CN105504020A - 医药级杆菌肽及其制备装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种适用于多种原料来源的医药级杆菌肽及其制备装置。该医药级杆菌肽的制备方法包括如下步骤：取杆菌肽发酵液进行酸化，经陶瓷膜过滤；取陶瓷膜透出液经阳离子交换层析，收集阳离子交换层析上柱液；将阳离子交换层析上柱液经阴离子交换，收集阴离子交换上柱液；将阴离子交换上柱液经金属螯合，收集金属螯合柱液；将金属螯合柱液经纳滤处理，得到末次纳滤产品液；将末次纳滤产品液溶解、过滤并取其滤液干燥、粉碎，即得；其中，起始物质杆菌肽发酵液可用低含量的杆菌肽溶液代替且末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。

Description

医药级杆菌肽及其制备装置
技术领域
本发明涉及一种杆菌肽，更具体地说，它涉及一种医药级杆菌肽及其制备装置。
背景技术
杆菌肽(Bacitracin)是一种有效的窄谱多肽抗菌素，其抗菌谱与青霉素类似，对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌、螺旋体、放线菌有效。
杆菌肽(Bacitracin)，又名枯草菌素、枯草菌肽，其为白色粉末，在水、乙醇、吡啶中易溶，酸性或中性的杆菌肽水溶液相对较稳定，pH值5-7的溶液可稳定4周，在pH大于9的溶液中存在时，室温下可迅速降解。研究发现，杆菌肽为多种氨基酸结合而成的不稳定的多肽，含A、A1、B、C…G等多种组分，且其以杆菌肽A为主。目前公认杆菌肽A、B1和B2组分最具有生物活性，其含有约杆菌肽混合物95％的生物活性。杆菌肽A的分子式为C66H103N17O16S，其为一个十二肽，含有一个七元环。杆菌肽A含有一个由带-SH异亮氨酸的羧酸和半胖氨酸的-NH2缩合形成的不寻常的噻唑邻环，一个在赖氨酸的ε-NH2侧链和天门酰胺的C-端之间连接形成的环状七肽结构，以及四个D-氨基酸包括D-谷氨酸、D-鸟氨酸、D-苯丙氨酸和D-天门冬氨酸，其结构式如式I所示：
目前，杆菌肽的工业化生产主要通过微生物发酵法制备，其以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和B类地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)发酵液为原料来提取分离制得。国内目前的杆菌肽产品质量参差不齐，且其以饲料级为主，其与中国药典中对药用级杆菌肽的质量标准相比仍具有相当的差距。其中，中国药典对药用的杆菌肽的质量标准见表1。
表1中国药典(2015)中杆菌肽质量标准
美国专利US2498165公开了一种利用有机溶剂萃取杆菌肽的方法，这种方法利用水、正丁酯之间的不互溶性、杆菌肽及其杂质在不同溶剂中的溶解度差异来萃取杆菌肽，这种方法需要使用大量的溶剂且在成品中的溶剂残留难除去，且其收率低。
公开号为CN102153633A的中国专利公开了一种提取分离杆菌肽的方法，其包括
(1)超滤提取分离杆菌肽浓缩液：杆菌肽发酵液经过酸化，震动筛过滤或离心去除菌体后，超滤去除菌体和大分子杂质、树脂吸附脱除无机盐、真空蒸发浓缩得到杆菌肽浓缩液；
(2)杆菌肽浓缩液制备杆菌肽结晶体：杆菌肽浓缩液经过溶剂萃取、脱色、纳滤、结晶分离、干燥、粉碎、筛分、检验、成品包装等生产得到合格的杆菌肽产品。研究发现，这种方法虽然在一定程度上可以提高杆菌肽的纯度和含量，但其受原料的来源影响较大，即其只能处理部分特定的发酵液，在工业化应用上存在较大的局限性。
因此，开发出一种适用于多种原料来源的药用级的杆菌肽具有较大的应用前景。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种适用于多种原料来源的医药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤：
S1，取杆菌肽发酵液进行酸化，经陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜透出液；
S2，将S1的陶瓷膜透出液经阳离子交换层析，收集阳离子交换层析上柱液；
S3，将S2的阳离子交换层析上柱液经阴离子交换，收集阴离子交换上柱液；
S4，将S3的阴离子交换上柱液经金属螯合，收集金属螯合柱液；
S5，将S4的金属螯合柱液经纳滤处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将S5的末次纳滤产品液溶解，并将溶解的末次纳滤产品液过滤处理，取其滤液进行干燥、粉碎处理，即得医药级杆菌肽；
其中，S1中的杆菌肽发酵液可用低含量的杆菌肽溶液代替；
所述末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液中含有目标杆菌肽、其他多肽类物质、糖类、色素和多种代谢产物等，其混合物中杂质较多较难分离。将杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液，先经酸化处理，除了能保证杆菌肽的正常活性，还能除去一些碱性菌，同时能将体系内的杆菌肽的物质完全溶解在发酵液的溶液中；将经酸化的杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液通过陶瓷膜过滤，一方面能除去一些大颗粒的物质，同时陶瓷膜的分离作用有利于将部分大分子的多肽或其他大分子物和杆菌肽分离，陶瓷膜还能吸附发酵液中的色素，有利于对杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液进行初步的提纯，同时还能保护后续过程中的色谱柱；将陶瓷膜透出液依次进行阳离子交换层析、阴离子交换，有利于提高杆菌肽A这类两性化合物的纯度和含量；将阴离子交换上柱液经金属螯合再经纳滤处理，有利于除去发酵液中的重金属含量，有利于保证产品的安全性，使之符合药用标准；将末次纳滤产品液溶解，并将溶解的末次纳滤产品液过滤处理，重结晶再次除杂；通过上述多重的除杂过程，其起到了较好的提纯的组合效果，得到的杆菌肽符合药用标准，且其不受发酵液来源的限制，其具有较好的大生产化价值。
