KR20100088251A - 면역활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법 - Google Patents
면역활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법Info
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Abstract
본 발명은 면역 활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법으로 구멍갈파래를 120~150Mpa, 110~120℃의 조건으로 각각 1~5분 동안 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
고온 고압 액화추출은 건조된 구멍갈파래를 고온·고압액화기안 용기에 물과 함께 넣어 밀봉한 후, 고압액화기를 이용하여 120~150Mpa, 110~120℃의 조건으로 1~5분 동안 추출공정을 실행하고, 후에 추출액을 20㎛ 여과지에 여과, 농축 후 동결건조 한다.
본 발명은 구멍갈파래를 고압 고온 단시간 추출하게 됨으로써 유용성분의 용출이 쉬워지며, 황산기결합, 수소결합과 같은 결합은 분리되어 세포독성 물질이 파괴되고 면역 활성 증진물질이 다량 용출되게 된다.
구멍갈파래, 면역활성, 황산기결합, 고온초고압추출
Description
본 발명은 구멍갈파래 추출에 관한 것으로, 구멍갈파래를 고온 고압 단시간 추출함으로써 수율이 증진되고 활성성분이 효율적으로 용출되게 하여 면역활성이 크게 증진된 구멍갈파래 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
제주산 구멍갈파래는 제주연안 마을 어장에 30% 이상을 갯녹음 현상으로 진행시킬 정도로 제주어장 황폐화에 주범이다. 이제 제주도는 해마다 막대한 자금을 들여 구멍갈파래를 수거한다. 이에 구멍갈파래의 처리방안이 절실히 요구되는 실정이다. 지금까지의 연구된 바에 의하면 해조류는 비타민, 무기질 등의 미량성분들이 균형 있게 분포되어 대사 작용의 개선, 저칼로리 다당류인 식이성 섬유에 의한 정장작용과 유독물질의 제거효과를 가지며, 저분자 생리활성 물질은 혈압과 콜레스테롤의 정상화 및 암 예방 에도 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 이처럼 구멍갈파래도 비타민 A,B,C를 비롯한 영양소를 풍부하게 함유하고 있어 기능성 식품소재로의 개발 가능성이 높음에도 우리나라에서는 위해자원이라는 인식 때문에 식용으로 사 용하고 있지 않으며 가축의 사료로 이용되는 실정이다. 하지만 유럽에서는 이미 구멍갈파래를 식용(샐러드 & 수프)으로 이용하고 있으며 유럽 또한 생리활성 및 식품학적 연구가 미비하게 이루어 지고 있다. 또한, 구멍갈파래에 상당량 존재하는 산성다당류때문에 항종양, 항바이러스, 면역증강, 혈액의 항 응고 작용 등의 효과가 있을 것으로 예측되지만, 기능성 소재로서 활용을 위한 체계적인 연구가 거의 안 되어 있다. 이에 국내 전무한 구멍갈파래의 활용도를 높이기 위하여 노화억제 면역 활성 증진을 위한 효과적인 추출기술을 개발하고자 하였다.
그런데, 구멍갈파래는 육상식물과는 다르게 황산기를 함유한 다당류를 다량 함유하고 있으며, 세포벽에 물을 다량 함유한 젤리 성분으로 원형체와 분리되어 세포질사로 연결되어 있어 세포벽이 육상식물에 비해 두꺼우며 종래의 해조류에 행해지는 추출법으로는 세포벽을 파괴하고 유용성분물질을 유효하게 용출해 낼 수 없다. 즉, 구멍갈파래를 단순 열수추출하여서는 낮은 수율을 나타낼 뿐만 아니라 100 이상의 고온으로 24시간 이상 장시간의 가열이 필요하며 이러한 고온 장시간 가열로 말미암아 다당류 및 활성성분이 파괴되어 생리활성을 크게 기대하기 힘든 단점이 있어 다당류와 활성성분이 다량 함유한 구멍갈파래의 효율적인 용출을 기대하기 힘든 점이 있다.
