CN105132506A - 一种辣椒籽抗菌肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，该方法包括提取辣椒籽粗蛋白；应用食品级酶制剂对辣椒籽粗蛋白进行酶解；利用抗菌肽与细菌相互作用并联合凝胶层析对酶解液中的抗菌肽进行分离即得辣椒籽抗菌肽；由蛋白酶水解辣椒籽获得的抗菌肽，具有安全性高、抗菌性强的特点，在食品、饲料及化妆品等行业具有潜在利用价值。该方法利用抗菌肽与细菌结合的特性，实现了靶向性分离，克服常规抗菌肽分离的步骤繁琐、过程大量使用化学试剂的缺点，该发明以辣椒加工副产物为原料，增加了辣椒籽资源的可利用性。
Description
技术领域
本发明涉及一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，属于生物活性肽的制备纯化领域。
背景技术
我国西南地区盛产辣椒，主要用于鲜食或加工成调味品，以及制备辣椒油、辣椒色素或辣椒碱。占辣椒果实干重30~60%以上的辣椒籽的利用价值常被忽视，造成资源浪费。辣椒籽除了不包含脂肪酸和酚类物质外，还含有约10%～29%的粗蛋白，是一种亟待开发的天然植物蛋白质资源。将辣椒籽蛋白进行有效利用并高值化，对充分利用辣椒加工副产物、合理利用资源、实现特色农产品高值化加工有重要意义。
食品中腐败菌及致病菌污染问题不仅造成了经济损失，还给食品安全带来巨大压力。如何防治食品腐败菌和食源性致病菌对食品安全的危害并实现对食品微生物污染与控制已是食品工业的一个重要方向。
抗菌肽也称为宿主防御肽，是机体抵御外来微生物威胁的第一道防线，属于抗生素的家族，它们对细菌、真菌、原生动物、肿瘤细胞、病毒等都具有毒性，抗菌肽在体内最终酶解为氨基酸，无残留毒性。因此，抗菌肽添加到食品中以维护食品的安全性、提高食品质量和改善人类健康方面的作用和潜力逐渐被认识，以抗菌肽为基础的解决食品防腐剂问题具有重要意义。但天然存在的抗菌肽含量较低，制备上一直沿用传统活性肽制备方法，样品制备繁琐且得率低，所以改进获得高效快速的制备方法是抗菌肽高效规模制备的关键。
抗菌肽与细菌相互作用是其发挥抗菌内活性作用的前提。利用抗菌肽与细菌间选择性结合的特点，结合凝胶层析技术可实现抗菌肽的快速制备。
发明内容
本发明提供一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，该辣椒籽抗菌肽可应用于食品、饲料和化妆品行业中。
其制备方法包括如下步骤：
（1）辣椒籽粗蛋白的制备；
（2）辣椒籽粗蛋白酶解液的制备；
（3）利用抗菌肽与细菌作用并联合凝胶层析分离酶解液中的抗菌肽。
上述方法的具体操作如下：
（1）以辣椒籽为原料，将其粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比为1:5～1:10，50～200W超声处理20～60min，然后于50～80℃浸提2～4h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:5～1:10的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，50～200W超声处理20～60min后，30～70℃下100～200rpm/min搅拌浸提4～10h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
（2）按料液比1:20～1:30的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度20～40℃、pH7～9条件下，搅拌混合30～60min后，于4000～10000rpm离心10～30min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值4～5以沉淀蛋白，再4000～10000rpm离心10～30min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
（3）制备质量百分比3～6%的辣椒籽粗蛋白水溶液，35～70℃下调节pH至2.0～9.0，添加酶酶解1～4h，将酶解液100℃煮沸5～10min灭酶，离心取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
（4）将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配制成10～40mg/mL的水溶液，在37℃下与1.0×105CFU/mL细菌悬液混合，轻微振荡孵育反应10～60min后，经0.22微米微孔滤膜过滤除去菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱检测细菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与细菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
所述细菌悬液为大肠杆菌、宋内志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌中的一种悬液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明抗菌肽与细菌间选择性结合的特点，结合凝胶层析技术可实现抗菌肽的快速制备，与传统制备抗菌肽方法相比仅需要抗菌肽与细菌孵育和凝胶层析两个关键步骤，快速、准确筛选到活性肽，降低抗菌肽制备成本，提高效率。
2、以辣椒加工副产物辣椒籽为原料，价格低廉，为深度开发利用辣椒籽资源开辟新途径。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：以宋内志贺菌筛选制备辣椒籽抗菌肽的方法，具体内容如下：
