CN102533912A - 一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法，属于生物活性肽的制备纯化领域。本发明以麻疯树仔粕蛋白为例，经多种蛋白酶水解，制备出含抗菌肽的组分，再利用细胞膜亲和色谱结合高效液相指纹图谱和质谱为技术快速发现、鉴定及制备纯化抗菌肽。本发明的分离纯化分为两个步骤(亲和萃取和RP-HPLC/MS/MS分离鉴定)，大大缩短了传统抗菌肽的纯化步骤(通常涉及到超滤、阴阳离子交换、大孔树脂吸附、脱盐、凝胶层析和RP-HPLC等5-7步)，并且所得样品均达到色谱纯。可见，本发明的方法的建立为大量制备、准确寻找和快速纯化抗菌肽这类含量较少的生物活性物质，提供一种操作简单、方便和快捷的途径。

Description

一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法

技术领域

本发明涉及一种以细胞膜亲和色谱结合高效液相指纹图谱和质谱为技术快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的工艺，属于生物活性肽的制备纯化领域。 

背景技术

由于抗生素滥用导致的残留严重，自然界中微生物的抗药性不断增强。在人和动物身上已发现了能抵抗现有抗生素(青霉素、大环内酯类、甲氧苄氨嘧啶.磺胺甲基异噫唑、四环素类、氟奎诺酮、氯霉素、万古霉素)的耐药菌株。近二十年来，耐药菌株的感染也逐年呈上升趋势，严重威胁人类的健康。常规抗生素的抗性增加问题已经成为全球公共卫生问题。因此，寻求广谱、高效的新一代抗菌药物已成为世界性的迫切需要。 

抗菌肽发现于二十世纪八十年代，和已有的常规抗生素作用于特异靶蛋白不同的是，抗菌肽以入侵微生物的细胞膜为靶目标，引起细胞膜的裂解从而导致细胞死亡，同时不易使病原菌产生耐药性。因而，抗菌肽有望成为替代抗生素的新一代抗菌药物。但是，目前在抗菌肽的生产方面存在以下问题：天然抗菌肽资源有限，且直接提取工艺复杂，成本昂贵；化学合成法成本太高，产业化困难，同时难以保证合成肽类的生物活性；基因工程方法虽然使获得大量、廉价抗菌肽成为可能，但在实际操作中发现其获得的抗菌肽抗菌、抗病毒能力弱，导致受体细胞“自杀”而难以用常用的细菌、病毒作表达体系且基因表达产量不高。因此，如何提高抗菌肽的生产效率，降低成本，是应用抗菌肽首要解决的问题。 

细胞膜色谱法(Cell Membrane Chromatography，CMC)是研究受体与药物相互作用的新型亲和色谱技术，将高效液相色谱、细胞生物学与受体药理学相结合，利用药物与膜受体间存在的特异性亲和力，成功地将药物体内的作用过程在色谱柱内进行动态模拟。 

由于抗菌肽与细菌细胞膜间存在着特异性的亲和力，将细胞膜色谱法运用在抗菌肽的制备纯化领域，为抗菌肽的分离纯化寻找提供一种目的性强、高效、简便、快捷的方法是可行的。但是，目前在国内外运用细胞膜色谱法分离纯化抗菌肽未见相关的文献报道。 

本专利利用细胞膜亲和色谱技术原理，建立大肠杆菌细胞膜固定相色谱萃取模型，同时，结合高效液相指纹图谱和质谱技术快速筛选蛋白质水解物源抗菌肽。 

发明内容

本发明的目的是提供一种以细胞膜亲和色谱结合高效液相指纹图谱和质谱为技术快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的工艺，包括如下步骤： 

