CN104163916B - 一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ‑谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ‑谷氨酸的方法，属于化学技术领域，步骤1.发酵液中菌体的去除；步骤2.活性炭脱色；步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序；步骤4.发酵液浓缩；步骤5.干燥。本发明建立了一套经济可行的预处理工艺，可有效实现γ‑PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除，并进行超滤冻干，最终精制得到高纯度的γ‑PGA成品，为γ‑PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。

Description

一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法

技术领域

本发明属于化学技术领域，具体为一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法。

背景技术

γ-PGA是自然界中微生物发酵产生的阴离子型多聚氨基酸，由D型谷氨酸和L型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基形成的高分子聚合物。在每一个重复单元的α碳原子，还有一个游离的羧基，因此γ-PGA的分子链上具有大量的活性较高的游离侧链羧基，可在分子内部或分子之间形成氢键。γ-PGA通常由5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量一般在100～1000kDa，没有典型的肽链结构，也不是一种环状多肽，基本骨架呈直链纤维状。

γ-PGA分子中有大量游离的亲水性羧基，它具有很多优良特性：(1)可在分子内部或分子之间形成氢键，水溶性好；(2)对金属离子的吸附性强；(3)优良的生物降解性。主链上存在大量肽键，也带来很多优良特性：(1)在体内环境下受酶的生物作用，会降解生成无毒的短肽、小分子或氨基酸单体。在医药行业上开发出的手术线和手术粘合剂就是利用这点性质。(2)在自然环境中，会受到某些微生物的作用而降解，可食无毒。利用这点可生产可降解的塑料。其他性质：良好的生物相容性；无自身抗原性；抗冻特性；絮凝特性；高分子量，平均分子量为100-1000kDa，化学合成一般达不到这么高的分子量，且合成成本要很高。在生理功能方面可防止细胞脱水、保护细胞免受蛋白酶的降解等；γ-PGA在放射线照射下会增加分子间的结合，提高吸水性能，由此可开发出一种强吸水性很强的生物树脂。这种树脂有良好的粘弹性，并在一定范围内具有耐酸、碱、盐，耐高渗透压，抗冻融等优良特性。γ-PGA强酸高温彻底酸水解后测得γ-PGA中D-谷氨酸和L-谷氨酸的比值稳定在D∶L＝60∶40。γ-PGA水溶液的流变性能溶液是非牛顿剪切变稀的假塑性流体，其粘度随温度的升高而呈现下降。这些优良的理化性质决定这种材料在多行业有着广泛的发展前景。

γ-PGA的应用领域γ-PGA由前所提及的优良的理化性质可广泛用做环保领域如生物絮凝剂、重金属吸附剂，食品工业如增稠剂，农业领域如保湿剂，医药工业如药物载体、医用生物粘合剂等等，一般认为它对人类和环境无毒害，甚至可食用。γ-PGA及其衍生物潜在应用价值极大可发展出许多特殊用途是一种有极大开发价值和应用前景的多功能新型生物制品。

1.γ-PGA在食品工业上的应用γ-PGA在食品中可用于新型的食品添加剂、抗冻剂、矿质吸收促进剂、除涩剂、稳定剂等。

γ-PGA作为新型的食品添加剂 γ-PGA分子上含有大量亲水基团，因而具有良好的吸水保湿性能可应用于淀粉类食品。日本将它用于淀粉类食品(糕点、面条)中，可防止老化、增强质地、维持食品外形和延长货架期；γ-PGA可以增加面包、蛋糕的弹性，使面包、蛋糕的颗粒更加细致，γ-PGA还可以增强面条的韧性，防止面条中的固体物质溶解在沸水中。

γ-PGA作为抗冻剂 频繁冷冻和融化生物细胞、生物活性物质和食品等会加速其退化和腐败，而加入γ-PGA可以避免这种状况。γ-PGA具有好的抗冻性能，γ-PGA的抗冻性和可食用性使γ-PGA可被广泛的应用于食品加工领域和对深度冷冻敏感的酶或培养物的冷藏冻藏，而且γ-PGA比通常的低分子量防冻剂(如糖类无机盐和蛋白质等)味淡，食品中即使加入了大量的γ-PGA对口感影响也不大。