作为优选，所述S1中，陶瓷膜为活性氧化铝或氧化锆；所述陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm。
活性氧化铝或氧化锆均成非对称膜结构，当杆菌肽发酵液通过其时，其能通过其非对称膜结构进行提纯，有利于杆菌肽(杆菌肽A的分子量为1000-2000)这类低分子物质的通过而阻止高分子量多肽等的通过。
作为优选，所述S2中，阳离子交换层析中使用的阳离子交换层析柱为BPG100/500，其阳离子交换层析的柱填料为CaptoSpimpres，所述洗脱液为0.1-2.5M的NaCl水溶液和pH＝3.0-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液；
所述S3中，阴离子交换中使用的阴离子交换柱为BPG140/500，其阴离子交换的柱填料为CaptoQimpres。
通过CaptoSpimpres的强阳离子交换，其在洗脱液为0.1-2.5M的NaCl水溶液和pH＝3.0-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液时具有较好的洗脱作用，有利于将产品和杂质有效的分离，同时还能溶解析出部分杂质有利于提纯，当NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用量比为1∶50-200时其提纯的效果最佳；通过CaptoQimpres的强阴离子交换，杂质被阴离子交换树脂吸附，从而提高通过阴离子交换树脂后的样品的纯度和含量。
作为优选，所述S2中，所述收集阳离子交换层析上柱液的过程中，根据其洗脱时间来收集阳离子交换层析后的目标产品液、目标产品和杂质的混合液、杂质液；取所述阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液经第一次纳滤处理，将纳滤处理后的滤液和阳离子交换层析后的目标产品液合并即为阳离子交换层析上柱液；所述第一次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
根据洗脱时间来判断目标产品和杂质的流出，直观方便，有利于控制产品的最终质量；对目标产品和杂质的混合液进行纳滤处理，有利于在保证产品纯度和含量的同时提高产品的收率。
作为优选，所述S3中，所述收集阴离子交换上柱液的过程中，先直接收集经阴离子交换后的目标产品液；再取所述阴离子交换后的目标产品液，先成盐使其目标产品和杂质发生共沉淀，再将共沉淀物溶解，即为阴离子交换上柱液；所述第二次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
对阴离子交换后的目标产品液(含有部分和目标产品的结构相似的杂质)，先成盐使其目标产品和杂质发生共沉淀，使目标产品和杂质特别是和目标产品相似的物质析出，这些与目标产品相似的物质的结构和性能均与目标产品相似，其较难除去，但当其成盐后，目标产品的盐和目标产品相似物的盐性质之间相差相对较大，两者比重差和溶解度等会有所加大，因此当再共沉淀物溶解的过程中，目标产品是完全溶解而其相似物是只能溶解极少量，因此通过该法再经过纳滤处理后的样品能基本除去与其结构相似的物质，提高分离的效果。
作为优选，所述阴离子交换后的目标产品和杂质的混合液的成盐过程中，添加的物质选自草酸或硫酸锌或氯化锌中的至少一种；所述共沉淀物溶解的过程中，添加的物质为氨水或氢氧化钠水溶液。
研究发现，杆菌肽的草酸或锌盐与其相似物的草酸或锌盐的性质相差较大，其容易分离；杆菌肽的草酸或锌盐与其相似物的草酸或锌盐，添加氨水和氢氧化钠水溶液的过程总，其目标产品是完全溶解而其相似物是只能溶解极少量，因此能提高产品的含量和纯度；且杆菌肽及其杂质与草酸或锌盐的反应可逆、无毒无害。
作为优选，所述S4中，金属螯合前，先将S3得到的阴离子交换上柱液经碱液处理至pH为7.0-7.5；所述收集金属螯合柱液的过程中，通过金属螯合的液体经超滤后的滤液，即为金属螯合柱液；所述超滤中，超滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
金属螯合前，先将S3得到的阴离子交换上柱液经碱液处理至pH为7.0-7.5，一方面能保证金属螯合的效果，另一方面还能提高其分离效果，还能保证产品的品质；将金属螯合的液体超滤，能快速除去金属螯合中产生的杂质，进一步提高分离效果。
作为优选，所述S6中，将纳滤产品液溶解使用的溶剂为乙醇或水或其混合物；所述过滤处理包括通过依次设置的0.45μm过滤器过滤和0.22μm过滤器过滤；所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-20℃-5℃；所述粉碎处理后的医药级杆菌肽的颗粒大小≤10μm。
将纳滤产品液先溶解再过滤，有利于进一步提纯，同时将纳滤产品加溶剂冷冻干燥，避免杆菌肽的变质，将其冻干和粉碎处理有利于提高产品的稳定性。
本发明的另一目的在于提供一种用于制备医药级杆菌肽的装置，其包括依次通过管路连接设置的用于酸化杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液的发酵液接收罐、用于将酸化后的杆菌肽发酵液或酸化后的低含量的杆菌肽溶液进行陶瓷膜过滤处理的陶瓷膜机组、用于接收陶瓷膜透出液的透出液收集罐、用于将透出液进行阳离子交换层析的阳离子交换层析柱、用于收集阳离子交换层析柱液的阳离子交换层析柱液收集罐、用于收集阳离子交换层析上柱液的阳离子交换层析上柱液收集罐、用于将阳离子交换层析上柱液进行阴离子交换的阴离子交换柱、用于将阴离子交换后的目标产品液先共沉淀后溶解的盐析溶解罐；用于收集阴离子交换上柱液及碱液处理的阴离子交换上柱液收集罐、用于将阴离子交换上柱液进行金属螯合的金属螯合柱、用于收集金属螯合柱液的金属螯合柱液收集罐、用于将金属螯合柱液进行纳滤处理的末次纳滤机组、用于将溶解的末次纳滤产品液的过滤处理的过滤器、干燥机和粉碎机。
