JP6488233B2 - 微生物用集塊状培地を作製する方法、及びその組成物 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮出願特許第６１／６８０，４４９号（２０１２年８月７日出願）及び米国仮出願特許第６１／７７３，８５２号（２０１３年３月７日出願）に記載の利益を主張するものであり、これらは参照によりその全体が本願に援用される。

動物、植物及び微生物細胞を含む数多くの細胞種の培養に、栄養培地製剤が使用されてきた。培養培地で培養された細胞は利用可能な栄養分を異化し、モノクローナル抗体、ホルモン、成長因子及びウイルスなどの有用な生体物質を生成する。このような生成物は治療用途を有しており、組み換えＤＮＡ技術の出現により、これらの生成物を大量に生産するよう細胞を遺伝子操作できるようになっている。したがって、試験管内での細胞培養は、細胞生理学の研究のみに重要なものではなく、高費用効率の手法により得ることのできない有用な物質の生産にも必要とされている。

微生物培養培地の典型的な成分としては、タンパク質加水分解物、無機塩類、ビタミン類、微量金属、及び炭水化物を挙げることができ、その種類及び量は、所与の微生物種に特有の要求に応じ変化し得る。これらの成分は、脱水型でより安定となる傾向があることから、しばしば乾燥粉末製剤として提供される。粉末製剤は水に加えられ、所望により使用前に安定化される。

培養培地は典型的には液体形態又は粉末形態で調製される。これらの形態のそれぞれは特有の利点及び欠点を有する。

例えば、液体培養培地は、すぐに使用できる状態で提供され（栄養分又は他の成分の添加が必要とされない限り）、かつ製剤が特定の細胞種に対し最適化されているという利点を有する。しかしながら、液体培地には、特定微生物の培養における性能を最適にするために、追加の成分（例えば、ビタミン又は補助因子、及び抗生物質）を添加する必要があるという欠点がある。更に、ほとんどの液体培地は、時間がかかり及び／又は効果なプロセスとなり得る、ある種の滅菌（例えば、オートクレーブ、濾過）を必要とする。

いくつかの欠点を克服するため、液体培養培地は濃縮形態で作製することができ、濃縮物は、使用前に使用濃度に希釈される。この用法は、標準的な培養培地と比較して、バッチサイズを、より大規模で、かつ変更可能なものとすることができ、濃縮培地製剤又はその成分は、多くの場合、より長期間の貯蔵寿命を有する。米国特許第５，４７４，９３１号は、培養培地濃縮法を目的とするものであり、参照によりその全体が本願に援用される。これらの利点にもかかわらず、濃縮液体培地は、尚も追加の成分の添加を必要とし、経済的に滅菌するのが困難な場合があるという欠点を有する。

液体培地の代用物としては、多くの場合、粉末培養培地が使用される。この手法は、より大規模なバッチサイズが製造され得るという利点を有し、及び粉末培地は、典型的には、液体培地よりも貯蔵寿命が長く、かつ照射（例えば、γ又は紫外線照射）又は製剤後エチレンオキシド流通により滅菌することができる。しかしながら、粉末培地は複数の欠点を有する。例えば、粉末培地のいくつかの成分は、凍結乾燥により不溶性になり、あるいは再可溶化が困難又は不可能である集塊体を形成する。更に、粉末培地は、典型的には微細な塵埃粒子を含み、この塵埃粒子は、構成材料の損失を生じずに粉末培地を移動させること及び／又は再形成させることを特に困難にし、かつ更にはある種の条件での粉末培地の使用を不可能にし得る。

再水和可能な培地には利点があるものの、様々な大容量で調製することができ、かつ滅菌しやすい、栄養的に複雑で、安定した乾燥粉末栄養培地と、培地の補充成分とを、迅速に溶解することが尚も必要とされている。

本開示は、一般的には、微生物（例えば、細菌、酵母、カビ）の増殖を促進するために使用される栄養培地に関する特に本開示は、１つ以上の粉末栄養成分を集塊させて、乾燥した集塊状栄養培地を作製する方法を提供する。方法は、選択された化学組成、大きさ、密度、含水量、あるいはこれらの特性の任意の２つ以上の組み合わせを有する集塊状粒子を提供する、プロセス条件を包含する。他の態様では、本開示は、更に、本明細書に記載の任意の方法により作製された、乾燥した集塊状栄養培地を含む組成物を提供する。他の態様では、本開示は、本願で開示される乾燥した集塊状栄養組成物を含む物品及びキットを提供する。

有利に、本開示の組成物は、水性溶媒による粒子表面の湿潤を促進する化学組成を有する。更に有利なことに、本開示の組成物は、水性溶媒への粒子の浸漬を促進するよう選択された密度（例えば、かさ密度）を有する。更に有利なことに、本開示の乾燥した集塊状栄養培地は、水性溶媒への粒子の迅速な溶解を促進するよう選択された粒度分布を有する。

一態様では、本開示は、流動性の、集塊状栄養培地の製造方法を提供する。方法は、粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに入れることと、流動化ガスをチャンバに貫流することと、集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることと、チャンバから組成物を回収することとを含んでよく、組成物は、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に、非集塊状粉末状栄養分とを含み、当該粒子群は、約２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有する少なくとも約３０重量％の集塊状栄養粒子を含む。粉末状栄養分は、微生物の増殖を促進する栄養成分を含む。任意の方法の実施形態において、粒子群の少なくとも約７０重量％の粒子は、約１０５〜８４１ミクロンの有効粒子径を有し得る。上記の任意の実施形態において、粒子群中１０重量％未満の粒子は、１０５ミクロン以下の有効粒子径を有し得る。

上記の任意の実施形態において、方法は、集塊状栄養培地粒子の分集団を単離することを更に含んでよく、分集団は規定の有効粒子径を有する。いくつかの実施形態では、分集団を単離することは、約１４９ミクロン〜約８４１ミクロンの有効粒子径を有する分集団を単離することを含む、分集団を単離することを含み得る。上記の任意の実施形態において、集塊液は、結合剤、及び／又は集塊液に溶解した微生物の増殖を促進する栄養分を含む、溶媒を含み得る。上記の任意の実施形態において、粉末状栄養分を配置することは、所定の体積の粉末状栄養分を配置することを含み得る。上記の任意の実施形態において、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることが、粉末状栄養分を所定の体積の集塊液と接触させることを含み得る。上記の任意の実施形態において、集塊状栄養培地の粒子群は、約５．５重量％以下の平均含水量を有し得る。

上記の任意の実施形態において、集塊状栄養培地の粒子群は、１立方ｃｍ当たり約０．２〜約０．５ｇのゆるみかさ密度を有し得る。上記の任意の実施形態において、１つ以上の粉末状栄養分は、タンパク質加水分解物、炭水化物、塩、及び前述の粉末状栄養分のうちの任意の２つ以上の混合物からなる群から選択される栄養分を含み得る。上記の任意の実施形態において、方法は、乾燥した集塊状栄養培地に対し、乾燥した集塊状栄養培地中の生菌数を減少させるプロセスを実施すること、を含み得る。いくつかの実施形態では、乾燥した集塊状栄養培地に対し生菌数を減少させるプロセスを実施することは、乾燥した集塊状栄養培地を電離放射又はエチレンオキシド蒸気に曝露することを含み得る。上記の任意の実施形態において、粉末状栄養分は、再水和したときに緩衝化されたペプトン水培地を形成する粉末混合物、再水和したときにトリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、及び再水和したときにラクトースブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＵＶＭ改変リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにリステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに酵母エキス添加トリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディス増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディスＲ１０ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトシスチンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＥＣブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに栄養ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにレーゼンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＤｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにブレインハートインフュージョンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに強度半分のデミフレイザー（Demi-Fraser）ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにフレイザー（Frasier）ブロスを形成する粉末混合物、並びに再水和したときにデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、からなる群から選択され得る。

別の態様において、本開示は組成物を提供する。組成物は、上記方法のいずれかにより作製された、流動性の乾燥した集塊状栄養培地を含み得る。組成物の任意の実施形態では、特定量の、乾燥した集塊状栄養培地は、集塊状栄養培地が作製されるものと等量の粉末状栄養分と比較してより迅速に水性溶媒に溶解する。