（1）将辣椒籽粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比1:8，200W超声处理30min，然后于70℃浸提4h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:10的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，200W超声处理30min，50℃下150rpm/min搅拌浸提5h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
（2）按料液比1:20的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度20℃、pH7条件下，搅拌混合60min后，于4000rpm离心30min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值4以沉淀蛋白，再10000rpm离心10min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
（3）称取辣椒籽粗蛋白制备质量百分比5%的辣椒籽粗蛋白水溶液，37℃下调节pH2.0，添加胃蛋白酶，酶活为4000U/g辣椒籽粗蛋白，酶解4h后将酶解液100℃煮沸10min灭酶，10000rpm离心30min取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
（4）将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配置成20mg/ml的水溶液，37℃下与1.0×105CFU/ml宋内志贺氏菌菌悬液轻微振荡(50rpm/min)孵育30min，经0.22微米微孔滤膜过滤去除菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱（16mm×100cm，流速0.8ml/min，去离子水洗脱）检测与宋内志贺氏菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与宋内志贺氏菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽；
（5）辣椒籽抗菌肽抑菌率分析时将100微升经0.22微米微孔滤膜过滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入96孔酶标板中，再加入等体积的1.0×105CFU/mL的宋内志贺氏菌菌悬液作为试验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的辣椒籽抗菌肽溶液作为对照组，37℃培养12h后用酶标仪测定620nm下吸光值，辣椒籽抗菌肽抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的比值。经抑菌率检测，本发明方法所获得辣椒籽抗菌肽对宋内志贺氏菌的抑菌率为87.21%。
实施例2：以金黄色葡萄球菌筛选制备辣椒籽抗菌肽的方法，具体内容为：
（1）将辣椒籽粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比1:5，100W超声处理40min后，于50℃浸提4h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:8的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，100W超声处理40min，70℃下100rpm/min搅拌浸提10h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
（2）按料液比1:25的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度30℃、pH8条件下，搅拌混合40min后，于8000rpm离心25min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值5以沉淀蛋白，再8000rpm离心20min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
（3）称取辣椒籽粗蛋白制备质量百分比5%的辣椒籽粗蛋白水溶液，50℃下调节pH7.5，添加胰蛋白酶，酶活为5000U/g辣椒籽粗蛋白，酶解3h后将酶解液100℃煮沸5min灭酶，9000rpm离心25min取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
（4）将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配置成30mg/ml的水溶液，37℃下与1.0×105CFU/ml金黄色葡萄球菌菌悬液轻微振荡(50rpm/min)孵育40min，经0.22微米微孔滤膜过滤去除菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱（16mm×100cm，流速0.8ml/min，去离子水洗脱）检测与金黄色葡萄球菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与金黄色葡萄球菌菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
