CN102952266A

CN102952266A - γ-聚谷氨酸的一种分离纯化方法

Info

Publication number: CN102952266A
Application number: CN2012103963666A
Authority: CN
Inventors: 王克柳; 王美海
Original assignee: Shandong Lubei Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Shandong Lubei Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2013-03-06

Abstract

本发明涉及一种从发酵液中分离纯化聚谷氨酸的方法，首先采用三氯乙酸调pH值至3.0～4.0以降低发酵液黏度，然后在发酵液中加入活性炭脱色和硅藻土吸附和抽滤，处理后的发酵液依次经过超滤浓缩和醇析纯化，最后经真空干燥后得到纯度≥95％的γ-聚谷氨酸。本发明具有在常温下进行、无相变、不产生二次污染、工艺简便，收率高、产品纯度高等优点，适合产业化生产。

Description

γ-聚谷氨酸的一种分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种从发酵液中分离纯化聚谷氨酸的方法，属于工业微生物技术领域。

背景技术

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，以下简称γ-PGA)，是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体之间通过a-氨基和γ-羧基形成肽键之后生成的同聚酰胺，通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，分子质量一般在100～1000kD。γ-PGA的基本骨架呈直链纤维状，分子链上具有大量活性较高的游离羧基在分子内部或分子间形成氢键，是一种水溶性和可生物降解的生物高分子物质。

聚谷氨酸可利用细菌产生或者化学合成。同化学合成的聚谷氨酸(a-PGA)相比较，细菌产生的聚谷氨酸依靠γ-酰基结合，并且能被土壤细菌分泌的水解酶所分解，而化学合成的a-PGA尽管也能被土壤细菌分泌的水解酶所分解，但是分解速度慢，因此被列为环境污染的原因之一，所以目前生物可降解的聚谷氨酸(γ-PGA)已越来越成为人们关注的焦点。

根据酸碱滴定测定结果，游离型γ-PGA的pK_a＝2.23，与谷氨酸的a-羧基的pK_a值大体一致：γ-PGA金属盐(Na型)的旋光度为-70，平均分子量为1.23×10⁴；利用TGA和DSC进行热性质分析，得出其热分解温度为235.9℃，熔点为223.5℃，热分解物为茶褐色；对γ-PGA的可溶性溶剂研究表明：1.0g的γ-PGA可溶于100mL的二甲基亚矾、热的N，N-二甲基甲酞胺、N-甲基-2-吡咯烷酮：γ-PGA酸水解后用GITC做诱导剂，用HPLC进行分离，测得当产量达到高峰的对数增殖后期时γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在D∶L＝60∶40。

γ-PGA的多分散性在2-5之间，聚合度200-700，具有很好的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性和重要的生物降解性、吸水性等。这些特性使γ-PGA具有增稠、乳化、凝胶、保温、成膜、缓释、助溶和粘结等功能。

由于γ-PGA分子的侧链上有大量游离羧基、分子带有大量的负电荷，使其具有强吸水性、具有大量的活性位点等特点，这些特点有利于它成为功能化材料，因此γ-PGA在医药、工业、农业等领域有着广泛的应用前景。

1942年Bovarnick等人研究发现芽孢杆菌属细菌能在培养基中积累γ-PGA，由此揭开了微生物发酵法生产γ-PGA的研究历史。目前，利用微生物发酵法生产γ-PGA一直是人们关注的热点，相关研究十分活跃。同化学合成法及酶转化法相比，微生物发酵法生产γ-PGA具有生产过程容易控制、发酵产量稳定、提取率高、目标产物产量较高以及产物分子量适宜、环境友好等优点，已逐步成为研究和生产γ-PGA的主要方法和途径。

通过微生物发酵得到的高粘度γ-聚谷氨酸发酵液，可通过有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法提取γ-聚谷氨酸。(1)有机溶剂沉淀法：一般采用有机溶剂(甲醇或乙醇)沉淀后，通过离心、干燥得到纯品。细胞通过离心从发酵液分离出来，再通过冷冻干燥，加入4倍甲醇放置过夜沉淀离心收集粗品，粗品溶解于蒸馏水，离心去掉不溶性物质。为了节省有机溶剂，Jin Hwang Do发明了从高粘性的培养液中分离和提取的方法，使酒精用量只有原来的1/4。(2)化学沉淀法：化学沉淀法是用饱和硫酸铜、氯化钠溶液代替低级醇类盐析沉淀获取γ-聚谷氨酸。为了节省有机溶剂的用量，JinHwanDo发明了膜分离沉淀法，第一步从高粘性发酵液中分离γ-聚谷氨酸，第二步通过超滤的办法浓缩溶液，通过调低pH值到3在35度条件下进行酸化，离心分离(离心力22公斤)，同时用空纤维膜圆柱(MWCO500000)，在pH值为5时，将浓度从20克/升浓缩到60克/升，酒精用量只是原来的四分之一，能量只是原来的83％。(3)膜分离沉淀法：国内有人选用截留分子量1万的有机膜，取超滤压力0.06MPa进行膜过滤，也取得较好效果。膜分离技术是一种高效节能型分离技术，大多数膜分离过程在常温下进行，无相变，不产生二次污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种从生物发酵液中分离纯化γ-聚谷氨酸的工艺方法，以膜沉淀过滤和醇析相结合的提取工艺为特征，解决了有机溶剂沉淀法提取γ-聚谷氨酸造成的有机溶媒损耗量高、工序长造成的生产成本较高的问题，具有在常温下进行、无相变、不产生二次污染、工艺简便，收率高、产品纯度高等优点。