更に別の態様において、本開示は、組成物を提供する。組成物は、水性媒質と組み合わせたときに、微生物の増殖を促進する混合物を形成する、集塊状粒子を含む集塊状栄養培地を含み得るものであり、粒子群中少なくとも約３０重量％の粒子は、約２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有し、粒子のかさ密度は、１立法ｃｍ当たり約０．２〜約０．５ｇである。任意の実施形態では、粒子群中の少なくとも約７０重量％の粒子は、約１０５〜８４１ミクロンの有効粒子径を有し得る。

上記の任意の組成物の実施形態では、集塊状栄養培地は、粉末状栄養分を含み得るものであり、粉末状栄養分は、再水和したときに緩衝化されたペプトン水培地を形成する粉末混合物、再水和したときにトリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、及び再水和したときにラクトースブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＵＶＭ改変リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに緩衝化リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに酵母エキス添加トリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディス増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディスＲ１０ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトシスチンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＥＣブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに栄養ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにレーゼンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＤｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにブレインハートインフュージョンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに強度半分のデミフレイザー（Demi-Fraser）ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにフレイザー（Frasier）ブロスを形成する粉末混合物、並びに再水和したときにデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、からなる群から選択される。

更に別の態様では、本開示は、カプセル剤、錠剤、又は上記の実施形態のいずれかを含むサシェを提供する。

更に別の態様において、本開示はあるキットを提供するものである。キットは、上記の任意の実施形態のカプセル剤、錠剤、サシェ及び／又は組成物のいずれかを含み得る。キットの任意の実施形態では、組成物は、所定の体積の乾燥した集塊状栄養培地を含む包装内に配置することができ、所定の体積は、９．９ｍＬ、１０ｍＬ、９０ｍＬ、９９ｍＬ、１００ｍＬ、２２５ｍＬ、１．０Ｌ、又は３．３７５Ｌの水性希釈剤と混合することで、微生物の増殖を促進することのできる培地が再形成されるよう選択される。上記の任意の実施形態において、キットは、袋、ボトル、及びサンプル収集用具からなる群から選択される物品を更に含み得る。上記の任意の実施形態において、キットは、選択剤及び／又は指示薬を更に含み得る。

更に別の態様では、本開示は、薄膜式培養装置を提供する。薄膜式培養装置は、第１及び第２主表面と、第１主表面の少なくとも一部分上に配置された接着層と、接着層の少なくとも一部分上に配置された、上記組成物の実施形態のいずれかを含むコーティングと、栄養培地により流動式に接触されるよう配置された乾燥型冷水溶解性ゲル化剤と、を有する自己支持性防水基材を含み得る。薄膜式培養装置の任意の上記の実施形態では、装置は、基材の少なくとも一部に連結させたカバーシートを更に含んでよく、カバーシートは、第一主表面に面する第一面を有する。

用語「好ましい」及び「好ましくは」とは、特定の状況下で、特定の利益をもたらすことができる、本発明の実施形態を指す。しかしながら、他の実施形態もまた、同じ状況又は他の状況下で、好ましい場合がある。更に、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを暗示するものではなく、また、本発明の範囲から他の実施形態を排除することを意図するものでもない。

用語「含む」及びその変化形は、これらの用語が、本明細書本文及び特許請求の範囲に現れる場合、限定する意味を有するものではない。

本明細書で使用するときに、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上の」は、互換可能に使用される。したがって、例えば、「ａ」粒子は、「１つ以上の」粒子を意味するものと解釈される。

用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ又は全てを、若しくは列挙された要素の任意の２つ以上の組み合わせを意味する。

また本明細書では、端点による数値範囲の記載は、その範囲に含まれる全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。

上記の本発明の課題を解決するための手段は、本発明の開示されるそれぞれの実施形態又は本発明の全ての実施を説明することを目的としたものではない。以下の説明は、例示的な実施形態をより具体的に例示するものである。本出願の全体にわたるいくつかの箇所で、実施例のリストを通じて指針が提供されるが、それらの実施例は、様々に組み合わせて使用することができる。いずれの場合も、記載される列挙は、あくまで代表的な群としてのみの役割を果たすものであって、排他的な列挙として解釈するべきではない。

これらの実施形態及び他の実施形態の更なる詳細を、添付の図面及び以下の説明文に記載する。他の特徴、目的、及び利点は、説明文及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかとなろう。

本開示による薄層培養装置の一実施形態の、部分的に切り欠いた上面図である。

本開示のいずれの実施形態が詳細に説明される前に、本発明は、以下の記述で説明される構成の詳細及び構成要素の配置の用途に限定されないことが理解される。本発明には他の実施形態が可能であり、本発明は様々な方法で実施又は実行することが可能である。また、本明細書で使用する語法及び専門用語は、説明を目的としたものであり、発明を限定するものとして見なされるべきでない点は理解されるべきである。「含む（including）」、「備える（comprising）」、又は「有する（having）」、及びこれらの変化形は、その後に列記される要素及びそれらの均等物、並びに更なる要素を包むものである。本開示の範囲から逸脱することなく、他の実施形態が利用されてもよく、構造的又は論理的な変更がなされてもよいことを理解すべきである。

本明細書で使用するときに、用語「かさ密度」、「ゆるみかさ密度」及び「見かけ密度」は、集塊されていない（untamped）かさ密度の値を互換的に指す。本明細書において言及されるかさ密度及び見かけ密度は、例えば、本願において実施例に記載される「ゆるみかさ密度」法などの集塊されていないかさ密度を測定するための一般的な方法により測定することができる。

本明細書で使用するときに、用語「集塊状粒子」は、一次粒子を一緒に連結又は結合されることにより形成される粒子であり、最終的な集塊形態においても元の密度が特定され得る粒子を指す。

本明細書において参照される全ての有効粒度（すなわち、「有効粒径」）は、米国規格基準局により設定される米国標準篩類仕様に基づくものである（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｒｅｃｌｏｔｈ．ｃｏｍ／ｈｏｗｔｏ／ｃｏｎｖｅｒｔ／ｕｓｓｉｅｖｅ．ｈｔｍｌを参照されたい）。したがって、例えば、約４００ミクロンの有効粒径を有する粒子は、４００ミクロンの目開径を有する４０メッシュスクリーンを通過し、３５４ミクロンの目開径を有する４５メッシュスクリーンにより捕捉される。

広くは、本開示は、水溶性粉末から作製された流動性乾燥集塊状粒子と、この集塊体の作製方法とに関する。いくつかの実施形態では、方法は、微生物の増殖を促進するための栄養培地に使用され得る。集塊状粒子が作製される少なくとも１つの粉末とは対照的に、並びにその他の集塊状粒子組成物とは対照的に、本発明の集塊状粒子群は、有利に２点の非常に望ましい特性を保有する：１）水性液体の表面上に集塊状粒子を注ぎ入れたときに、水性液体の表面下に、迅速（すなわち、即座又はほとんど即座）に、かつ実質的に定量的に沈み込むこと、並びに２）集塊状粒子が水性液体に迅速に溶解すること。理論に束縛されるものではないが、これらの非常に望ましい特性は、平均粒度、多孔性、表面積、密度及び／又は本開示により作製された集塊状粒子群に見られる前述の物理的特性のうち２つ以上の特有の組み合わせに由来するものと考えられている。したがって、一態様では、本開示は、手作業により又は機械的にわずかに撹拌することにより、あるいは撹拌を全くせずとも、水性液体に迅速に分散及び溶解する栄養培地を提供する。

したがって、本開示は、集塊状栄養培地の調製方法を提供し、集塊状培地は微生物の回復及び／又は増殖を促進させるのに好適なものであり、方法は、ｉ）粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することと、ｉｉ）集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることと、栄養培地組成物を形成することを含む。方法は、チャンバから組成物を回収することを更に含む。栄養培地組成物の形成後、組成物は、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に、非集塊状粉末状栄養分とを含み、粒子群は、約２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有する少なくとも約３０重量％の集塊状栄養粒子を含む。本開示の方法により、栄養成分（例えば、少なくとも１つの粉末状栄養分）は、微生物の増殖を促進する。

