CN105699554A - 高纯度达托霉素内酯水解物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度达托霉素内酯水解物、制备及其应用。本发明解决了现有技术中达托霉素内酯水解物采用制备柱分离的方法制备时流动相用量大、生产周期长、操作复杂、收率低和成本高的问题。本发明公开的高纯度达托霉素内酯水解物可用于达托霉素的检测，从而实现了有效控制达托霉素质量，确保达托霉素的用药安全。

Description

高纯度达托霉素内酯水解物及其应用

技术领域

本发明属于医药分析技术领域，具体涉及一种高纯度达托霉素内酯水解物、制备及其应用。

背景技术

达托霉素(Daptomycin)是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是它在体外对已呈现甲氧西林(Methicillin)、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强力活性，这个特性对于危重感染患者具有非常重要的临床意义。达托霉素内酯水解物结构式如下：

达托霉素内酯水解物结构式

中国发明专利CN01805212.6公开了达托霉素的14个杂质，如脱水达托霉素、异构达托霉素、达托霉素内酯水解物等杂质，并未具体涉及达托霉素杂质分离方法。

中国抗生素杂志2013年10月第38卷第10期，760～764中公开了达托霉素在不同酸碱条件下产生的杂质及其结构研究，其中杂质4为达托霉素的内酯开环产物CB-131012，该杂质4在pH近中性至碱性条件下产生，但是制备方法是利用HPLC对转化液进行杂质制备，需要消耗大量的流动相、收率低、制备成本高。

达托霉素内酯水解物是达托霉素主要降解杂质，是达托霉素质量控制中重点关注的杂质，严重影响产品质量，为此寻找一种制备方法简单、周期短、成本低并且能够单独分离纯化出该杂质并对其稳定性等相关性质进行研究是非常必要的，对达托霉素的质量提升意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供一种操作简便、成本低廉且能快速地从达托霉素成品制备高纯度达托霉素内酯水解物的方法。

为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案得以解决：

一种达托霉素内酯水解物制备方法，包括如下步骤：

1)碱破坏：取达托霉素样品于室温加入碱性溶液中，待样品完全溶解，加入酸性溶液进行中和，加乙腈-水混合液稀释；

2)稀释液冷藏过夜、结晶沉淀，过滤；

3)水洗滤饼；

4)滤饼30℃真空烘干，获得达托霉素内酯水解物纯品。

作为优选，步骤1)中达托霉素样品为达托霉素粗品、达托霉素成品或达托霉素粉针中任一种或其混合物。

作为优选，步骤1)中碱性溶液的PH值为12～14；更优选碱性溶液为NaOH或KOH溶液，最优选NaOH或KOH溶液摩尔浓度为0.5mol/L。

进一步的，步骤1)中碱性溶液与达托霉素样品的重量体积比为10～50ml/g，优选20～30ml/g。

作为优选，步骤1)中酸性溶液的PH值为0～2；更优选酸性溶液为HCl溶液，最优选HCl的摩尔浓度为0.5mol/L。

作为优选，步骤1)中乙腈-水混合液中乙腈含量为30％～70％；乙腈-水混合液加入量为中和液体积的10～25倍。

作为优选，步骤2)中结晶沉淀温度为2～8℃。

相比于现有技术，本方法无需通过使用价格昂贵的制备色谱柱，也无需使用大量含有有机溶媒的流动相，成本低，方法环保。只需一次性处理，无需反复多次处理。且对起如物料来源要求低，易于获得，可以是达托霉素成品、达托霉素粗品、达托霉素粉针样品。同时本方法可以获得足够量的达托霉素内酯水解物，可以根据需要进行放大制备，可以获得克级杂质，甚至十克级以上杂质，满足研究、生产需要。

本发明还提供了按照上述制备方法制备的高纯度达托霉素内酯水解物在检测达托霉素中内酯水解物含量的应用。

利用高纯度的达托霉素内酯水解物可以利用外标法准确的测定达托霉素中的达托霉素内酯水解物的含量，而外标法是目前测定达托霉素中的达托霉素内酯水解物含量最可靠、最准确、最接近于真实值的方法。外标法需要达托霉素内酯水解物的含量为95％以上，以满足达托霉素内酯水解物结构确定条件。

由于制备了高纯度达托霉素内酯水解物，能进行系统的、完整的测定方法学验证，经验证，该内酯水解物溶液的稳定性良好，从而保证检测结果的准确可靠性，保证药物质量。这是药物质量研究所必需的。