（5）辣椒籽抗菌肽抑菌率分析时将100微升经0.22微米微孔滤膜过滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入96孔酶标板中，再加入等体积的1.0×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌悬液作为试验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的辣椒籽抗菌肽溶液作为对照组，37℃培养12h后用酶标仪测定620nm下吸光值，辣椒籽抗菌肽抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的比值。经抑菌率检测，本发明方法所获得辣椒籽抗菌肽对宋内志贺氏菌的抑菌率为74.16%。
实施例3：以大肠杆菌筛选制备辣椒籽抗菌肽的方法，具体内容为：
（1）将辣椒籽粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比1:10，50W超声处理60min后，于80℃浸提2h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:5的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，55W超声处理50min，30℃下150rpm/min搅拌浸提8h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
（2）按料液比1:30的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度40℃、pH9条件下，搅拌混合30min后，于5000rpm离心15min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值5以沉淀蛋白，再6000rpm离心15min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
（3）称取辣椒籽粗蛋白制备质量百分比6%的辣椒籽粗蛋白水溶液，60℃下调节pH9，添加碱性蛋白酶酶，酶活为4000U/g辣椒籽粗蛋白，酶解3h后将酶解液100℃煮沸8min灭酶，8000rpm离心20min取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
（4）将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配置成40mg/ml的水溶液，37℃下与1.0×105CFU/ml大肠杆菌菌悬液轻微振荡(50rpm/min)孵育40min，经0.22微米微孔滤膜过滤去除菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱（16mm×100cm，流速0.8ml/min，去离子水洗脱）检测与大肠杆菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与大肠杆菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
（5）辣椒籽抗菌肽抑菌率分析时将100微升经0.22微米微孔滤膜过滤除菌的辣椒籽抗菌肽溶液加入96孔酶标板中，再加入等体积的1.0×105CFU/mL的大肠杆菌菌菌悬液作为试验组，用100微升无菌生理盐水代替等体积的辣椒籽抗菌肽溶液作为对照组，37℃培养12h后用酶标仪测定620nm下吸光值，辣椒籽抗菌肽抑菌率为对照组和实验组吸光值之差与对照组吸光值的比值。经抑菌率检测，本发明方法所获得辣椒籽抗菌肽对大肠杆菌菌的抑菌率为90.81%。
Claims (2)
1.一种辣椒籽抗菌肽的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）以辣椒籽为原料，将其粉粹过20目筛，在辣椒籽粉末中添加质量百分比浓度95%的食用乙醇，调节料液比为1:5～1:10，50～200W超声处理20～60min，然后于50～80℃浸提2～4h以脱辣椒碱；弃掉乙醇挥发净后，按料液比1:5～1:10的比例，在脱辣椒碱的辣椒籽粉中加入食品级正己烷，50～200W超声处理20～60min后，30～70℃下100～200rpm/min搅拌浸提4～10h，真空抽滤除去正己烷，挥干溶剂即得脱脂辣椒籽粉；
（2）按料液比1:20～1:30的比例在脱脂辣椒籽粉中添加蒸馏水，在温度20～40℃、pH7～9条件下，搅拌混合30～60min后，于4000～10000rpm离心10～30min，收集上清液，上清液用0.1mol/LHCL和0.1mol/LNaOH调节pH值4～5以沉淀蛋白，再4000～10000rpm离心10～30min收集沉淀，将收集的沉淀用纯水洗3遍后将pH调节为7，让沉淀的粗蛋白复溶，置于透析袋中，透析24h，冻干得到辣椒籽粗蛋白；
（3）制备质量百分比3～6%的辣椒籽粗蛋白水溶液，35～70℃下调节pH至2.0～9.0，添加酶酶解1～4h，将酶解液100℃煮沸5～10min灭酶，离心取上清液，上清液用截留分子量为5KDa的超滤膜进行分离，收集滤液即得到分子量在5KDa以下的辣椒籽抗菌肽粗品溶液，冻干得辣椒籽抗菌肽粗品粉末；
（4）将辣椒籽抗菌肽粗品粉末配制成10～40mg/mL的水溶液，在37℃下与1.0×105CFU/mL细菌悬液混合，轻微振荡孵育反应10～60min后，经0.22微米微孔滤膜过滤除去菌体后，用葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱检测细菌菌悬液孵育前后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液的洗脱曲线图，与细菌菌悬液孵育后的辣椒籽抗菌肽粗品溶液在凝胶层析图谱上减少的峰，即为目标辣椒籽抗菌肽峰，收集即得辣椒籽抗菌肽。
2.根据权利1要求所述的辣椒籽抗菌肽的制备方法，其特征在于：细菌悬液为大肠杆菌、宋内志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌中的一种悬液。
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