流動層における集塊液の適用及び粉末状栄養分の湿式集塊により、流動性の乾燥した栄養培地を作製するのに好適である集塊状粒子群がもたらされることが判明している。

本方法での使用に好適な装置としては、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ａｎｄ Ｍｉｓｈｒａ（「Ｆｌｕｉｄ Ｂｅｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ａｎｄ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．；２０１０；Ｖｏｌ．２，ｐｐ．２３６〜２４６、この文献は参照によりその全体が本願に援用される）により記載の流動層造粒装置が挙げられる。特に好適な装置としては、本願に記載の「頂部噴霧」及び「接線方向噴霧」式装置が挙げられる。

典型的には、頂部噴霧集塊プロセスでは、ある量（例えば、所定の体積）の粉末成分（例えば、１つ以上の粉末状栄養分）を造粒チャンバに装填する。粉末成分は、流動化ガス（例えば、空気、窒素）を粉末成分に通過させて、粉末成分の流動層を作製することにより流動化される。粉末が流動化される一方で、集塊液が集塊チャンバに噴霧され、流動化された粉末成分及び／又は集塊状栄養培地粒子と接触する。接触により、集塊液は、粉末成分粒子の表面の少なくとも一部分の被覆を形成し、この被覆が別の粉末粒子と接触して集塊状粒子を形成し得る。続いて及び／又は同時に、例えば、流動化ガスは集塊液の蒸発を促進して、集塊状粒子を乾燥させる。したがって、理論に束縛されるものではないが、集塊は、次の機序のうちの１つ以上を介し実施される：１）粒子表面上の固定化集塊液が２つ以上の粒子間に架橋（例えば、凝着及び凝集力により）を形成する、２）流動する集塊液（例えば、隣接する粒子間の界面張力及び／又は毛管力により移動）が２つ以上の粒子間に架橋を形成する、並びに３）乾燥中に、溶解した剤（例えば、集塊液が粒子表面に接触するにつれて集塊液に溶解する）が結晶化することにより、２つ以上の粒子間に固体架橋が形成される。

当業者であれば、採用される装置の大きさに依存して、集塊チャンバに装填された粉末組成物量、並びに流動化ガスの流速、及び集塊液の流速は変化し得ることは認識されるであろう。

本開示の方法は、集塊状栄養培地（例えば、乾燥湿潤集塊状栄養培地）を作製するために使用される。集塊状栄養培地は、微生物（例えば、細菌、酵母、カビ）の増殖を促進する微生物用集塊状栄養培地であってよい。本開示の方法は、流動層式集塊チャンバの粉末状栄養分を配置することを含む。粉末状栄養分は、微生物の増殖を支持する栄養成分を含む。任意の実施形態では、粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することは、所定の体積の粉末状栄養分を集塊チャンバに配置することを含み得る。栄養成分は、本明細書に記載の任意の好適な栄養成分であり得る。任意の実施形態では、栄養成分は、２つ以上の粉末状栄養分の実質的に均一な混合物を含み得る。

任意の実施形態では、本開示の方法は、集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることを含む。任意の実施形態では、粉末状栄養分を集塊液と接触させることは、粉末状栄養分（例えば、所定の体積の粉末状栄養分）を所定の体積の集塊液と接触させることを含み得る。当業者であれば、特定のプロセスパラメータ（例えば、粉末粒子の量、粒子の流動化、噴霧圧、集塊チャンバの温度、粉末状栄養分の体積に対する集塊液の体積の比、及び集塊液の流速）を調節して、粒子上に配置された集塊液を有する粒子間の接触増加を促進することにより、より大きな集塊の形成が促進されることを認識されるであろう。反対に、当業者であれば、これらの上記のパラメータを調節して、粒子上に配置された集塊液を有する粒子間の接触減少を促進することにより、より小さな集塊の形成が促進されることを認識されるであろう。具体的には、集塊液の噴霧圧は、集塊プロセスにより形成される組成物における、より小さな集塊（例えば、約１０５〜約４００ミクロン有効径）割合を増加するために増加され得る。

流動層に供給される流動化ガスは、通常空気であるが、集塊化させる粉末に対して不活性な任意の他のガス、例えば、窒素を使用することができる。流動化ガスは、一般的に、入口温度約０℃〜約１４０℃、好ましくは約２０℃〜約１４０℃で、集塊チャンバに（例えば、１つ以上の入りを介し）導入される。集塊チャンバに導入される流動化ガスが、例えば、約５０℃〜約１４０℃、好ましくは約５０℃〜約９０℃に加熱されていることは好ましいものであり得る。

任意の実施形態では、本開示による集塊状粒子の作製に使用される粉末原材料は、集塊液をチャンバに導入する前に、所定の時間（例えば、２０分）にわたって集塊チャンバ（例えば、室温）内で配合され得る。有利なことに、この配合工程は、集塊化させた際に各粉末原材料のより均一な混合物をもたらすことができ、本明細書に記載の実施例１１により明らかであるように、集塊状粒子において実質的な均一性をもたらし得る。

典型的には、流動化ガスは、集塊プロセス中に集塊チャンバを通過して排出される。したがって例えば、集塊チャンバは、典型的には、流動化ガスを集塊チャンバから排出させる１つ以上の排出口を有する。流動化ガスが集塊チャンバを通過するにつれ、集塊液の蒸発が生じ、流動化ガスの温度は低下する。したがって、任意の実施形態では、流動化ガスの温度は、集塊チャンバから排出されるときに、入り口の流動化ガス温度よりも低下し得る。任意の実施形態では、例えば、流動化ガスの温度は、集塊チャンバから排出されるときに、約３５℃〜約５０℃であり得る。

任意の実施形態では、集塊プロセスは、流動化ガスの入口温度を調節し、集塊液の噴霧速度を維持して、規定の温度範囲（例えば、約３５℃〜約５０℃）内に流動化ガス（例えば、集塊チャンバの噴霧帯内で）の第２温度を維持することができる。

集塊チャンバに導入される集塊液の量及び流速も、集塊液を、粉末状栄養分の湿塊に適切に適用するために重要なパラメータである。通常、集塊液は１つ以上のエアゾールノズルを介し組成物上に噴霧される。当業者であれば、液体流速は、例えば、ノズルにおける液圧を調節することにより調節できることを認識されるであろう。任意の実施形態では、例えば、液体の流速を調節して、流動化ガスの規定の排出温度を維持することができる。任意の実施形態では、集塊チャンバ粉末状栄養分（例えば、所定の体積の粉末状栄養分）を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることは、粉末状栄養分を所定の体積の集塊液と接触させることを含む。

任意選択的に、集塊チャンバからの除去後、集塊状栄養培地に対し好適な乾燥チャンバにおいて乾燥を行ってもよい。乾燥チャンバは、回分式に、又は連続式に操作することができ、及び任意選択的に、異なる温度で操作される２つ以上の独立調節式乾燥ゾーンに分離してもよい。任意の実施形態では、例えば、乾燥条件（例えば、温度、時間、及びガス流又は空気流）を選択して、予め選択された平均含水量及び／又は予め選択された含水量範囲を有する集塊状栄養培地粒子を作製することができる。

上記の任意の実施形態において、本開示の方法は、乾燥した集塊状栄養培地に対し、乾燥した集塊状栄養培地中の生菌数を減少させるプロセスを実施することを更に含み得る。任意の実施形態では、当該技術分野において既知の方法により生菌数を減少させるため、例えば、乾燥した集塊状栄養培地は、エチレンオキシド蒸気により処理することができる。エチレンオキシド蒸気による処理後、栄養培地を、エチレンオキシド処理した集塊状培地中に残存するエチレンオキシドを減少又は除去するために使用前に通気することができる。任意の実施形態では、例えば、乾燥した集塊状栄養培地は、当該技術分野で既知の方法により、生菌数を減少させるため、電離放射線（例えば、ガンマ線）又は紫外線源により処理することができる。乾燥集塊状培地は、参照によりその全体が本願に援用される米国特許第６，３８３，８１０号に記載の通りにγ線照射源に暴露することができる。