作为优选，所述阳离子交换层析上柱液收集罐上连有第一次纳滤机组；所述盐析溶解罐上连有第二次纳滤机组；所述金属螯合柱液收集罐上连有超滤收集罐；所述陶瓷膜机组中，陶瓷膜为活性氧化铝或氧化锆，所述陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm；所述阳离子交换层析柱为BPG100/500，其阳离子交换层析的柱填料为CaptoSpimpres；所述第一次纳滤机组的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；所述阴离子交换柱为BPG140/500，其阴离子交换的柱填料为CaptoQimpres；所述第二次纳滤机组的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；所述超滤机组的超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da；所述末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；所述过滤器包括依次设置的0.45μm过滤器和0.22μm过滤器；所述干燥为冷冻干燥机；所述粉碎机包括打粉机、微粉机和混粉机。
通过上述设置的装置，能保证其制备的医药级杆菌肽能适用于多种产品来源，保证其大生产化的应用前景。
通过采用上述技术方案，具有以下有益效果：
将杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液，先经酸化处理，再通过陶瓷膜过滤、阳离子交换层析、阴离子交换、金属螯合、纳滤、末次纳滤产品液过滤、干燥、粉碎处理，全程保持杆菌肽的稳定性，且通过不同手段层层递进来分离杂质，在分离的过程中除了能将与其结构相差较大的杂质除去，还能除去与其结构相似的杂质，提高产品的纯度和含量及效价，使最终产品符合药用级别；且试验证明通过该方法制备的杆菌肽不受原料来源的影响，其能适用于多种原料，能确保大生产化的效果；
通过CaptoSpimpres的强阳离子交换和CaptoQimpres的强阴离子交换，且其均在一定的洗脱液中进行，其适用于杆菌肽这类双性物质，有利于其提纯；对阴离子交换后的目标产品液，先成盐使其目标产品和杂质发生共沉淀，使目标产品和杂质特别是和目标产品相似的物质析出，这些与目标产品相似的物质的结构和性能均与目标产品相似，其较难除去，但当其成盐后，目标产品的盐和目标产品相似物的盐性质之间相差相对较大，两者比重差和溶解度等会有所加大，因此当再共沉淀物溶解的过程中，目标产品是完全溶解而其相似物是只能溶解极少量，因此通过该法再经过纳滤处理后的样品能基本除去与其结构相似的物质，提高分离的效果；
经本申请的方法制备得到的杆菌肽在提纯并冷冻干燥、粉碎后，其具有较好的稳定性，能在25℃/60℃下放置3个月不发生变质，其品质远高于目前很多市售的产品；
研究发现，本申请的杆菌肽效价均较高，其均远高于中国药典标准(55U/mg)，均已达医药级，且其适用于不同的原料来源；其总的杆菌肽的纯度高于86％且其含量均高于75％，其远远高于对照样的纯度和含量。性状、溶解度、鉴别、酸碱度和干燥失重也均符合医药级标准。
附图说明
图1为实施例1的S1和S2的制备过程；
图2为实施例1的S3、S4和S5的制备过程；
图3为实施例1的S6的制备过程。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
制备例1：杆菌肽发酵液的制备
取枯草芽孢杆菌，直接以黄豆粉、淀粉、玉米浸出物、糖蜜和无机盐为培养基，接种量为5％，发酵时间30小时；且发酵初期的温度为30℃，经过2-3小时温度提高至37℃，有效活菌数达到1.1×109CFU/g，即得。
制备例2：杆菌肽发酵液的制备
参考申请公布号为CN103232959A的中国专利制备，其制备过程包括：(1)一级种子培养：将地衣芽孢杆菌在牛肉膏蛋白胨斜面培养基上活化20小时后，转接到种子培养基中摇瓶培养16小时，作为种子培养液；(2)液态发酵增殖培养：将一级种子培养液按发酵培养基体积的7％的接种量转接到液态发酵培养基中，培养温度为35℃，培养20小时，有效活菌数达到5.0×109CFU/g，即得。
实施例1
如图1所示，一种医药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤：
S1，取制备例1制备的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为1.1×109CFU/g)于发酵液接收罐中，加入0.05M的盐酸酸化至pH为5.0-5.5；搅拌混匀后将酸化的杆菌肽发酵液通过管路输送至陶瓷膜机组(其材料为活性氧化铝，陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm)内进行过滤，将陶瓷膜透出液通过管路收集至透出液收集罐中；
S2，在透出液收集罐中的透出液通过管路进入阳离子交换层析柱(阳离子交换层析柱为BPG100/500，柱填料为CaptoSpimpres)内，其通过0.1-2.5M的NaCl水溶液和pH＝3.0-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液(NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用量比为1∶100)进行洗脱，取经阳离子交换层析柱分离后的物质进行TLC点板判断目标产品液和杂质液的洗脱时间，其阳离子交换层析后的目标产品液(先流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐和阳离子交换层析上柱液收集罐并被收集，其阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液(中间流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐、阳离子交换层析上柱液收集罐并通过第一次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)进行纳滤处理得到其第一次纳滤液，将第一次纳滤液和收集的阳离子交换层析后的目标产品液合并得到阳离子交换层析上柱液；