또한 이러한 문제를 극복하기 위한 신기술인 초고압 처리를 이용하였으나 기존 초고압 처리는 100℃ 가까운 고온에서의 초고압추출은 급격한 세포파괴와 함께 HMF(Hydroxymethyl furfural)등의 인체에 해를 끼칠 수 있는 독성 물질이 생성되어 50℃이하의 저온의 공정에서만 이루어졌으며, 이러한 저온의 공정으로도 다른 식물 의 추출에서는 추출 효율이 낮고 에너지 소비가 많으며 열로 인한 많은 유용성분의 파괴, 단백질의 변이, 성분의 손실, 가용성분 위주의 추출, 열에 대하여 불안정한 것 등의 열수추출의 단점을 개선하였으나 구멍갈파래의 추출에서는 구멍갈파래의 특징인 황산다당류의 결합을 분해할 수 없어 면역기능에 유용한 물질의 효율적인 추출을 수행하지 못하며, 따라서 효율적인 추출을 위해서는 저온 초고압 처리 후 다시 열수 추출을 수행하기 때문에 시간과 자원의 낭비를 초래하게 된다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해소시켜주기 위하여 본 발명에서는 구멍갈파래를 고온 고압액화기술로 단시간 추출함으로서 면역활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명의 고온·고압액화 추출공정은 저온 고압추출에서 다시 열수추출하여야 하는 반복의 과정이 일원화 되어 신속하게 진행되며, 장시간의 추출이 아닌 순간의 고온·초고압에 의해 구멍갈파래의 중요 구성 성분을 단시간 내에 추출이 가능하며, 추출물은 거의 불순물이 없고, 높은 순도의 단일 성분을 쉽게 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 고온·고압 액화 추출공정은 추출 대상의 세포 조직의 적절한 파괴로 인한 유용성분의 용출이 쉬워지며, 황산기결합, 수소결합과 같은 결합은 분리되어 세포독성 물질이 파괴되고 면역 활성 증진물질이 다량 용출된다.
구멍갈파래의 구조상 고온 초고압 하에서 추출하여도 급격한 세포파괴가 되 지 않고 독성물질이 생성되지 않아 상기한 것처럼 본 발명의 고온 초고압추출은 구멍갈파래에 있어서는 최적의 추출 조건이 되는 것이다.
본 발명은 면역 활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법으로 구멍갈파래를 120~150Mpa, 110~120의 조건으로 1~5분 동안 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
고온 고압 액화추출은 건조된 구멍갈파래를 고온·고압액화기안용기에 물과 함께 넣어 밀봉한 후, 고압액화기를 이용하여 120~150Mpa, 110~120의 조건으로 1~5분 동안 추출공정을 실행하고, 후에 추출액을 20㎛ 여과지에 여과, 농축 후 동결건조 한다.
본 발명은 고압과 고온상태에서 동시에 추출하게 됨으로써 단시간에 유용성분의 용출이 쉬워지며, 황산기결합, 수소결합과 같은 결합은 분리되어 면역 활성 증진물질이 다량 용출되게 된다.
이를 확인하기 위해 본 발명은 상기 추출 공정을 거친 후 구멍갈파래의 추출 수율 및 면역활성을 측정함으로서 상기 공정의 면역 활성 증진효과를 검토하기로 하였다.
구멍갈파래는 항종양, 항바이러스, 면역증강, 혈액의 항 응고 작용 등 많은 활성을 갖고 있을 것으로 예측됨에도 불구하고 환경의 위해요소 라는 인식으로 인해 활용이 거의 없는 실정이었다. 따라서 구멍갈파래의 기능성 식품소재 활용방안 을 연구하기위해 본 발명에서 제시한 고온·초고압처리를 통하여 구멍갈파래의 수율 증가 및 면역활성 증진 추출물을 얻을 수 있어, 이와 같은 문제를 해결할 수 있는 방법을 제시하였고, 폐기물로 치부된 구멍갈파래의 부가가치 창출이라는 경제적·친환경적 효과를 얻을 수 있다.
또한 고온 초고압 액화 공정 기술을 도입하여 기존 추출 공정의 문제점을 해결함과 동시에 보다 높은 수율증진과 면역활성성분 용출을 통하여 비교적 높은 면역활성을 나타낼 수 있는 장점 뿐만이 아니라 단시간의 고온처리로 인한 성분변화가 적은 장점이 있어 이러한 추출 공정을 적용하여 구멍갈파래와 유사한 구조의 다른 해조류나 육상자원의 기능성 식품 소재의 추출공정에도 활용될 수 있을 것이다.
본 발명의 구멍갈파래의 구체적인 추출 방법은 다음과 같다.
건조된 구멍갈파래를 고온·고압액화기안 용기에 물과 함께 넣어 밀봉한 후, 고압액화기를 이용하여 120~150Mpa, 110~120℃의 조건으로 1~5분 동안 추출공정을 실행하고, 후에 추출액을 20㎛ 여과지에 여과, 농축 후 동결건조 한다.
실시 예 1. 구멍갈파래의 고온·고압 추출
1) 원료 : 구멍갈파래(Ulva pertusa kjellman)을 세척하여 건조하였다.
2) 고온·고압 추출 : 고온·고압액화기(도1)를 이용하여 150Mpa, 110℃의 조건으로 5분 동안 추출공정을 실행하였다.