栄養成分
本開示の方法は、集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させる工程を含む。粉末状栄養分は、微生物（例えば、細菌、酵母、カビ）の増殖を促進する少なくとも１つの栄養成分を含む。任意の実施形態では、栄養成分は、微生物の増殖を促進する２つ以上の栄養分の混合物を含み得る。好適な栄養分の非限定例としては、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、又は多糖類）、タンパク質、タンパク質加水分解物、細胞抽出物（例えば、酵母エキス）、塩、緩衝剤成分、選択剤（例えば、抗生物質）、及び前述の栄養分のうち２つ以上の組み合わせが挙げられる。

任意の実施形態では、栄養成分は、実質的に乾燥した製剤（例えば、実質的に乾燥した粉末）であることができる。粉末培地は、典型的には、混合プロセス（例えば、ボールミリング）を介し培養培地の乾燥成分を混合することにより、あるいは予め作製した液体培養培地を凍結乾燥することにより作製される。本開示の方法で使用される栄養培地例は、例えば、３Ｍ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）、Ｏｘｏｉｄ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などの各種供給元から粉末として市販される緩衝化ペプトン水である。

本開示により集塊化され得る他の粉末状栄養分培地製剤としては、トリプチケースソイブロス、ラクトースブロス、ＵＶＭ改変リステリア増菌ブロス、緩衝化リステリア増菌ブロス、トリプチケースソイ酵母エキスブロス、ラパポート・バシリアディス（Rappaport-Vassiliadis）増菌ブロス、再水和したときにラパポート・バシリアディスＲ１０ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトシスチンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＥＣブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに栄養ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにレーゼンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＤｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに中和ブロスを形成する粉末混合物、セレナイトブロス、ブレインハートインフュージョンブロス、強度半分のデミフレイザーブロス、フレイザーブロス、デミフレイザーブロス、及びその他の微生物用栄養培地製剤が挙げられる。

流動層に供給される粉末原料は、典型的には、５〜２００ミクロンの範囲の平均粒径を有するものの、より大きな粒度（例えば、最大３００ミクロン、又は更には４００ミクロン）を有する粉末原料を使用できる。流動層に供給される粉末原料は、一般的に、乾燥重量基準で、少なくとも６０重量％の集塊状栄養培地を形成し、及び多くの場合、８０％超、最大で９５又は１００重量％の集塊状栄養培地を形成する。

集塊液
集塊液は、より小さな個々の栄養成分粒子（例えば、粉末粒子）の、より大きな集塊状粒子への集塊を促進するため、集塊チャンバに噴霧される。任意の実施形態では、集塊液は、水（例えば、滅菌及び／又は脱イオン水）を含み得る。任意の実施形態では、集塊液は、本質的に水（例えば、滅菌及び／又は脱イオン水）から構成され得る。任意の実施形態では、集塊液は、水（例えば、滅菌及び／又は脱イオン水）から構成され得る。任意の実施形態では、集塊液は、有機溶媒（例えば、エタノール、イソプロパノール）を含み得る。

任意の実施形態では、集塊液は、溶解した材料（例えば、以降に記載される通りの栄養分、栄養培地、及び／又は結合剤）を含み得る。任意の実施形態では、集塊液は、集塊チャンバに噴出されるときに、例えば、０°〜２０℃、最大で１００°又は１１０℃の温度であってよい。集塊液は溶解している材料（例えば、集塊を補助するためのもの）を全く含有しない場合、集塊液（例えば、水）を、例えば５０〜１１０℃に加熱することが好ましい。蒸気は、一般的に、集塊の促進においては少なくとも熱水と同程度に有効である。

任意選択的に、任意の実施形態では、栄養成分の集塊を促進するためには、結合剤、特に水溶性結合剤が有用であり得る。結合剤を（例えば、粉末などの実質的に乾燥した粒子の形態で）栄養成分に加えてもよく、あるいは結合剤を集塊液に溶解又は懸濁してもよい。

任意選択的に、任意の実施形態では、集塊液は、集塊状粒子の溶解（例えば、少なくとも部分的な溶解）を促進するため、湿潤剤（例えば、ＴＷＥＥＮなどの界面活性剤）を更に含み得る。

好適な結合剤の非限定的な例としては、生体適合性ポリマー（例えば、タンパク質、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、デキストリン、マルトデキストリン、微結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、デンプン、及び前述の任意のポリマーの生体適合性誘導体）及び糖類（例えば、デキストロース、フルクトース、グルコース、イノシトール、エリスリトール、イソマルト、ラクチトール、乳糖、マルチトール、マルトース、マニトール、ソルビトール、スクロース、タガトース、トレハロース、及びキシリトール）が挙げられる。任意の実施形態では、例えば、結合剤は、微生物の増殖を促進する任意の剤であってよい（例えば、完全培地又は少なくとも１つの栄養分を含有する希釈液）。例えば、緩衝化ペプトン水培地の集塊に好適な集塊液は、１〜５０重量％緩衝化ペプトン水溶液であってよく、かつ集塊状トリプチケースソイブロス培地に好適な集塊液は、１〜５０重量％トリプチケースソイ培地の水性溶液であってよい。

栄養分を含む組成物の結合剤濃度は、採用する個々の結合剤に応じて多様な範囲にわたって変化し得るものの、広くは約０．１％〜約４０％（重量／重量）、例えば、約０．２〜約３５％（重量／重量）、約０．３〜約３０％（重量／重量）、又は約０．４〜約２５％（重量／重量）、又は約０．４〜約２４．２％（重量／重量）である。ソルビトールの場合、濃度は、通常約２０〜３０％（重量／重量）であり、ソルビトール以外の糖アルコールの場合、その濃度は、通常、約３０〜約４０％（重量／重量）などのより高い範囲となる。

好ましくは、集塊液は水性培地である。結合剤が集塊液に含有される場合、集塊液は、結合剤を水に溶解することにより調整される。あるいは、結合剤は、乾燥形態で粉末と混合できる。

任意の実施形態では、集塊液は、微生物の増殖を促進する栄養培地を含み得る。例えば、一実施形態では、集塊液は、緩衝化ペプトン水ブロス（水、１０．０ｇ／Ｌペプトン、５．０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、９．０ｇ／Ｌオルトリン酸水素ニナトリウム１２Ｈ_２Ｏ、及び１．５ｇ／Ｌオルトリン酸二水素カリウム）を含み得る。

任意の方法の実施形態において、集塊液は、微生物の増殖を促進する少なくとも１つの溶解栄養分を含み得る。溶解される栄養分は、タンパク質（例えば、タンパク質、精製タンパク質、及び／又はタンパク質加水分解産物の混合物）を含み得る。一実施形態では、集塊液は、緩衝化ペプトン水を含む。

当業者であれば、少なくともいくつかのプロセス条件（例えば、プロセスに使用される栄養粉末量、プロセスに使用される集塊液量、集塊液の噴霧速度、及び／又は集塊チャンバ内の温度）は、本開示の方法により作製された、得られる集塊状栄養培地粒子の物理化学特性の１つ以上に影響を与え得ることを認識されるであろう。これらの物理化学特性としては、平均有効粒径、粒子の形状、平均粒子量、平均粒子含水率、有効粒径範囲、平均粒子量範囲、及び／又は粒子含水量範囲が挙げられるがこれに限定されない。１つの、又は任意の２つ以上の物理化学特性は、乾燥した集塊状栄養培地粒子の流体力学特性（例えば、水性液体への粒子の沈降速度、水性液体への粒子の分散速度）に影響し得る。

任意の実施形態では、本開示による方法は、平均有効粒径及び第１粒度分布範囲を有する乾燥した集塊状栄養培地の粒子群を生成する。任意の実施形態では、例えば、第１粒度分布範囲は、約１０５ミクロン〜約２０００ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子を含み得る。任意の実施形態では、例えば、第１粒度分布範囲は、約１０５ミクロン〜約１０００ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子を含み得る。

任意の実施形態では、本開示の方法を使用して作製される集塊状粒子の組成物は、集塊状粒子の少なくとも約７０重量％が約１０５ミクロン〜約８４１ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子群を含み得る。任意の実施形態では、例えば、本開示の方法を使用して作製される集塊状粒子は、集塊状粒子の１０重量％未満が１０５ミクロン以下の有効粒子径を有する、第１集塊状粒子群を含み得る。