γ-PGA作为矿质吸收促进剂 γ-PGA还可以作为矿质吸收促进剂，在含高矿物质的食品中加入了γ-PGA或其降解产物可以促进小肠对矿物质的吸收。与酪蛋白磷酸肽相比，γ-PGA具有优良的水溶性，效果更佳。而且γ-PGA可以掩盖高浓度矿质元素所带来的刺激性、收敛性和粗糙感等适口性问题，尤其适用于补钙和补铁的保健品。

γ-PGA作为除涩剂 γ-PGA可作为各种食品的苦味掩盖剂和除涩剂，研究发现，γ-PGA可以消除或减少诸如氨基酸、多肽、奎宁、咖啡因、矿物质引起的酸味，是高钠调味剂的替代品，可为糖尿病患者和高血压患者所用，作为健康饮食的一个组分。

γ-PGA作为稳定剂 可用作冰淇淋的稳定剂；果汁饮料的增稠剂等。

2.γ-PGA在农业领域的应用γ-PGA与其他单体经过聚合能够得到一种高倍吸水性树脂(Superabsorbent polymer，SAP)，吸水能力急剧增强目前报道的最高可达5300倍。这种高吸水性树脂无毒、无味、无色透明，具有高吸水性和保水性。将这种高吸水性树脂应用在荒山、秃岭、沙漠治理等方面可发挥积极作用，我国科研人员采用γ-PGA吸水树脂种子做发芽实验取得了良好的效果。另外，在肥料、杀虫剂、除草剂、驱虫剂等使用时，加入适量的γ-PGA盐可以延长这些药物在作用对象表面上的停留时间，不易因干燥、下雨而被冲刷掉。

3.γ-PGA在环保领域的应用

γ-PGA用于生物修复 全世界工业的高速发展的同时，也带来了对环境的严重污染，目前被污染的土壤、水和空气的净化修复是我们迫切解决的难题。利用γ-PGA与这些污染物之间的黏附浓缩作用机制可对被污染的环境进行修复。如利用γ-PGA吸水与土壤结合，能提高土壤吸湿能力、通风性、保肥性能，在大规模改造荒山、沙漠方面能发挥积极作用。γ-PGA能吸收农药和化肥，防止流失并缓慢释放，改善作物栽培条件、提高肥料的利用率。

γ-PGA作为生物絮凝剂治理水污染 生产上已经开发了的用于废水处理、工业下游处理的许多絮凝剂如铝盐、聚丙烯酸、活性炭材料，这些材料既经济又有效，应用最为广泛，但是大多数不能被生物降解，长期使用也会对环境造成二次污染。利用γ-PGA的电负性和粘结性对水中的污染物进行处理不仅可以应用于废水处理、饮用水的纯化及深海水的加工，而且也可以用于食品和发酵工业的下游工程操作。此外还可以作为重金属和放射性核物质的吸附剂。

4.γ-PGA在工业领域的应用 利用γ-PGA聚合成高分子材料此类聚合物性质类似于塑料，可以用来制造皮革、纤维、食品包装膜等，具有适合的强度、透明度和较好弹性。γ-PGA用苯乙烯改性后，可得到高抗碱性的纤维树脂。若通过改性再聚合，可得到比一般天然纤维和化学纤维更优的材料。利用γ-PGA合成的材料相对于现有的材料优点在于可降解，无毒，对环境没有危害是一种绿色的高分子塑料。

5.γ-PGA在医药领域的应用 γ-PGA聚合的高分子材料可用于药品的包装膜，可降解手术线等。近年来国外还有人研究得出γ-PGA还能够增强前列腺素EI的作用。还建立了用谷氨酞聚合物作为基因治疗的载体。由交联胶原蛋白和γ-PGA制备的一种新型生物粘合剂表现出比外科手术粘合剂及纤维胶更高的软组织粘合和止血作用，并且能够在体内降解而不会引起任何炎症反应。