当没有高纯度的达托霉素内酯水解物杂质时，只能采用自身对照法对达托霉素内酯水解物进行测定，方法的可靠性、准确度难以保证，也无法进行系统、完整的测定方法学验证，从而难以保证检测结果的可靠性，无法保证药物质量。

应用如上所述的制备方法制备的高纯度达托霉素内酯水解物检测达托霉素中内酯水解物含量的方法，步骤如下：

1)流动相的配制：

取磷酸二氢铵9g，加水溶解并稀释至2000ml，用1M磷酸调节pH值至3.5，再加入乙腈，磷酸二氢铵与乙腈的体积比为60:40，获得流动相磷酸二氢铵-乙腈缓冲液；

2)供试品溶液的配制：

取达托霉素适量，用pH3.5的磷酸二氢铵溶液-乙腈以体积比为80:20的溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含2mg的溶液，作为供试品溶液；

3)以辛烷基硅烷键和硅胶为填充剂，色谱柱为C₈常规柱；流速为每分钟1.5ml/min，柱温30℃，检测波长214nm，进样盘温度为3℃～7℃，优选5℃。

与现有技术相比，本发明带来的有益技术效果如下：

1、本发明所提供制备高纯度达托霉素内酯水解物的方法简单，对起始物料要求低，重现性好，易于连续生产，生产周期短，生产量大。且所制备得到的达托霉素内酯水解物水解完全、内酯水解物收率高，收率超过50％，纯度高、归一化含量高达97％以上。

2、本发明提供了高纯度达托霉素内酯水解物在检测达托霉素中内酯水解物含量的应用，可更便捷、可靠的检测达托霉素成品质量，提供更安全用药。

附图说明

图1为本发明实施例1的HPLC谱图。

具体实施方式

1、仪器：

检测仪器及方法：

高效液相色谱(HPLC)谱图数据采自于高效液相色谱仪：Agilent1260；

色谱柱：C₈常规柱；

流动相：磷酸二氢铵溶液-乙腈缓冲液；

该缓冲液配制方法如下：取磷酸二氢铵9g，加水溶解并稀释至2000ml，用1M磷酸调节pH值至3.5，然后加入乙腈，二者体积比为60:40；

紫外检测波长：214nm；

柱温：30℃；

流速：1.5ml/min；进样量：10ul。

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实施例1

1)碱破坏：取达托霉素粗品1g，加25ml0.5mol/LNaOH，室温待样品完全溶解，再加入25ml0.5mol/LHCl中和，再加入500ml乙腈含量为50％的乙腈-水混合液稀释。

2)稀释液冷藏至2～8℃，过夜结晶沉淀，过滤；

3)水洗滤饼；

4)滤饼30℃真空烘干，获得达托霉素内酯水解物纯品530mg，归一化含量97.16％，见图1。

通过正离子模式质谱法氨基酸全序列测试，结果达托霉素内酯水解物的氨基酸全序列为：

Dec-Trp(1)-Asn(2)-Asp(3)-Thr(4)-Gly(5)-Orn(6)-Asp(7)-Ala(8)-Asp(9)-Gly(10)-Ser(11)-3mGlu(12)-Kyn(13)。

本实施例制备的达托霉素内酯水解物核磁共振氢谱为：(1H-NMR)(600MHz，DMSO-d6+D2O)：δ7.67(d，J＝7.9Hz，1H)，7.21(dd，J＝7.6Hz，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，1H)，7.09(1H)，7.29(d，J＝7.8Hz，1H)，7.02(dd，J＝7.2Hz，1H)，6.94(dd，J＝7.2Hz，1H)，6.68(d，J＝8.4Hz，1H)，6.53(dd，J＝7.6Hz，1H)，4.70-2.82(22H)，2.82-1.40(19H)，1.40-0.62(26H)。

实施例2

1)碱破坏：取达托霉素成品10g，加150ml1mol/LNaOH，室温待样品完全溶解，再加入150ml1mol/LHCl中和，再加入3800ml乙腈含量为70％的乙腈-水混合液稀释。

2)稀释液冷藏至2～8℃，过夜结晶沉淀，过滤。

3)水洗滤饼。

4)滤饼30℃真空烘干，获得达托霉素内酯水解物纯品5.02g，归一化含量96.15％。

本实施例制备的达托霉素内酯水解物的氨基酸全序列和核磁共振氢谱同实施例1。

实施例3

1)碱破坏：取达托霉素粉针1g，加50ml0.01mol/LKOH，室温待样品完全溶解，再加入50ml0.01mol/LHCl中和，再加入500ml乙腈含量为30％的乙腈-水混合液稀释。