任意の実施形態では、例えば、本開示による方法のためのプロセス条件は、本開示の方法により作製される組成物中の相対的に大きい（例えば、＞８４１ミクロンの有効粒径を有する）粒子の重量％を制限するよう選択できる。例えば、プロセスは、＞８４１ミクロンの有効粒径を有する粒子を４重量％未満有する集塊状粒子群を生成し得る。

任意の実施形態では、例えば、本開示による方法のためのプロセス条件は、包括的に、４００〜８４１ミクロンの有効粒径を有する粒子群が豊富になるよう選択できる。例えば、プロセス条件は、包括的に、４００〜８４１ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子を約１．５重量％〜約４０重量％有する集塊状粒子群が生成されるよう選択できる。

任意の実施形態では、例えば、本開示による方法のためのプロセス条件は、包括的に、２５０〜４００ミクロンの有効粒径を有する粒子群が豊富になるよう選択できる。例えば、プロセス条件は、包括的に、２５０〜４００ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子を約３５重量％〜約５５重量％有する集塊状粒子群が生成されるよう選択できる。

任意の実施形態では、例えば、本開示による方法のためのプロセス条件は、包括的に、１０５〜２５０ミクロンの有効粒径を有する粒子群が豊富になるよう選択できる。例えば、プロセス条件は、包括的に、１０５〜２５０ミクロンの有効粒径を有する集塊状粒子を約１５重量％〜約５５重量％有する集塊状粒子群が生成されるよう選択できる。

任意の実施形態では、例えば、本開示による方法のためのプロセス条件は、本開示の方法により作製される組成物中の相対的に小さい（例えば、＜１０５ミクロンの有効粒径を有する）粒子の重量％を制限するよう選択できる。例えば、プロセスは、＜１０５ミクロンの有効粒径を有する粒子を５重量％未満有する集塊状粒子群を生成し得る。いくつかの実施形態では、例えば、プロセスは、集塊状粒子群＜１０５ミクロンの有効粒径を有する粒子を１重量％実案有する集塊状粒子群を生成し得る。

したがって、好ましい実施形態では、本開示による方法のためのプロセス条件は、＞８４１ミクロンの有効粒径を有する粒子を約０〜４重量％有する、包括的に、４００〜８４１ミクロンの有効粒径を有する粒子を約１．５〜４０重量％有する、包括的に、２５０〜４００ミクロンの有効粒径を有する粒子を約３５〜５０重量％有する、包括的に、１０５〜２５０ミクロンの有効粒径を有する粒子を約１５〜５５重量％有する、及び包括的に、＜１０５ミクロンの有効粒径を有する粒子を＜５重量％有する、集塊状粒子群が生成されるよう選択できる。

任意の実施形態では、例えば、方法は、乾燥した集塊状栄養培地粒子の分集団を単離することを更に含むことができ、分集団は、予め選択された平均有効粒径を有し、及び／又は第２粒度分布範囲内に該当する有効粒径を有する。分集団は、当該技術分野において既知の、粒度選別法（例えば、規定の有効粒径を有する粒子を保持又は通過させ得る篩を使用）を使用して単離できる。任意の実施形態では、分集団は、包括的に、約１０５ミクロン〜約８４１ミクロンの平均粒径を有する集塊状粒子を含有し得る。任意の実施形態では、分集団は、包括的に、約１０５ミクロン〜約４００ミクロンの平均粒径を有する集塊状粒子を含有し得る。任意の実施形態では、分集団は、包括的に、約１２５ミクロン〜約４００ミクロンの平均粒径を有する集塊状粒子を含有し得る。任意の実施形態では、分集団は、包括的に、約１５０ミクロン〜約２５０ミクロンの平均粒径を有する集塊状粒子を含有し得る。

他の態様では、本開示は、組成物も提供する。組成物は、流動性の集塊状栄養培地を含む。組成物は、本願で開示される任意の実施形態を使用して作製され得る。組成物を使用して、サンプル（例えば、臨床検体、環境サンプル、食品サンプル、飲料サンプル、水サンプル）中の微生物の回復及び／又は増殖を促進する栄養培地を作製する。更に、微生物を培養するための物品に組成物を使用することができる。

有利なことに、本開示の組成物は、流動性であり（例えば、１つの容器から別の容器に注ぎ入れることができる）、塵埃を実質的に不含有であり（例えば、集塊状培地が作製される栄養分はより小さい粒子となる）、少なくとも１種の水溶性粉末を含有する実質的に乾燥した出発原料から集塊状培地が作製されるときに、集塊状培地は出発原料よりも大幅に迅速に水に溶解し得る。

任意の方法の実施形態において例えば、組成物の乾燥した集塊状栄養培地粒子は、水性溶媒への組成物の分散及び溶解を促進する、選択された平均含水量（例えば、水の重量％として表される）を有し得る。平均含水量は、例えば、カール・フィッシャー滴定法を使用し測定され得る。任意の実施形態では、例えば、水の平均重量％は、約５重量％未満となるよう予め選択できる。任意の実施形態では、例えば、水の平均重量％は、約３重量％以下となるよう予め選択できる。当業者であれば、平均含水量は、例えば、集塊状粒子の湿塊をもたらすのに使用される水分量を調節することにより及び／又は集塊プロセス中及び／又は後の乾燥条件を調節することにより調節できることは認識されるであろう。

任意の方法の実施形態において例えば、乾燥した集塊状栄養培地粒子は、水性溶媒への集塊状粒子の分散を促進するゆるみかさ密度を有し得る。乾燥した集塊状栄養培地粒子のゆるみかさ密度は、平均密度を算出するため、例えば、所定の体積（例えば、２０ｍＬ）の粒子を５０ｍＬメスシリンダーに注ぎ入れ、重力により一箇所に集められた（gravity-packed）粒子の体積を測定することにより、測定できる。任意の実施形態では、例えば、ゆるみかさ密度は、１立方ｃｍ当たり約０．２ｇ〜約０．５ｇとなり得る。

有利なことに、本開示の組成物は、水性溶媒に迅速に分散及び溶解する。脱イオン水１００ｍＬを入れた容器に、２．５５ｇ〜４．４４ｇの、乾燥した、集塊状栄養培地（例えば、緩衝化ペプトン水、トリプチケースソイブロス又は改変リステリア菌回復培地を作製するために使用される、乾燥した、集塊状栄養培地）を注ぎ入れて、撹拌せずに室温で容器を保持し、溶解時間を測定したときに、乾燥した、集塊化した培地は５分未満で溶解できる。いくつかの実施形態では、例えば、乾燥集塊状培地は４分未満で溶解することができる。いくつかの実施形態では、例えば、乾燥集塊状培地は３分未満で溶解することができる。いくつかの実施形態では、例えば、乾燥集塊状培地は２分未満で溶解することができる。いくつかの実施形態では、例えば、乾燥集塊状培地は１分未満で溶解することができる。

本開示は栄養培地の集塊状粒子の組成物の溶解時間を、プロセス条件を調節することにより、及び／又は任意選択的な単離プロセス（例えば、篩分け）を使用することにより選択して、特定の有効粒径を有する組成物を得ることができることを示す。例えば、包括的に４００〜８４１ミクロンの有効粒径を有する、集塊化した緩衝化ペプトン水培地は、実施例８に示す通り約９０〜１２０秒で室温の水に溶解でき、包括的に２５０〜４００ミクロンの有効粒径を有する、集塊化した緩衝化ペプトン水培地は、実施例８に示す通り約３０秒で室温の水に溶解でき、包括的に１０５〜２５０ミクロンの有効粒径を有する、集塊化した緩衝化ペプトン水培地は、実施例８に示す通り約１５秒で室温の水に溶解でき、並びに、＜１０５ミクロンの有効粒径を有する、集塊化した緩衝化ペプトン水培地は、実施例８に示す通り約９０〜１２０秒で室温の水に溶解でき、集塊状ＢＰＷ栄養培地を作製するために混合粉末を使用するときに、室温の水への溶解に必要とされる時間は＞１０分である。