本发明按下述工艺步骤操作：

1、发酵液预处理：发酵结束后将γ-聚谷氨酸发酵液快速搅拌，三氯乙酸调pH3.0～4.0，加入5～30g/L硅藻土充分搅拌，粗细硅藻土的比例为0.5∶1～2.0∶1(粗硅藻土为100目，细硅藻土为200目)，加入1.5～3.0倍发酵酸化液体积的去离子水稀释后倒入预涂了硅藻土的抽滤装置中抽滤，直至滤液浊度恒定；随后进行0.3～2.0g/L活性炭脱色和滤板过滤。

2、超滤提取：超滤膜采用聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)中空纤维膜，截留分子量(MWCO)为10000、100000，在pH3.0～5.0条件下对预处理液进行超滤浓缩。当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅匀再重复浓缩。之后继续浓缩截流液至透过液过膜通量降为原来的1/10为止。

3、乙醇沉淀：向γ-聚谷氨酸浓缩液缓慢滴加乙醇1～4L，过程采用机械搅拌桨不断搅拌，使γ-聚谷氨酸缓慢析出。将析出的γ-聚谷氨酸置于放有P₂O₅的真空干燥器中干燥2～4h，经进一步粉碎，得到流动性γ-聚谷氨酸粉末。

本发明γ-聚谷氨酸的分离纯化方法，采用多种现代生物技术提取纯化发酵液中的目标产物，提升了终产品质量，具有以下特点：

1、首先在发酵液中加入活性炭脱色和硅藻土吸附和抽滤，有效地实现了菌液分离以及色素和杂蛋白的去除。

2、对除菌后的发酵液进行超滤后，γ-聚谷氨酸浓度增加，用于提取的乙醇用量降低。超滤过程中引入加水稀释和重复浓缩的步骤，尽可能的去掉杂质。

最终γ-聚谷氨酸产品纯度达95％以上，总收率达90％以上。产品为白色无定型粉末，质量指标已达到化妆品级的要求。

具体实施方式

实施例1聚谷氨酸的一种分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

(1)发酵液预处理：发酵结束后将γ-聚谷氨酸发酵液快速搅拌，滴加50％三氯乙酸调pH3.0，加入20g/L、发酵酸化液2％的吸附剂硅藻土充分搅拌，粗细硅藻土的比例为1.5∶1(粗硅藻土为100目，细硅藻土为200目)，加入2.5倍发酵酸化液体积的去离子水稀释后倒入预涂了发酵酸化液0.5％硅藻土的抽滤装置中，0.1MPa压力循环抽滤，直至滤液浊度恒定，检测杂蛋白含量和γ-聚谷氨酸浓度；随后进行0.5g/L活性炭脱色和滤板过滤。

(2)超滤提取：超滤膜采用聚醚砜(PES)中空纤维膜，截留分子量(MWCO)为10000，在pH3.0条件下对预处理液进行超滤浓缩。当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅匀再重复浓缩，以尽可能滤去盐分和小分子杂质。期间取透过液滴加0.1％AgNO₃溶液检测有无浑浊。之后继续浓缩截流液至透过液过膜通量降为原来的1/10为止。

(3)乙醇沉淀：向γ-聚谷氨酸浓缩液缓慢滴加乙醇3L，过程采用机械搅拌桨不断搅拌，使γ-聚谷氨酸缓慢析出。将析出的γ-聚谷氨酸置于放有P₂O₅的真空干燥器中干燥4h，经进一步粉碎，得到流动性γ-聚谷氨酸粉末，纯度为96.8％。