2)稀释液冷藏至2～8℃，过夜结晶沉淀，过滤。

3)水洗滤饼。

4)滤饼30℃真空烘干，获得达托霉素内酯水解物纯品503mg，归一化含量96.65％。

本实施例制备的达托霉素内酯水解物的氨基酸全序列和核磁共振氢谱同实施例1。

实施例4

达托霉素中内酯水解物含量检测

1)流动相的配制：

取磷酸二氢铵9g，加水溶解并稀释至2000ml，用1M磷酸调节pH值至3.5，再加入乙腈，磷酸二氢铵与乙腈的体积比为60:40，获得流动相磷酸二氢铵-乙腈缓冲液；

2)供试品溶液的配制：

取达托霉素适量，用pH3.5的磷酸二氢铵溶液-乙腈以体积比为80:20的溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含2mg的溶液，作为供试品溶液；

3)以辛烷基硅烷键和硅胶为填充剂，色谱柱为C₈常规柱；流速为每分钟1.5ml/min，柱温30℃，检测波长214nm，进样盘温度为5℃。

采用本实施例的检测方法，对3批达托霉素原料进行内酯水解物测定结果见下表1：

表1：达托霉素原料中内酯水解物含量

批号	150402	150406	150501
				内酯水解物(％)	0.12	0.14	0.12

实施例5

达托霉素内酯水解物溶液的稳定性试验

本发明实施例1至3所制备的达托霉素内酯水解物溶液稳定性均较好，以本发明实施例1制备的内酯水解物为例，具体步骤和结果如下：

称取4.5g磷酸二氢铵加入1000ml水溶解，用1M磷酸调节pH至3.5溶液，加入乙腈，按照磷酸二氢铵与乙腈体积比为20:80配制成磷酸二氢铵-乙腈的缓冲盐溶液，备用；

取内酯水解物适量，精密称定，加入上述磷酸二氢铵-乙腈的缓冲盐溶液溶解并稀释制成含29.98μg/ml的溶液，精密量取10μl注入液相色谱仪，连续进样12h，结果见下表2。

表2：内酯水解物溶液的稳定性

结果表明，12h内进样操作内酯水解物溶液稳定。其中RSD是相对标准偏差的英文简称。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种高纯度达托霉素内酯水解物制备方法，包括如下步骤：

1)碱破坏：取达托霉素样品于室温加入碱性溶液中，待样品完全溶解，加入酸性溶液进行中和，加乙腈-水混合溶液稀释；

2)稀释液冷藏过夜、结晶沉淀，过滤；

3)水洗滤饼；

4)滤饼30℃真空烘干，获得达托霉素内酯水解物纯品；

所述高纯度达托霉素内酯水解物归一化含量为95％以上。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中达托霉素样品为达托霉素粗品、达托霉素成品或达托霉素粉针中任一种或其混合物。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中碱性溶液的PH值为12～14；优选碱性溶液为NaOH或KOH溶液，更优选NaOH或KOH溶液摩尔浓度为0.5mol/L。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中碱性溶液与达托霉素样品的重量体积比为10～50ml/g，优选20～30ml/g。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中酸性溶液的PH值为0～2；优选酸性溶液为HCl溶液，更优选HCl的摩尔浓度为0.5mol/L。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中乙腈-水混合液中乙腈含量为30％～70％；乙腈-水混合液加入量为中和液体积的10～25倍。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中结晶沉淀温度为2～8℃。

8.如权利要求1至7任一项权利要求所述的制备方法制备的高纯度达托霉素内酯水解物在检测达托霉素中内酯水解物含量的应用。

9.应用如权利要求1至7任一项权利要求所述的制备方法制备的高纯度达托霉素内酯水解物检测达托霉素中内酯水解物含量的方法，步骤如下：

1)流动相的配制：

取磷酸二氢铵9g，加水溶解并稀释至2000ml，用1M磷酸调节pH值至3.5，再加入乙腈，磷酸二氢铵与乙腈的体积比为60:40，获得流动相磷酸二氢铵-乙腈缓冲液；

2)供试品溶液的配制：

取达托霉素适量，用pH3.5的磷酸二氢铵溶液-乙腈以体积比为80:20的溶液溶解并定量稀释制成每1ml中含2mg的溶液，作为供试品溶液；

3)以辛烷基硅烷键和硅胶为填充剂，色谱柱为C₈常规柱；流速为每分钟1.5ml/min，柱温30℃，检测波长214nm，进样盘温度为3℃～7℃，优选5℃。