S3，阳离子交换层析上柱液通过管路进入阴离子交换柱(阴离子交换柱为BPG140/500，柱填料为CaptoQimpres)内，取经阴离子交换柱分离后的阴离子交换目标产品液进入盐析溶解罐内，于盐析溶解罐内加入0.05M的草酸水溶液，使其逐渐析出沉淀，沉淀完全后逐滴加入0.01M的氨水至pH为5.5-6.0，得到稍有浑浊的混合液，将该混合液导入第二次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)内进行纳滤处理得到其第二次纳滤液，将第二次纳滤液通过管路输送至阴离子交换上柱液收集罐内，即为阴离子交换上柱液；S4，于阴离子交换上柱液收集罐内滴加0.005M氢氧化钠水溶液至pH＝7.0-7.5，并将其通过管路引入金属螯合柱内，将通过金属螯合柱的液体经超滤机组(其超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da)处理得到金属螯合柱液，于超滤收集罐内放置该金属螯合柱液；
S5，将金属螯合柱液通过末次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将末次纳滤产品液引入溶解罐内，加入末次纳滤产品液的2-3倍体积量的乙醇使其完全溶解；将溶解液依次通过0.45μm有机系过滤器和0.22μm有机系过滤器过滤；将该过滤液引入冷冻干燥机内，于-20℃下冷冻干燥10-48小时；将冻干后的样品经过打粉机内进行打粉，筛取颗粒大小为≤10μm的杆菌肽进入混粉机内；将颗粒大小大于10μm的杆菌肽放入微粉机内再次粉碎直至所有颗粒大小均≤10μm，将微粉合格的颗粒引入混粉机内与其他≤10μm的颗粒进行混合，混合充分后即得本申请所述的医药级杆菌肽。
实施例2
一种医药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤：
S1，取制备例2制备的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为5.0×109CFU/g)于发酵液接收罐中，加入0.05M的盐酸酸化至pH为4.5-5.0；搅拌混匀后将酸化的杆菌肽发酵液通过管路输送至陶瓷膜机组(其材料为活性氧化铝，陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm)内进行过滤，将陶瓷膜透出液通过管路收集至透出液收集罐中；
S2，在透出液收集罐中的透出液通过管路进入阳离子交换层析柱(阳离子交换层析柱为BPG100/500，柱填料为CaptoSpimpres)内，其通过0.1-2.0M的NaCl水溶液和pH＝4.0-5.0的NaAc-HAc缓冲溶液(NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用量比为1∶80)进行洗脱，取经阳离子交换层析柱分离后的物质进行TLC点板判断目标产品液和杂质液的洗脱时间，其阳离子交换层析后的目标产品液(先流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐和阳离子交换层析上柱液收集罐并被收集，其阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液(中间流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐、阳离子交换层析上柱液收集罐并通过第一次纳滤机组(其纳滤膜的孔径为截留分子量为300Da-500Da)进行纳滤处理得到其第一次纳滤液，将第一次纳滤液和收集的阳离子交换层析后的目标产品液合并得到阳离子交换层析上柱液；
S3，阳离子交换层析上柱液通过管路进入阴离子交换柱(阴离子交换柱为BPG140/500，柱填料为CaptoQimpres)内，取经阴离子交换柱分离后的阴离子交换目标产品进入盐析溶解罐内，于盐析溶解罐内加入0.01M的硫酸锌水溶液，使其逐渐析出沉淀，沉淀完全后逐滴加入0.005M的氢氧化钠至pH为6.0-6.5，得到稍有浑浊的混合液，将该混合液导入第二次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)内进行纳滤处理得到其第二次纳滤液，将第二次纳滤液通过管路输送至阴离子交换上柱液收集罐内，即为阴离子交换上柱液；
S4，于阴离子交换上柱液收集罐内滴加0.003M氢氧化钠水溶液至pH＝7.0-7.5，并将其通过管路引入金属螯合柱内，将通过金属螯合柱的液体经超滤机组(其超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da)处理得到金属螯合柱液，于超滤收集罐内放置该金属螯合柱液；
S5，将金属螯合柱液通过末次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将末次纳滤产品液引入溶解罐内，加入末次纳滤产品液的2-3倍体积量的水使其完全溶解；将溶解液依次通过0.45μm有机系过滤器和0.22μm有机系过滤器过滤；将该过滤液引入冷冻干燥机内，于5℃下冷冻干燥24-72小时；将冻干后的样品经过打粉机内进行打粉，筛取颗粒大小为≤10μm的杆菌肽进入混粉机内；将颗粒大小大于10μm的杆菌肽放入微粉机内再次粉碎直至所有颗粒大小均≤10μm，将微粉合格的颗粒引入混粉机内与其他≤10μm的颗粒进行混合，混合充分后即得本申请所述的医药级杆菌肽。
实施例3
一种医药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤：