(1)将在固体培养基中活化好的大肠杆菌接入液体培养基中培养至对数期，离心取得菌体，清洗菌体7-10次以去除残留的培养基。 

(2)将步骤(1)中得到的菌体，在-30℃冰箱中冻存4-7h，取出置于37℃水浴锅中融解，反复冻融5-9次，低速离心取得菌体。 

(3)将步骤(2)中得到的菌体，用400-800W的超声波功率进行细胞裂解处理，超声波每次辐射4-10s，间隔4-10s，总时间40-60min，低速离心取得沉淀，此沉淀为大肠杆菌细胞膜。 

(4)将步骤(3)中得到的细胞膜，放在离心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅胶，在4-10℃下反应结合20-90min后，采用3-5μm的微孔滤膜反复过滤5-10次，去除液体，取得固体，此固体为细胞膜亲和固定相。 

(5)以麻疯树仔粕蛋白为例，利用多种蛋白酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶等)进行酶解，控制料液比1∶8～1∶15混合，在50～60℃下调节pH2.0～9.0，水解得到的不同水解度(7％-15％)的水解物后，调回pH到6.8-7.6，90～100℃水浴灭酶10min，然后对得到的不同水解度的水解物(等溶度1-10mg/ml)进行抗菌测试，取的抗菌能力测试最好的组分并在-20℃下保存。 

(6)将步骤(5)得到的样品和步骤(3)得到的亲和固定相，置于置于1-15ml容量的离心管中，置于1-15ml的离心管中，在10-37℃下孵育萃取20-120min，离心取的上清液。沉淀用缓冲液清洗5-10次，合并清洗液和上清液，并命名为流出液。 

(7)将步骤(5)得到的样品和步骤(6)得到的流出液，利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，分析差异峰，纯化制备差异峰并进行抗菌能力测试，同时，找出差异峰的肽系列，制备得到的差异峰为蛋白质水解物源抗菌肽。 

本发明方法的优点： 

1、本发明可以以廉价的农副产品和食品工业下脚料为原料，采用蛋白酶水解，大量制备出抗菌肽组分，变废为宝，减少环境污染，降低生产成本，具有很好的发展前景； 

2、传统抗菌肽的纯化方法中，通常涉及到超滤、阴阳离子交换、大孔树脂吸附、脱盐、凝胶层析和RP-HPLC等5-7步，而本发明的分离纯化主要分为两个步骤：亲和萃取；RP-HPLC/MS/MS分离鉴定，所得样品均达到色谱纯，该分离方法的建立为准确寻找和快速纯化抗菌肽这类含量较少的生物活性物质，提供一种简单、方便和快捷的途径。 

附图说明

附图1为快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的流程图。 

附图2为扫描电镜图。A：活化硅胶；B：细胞膜亲和固定相 

附图3为高效液相指纹图谱。A：阴性对照；B：Fh13-1；C：Fh13 

具体实施方式

以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的 目的。 

实施例1亲和细胞膜固定相的制备 

将培养至对数期的大肠杆菌培养物500ml，在4000r/min离心15min，取得菌体，菌体用25ml的Tris-EDTA缓冲液(pH7.4)清洗10次，以除去培养基残留物。将清洗干净的菌体，用Tris-EDTA缓冲液复溶，并在-30℃冰箱中冻存4h，取出置于37℃水浴锅中融解，反复冻融5次后，3000r/min离心15min。将冻融后的菌体，在600W的超声波功率进行细胞裂解处理，超声波每次辐射4s，间隔4s，总时间60min，低速离心取得沉淀，此沉淀为大肠杆菌细胞膜。将得到的细胞膜复溶制备的悬液10ml，放在离心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅胶0.5g(3-7μm)，在4℃下振荡反应结合1h后，再在超声功率为90W下超声15min之后，采用3μm的微孔滤膜过滤，去除液体，取得固体，此固体为细胞膜亲和固定相(如说明书附图中的图2B)。 

实施例2蛋白抗菌水解物的制备 

以麻疯树仔粕蛋白为例，取蛋白样品10g，纯度为92.26％，加入100mL的去离子水，用不同的水解蛋白酶就行水解，蛋白酶的水解最优条件如表1所示。蛋白溶液被不同的蛋白酶水解成不同的水解度(7％，9％，11％，13％，15％ and 17％)后，将混浊液在45℃下调节pH到7.5，并100℃水浴灭酶10min，然后4000r/min离心15min，取得上清液，冻干，复溶成1mg/ml样品液，并分别做抗菌能力测试，找出抗菌能力最强的组分，并进行冷到干燥。将此样品命名为Fh13. 