好ましい実施形態では、本開示の組成物は、回復培地（すなわち、微生物を化学的及び／又は環境ストレスから回復させるために使用できる水性培地）を再形成できる粉末から作製される。いくつかの実施形態では、例えば、回復培地は微生物の培養（例えば、増殖）に使用できる。別の方法としては、又はそれに加えて、回復培地は希釈液として使用できる。ストレスを受けた微生物の回復及び／又は増殖の促進に特に好ましい回復培地は、緩衝化ペプトン水（ＢＰＷ）培地であり、この培地は、タンパク質加水分解物、塩、及びリン酸緩衝系を含み、ｐＨ ７．２に調整される。特定量の、集塊状ＢＰＷ培地は、本願の実施例に示す通り、わずか１５秒で溶解できる。

任意の実施形態では、本開示による集塊状栄養培地の組成物を使用して、当業者に既知の方法によるカプセル剤、錠剤、又はサシェを作製できる。有利なことに、カプセル剤、錠剤、又はサシェは、組成物を水和させて、栄養培地を再形成する容器に所定の体積（例えば、「１回用量」）の組成物を送達するための一般的な手法を提供できる。

更に別の態様では、本開示は、微生物を培養するための物品を提供する。本開示による物品の非限定例は、米国特許第４，５６５，７８３号及び米国特許第５，０８９，４１３号に記載の粉末被覆された装置に類似する薄膜式培養装置である（これらの文献は参照によりその全体が本願に援用される）。本開示の乾燥した集塊状栄養培地は、粉末状栄養分の代わりに薄膜式培養装置に使用できる。

図１は、本開示による薄膜式培養装置の一実施形態を示す。培養器具１０は、上面及び下面を有する自己支持型防水基材１２を備える本体部材を含む。基質１２は好ましくは、水を吸着しないか又は他の方法で水による影響を受けないポリエステル、ポリプロピレン、又はポリスチレン等の材料の比較的剛性のフィルムである。厚さ約０．００４〜０．００７インチ（０．１〜０．１８ｍｍ）のポリエステルフィルム、厚さ約０．００４〜０．００８インチ（０．１〜０．２ｍｍ）のポリプロピレンフィルム、及び厚さ約０．０１５インチ（０．３８ｍｍ）のポリスチレンフィルムは、良好に機能することが判明している。他の好適な基材には、ポリエチレン又は他の耐水性コーティングを有する紙が挙げられる。好適なポリエチレンコーティング紙基材の例は、「Ｓｃｈｏｅｌｌｅｒ Ｔｙｐｅ ＭＩＬ」写真印画紙（Ｐｕｌａｓｋｉ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹから入手可能）である。基質１２は、使用者が細菌コロニーを基質を介して視察することを望むか否かによって、透明又は不透明のどちらかであり得る。細菌コロニーの計数を容易にするため、基材１２は、好ましくは、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号に記載の通りの格子模様の印刷を基材上に有する。

基材１２は、その上面が接着剤層１４によってコーティングされており、接着剤層１４は、容易な水和のため、均一の単層中に乾燥ゲル化剤及び／又栄養素を保持するよう提供される。接着剤１４は、非水溶性であり、微生物の増殖を阻害しないものでなければならない。好ましくは、接着剤は、濡れたときに、接着剤でコーティングされたフィルムを通して細菌コロニーを見ることができるように、十分に透明である。接着剤１４は、感圧性であることが好ましい。しかしながら、より融点の低い物質がより融点の高い基材上にコーティングされている熱活性化接着剤を用いてもよい。ゴム糊等の水活性化接着剤も有用である場合がある。

接着剤１４は、好ましくは粉末化されたゲル化剤及び／又は栄養素の粒子の直径未満の厚さで基質１２上に被覆されるべきである。目的は、粒子を基質に接着させるために十分な接着剤を塗布することであるが、あまり接着剤が多いと粒子が完全に接着剤に埋め込まれてしまう。粉末１６の均一な単層は、水和のために露出される十分な表面積を有することが所望される。概して、０．０００２〜０．０００５インチ（０．００５１〜０．０１２７ｍｍ）の範囲の厚さの接着層が好適である。本開示の乾燥した集塊状栄養培地は、例えば、米国特許第４，５６５，７８３号に記載の通り、接着層上に被覆できる。

本体部材のスペーサー１８の一端に取り付けられているのは、任意選択的なカバーシート２２である。カバーシート２２は、好ましくは、細菌コロニーの数え上げを促進するために透明であり、細菌及び水蒸気に対して実質的に不透過性である。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「細菌及び水蒸気に対して実質的に不透過性」は、装置の保管及び使用中の、脱水化された培地の望ましくない汚染を防止する、並びにインキュベーション期間に微生物の増殖を助ける環境を提供する、カバーシートを指す。一般的に、カバーシート１２は、基材と同一の特性を有するが、同じくらい剛性である必要はない。

図１に図示した実施形態は装置に取り付けられたカバーシート２２を有するが、本発明の範囲内で、保存及びインキュベートの間、粉末を含む実施形態が覆われずに単純に無菌環境に配置され得ることも予期される。任意選択的に、カバーシート２２は、接着層（不記載）及び粉末（不記載）層を更に含み得る。カバーシートに取り付けられる接着剤及び粉末は、上記の粘着剤１４及び粉末１６と類似する（又は同一の）特性及び／又は組成を有することができ、適用接着剤１４及び粉末１６が基材１２に適用されるのと同様の方法でカバーシートに適用できる。

別の一態様において、本開示はキットを提供する。キットには、本明細書に記載の乾燥した集塊状栄養培地を含む任意の組成物を含有させることができる。任意の実施形態では、キットは、乾燥した集塊状栄養培地を使用するための指示書を含有してよい。任意の実施形態では、キットは、サンプルの獲得、サンプルの加工、及び／又は微生物の培養のための物品を更に含み得る。物品は、袋、ボトル、サンプル捕捉装置（例えば、ピペット、綿棒、スポンジ）、及び前述の物品の内の任意の２つ以上の組み合わせからなる群から選択できる。

上記の任意の実施形態において、キットは、別の種類の微生物よりもある一種の微生物の増殖に望ましい選択剤（例えば、抗生物質）を更に含み得る。任意の実施形態では、例えば、選択剤は、溶液で、又は実質的に乾燥形態で提供され得る。任意の実施形態では、例えば、選択剤は、所定の体積のサンプルに添加できる１回量形態（例えば、錠剤、チューブ、又はアンプル）で提供される。

任意の実施形態では、キットは、サンプル中の微生物の存在又は非存在を検出するのに使用される指示薬を更に含み得る。好適な指示薬としては、例えば、ｐＨ指示薬（例えば、フェノールレッド、クロロフェノールレッド、メチルレッド、ニュートラルレッド、ブロモチモールブルー、ブロモクレゾールパープル）、酸化還元指示薬（例えば、トリフェニルテトラゾリウムクロリド、メチレンブルー）、色素生成性酵素基質（例えば、グリコシダーゼ酵素活性、脱リン酸化酵素活性、リパーゼ酵素活性、又はアミノペプチダーゼ酵素活性を検出するための色素生成性酵素基質）、又は発蛍光性酵素基質（例えば、グリコシダーゼ酵素活性、脱リン酸化酵素活性、リパーゼ酵素活性、又はアミノペプチダーゼ酵素活性を検出するための発蛍光性酵素基質）が挙げられる。

上記の任意の実施形態において、キットは、所定の体積の乾燥した集塊状栄養培地を含む包装を含み得る。任意の実施形態では、例えば、所定の体積は、所定の体積（例えば、９．９ｍＬ、１０ｍＬ、９０ｍＬ、９９ｍＬ、１００ｍＬ、２２５ｍＬ、１．０Ｌ、又は３．３７５Ｌ）の水性希釈剤と混合して、微生物の増殖を促進することのできる培地を再形成させるのに十分な量であり得る。任意の実施形態では、例えば、所定の体積の組成物は、カプセル剤、錠剤、又は佐サシェの形態でキットに提供され得る。

本開示の方法、組成物、物品、及びキットの特定の実施形態は、以降の一連の実施形態で説明される。

実施形態
実施形態Ａは、流動性の集塊状栄養培地を作製するための方法であり、方法は、
微生物の増殖を促進する栄養成分を含む粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することと、
流動化ガスをチャンバに貫流することと、
集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることにより栄養培地組成物を生成する工程、及び、
チャンバから組成物を回収する工程、を含み、
組成物は、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に、非集塊状粉末状栄養分を含み、
粒子群は少なくとも約３０重量％集塊状栄養粒子約２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有する。