目前，微生物发酵法合成γ-PGA的分离纯化主要存在2个难题：1是发酵液黏度高，菌液分离困难；2是发酵液成分复杂，提取纯化成本高。目前适合高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高，且除杂不彻底；由于γ-PGA分子大小与菌体较为接近，微孔滤膜法不能有效实现γ-PGA与菌体的分离；对于高浓度的γ-PGA发酵液，酸化处理后虽黏度大大降低，但高速离心的方法仍难以实现彻底的菌液分离和杂蛋白的去除，且难以应用于工业化生产。如何实现γ-PGA高黏发酵液中的菌液分离是γ-PGA提取纯化工艺的关键之一。γ-PGA的提取纯化通常采用有机溶剂沉淀法、铜盐沉淀法和膜分离沉淀法，膜分离技术由于兼有分离、浓缩、纯化和精制的功能，已被应用于γ-PGA的分离纯化。Do等采用发酵液酸化、离心、过膜微滤、超滤浓缩、醇析、真空干燥的工艺进行了γ-PGA的提取与纯化，与传统的有机溶剂沉淀-复溶-透析的方法相比，节省了乙醇用量，降低了成本。但由于该工艺采用离心步骤，使得处理发酵液的能力有限，且得到的成品品质不够高。目前用于高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高，且除杂不彻底；由于γ-PGA分子大小与菌体较为接近，微孔滤膜法不能有效实现γ-PGA与菌体的分离；对于高浓度的γ-PGA发酵液，酸化处理后虽黏度大大降低，但高速离心法消耗动力大，成本高，不适于工业化生产。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法，建立了一套经济可行的预处理工艺，可有效实现γ-PGA高黏发酵液的菌液分离、色素等杂质的去除，并进行超滤冻干，最终精制得到高纯度的γ-PGA成品，为γ-PGA的最终商品化提供了可行的工艺路线。其技术方案为：

一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法，包括以下步骤：

步骤1.发酵液中菌体的去除

(1)发酵液预处理

发酵结束后，将发酵液在40～100℃条件下处理10～60min，用蒸馏水稀释1～10倍；

(2)硅藻土过滤除菌体

将滤纸浸湿后，铺于抽滤漏斗的底部，使滤纸与漏斗底部紧紧相贴；将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内，待硅藻土沉淀后，开启真空泵进行真空抽滤，抽滤压力为0.1MPa；硅藻土形成1～2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后，倒入预处理后的发酵液，虑液有黏性后收集，在不换硅藻土滤层的情况下，连续过滤4次，1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体；

步骤2.活性炭脱色

(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定

对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm～500nm下进行紫外光谱全波长扫描，确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长，作为脱色处理的评价指标，结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱；经紫外扫描后，γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm；

(2)发酵液中有色杂质的去除

硅藻土除菌体后的发酵液，添加颗粒状活性炭0.1～2.0％(质量体积比)，以20～100rpm的速度搅拌5～60min；

步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序

脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂，后过阴离子交换树脂；

步骤4.发酵液浓缩

用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩，浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5～2倍，再进行浓缩，此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1～4次，发酵液中的小分子物质，如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0；

步骤5.干燥

将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中，置于-80℃冰箱内预冻6h后，在-60℃下真空冷冻干燥，获得纯品γ-PGA。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.传统去除高粘度γ-PGA发酵液中菌体的高速离心法，动力消耗大，菌体去除率低；酸处理虽可有效降低发酵液粘度，以利于γ-PGA纯化工艺，但对其质量造成一定损害。本发明采用适当的热处理，联合硅藻土过滤，有效的分离了菌体，而且由于硅藻体本身的特性，还除去了部分其它杂质。