表1蛋白酶的最优作用条件 

实施例3亲和萃取联用高效液相及质谱技术准确快速发现及鉴定抗菌肽 

将实施例1中的亲和固定相和实施例2的中Fh13置于10ml的离心管中，37℃下振荡结合1h后，离心取的上清液。沉淀用缓冲液清洗7次，合并清洗液和上清液，冷到干燥并命名为Fh13-1。将Fh13和Fh13-1复溶，并利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，分析差异峰(如说明书附图中的图3中的1，2和3号峰)，制备差异峰并进行抗菌能力测试。在此条件下快速发现制备了一个蛋白质水解物源抗菌肽，此肽的系列为CAILTHKR，其大肠杆菌的最低抑菌溶度为29μg/mL。 

Claims (4)

1.一种快速准确发现、鉴定及制备蛋白质水解物源抗菌肽的方法，包括如下步骤：

(1)亲和细胞膜固定相的制备

(2)蛋白抗菌水解物的制备

(3)亲和萃取联用高效液相及质谱技术准确快速发现及鉴定抗菌肽

2.根据权利要求1所述亲和细胞膜固定相的制备，其特征在于：

(1)将在固体培养基中活化好的大肠杆菌接入液体培养基中培养至对数期，离心取得菌体，清洗菌体7-10次以去除残留的培养基。

(2)将步骤(1)中得到的菌体，在-30℃左右的冰箱中冻存4-7h，取出置于10-37℃水浴锅中融解，反复冻融5-9次，低速离心取得菌体。

(3)将步骤(2)中得到的菌体，用400-800W的超声波功率进行细胞裂解处理，超声波每次辐射4-10s，间隔4-10s，总时间40-60min，低速离心取得沉淀，此沉淀为大肠杆菌细胞膜。

(4)将步骤(3)中得到的细胞膜，放在离心管中，然后加入活化好了的大孔球形硅胶，在4-10℃下反应结合20-90min后，采用3-5μm的微孔滤膜反复过滤5-10次，去除液体，取得固体，此固体为细胞膜亲和固定相。

3.根据权利要求1所述蛋白抗菌水解物的制备，其特征在于：

(1)以麻疯树仔粕蛋白为例，利用多种蛋白酶进行酶解，控制料液比1∶8～1∶15混合，在50～60℃下调节pH2.0～9.0，水解得到的不同水解度(7％-15％)的水解物后，调回pH到6.8-7.6，90～100℃水浴灭酶10min，然后对得到的不同水解度的水解物(等溶度1-10mg/ml)进行抗菌测试，取的抗菌能力测试最好的组分并在-20℃下保存。

4.根据权利要求1所述亲和萃取联用高效液相及质谱技术准确快速发现及鉴定抗菌肽，其特征在于：

(1)将权利要求2中得到的细胞膜亲和固定相和权利要求3中得到的最好的抗菌水解物组分，置于1-15ml的离心管中，在10-37℃下孵育萃取20-120min，离心取的上清液。沉淀用缓冲液清洗5-10次，合并清洗液和上清液，并命名为流出液。

(2)将权利要求3中得到的最好的抗菌水解物组分和步骤(1)得到的流出液，利用高效液相-质谱技术，检测其指纹图谱，分析差异峰，纯化制备差异峰并进行抗菌能力测试，同时，找出差异峰的肽系列，制备得到的差异峰为蛋白质水解物源抗菌肽。

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