実施形態Ｂは、粒子群中の少なくとも約７０重量％の粒子が約１０５〜８４１ミクロンの有効粒子径を有する、実施形態Ａの方法である。

実施形態Ｃは、粒子群中の１０重量％未満の粒子が１０５ミクロン以下の有効粒子径を有する、実施形態Ａ又は実施形態Ｂの方法である。

実施形態Ｄは、集塊状栄養培地粒子の分集団を単離することを更に含み、分集団が規定の有効粒子径を有する、実施形態Ａ〜Ｃのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｅは、分集団を単離することが、約１４９ミクロン〜約８４１ミクロンの有効粒子径を有する分集団を単離することを含む、実施形態Ｄの方法である。

実施形態Ｆは、集塊液が水から構成される、実施形態Ａ〜Ｅのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｇは、集塊液が、溶媒と、溶媒に溶解した結合剤及び／又は微生物の増殖を促進する栄養分を含む、実施形態Ａ〜Ｅのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｈは、粉末状栄養分が、２つ以上の粉末状栄養分の実質的に均一な混合物を含む、実施形態Ｇの方法である。

実施形態Ｉは、粉末状栄養分を配置することが、所定の体積の粉末状栄養分を配置することを含む、実施形態Ａ〜Ｈのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｊは、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることが、粉末状栄養分を所定の体積の集塊液と接触させることを含む、実施形態Ａ〜Ｉのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｋは、集塊チャンバに入るときに、流動化ガスが第１温度を有し、流動化ガスの第１温度は約５０℃〜約９０℃である、実施形態Ａ〜Ｊのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｌは、集塊チャンバの噴霧ゾーンにおいて流動化ガスが第２温度を有し、流動化ガスの第２温度は約３５℃〜約５０℃である、実施形態Ｊに記載の方法である。

実施形態Ｍは、集塊状栄養培地の粒子群が約５．５重量％以下の平均含水量を有する、実施形態Ａ〜Ｌのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｎは、集塊状栄養培地の粒子群が、１立方ｃｍ当たり約０．２〜約０．５ｇのゆるみかさ密度を有する、実施形態Ａ〜Ｍのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｏは、１つ以上の粉末状栄養分が、タンパク質加水分解物、炭水化物、塩、及び前述の粉末状栄養分のうちの任意の２つ以上の混合物からなる群から選択される栄養分を含む、実施形態Ａ〜Ｎのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｐは、乾燥した集塊状栄養培地に対し、乾燥した集塊状栄養培地中の生菌数を減少させるプロセスを実施する工程を更に含む、実施形態Ａ〜Ｏのいずれかに記載の方法である。

実施形態Ｑは、乾燥した集塊状栄養培地に対し生菌数を減少させるプロセスを実施することが、乾燥した集塊状栄養培地を電離放射又はエチレンオキシド蒸気に曝露することを含む、実施形態Ｐに記載の方法である。

実施形態Ｒは、実施形態Ａ〜Ｑのいずれか１つに記載の方法であり、粉末状栄養分は、再水和したときに緩衝化されたペプトン水培地を形成する粉末混合物、再水和したときにトリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、及び再水和したときにラクトースブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＵＶＭ改変リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに緩衝化リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに酵母エキス添加トリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディス増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディスＲ１０ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトシスチンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＥＣブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに栄養ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにレーゼンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＤｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにブレインハートインフュージョンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに強度半分のデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにフレイザーブロスを形成する粉末混合物、並びに再水和したときにデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、からなる群から選択される。

実施形態Ｓは、実施形態Ａ〜Ｒのいずれかに記載の方法により作製された、流動性の乾燥した集塊状栄養培地を含む、組成物である。

実施形態Ｔは、特定量の、乾燥した集塊状栄養培地が、集塊状栄養培地が作製されるものと等量の粉末状栄養分と比較して、より迅速に水性溶媒に溶解する、実施形態Ｓに記載の組成物である。

実施形態Ｕは、水性媒質と組み合わせた場合に微生物の増殖を促進する混合物を形成する集塊状粒子を含む集塊状栄養培地を含む組成物であり、粒子群中少なくとも約３０重量％の粒子は、約２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有し、粒子のかさ密度は、１立方ｃｍ当たり約０．２〜約０．５ｇである。

実施形態Ｖは、粒子群中少なくとも約７０重量％の粒子が約１０５〜８４１ミクロンの有効粒子径を有する、実施形態Ｕの組成物である。

実施形態Ｗは、実施形態Ｕ又は実施形態Ｖの組成物であり、集塊状栄養培地は粉末状栄養分を含み、粉末状栄養分は、再水和したときに緩衝化されたペプトン水培地を形成する粉末混合物、再水和したときにトリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラクトースブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＵＶＭ改変リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに緩衝化リステリア増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに酵母エキス添加トリプチケースソイブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディス増菌ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにラパポート・バシリアディスＲ１０ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトシスチンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＥＣブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに栄養ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにレーゼンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにＤｅｙ／Ｅｎｇｌｅｙ中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに中和ブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにセレナイトブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにブレインハートインフュージョンブロスを形成する粉末混合物、再水和したときに強度半分のデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、再水和したときにフレイザーブロスを形成する粉末混合物、並びに再水和したときにデミフレイザーブロスを形成する粉末混合物、からなる群から選択される。

実施形態Ｘは、実施形態Ｓ〜Ｗのいずれかに記載の組成物を含むカプセル剤、錠剤、又はサシェである。

実施形態Ｙは、実施形態Ｓ〜Ｘのいずれかに記載のカプセル剤、錠剤、サシェ、及び／又は組成物を含むキットである。

実施形態Ｚは、組成物を、所定の体積の乾燥した集塊状栄養培地を含む包装内に配置することができ、所定の体積は、９．９ｍＬ、１０ｍＬ、９０ｍＬ、９９ｍＬ、１００ｍＬ、２２５ｍＬ、１．０Ｌ、又は３．３７５Ｌの水性希釈剤と混合することで、微生物の増殖を促進することのできる培地が再形成されるよう選択される、実施形態Ｙのキットである。

実施形態ＡＡは、袋、ボトル、及びサンプル捕捉装置からなる群から選択される物品を更に含む、実施形態Ｙ又は実施形態Ｚに記載のキットである。

実施形態ＢＢは、選択剤及び／又は指示薬を更に含む、Ｙ〜ＡＡのいずれか１つに記載のキットである。

実施形態ＣＣは、薄膜式培養装置であって、
第１及び第２主表面を有する自己支持性防水基材と、
第１主表面の少なくとも一部分上に配置された接着層と、
接着層の少なくとも一部分上に配置された実施形態Ｓ〜Ｗのいずれか１つに記載の組成物を含むコーティングと、
栄養培地により流動式に接触されるよう配置された乾燥型冷水溶解性ゲル化剤と、を含む、装置である。

実施形態ＤＤは、基材の少なくとも一部に連結させたカバーシートを更に含み、カバーシートが第一主表面に面する第一面を有する、実施形態ＣＣに記載の薄膜式培養装置である。

実施形態ＥＥは、ゲル化剤が、カバーシートの第１面に接着されている、実施形態ＤＤに記載の薄膜式培養装置である。

本発明の目的及び利点は、以下の実施例によって更に例示されるが、これらの実施例において列挙された特定の材料及びその量は、他の諸条件及び詳細と同様に本発明を過度に制限するものと解釈されるべきではない。

試験方法
集塊化したサンプルの粒度測定：
実施例１〜６及び実施例９のため、集塊化したサンプルを２０、４０、６０、及び１４０メッシュのスクリーンに通過させた。各スクリーニング手順に関し、スクリーンを通過しなかった材料画分を回収し、計量した。

ゆるみかさ密度：
サンプル物質を５０ｍＬメスシリンダーの２０ｍＬのメモリまで注ぎ入れた。加えた物質の正味重量を記録し、かつゆるみかさ密度を、サンプルの体積に対するサンプル重量（ｇ／ｍＬ）の比として求めた。各サンプルに関し、複数の測定値を得て、かさ密度を平均値として記録した。