2.本发明确定了微生物发酵合成γ-PGA发酵液中有色物质的最大吸收波长，有助于工业化生产过程中产品质量的控制。

3.本发明确定了活性炭脱除发酵液色素的工艺条件。

4.微生物发酵合成γ-PGA发酵液中含有培养基残余的阴阳离子，本发明确定了阴阳离子的去除顺序。

5.浓缩可有效的降低工业化生产中干燥成本，本发明确定了发酵液浓缩的工艺参数。

附图说明

图1是活性炭脱色处理液紫外扫描图谱，样品从上到下依次为：未经活性炭处理的γ-PGA、经活性炭处理的γ-PGA、购买的标样；

图2是精制品γ-PGA；

图3是γ-PGA酸水解液HPLC分析γ-PGA的组成；

图4是γ-PGA酸水解液薄层层析分析γ-PGA的组成；

图5是标准γ-PGA红外扫描光谱；

图6是微生物发酵产γ-PGA红外扫描光谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明的目的在于提供一个微生物发酵法合成γ-PGA的发酵液预处理，γ-PGA分离纯化精制的方法。详细技术方案如下：

1.发酵液中菌体的去除

(1)发酵液预处理

发酵结束后，将发酵液在40～100℃条件下处理10～60min，用蒸馏水稀释1～10倍。

(2)硅藻土过滤除菌体

将滤纸浸湿后，铺于抽滤漏斗的底部，使滤纸与漏斗底部紧紧相贴；将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内，待硅藻土沉淀后，开启真空泵进行真空抽滤，抽滤压力为0.1MPa。硅藻土形成1～2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后，倒入预处理后的发酵液，虑液有黏性后收集，在不换硅藻土滤层的情况下，连续过滤4次，1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体。

2.活性炭脱色

(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定

对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm～500nm下进行紫外光谱全波长扫描，确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长，作为脱色处理的评价指标，结果是图1活性炭脱色处理液紫外扫描图谱。经紫外扫描后，γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm。

(2)发酵液中有色杂质的去除

硅藻土除菌体后的发酵液，添加颗粒状活性炭0.1～2.0％(质量体积比)，以20～100rpm的速度搅拌5～60min。

3.发酵液中阴阳离子的去除顺序

脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂，后过阴离子交换树脂。

4.发酵液浓缩

用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩，浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5～2倍，再进行浓缩，此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1～4次，发酵液中的小分子物质，如谷氨酸和葡萄糖残余量可减少至0。

5.干燥

将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中，置于-80℃冰箱内预冻6h后，在-60℃下真空冷冻干燥，获得纯品γ-PGA，见图2。

6.γ-PGA精制品的鉴定

(1)γ-PGA精制品组成分析

取样品0.5g放入水解管中，加入10mL6mol/L HCl，抽真空，110℃水解24h，冷却后移至100mL容量瓶中，定容，经0.45μm微孔滤膜过滤后取滤液用高压液相色谱测定谷氨酸和薄板层析分析氨基酸组成，其结果是图3所示酸水解HPLC测定γ-PGA的组成。

用硅胶G制备薄层层析用硅胶板，110℃活化5min后，在硅胶板上点样，选用正丁醇∶乙酸∶水＝3∶1∶1展开剂溶液，上行法展开后，以0.25％茚三铜显色，于干燥箱中加热60℃烘干15min。其结果是图4所示的图硅胶薄层层析测定γ-PGA的组成。

委托农业部谷物及制品质量监督检验测试中心(哈尔滨)做γ-PGA水解液的氨基酸分析，采用水解后利用氨基酸分析仪直接测定的方法，检测报告的数据如表1所示，所示的氨基酸分析仪分析γ-PGA水解液的氨基酸组成。

表1 氨基酸分析仪测定γ-PGA酸水解液的氨基酸组成

检验项目	单位	标准要求	检验结果	检验方法
					天门冬氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
苏氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					丝氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
谷氨酸	％	-	65.75	GB/T5009.124-2003
					甘氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
丙氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					胱氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
缬氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					蛋氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
异亮氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					亮氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
酪氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					苯丙氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
赖氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					组氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
精氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
					脯氨酸	％	-	0.00	GB/T5009.124-2003
氨基酸总量	％	-	65.75	GB/T5009.124-2003

通过酸水解HPLC测定γ-PGA的组成，可见，此聚合物的水解产物只含有一种氨基酸，与标准谷氨酸的出峰时间相同，推断此水解物为谷氨酸。同时对照硅胶薄层层析图4，水解物只显示一个斑点，也说明此水解物只有一种氨基酸组成，并且其迁移率与标准L-谷氨酸相同，另外结合氨基酸分析仪测定结果，更进一步证明该聚合物是由谷氨酸一种氨基酸组成，可以认为是谷氨酸的同聚物。