实施例2聚谷氨酸的一种分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

(1)发酵液预处理：发酵结束后将γ-聚谷氨酸发酵液快速搅拌，滴加50％三氯乙酸调pH4.0，加入15g/L、发酵酸化液2％的吸附剂硅藻土充分搅拌，粗细硅藻土的比例为1.0∶1(粗硅藻土为100目，细硅藻土为200目)，加入3.0倍发酵酸化液体积的去离子水稀释后倒入预涂了发酵酸化液0.5％硅藻土的抽滤装置中，0.1MPa压力循环抽滤，直至滤液浊度恒定，检测杂蛋白含量和γ-聚谷氨酸浓度；随后进行1.5g/L活性炭脱色和滤板过滤。

(2)超滤提取：超滤膜采用聚丙烯腈(PAN)中空纤维膜，截留分子量(MWCO)为100000，在pH4.0条件下对预处理液进行超滤浓缩。当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅匀再重复浓缩，以尽可能滤去盐分和小分子杂质。期间取透过液滴加0.1％AgNO₃溶液检测有无浑浊。之后继续浓缩截流液至透过液过膜通量降为原来的1/10为止。

(3)乙醇沉淀：向γ-聚谷氨酸浓缩液缓慢滴加乙醇2L，过程采用机械搅拌桨不断搅拌，使γ-聚谷氨酸缓慢析出。将析出的γ-聚谷氨酸置于放有P₂O₅的真空干燥器中干燥3h，经进一步粉碎，得到流动性γ-聚谷氨酸粉末，纯度为95.5％。

实施例3聚谷氨酸的一种分离纯化方法，按以下步骤依次进行：

(1)发酵液预处理：发酵结束后将γ-聚谷氨酸发酵液快速搅拌，滴加50％三氯乙酸调pH3.5，加入30g/L、发酵酸化液2％的吸附剂硅藻土充分搅拌，粗细硅藻土的比例为2.0∶1(粗硅藻土为100目，细硅藻土为200目)，加入2.0倍发酵酸化液体积的去离子水稀释后倒入预涂了发酵酸化液0.5％硅藻土的抽滤装置中，0.1MPa压力循环抽滤，直至滤液浊度恒定，检测杂蛋白含量和γ-聚谷氨酸浓度；随后进行2.0g/L活性炭脱色和滤板过滤。

(2)超滤提取：超滤膜采用聚醚砜(PES)中空纤维膜，截留分子量(MWCO)为10000，在pH5.0条件下对预处理液进行超滤浓缩。当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅匀再重复浓缩，以尽可能滤去盐分和小分子杂质。期间取透过液滴加0.1％AgNO₃溶液检测有无浑浊。之后继续浓缩截流液至透过液过膜通量降为原来的1/10为止。

(3)乙醇沉淀：向γ-聚谷氨酸浓缩液缓慢滴加乙醇4L，过程采用机械搅拌桨不断搅拌，使γ-聚谷氨酸缓慢析出。将析出的γ-聚谷氨酸置于放有P₂O₅的真空干燥器中干燥2h，经进一步粉碎，得到流动性γ-聚谷氨酸粉末，纯度为95.5％。

Claims

1.聚谷氨酸的一种分离纯化方法，其特征在于：本方法包括以下步骤：

1)发酵结束后将γ-聚谷氨酸发酵液快速搅拌，调pH值，加入硅藻土充分搅拌，去离子水稀释后抽滤，直至滤液浊度恒定；

2)进行活性炭脱色和滤板过滤；

3)超滤提取：一定条件下对预处理液进行超滤浓缩，引入加水稀释和重复浓缩的步骤，尽可能的去掉杂质。

4)乙醇沉淀：向γ-聚谷氨酸浓缩液缓慢滴加乙醇使γ-聚谷氨酸缓慢析出。真空干燥、粉碎，得到γ-聚谷氨酸粉末，纯度≥95％。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤1)中三氯乙酸调pH至3.0～4.0，加入5～30g/L硅藻土，粗细硅藻土的比例为0.5∶1～2.0∶1，去离子水稀释倍数为1.5～3.0倍。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤2)活性炭脱色浓度为0.3～2.0g/L。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤3)中超滤膜采用聚醚砜(PES)、聚丙烯腈(PAN)中空纤维膜，截留分子量(MWCO)为10000、100000，在pH3.0～5.0条件下对预处理液进行超滤浓缩。当截留液体积浓缩为原体积的1/2时，加1/2原体积去离子水稀释搅匀再重复浓缩。之后继续浓缩截流液至透过液过膜通量降为原来的1/8～1/10为止。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤4)中滴加乙醇1～4L，过程采用机械搅拌桨不断搅拌，使γ-聚谷氨酸缓慢析出。将析出的γ-聚谷氨酸置于放有P₂O₅的真空干燥器中干燥2～4h。