3) 농축 : 위의 항에서 얻어진 각각의 추출물들은 감압 여과장치(20㎛ 여과지)로 여과하여 추출 온도보다 낮은 온도로 감압 농축 하였다.
4) 동결건조 : 상기의 방법으로 얻어진 농축 물들은 동결 건조하여 사용 하였다.
실시 예 2. 구멍갈파래의 열수추출
건조된 구멍갈파래를 100℃에서 24시간동안 열수추출 하였다.
위에서 얻은 추출물을 실시예 1처럼 감압농축 동결건조하여 사용하였다.
실시 예 3. 구멍갈파래의 저온 고압추출
건조된 구멍갈파래를 비닐 용기에 물과 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출 장치를 이용하여 150 Mpa의 기압으로 15분동안 50℃ 온도로 초고압 추출을 실행하였다.
위에서 얻은 추출물을 실시예 1처럼 감압농축 동결건조하여 사용하였다.
실험 예. 추출방법에 따른 구멍갈파래 추출물의 면역활성 비교
실시 예 1,2,3에서 얻어진 구멍갈파래 추출물에 대하여 수율 및 세포독성활성을 비교하였다.
1) 수율
| Sample | High-Pressure(Mpa) | temperature(℃) |
yields
(%, w/w) |
|
Ulva pertusa kjellman
|
- | 100 | 4.98 |
| 150 | 50 | 8.31 | |
| 150 | 110 | 12.28 |
구멍갈파래의 추출수율은 다음과 같다. 모든 조건 중 고온·고압액화 추출물에서 가장 높은 수율을 나타내었다. 추출 수율은 100℃ 일반 열수 추출에 비해서 2.5배 정도 증가한 것으로 나타났다. 또한 저온·고압 추출물에 비해서는 1.5배 높은 추출수율을 보인다. 이것은 고온 고압액화추출에 의해 구멍갈파래의 두꺼운 세포벽이 쉽게 파괴됨으로서 기존 물질들의 용출량이 증가하고 새로운 물질이 용출되어 수율이 높게 나타난 것으로 보인다.
2) 항노화 활성 비교
① Natural Killer cell(NK cell)의 면역증진 효과(도2)
NK-92MI cell을 D-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10-4M 2-mercaptoethanol, 12.5% FBS와 12.5% horse serum(Myelocult)에 2×107 cells/㎖의 농도로 희석시켜 이용하였다. 인간 T세포를 T-25 Flask에 배양하면서 실시예 1,2,3의 추출물을 투여한 후 증식정도를 관찰하면서 3~4번의 계대 배양 후 세포를 원심 분리하여 상층액을 취하였다. NK-92MI cell을 24 well plate에 4~5×104 cells/로 900㎕ 씩 분주하고 24시간 후 T세포의 상층액을 각 plate에 100㎕씩 투여하여 배양 48시간 후 6일 동안 NK-92MI cell의 활성도를 cell counter를 이용하여 생세포수를 이용하여 NK-92MI cell의 활성도를 측정한다.
6일동안의 NK cell의 활성을 측정한 결과 모든 처리조건에서 생육도가 증가 하였다.
6일째에 고온·고압 추출물 에서 11.8×102 cells/㎖를 보여 가장 높은 활성을 나타내었다. 이는 면역 활성 물질들이 고온 초고압 처리를 통해 조직과 세포의 적절한 파괴로 인해 기존의 추출방법보다 더욱더 용출된 것으로 판단된다.
② 대식세포에서의 nitric oxide 생성능 측정(도3)
J774.1 macrophage(mouse)이며, 세포의 생육은 10 % FBS를 함유하는 RPMI1640배지를 이용하여 24well plate에 4~5×104 cell/㎖의 농도로 넣은 5 % CO2, 37℃ 조건에서 48시간 동안 배양하였으며 실험에 사용하였다. macrophage에서 발생되는 nitric oxide의 양은 활성화 되는 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitric의 양을 microplate assy를 이용하여 정량함으로서 측정하였다.
먼저 실시예1,2,3의 추출물을 넣고 48시간 동안 세포를 배양하고 상등액 50㎕ 를 취하여 동일 부피의 Griesstldir(1% sulfanilamide/0.1 %, N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5 % H3PO4)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시킨 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)를 이용하여 540nm의 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 표준물질로는 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 32 ㎛에서부터 0.25 ㎛까지 RPMI 1640 medium으로 2배씩 희석하여 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. NO 생성능의 양성 대조구 물질로는 LPS(lipopolysaccharide)를 사용하였다.