(2)γ-PGA精制品分子量的测定

精密称取经真空冷冻干燥后的γ-PGA固体样品1.0mg，加水溶解制成0.1mg/mL的溶液，经0.45μm的微滤膜处理，转移至Angilent HPLC专用实样瓶中，进样20μL，以pH为7的磷酸缓冲溶液为流动相，流速为1.0mL/min。其结果是表2所示的GPC法测定γ-PGA的分子量。

表2 GPC法测分子量的结果

样品的比折光指数增量dn/dc＝0.180＞0.05，完全可以用GPC法确定样品的分子量；γ-PGA的洗出时间为13.075-23.830min；γ-PGA的Mw为1095kDa，Mz为1206kDa，Mp为740kDa，Mn为1033kDa；γ-PGA的分子量分散指数Mw/Mn为1.060，Mz/Mw为1.01，都说明该样品的聚合度很高，分子量分布较窄，高聚物的“纯度”较高。综上所述，γ-PGA的分子量很大，且聚合度很好。

(3)标准γ-PGA与精制γ-PGA红外扫描光谱分析

取样品0.2mg，在60℃下真空干燥，与少量KBr研磨压片制样，然后用红外光谱仪测定样品的红外图谱，扫描范围4000～400cm^-1。聚酰胺由于具有一系列特征吸收、可由红外光谱鉴定，其结果是图5标准γ-PGA红外扫描光谱。图6是精制γ-PGA红外扫描光谱，通过红外扫描图谱解析，结合标准谱图对照可知该聚合物为γ-PGA聚酰胺类化合物无疑。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员，在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变换或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (1)

1.一种从发酵液中提取纯化高分子聚γ-谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1.发酵液中菌体的去除

所述发酵液为微生物发酵法合成γ-PGA的发酵液；

(1)发酵液预处理

发酵结束后，将发酵液在40～100℃条件下处理10～60min，用蒸馏水稀释1～10倍；

(2)硅藻土过滤除菌体

将滤纸浸湿后，铺于抽滤漏斗的底部，使滤纸与漏斗底部紧紧相贴；将硅藻土与水的均匀混合液倒入铺好滤纸的漏斗内，待硅藻土沉淀后，开启真空泵进行真空抽滤，抽滤压力为0.1MPa；硅藻土形成1～2.5cm厚涂层且其表面水抽尽后，倒入预处理后的发酵液滤液有黏性后收集，在不换硅藻土滤层的情况下，连续过滤4次，1g硅藻土可以去除3.4mL原发酵液中的菌体；

步骤2.活性炭脱色

(1)发酵液中有色杂质吸光度的确定

对用活性炭处理前后的γ-PGA发酵液及购买的标准γ-PGA分别在波长200nm～500nm下进行紫外光谱全波长扫描，确定γ-PGA发酵液中色素杂质最大吸收波长，作为脱色处理的评价指标；经紫外扫描后，γ-PGA发酵液中有色杂质的最大吸收波长为260nm；

(2)发酵液中有色杂质的去除

硅藻土除菌体后的发酵液，添加颗粒状活性炭，其中颗粒状活性炭与硅藻土除菌体后的发酵液的质量体积比为0.1～2.0％，以20～100rpm的速度搅拌5～60min；

步骤3.发酵液中阴阳离子的去除顺序

脱色后的发酵液先过阳离子交换树脂，后过阴离子交换树脂；

步骤4.发酵液浓缩

用0.1μm-0.6μm孔径的中空纤维膜进行浓缩，浓缩液稀释至浓缩前液体体积的0.5～2倍，再进行浓缩，此浓缩-稀释-浓缩的过程重复1～4次，发酵液中的小分子物质，谷氨酸和葡萄糖残余量减少至0；

步骤5.干燥

将浓缩后的γ-PGA发酵液分装于样品盘中，置于-80℃冰箱内预冻6h后，在-60℃下真空冷冻干燥，获得纯品γ-PGA。