S1，取购自中农颍泰生物技术有限公司的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为13.1×109CFU/g)于发酵液接收罐中，加入0.05M的盐酸酸化至pH为5.5-6.0；搅拌混匀后将酸化的杆菌肽发酵液通过管路输送至陶瓷膜机组(其材料为活性氧化锆，陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm)内进行过滤，将陶瓷膜透出液通过管路收集至透出液收集罐中；
S2，在透出液收集罐中的透出液通过管路进入阳离子交换层析柱(阳离子交换层析柱为BPG100/500，柱填料为CaptoSpimpres)内，其通过0.1-2.0M的NaCl水溶液和pH＝4.0-5.0的NaAc-HAc缓冲溶液进行洗脱(NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用量比为1∶200)，取经阳离子交换层析柱分离后的物质进行TLC点板判断目标产品液和杂质液的洗脱时间，其阳离子交换层析后的目标产品液(先流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐和阳离子交换层析上柱液收集罐并被收集，其阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液(中间流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐、阳离子交换层析上柱液收集罐并通过第一次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)进行纳滤处理得到其第一次纳滤液，将第一次纳滤液和收集的阳离子交换层析后的目标产品液合并得到阳离子交换层析上柱液；
S3，阳离子交换层析上柱液通过管路进入阴离子交换柱(阴离子交换柱为BPG140/500，柱填料为CaptoQimpres)内，，取经阴离子交换柱分离后的阴离子交换目标产品液进入进入盐析溶解罐内，于盐析溶解罐内加入0.01M的氯化锌水溶液，使其逐渐析出沉淀，沉淀完全后逐滴加入0.005M的氢氧化钠至pH为6.5-7.0，得到稍有浑浊的混合液，将该混合液导入第二次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)内进行纳滤处理得到其第二次纳滤液，将第二次纳滤液通过管路输送至阴离子交换上柱液收集罐内，即为阴离子交换上柱液；
S4，于阴离子交换上柱液收集罐内滴加0.003M氢氧化钾水溶液至pH＝7.0-7.5，并将其通过管路引入金属螯合柱内，将通过金属螯合柱的液体经超滤机组(其超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da)处理得到金属螯合柱液，于超滤收集罐内放置该金属螯合柱液；
S5，将金属螯合柱液通过末次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将末次纳滤产品液引入溶解罐内，加入末次纳滤产品液的2-3倍体积量的水使其完全溶解；将溶解液依次通过0.45μm有机系过滤器和0.22μm有机系过滤器过滤；将该过滤液引入冷冻干燥机内，于5℃下冷冻干燥24-72小时；将冻干后的样品经过打粉机内进行打粉，筛取颗粒大小为≤10μm的杆菌肽进入混粉机内；将颗粒大小大于10μm的杆菌肽放入微粉机内再次粉碎直至所有颗粒大小均≤10μm，将微粉合格的颗粒引入混粉机内与其他≤10μm的颗粒进行混合，混合充分后即得本申请所述的医药级杆菌肽。
实施例4
一种医药级杆菌肽，其制备方法包括如下步骤：
S1，取购自中农颍泰生物技术有限公司的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为13.1×109CFU/g)加入0.1M的盐酸酸化至pH为6.0-6.5；搅拌混匀后将酸化的杆菌肽发酵液通过管路输送至陶瓷膜机组(其材料为活性氧化铝，陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm)内进行过滤，将陶瓷膜透出液通过管路收集至透出液收集罐中；
S2，在透出液收集罐中的透出液通过管路进入阳离子交换层析柱(阳离子交换层析柱为BPG100/500，柱填料为CMSepharoseFF)内，其通过1.0-3.0M的NaCl水溶液和pH＝4.5-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液(NaCl水溶液和NaAc-HAc缓冲溶液的体积用量比为1∶40)进行洗脱，取经阳离子交换层析柱分离后的物质进行TLC点板判断目标产品液和杂质液的洗脱时间，其阳离子交换层析后的目标产品液(先流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐和阳离子交换层析上柱液收集罐并被收集，其阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液(中间流出)依次通过阳离子交换层析柱液收集罐、阳离子交换层析上柱液收集罐并通过第一次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)进行纳滤处理得到其第一次纳滤液，将第一次纳滤液和收集的阳离子交换层析后的目标产品液合并得到阳离子交换层析上柱液；
S3，阳离子交换层析上柱液通过管路进入阴离子交换柱(阴离子交换柱为BPG140/500，柱填料为DEAESephroseFF)内，取经阴离子交换柱分离后的阴离子交换目标产品液进入盐析溶解罐内并将其导入第二次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)内进行纳滤处理得到其第二次纳滤液，将第二次纳滤液通过管路输送至阴离子交换上柱液收集罐内，即为阴离子交换上柱液；
S4，于阴离子交换上柱液收集罐内滴加0.005M氢氧化钠水溶液至pH＝7.0-7.5，并将其通过管路引入金属螯合柱内，将通过金属螯合柱的液体经超滤机组(其超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da)处理得到金属螯合柱液，于超滤收集罐内放置该金属螯合柱液；
