用流动相稀释待测乙酰半胱氨酸溶液和溶解N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸对照品,制得供试品溶液和对照品溶液,随后分别将供试品溶液和对照品溶液注入高效液相色谱仪检测,根据检测结果计算得到乙酰半胱氨酸溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的含量;
其中,色谱条件如下:
色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶柱;
检测波长:205±2nm;
流动相:6.8g/L磷酸盐缓冲液-甲醇溶液,所述6.8g/L磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为97.4%:2.6%-98.6%:1.4%,且所述6.8g/L磷酸盐缓冲液的pH值为1.8-2.2。
2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述色谱柱的规格为:内径3.9mm,长度300mm,填料粒径10μm。
3.根据权利要求2所述的检测方法,其特征在于,所述色谱柱的型号为C18柱。
4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述流动相中6.8g/L磷酸盐缓冲液和甲醇的体积比为98%:2%;
优选地,所述6.8g/L磷酸盐缓冲液的制备方法为,称量磷酸二氢钾6.8g,加纯化水1000ml溶解,并用磷酸调节pH值至1.8-2.2。
5.根据权利要求1-4任一项所述的检测方法,其特征在于,所述供试品溶液中乙酰半胱氨酸的浓度为3.5-4.8mg/mL,所述对照品溶液中N,N-二乙酰基羊毛硫氨酸的浓度为0.007-0.009mg/mL。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法,其特征在于,所述色谱条件的柱温为20-30℃,优选为25℃。
7.根据权利要求1-5任一项所述的检测方法,其特征在于,所述色谱条件的流速为1.4-1.6ml/min,优选为1.5ml/min。
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法,其特征在于,所述色谱条件的检测波长为205nm。
9.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法,其特征在于,所述色谱条件的进样量为20μL。
10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法,其特征在于,所述乙酰半胱氨酸溶液为吸入用乙酰半胱氨酸溶液。
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