대식세포를 이용하여 NO 생성능을 확인한 결과를 위와 같이 나타내었다. 대식세포의 NOS(nitric oxide syntase)는 항상 존재하는 것이 아니라 TNF-a와 같은 여러 가지 cytokine과 LPS(E. coli derived lipopolysaccharide)와 같은 세균내 독소의 영향을 받아 NOS 유전자의 발현이 유도되기 때문에 이번 실험에서는 실시예 1,2,3의 추출물을 LPS와 같이 투여하여 NO의 생성능을 확인하였다.
대식세포를 이용하여 NO 생성능을 확인한 결과를 도3에 나타내었다.
도3 결과에서 보여 지듯이 LPS와 J774.1 세포주에 실시예1,2,3의 추출물을 넣고 배양한 후 배양액 중에 NO 농도를 측정한 결과 아무처리도 하지 않은 대조군과 비교했을 때 추출물 처리 후 높은 생성능을 확인하였다. 특히 본 발명의 고온· 고압액화 추출물에서 가장 높은 30.0㎛을 보여 주었다. 면역매개체로서 중요한 역할을 하는 NO가 대량 생산 됨은 면역활성기능이 뛰어남을 의미하며, 따라서 고온·고압액화 공정을 통한 면역활성 성분의 용출량이 일반추출물 및 저온·고압 추출물에 비해 높은 것을 알 수 있다.
③ 구멍갈파래 추출물의 dermal fibroblast cell에서 cell morphology 비교(도4)
섬유아세포(CCD-986sk)을 DMEM과 10%FBS가 각 Well에 포함된 6-well 플레이트에 2×105개 씩을 넣고 각 추출물을 1.0mg/mL의 농도로 처리한 후 4일간 37℃ 5% CO2 조건에서 배양한 세포의 형태학적 관찰 결과를 나타낸 것이다. 위의 결과로 보 아 모든 추출물이 활발한 세포분화도를 보이는 것을 확인할 수 있으며, 이것은 세포수준에서 큰 독성(높은 생존율)이 없다는 것을 의미하며, 또한 이것은 고온 고압 액화 시 문제가 될 수 있는 HMF(Hydroxymethyl furfural)등의 인체에 해를 끼칠 수 있는 독성 물질이 생성이 없다는 것을 의미한다. 특히 고온·고압액화 추출물에서 세포의 활성도가 높게 보이고 있다. 이는 또한 고온·고압액화공정을 통해서 다른 추출공정에 비해 높은 수율의 유용 생리 활성물질로 인한 세포의 활성이 활발히 나타난 것으로 보인다.
④ 공정별로 얻어진 추출물들의 HPLC peak 비교(도5)
조건별로 추출된 생성 면역활성 물질의 비교를 위하여 고성능 액체코로마토그래피(HPLC; High-Performance Liquid Chromatography)분석이용하여각 추출공정을 통한 구멍갈파래 추출물의 peak를 얻고 . 공정간의 상호 분석을 하였다. 분리 조건은 실시예1,2,3의 추출물을 분석용 water에 0.2㎛ syringe filter로 여과하고 각각 100 ppm의 농도로 조제하여 injection volume 20㎕ 로 측정하였다. HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사 HPLC 500 series의 BIO-TEK 522 controller Pump와 BIO-TEK HPLC 535 UV Detector (254 nm)를 사용하였고, Column은 Alltech사의 Prevail C18(5㎛, 4.6 ×250㎜)을 사용하였다. 이동상은 물과 메탄올(50 : 50, v/v)의 혼합용액을 사용하였고, 유속은 0.50㎖/min 로 흘려주었다.
공정별로 얻어진 구멍갈파래 추출물의 HPLC 분석결과 고온·고압 액화 추출물에서 보다 많은 물질의 peak가 확인되었다. 이는 구멍갈 파래의 두꺼운 세포벽을 효과적으로 파괴하여 다른 공정(100℃ 열수추출, 저온·고압)에서 보다 많은 생리활성 물질이 추출된 것으로 보인다.
도1은 본 발명에 사용되는 고온 고압액화기 사진이다.
도2는 구멍갈파래 추출물의 Natural Killer cell(NK cell)의 면역증진 효과 비교 그래프이다.
도3은 구멍갈파래 추출물은 대식세포에서의 nitric oxide 생성능 측정 그래프이다.
도4는 구멍갈파래 추출물의 dermal fibroblast cell에서 cell morphology 비교 사진이다.
도5는 구멍갈파래 추출물의 HPLC peak 비교 그래프이다.
Claims (1)
- 구멍갈파래를 120~150Mpa, 110~120℃의 조건으로 1~5분 동안 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 활성이 증진된 구멍갈파래 추출물의 제조방법.
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