S5，将金属螯合柱液通过末次纳滤机组(其纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da)处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将末次纳滤产品液引入溶解罐内，加入末次纳滤产品液的2-3倍体积量的乙醇使其完全溶解；将溶解液依次通过0.45μm有机系过滤器和0.22μm有机系过滤器过滤；将该过滤液引入冷冻干燥机内，于-20℃下冷冻干燥10-48小时；将冻干后的样品经过打粉机内进行打粉，筛取颗粒大小为≤10μm的杆菌肽进入混粉机内；将颗粒大小大于10μm的杆菌肽放入微粉机内再次粉碎直至所有颗粒大小均≤10μm，将微粉合格的颗粒引入混粉机内与其他≤10μm的颗粒进行混合，混合充分后即得本申请所述的医药级杆菌肽。
对比例
1、对照品的制备：
参照公开号为CN104109191A的中国专利，将枯草芽孢杆菌发酵液离心得上清液1，再将所得的上清液1用冰醋酸调节pH至4.5-5.5，静置1-2小时，得酸性沉淀后的样品；
将酸性沉淀后的样品离心得上清液2；将上清液2滤膜过滤，得过滤液；
将过滤液进行阴离子交换层析(柱填料为Capto0，层析柱为BPG140/500)，得穿透液和平衡液；其中阴离子交换层析的方法为：用含有50mMTris、1MNaCl的水溶液和50mMTris的水溶液交替处理层析柱，再上样过滤液，收集穿透液，上样完毕后，用50mMTris水溶液平衡，得平衡液，将平衡液与穿透液合并；
将穿透液和平衡液进行第一次疏水层析(柱填料为ButylHP，层析柱为BPG100/500)，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；其中，第一次疏水层析的方法为：用超纯水洗脱，再用pH5.0的含有50mMNaAc-HAc、1.5MNaCl的水溶液平衡，平衡完毕，再将阴离子交换层析得到的穿透液和平衡液上样，上样完毕，用pH5.0的含有50mMNaAc-HAc、1.5MNaCl的水溶液继续平衡，平衡完毕，用pH5.0的50mMNaAc-HAc的水溶液进行洗脱，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品1；
将样品1进行阳离子交换层析(柱填料为CaptoSpimpres，层析柱为BPG100/500)，280nm检测并收集洗脱峰，将鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰合并，得到样品2；其中阳离子交换层析的方法为：用pH5.0的含有50mMNaAc-HAc、1.5MNaCl的水溶液洗脱，再用pH5.0的50mMNaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，将样品1上样，分段收集穿透，检测其是否含有目的抗菌肽，继续用pH5.0的50mMNaAc-HAc缓冲液平衡，平衡完毕，用pH5.0的含有50mMNaAc-HAc，1MNaCl的水溶液洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品2；其中，第二次疏水层析的方法为：超纯水洗脱，再用pH5.0的50mMNaAc-HAc，1.5MNaCl水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH5.0的50mMNaAc-HAc，1.5MNaCl水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3；
将样品2进行第二次疏水层析(柱填料为ButylHP，层析柱为BPG100/500)，280nm检测并收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3，将样品3超滤换液得到枯草菌素抗菌肽；其中，第二次疏水层析的方法为：超纯水洗脱，再用pH5.0的50mMNaAc-HAc，1.5MNaCl水溶液平衡，平衡完毕，将样品2上样，上样完毕，用pH5.0的50mMNaAc-HAc，1.5MNaCl水溶液继续平衡，平衡完毕，用超纯水进行洗脱，280nm收集洗脱峰，收集鉴定含有目的抗菌肽的洗脱峰，得到样品3；
将样品3超滤换液，干燥得到对照品；
其中，对照品1以制备例1制备的杆菌肽发酵液(有效活菌数达到1.1×109CFU/g)为原料，对照品2以制备例2制备的杆菌肽发酵液(有效活菌数达到5.0×109CFU/g)为原料，对照品3以购自中农颍泰生物技术有限公司的杆菌肽发酵液(其有效活菌数为13.1×109CFU/g)为原料。
2、效价测试试验
(1)样品：以实施例1-4制备的样品为试验样，以对照品1-3为对照样。
(2)标准品及工作标准溶液的配制：
选用美国Alpharma公司生产的标示效价74U/mg的医药级杆菌肽锌为标准品；
将精密称取干燥后的标准品置于量瓶中，用0.01M盐酸溶解并定容，制备成10U/mL的储备标准溶液，用该储备标准溶液为母液且以pH6.0的磷酸缓冲溶液为稀释液配制得到浓度为0.64U/mL、0.80U/mL、1.00U/mL、1.25U/mL和1.56U/mL的工作标准溶液。
(3)样品溶液的制备
按样品的估计效价精确称取适量的试验样，用0.01M盐酸溶解并定容，制备成10U/mL的储备溶液，用该储备溶液为母液且以pH6.0的磷酸缓冲溶液为稀释液配制得到浓度为估计效价为1.0U/mL的溶液。
(4)试验内容
①制备藤黄微球菌普通斜面：
每支200×30mm试管中装入30-50mL溶化后未灭菌的培养基I(按美国药典配制)，用棉塞和牛皮纸塞住试管口，121℃灭菌15分钟，然后趁热取出以30℃角度斜放，带冷却凝固后备用；自冰箱中取出菌种斜面，室温下放置20-30℃，待温度平衡后移入接种室；将培养基和菌种从传递窗送入接种室；点燃酒精灯，在无菌条件下给每支装有琼脂斜面的试管接种；接种完毕立即灼烧接种环，将接种环在火焰上往返几次灼烧小毒；将接种后的试管放入霉菌培养箱于32-35℃培养24小时，取出，室温下放置1小时，待温度平衡后放入冰箱中于2-6℃保存。
②制备藤黄微球菌菌悬液：
配制250mL培养基I放入500mL洛克氏瓶中，121℃灭菌15分钟，取出以30℃角度斜放，冷却凝固制备成大斜面；将新鲜制备的藤黄微球菌普通斜面上的菌苔取下，放入装有2-3mL0.9％灭菌生理盐水的5mL小试管中，晃动小试管，借助玻璃珠将菌苔打散，使之均匀分散在溶液中；将小试管中的菌液倒入洛克氏瓶中，塞上棉塞，借助于玻璃珠使菌苔均匀分布在培养基的表面，32-35℃下培养24吸收；向洛克氏瓶中加入50mL0.9％灭菌生理盐水，借助于玻璃珠将菌苔洗下，将菌液导入三角烧瓶中，摇晃三角烧瓶，借助于玻璃珠使菌苔分散均匀，其溶液为储备菌悬液；用移液管移取1mL储备菌悬液放入小烧杯中，按1∶35的体积比加入0.9％灭菌生理盐水稀释，混匀，用722分光光度计测稀释菌悬液在580nm处的透光度；若透光度为15-20％，则将4.0mL储备菌悬液加入到上层培养基中，如果透光度为21-30％，则将6.0mL储备菌悬液加入到上层培养基中；配制250mL上层培养基，灭菌后冷却至45-50℃，加入储备菌悬液，混匀，得到藤黄微球菌菌悬液。
③制备双碟：
底层，配制1000mL培养基II(参照美国药典)，121℃灭菌15分钟；
上层，配制250mL培养基I，121℃灭菌15分钟，然后放在恒温水浴中，45-49℃恒温1小时；
制备底层培养基，每个培养皿加入21mL培养基II，盖上陶瓦盖，待琼脂培养基凝固；
制备上层培养基，底层培养基凝固后，在其上每盘摊布4mL藤黄微球菌菌悬液，盖上陶瓦盖使凝固。
④分析程序
(A)双碟制备好后，每盘用牛津杯放置器放置6个牛津布，分布在半径为2.8cm的圆上，间隔60℃；
(B)取多个上述制备的双碟，每3个双碟为一组，共分5组，标准曲线为第1-4组，样品或对照品为第5组。将每碟6个牛津杯间隔的3个杯中各装每毫升含1.0单位的标准品稀释液，即中心浓度，第二组的空杯中各装入0.80U/mL的标准品稀释液，依次将4种浓度的标准品稀释液装入，共得中心浓度标准品稀释液45杯，其他四种浓度的标准品溶液各得9杯，全部双碟盖上陶瓦圆盖后于32-35℃培养18-24小时；
(C)测定样品效价则是讲上述(B)中第五组剩余的3个双碟，各碟其他3杯中各装入估计浓度1.0U/mL的样品溶液，盖上陶瓦圆盖，与标准曲线双碟在相同条件下同时培养；
(D)培养结束后，使用扫描仪扫描记录各双碟图像，测量各抑菌圈的直径；
(E)使用以下公式计算效价：
X = A × 100 mL B × 100 mL 10 mL × 100 mL 10 mL (公式1)
其中X代表效价，其单位为U/mg；A代表测定效价，其单位为U/mg；B代表样品重量，其单位为mg。
(5)试验结果
试验结果如表2所示，研究发现试验样1-4的效价均较高，其均远高于中国药典标准(55U/mg)，均已达医药级，且其适用于不同的原料来源；而对照样中只有对照样3是恰好能达到中国药典标准(55U/mg)，其余两个对照样均未达到医药级标准。
表2效价试验结果统计
样品 效价(U/mg)
试验样1(实施例1) 63
试验样2(实施例2) 68
试验样3(实施例3) 74
试验样4(实施例4) 60
对照样1 37
对照样2 45
对照样3 58
3、含量及纯度测试
(1)色谱条件：
试剂：HPLC级甲醇、HPLC级水、KH2PO4、0.2MK2HPO4溶液；
色谱柱：GLScience，InertsilC8-3.5μ，250×4.6mm，Cat.No.：1AI13518；
流动相：溶剂A：pH＝6.0缓冲溶液，溶剂B：甲醇；溶剂C：乙腈；
缓冲溶液制备：称取6.8gKH2PO4溶液调节pH调到6.0±0.05；
梯度：如表3所示；
平衡时间为15min，流速为1.0mL/min，检测器为254nm紫外灯照射，进样量为20μL。
表3HPLC检测的流动相梯度
时间，min 溶剂A，％ 溶剂B，％ 溶剂C，％
0 43 55 2
5 43 55 2
75 35 55 10
(2)检测溶液
溶解样品的溶剂制备：移取20mL1mol/L的盐酸到1L容量瓶中，加入200mL水和800mL甲醇，混匀；
样品制备：精确称取约500mg的样品溶于5mL上述溶解样品的溶剂中，室温下静置至少10分钟，然后将溶液用4.5μm的针头过滤器过滤；其中选用美国Alpharma公司生产的标示效价74U/mg的医药级杆菌肽锌为标准品。
(3)试验结果
与标准品相比，以单点比较法计算样品的含量值；以归一法计算纯度。结果如表4所示，研究发现试验样1-4的纯度和含量均较高，其总的杆菌肽的纯度高于86％且其含量均高于75％，其远远高于对照样的纯度和含量。
表4含量及纯度测试的结果统计
4、综合质量评价
(1)性状：试验样和对照样，均为类白色至淡黄色的粉末；无臭；有引湿性；易被氧化剂破坏，在溶液中易被多种重金属盐类沉淀。
(2)溶解度：试验样和对照样，在水中易溶，在乙醇中溶解，在丙酮或乙醚中不溶。
(3)鉴别：取试验样或对照样与杆菌肽标准品各适量，分别用1％乙二胺四醋酸二钠溶液制成每1mL中各约含6.0mg的溶液，作为供试品溶液和标准品溶液，照薄层色谱法试验，取上述两种溶液各5μL分别点于同一硅胶GF254薄层板(临用前于105℃活化1-2小时)上，自然干燥，以正丁醇-冰醋酸-水-吡啶-乙醇(60∶15∶10∶6∶5)为展开剂，展开，晾开，喷以1％茚三酮的丁醇-吡啶(99∶1)溶液，于105℃加热约5分钟，至出现棕红色斑点。供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与标准品溶液主斑点的位置和颜色相同。
(4)酸碱度：试验样1-4和对照样1-3，pH＝5.5-7.5(加水制成1mL中含1000单位的溶液)。
(5)干燥失重
试验样1-4和对照样1-3，以五氧化二磷为干燥剂，在60℃减压干燥3小时，减失重量均不超过5.0％。
其综合质量评价见表5，试验样1-4符合中国药典标准。
表5综合质量评价统计
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种医药级杆菌肽，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
S1，取杆菌肽发酵液进行酸化，经陶瓷膜过滤，得到陶瓷膜透出液；
S2，将S1的陶瓷膜透出液经阳离子交换层析，收集阳离子交换层析上柱液；
S3，将S2的阳离子交换层析上柱液经阴离子交换，收集阴离子交换上柱液；
S4，将S3的阴离子交换上柱液经金属螯合，收集金属螯合柱液；
S5，将S4的金属螯合柱液经纳滤处理，得到末次纳滤产品液；
S6，将S5的末次纳滤产品液溶解，并将溶解的末次纳滤产品液过滤处理，取其滤液进行干燥、粉碎处理，即得医药级杆菌肽；
其中，S1中的杆菌肽发酵液可用低含量的杆菌肽溶液代替；
所述末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
2.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，所述S1中，陶瓷膜为活性氧化铝或氧化锆；所述陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm。
3.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述S2中，阳离子交换层析中使用的阳离子交换层析柱为BPG100/500，其阳离子交换层析的柱填料为CaptoSpimpres，所述洗脱液为0.1-2.5M的NaCl水溶液和pH=3.0-5.5的NaAc-HAc缓冲溶液；
所述S3中，阴离子交换中使用的阴离子交换柱为BPG140/500，其阴离子交换的柱填料为CaptoQimpres。
4.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述S2中，所述收集阳离子交换层析上柱液的过程中，根据其洗脱时间来收集阳离子交换层析后的目标产品液、目标产品和杂质的混合液、杂质液；
取所述阳离子交换层析后的目标产品和杂质的混合液经第一次纳滤处理，将纳滤处理后的滤液和阳离子交换层析后的目标产品液合并即为阳离子交换层析上柱液；
所述第一次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
5.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述S3中，所述收集阴离子交换上柱液的过程中，先直接收集经阴离子交换后的目标产品液；再取所述阴离子交换后的目标产品液，先成盐使其目标产品和杂质发生共沉淀，再将共沉淀物溶解，即为阴离子交换上柱液；
所述第二次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
6.根据权利要求5所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述阴离子交换后的目标产品和杂质的混合液的成盐过程中，添加的物质选自草酸或硫酸锌或氯化锌中的至少一种；
所述共沉淀物溶解的过程中，添加的物质为氨水或氢氧化钠水溶液。
7.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述S4中，金属螯合前，先将S3得到的阴离子交换上柱液经碱液处理至pH为7.0-7.5；
所述收集金属螯合柱液的过程中，通过金属螯合的液体经超滤后的滤液，即为金属螯合柱液；
所述超滤中，超滤膜的截留分子量为300Da-500Da。
8.根据权利要求1所述的医药级杆菌肽，其特征在于，
所述S6中，将纳滤产品液溶解使用的溶剂为乙醇或水或其混合物；
所述过滤处理包括通过依次设置的0.45μm过滤器过滤和0.22μm过滤器过滤；
所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为-20℃-5℃；
所述粉碎处理后的医药级杆菌肽的颗粒大小≤10μm。
9.一种用于制备医药级杆菌肽的装置，其特征在于，包括依次通过管路连接设置的
用于酸化杆菌肽发酵液或低含量的杆菌肽溶液的发酵液接收罐、
用于将酸化后的杆菌肽发酵液或酸化后的低含量的杆菌肽溶液进行陶瓷膜过滤处理的陶瓷膜机组、
用于接收陶瓷膜透出液的透出液收集罐、
用于将透出液进行阳离子交换层析的阳离子交换层析柱、
用于收集阳离子交换层析柱液的阳离子交换层析柱液收集罐、
用于收集阳离子交换层析上柱液的阳离子交换层析上柱液收集罐、
用于将阳离子交换层析上柱液进行阴离子交换的阴离子交换柱、
用于将阴离子交换后的目标产品液先共沉淀后溶解的盐析溶解罐；
用于收集阴离子交换上柱液及碱液处理的阴离子交换上柱液收集罐、
用于将阴离子交换上柱液进行金属螯合的金属螯合柱、
用于收集金属螯合柱液的金属螯合柱液收集罐、
用于将金属螯合柱液进行纳滤处理的末次纳滤机组、
用于将溶解的末次纳滤产品液的过滤处理的过滤器、干燥机和粉碎机。
10.根据权利要求9所述的用于制备医药级杆菌肽的装置，其特征在于，
所述阳离子交换层析上柱液收集罐上连有第一次纳滤机组；
所述盐析溶解罐上连有第二次纳滤机组；
所述金属螯合柱液收集罐上连有超滤收集罐；
所述陶瓷膜机组中，陶瓷膜为活性氧化铝或氧化锆，所述陶瓷膜的孔径为0.1-1.0μm；
所述阳离子交换层析柱为BPG100/500，其阳离子交换层析的柱填料为CaptoSpimpres；
所述第一次纳滤机组的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；
所述阴离子交换柱为BPG140/500，其阴离子交换的柱填料为CaptoQimpres；
所述第二次纳滤机组的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；
所述超滤机组的超滤膜的截留分子量为10000Da-20000Da；
所述末次纳滤处理的纳滤膜的截留分子量为300Da-500Da；
所述过滤器包括依次设置的0.45μm过滤器和0.22μm过滤器；
所述干燥为冷冻干燥机；
所述粉碎机包括打粉机、微粉机和混粉机。
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