溶解時間：
ＢＰＷ（ＩＳＯ）サンプルに関し、室温に維持した脱イオン水１００ｍＬを入れたガラス瓶（直径４ｃｍ）に、固体材料（２．５５ｇ）を１度に加えた。液体の撹拌は行わなかった。視認により測定したときに、サンプルが完全に溶解するまでにかかった時間を溶解時間として記録した。各サンプルに関し、複数の測定値を得て、溶解時間を平均値として記録した。

ＴＳＢに関してはサンプルを３．４ｇ使用し、ｍＬＲＢに関してはサンプルを４．４ｇ使用したことを除き、ＴＳＢ及びｍＬＲＢの集塊化したサンプルにも同一の手順を用いた。

湿分含量：
カール・フィッシャー解析によりサンプルの含水量（水％）を分析した。１０ｍＬ無水メタノール（Ａｖａｎｔｏｒ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｃｅｎｔｅｒ Ｖａｌｌｅｙ，ＰＡ）を入れたバイアルに０．１ｇのサンプル材料を入れ、試験サンプルを調製した。バイアルを密閉し、一晩乾燥ボックス内で保管した（窒素雰囲気下）。各サンプルに関し、バイアルは重複させて２つずつ調製した。各バイアルから抽出物のアリコート（０．１〜０．３ｇ）を回収し、モデル７５６ ＫＦ電量計（Ｍｅｔｒｏｈｍ ＡＧ，Ｈｅｒｉｓａｕ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に注入した。Ａｑｕａｓｔａｒ（登録商標）Ｃｏｕｌｏｍａｔ Ａ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を分析質として使用した。含水量の測定は各バイアル３回ずつ行った。試験サンプルは重複させて２つずつ調製したことから、各サンプルの測定値は、計６つずつ存在した。試験方法は、ＮＩＳＴ ＳＲＭ ２８９０ ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｈｙｄｒａｎａｌ（登録商標）Ｗａｔｅｒ Ｓｔａｎｄａｒｄ １．００（１．００１＋／−０．００３ｍｇ／ｇ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して標準化した。

（実施例１）
空気流を１３０Ｌ／分（ＬＰＭ）（２．２Ｌ／秒（Ｌ／ｓ））に設定し、６５℃の吸気温度を使用して予熱した、ＶＦＣ−Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水（ＩＳＯ）粉末（５０ｇ）を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝１２０ＬＰＭ（２Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝２６５ｍｂａｒ（２６５００Ｐａ）；初期入口温度＝６５℃；初期排気温度＝４１℃；フィルター・パルス＝１秒；初期ポンプ速度＝５ｒｐｍ。排気温度を３９〜４２℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。３０．１ｇの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４５℃に達するまで（約５〜１０分）流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した（表２）。２０〜１４０メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した（表３）。

（実施例２）
空気流を１３０Ｌ／分（ＬＰＭ）（２．２Ｌ／秒（Ｌ／ｓ））に設定し、６５℃の入り口温度を使用して予熱した、ＶＦＣ−Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水（ＩＳＯ）粉末（５０ｇ）を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付けた。５％（重量／体積）ＢＰＷ水溶液（脱イオン水）を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝１３１ＬＰＭ（２．２Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝３１５ｍｂａｒ（３１５００Ｐａ）；初期入口温度＝６５℃；初期排気温度＝４１℃；フィルター・パルス＝１秒；初期ポンプ速度＝５ｒｐｍ。排気温度を３９〜４２℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。２０．０ｇの５％ ＢＰＷ溶液の使用後、噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４５℃に達するまで（約５〜１０分）流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した（表４）。２０〜１４０メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度に関し試験した（表５）。

（実施例３）
５％（重量／体積）ＢＰＷ水溶液（脱イオン水）の代わりに、７．５％溶液を集塊液として使用したこと以外は、実施例２において記載されるのと同様の手順を行った。粒度分布を表６に掲載する。２０〜１４０メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度に関し試験した（表７）。

（実施例４）
空気流を１３０Ｌ／分（ＬＰＭ）（２．２Ｌ／ｓ）に設定し、６５℃の入り口温度を使用して予熱した、ＶＦＣ−Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）の集塊チャンバに、トリプチックソイブロス粉末（５０ｇ）を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝１７０ＬＰＭ（２．８Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝２５０ｍｂａｒ（２５０００Ｐａ）；初期入口温度＝６５℃；初期排気温度＝４１℃；フィルター・パルス＝１秒；初期ポンプ速度＝５ｒｐｍ。排気温度を３９〜４２℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。３０．０ｇの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４５℃に達するまで（約５〜１０分）流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した（表８）。２０〜１４０メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した（表９）。

（実施例５）
空気流を１３０Ｌ／分（ＬＰＭ）（２．２Ｌ／秒（Ｌ／ｓ））に設定し、６５℃の入り口温度を使用して予熱した、ＶＦＣ−Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）の集塊チャンバに、改変リステリア回復ブロス（５０ｇ）を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝１９０ＬＰＭ（３．２Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝２５０ｍｂａｒ（２５０００Ｐａ）；初期入口温度＝６５℃；初期排気温度＝４３℃；フィルター・パルス＝１秒；初期ポンプ速度＝５ｒｐｍ。排気温度を４０〜４３℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。３０．０ｇの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４５℃に達するまで（約５〜１０分）流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した（表１０）。２０〜１４０メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した（表１１）。

（実施例６）
室温に維持した脱イオン水１００ｍＬを入れた１５０ｍＬガラスビーカー（直径６ｃｍ）に、実施例１のＢＰＷ（ＩＳＯ）集塊生成物（２．５５ｇの２０〜１４０メッシュサンプル）を一度に手早く加えた。撹拌せずに３０秒間静置した後、ブフナー漏斗を使用し、Ｗｈａｔｍａｎ（商標）＃５４濾紙（直径５５ｍｍ）によりビーカーの内容物を真空濾過した。回収された固体材料を炉（６０℃）で３時間乾燥させた後、計量した。

粉末ＢＰＷ（ＩＳＯ）及び顆粒ＢＰＷ（ＩＳＯ）を使用して、同様の手順を実施した。実施例１のＢＰＷ（ＩＳＯ）の集塊生成物を、粉末ＢＰＷ（ＩＳＯ）及び顆粒ＢＰＷ（ＩＳＯ）と比較することにより得られる溶解効率を表１２に掲載する。

（実施例７）
室温に維持した脱イオン水５０ｍＬを入れた１５０ｍＬガラスビーカー（直径６ｃｍ）に、実施例５のトリプチックソイブロス（ＴＳＢ）集塊生成物（１．５ｇの２０〜１４０メッシュサンプル）を一度に手早く加えた。撹拌せずに３０秒間静置した後、ブフナー漏斗を使用し、Ｗｈａｔｍａｎ（商標）＃５４濾紙（直径５５ｍｍ）によりビーカーの内容物を真空濾過した。回収された固体材料を炉（６０℃）で３時間乾燥させた後、計量した。

集塊ＴＳＢ及び粉末ＴＳＢを使用して、同様の手順を示指した。実施例４のＴＳＢの集塊生成物を、粉末ＴＳＢ及び顆粒ＴＳＢと比較することにより得られる溶解効率を表１３に掲載する。

（実施例８）
空気流を６２ＬＰＭ（１Ｌ／ｓ）に設定し、７０℃の入り口温度を使用して予熱した、Ｖｅｃｔｏｒ ＦＬ−Ｍ−１ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｒｉｏｎ，ＩＡ）の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水（ＩＳＯ）粉末（１Ｋｇ）を装填した。流動層からの混入を防ぐため、標準的なボトム・スクリーンに加えて、２枚目に微細なオランダ織スクリーンメッシュを使用した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝１０８ＬＰＭ（１．８Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝８２７ｍｂａｒ（８２７００Ｐａ）；初期入口温度＝７０℃；初期排気温度＝４１℃；初期ポンプ速度＝８〜１０秒；フィルター・パルス＝１０〜２０秒。集塊プロセス中、排気温度はモニターし、入口温度及びポンプ速度を調節することにより３９〜４２℃に維持した。４５０ｇの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４３℃に達するまで（約５分）流動層で乾燥した。乾燥した、集塊化した生成物のゆるみかさ密度は０．４０ｇ／ｍＬであった。次に、乾燥した集塊化生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した（表１４）。集塊化した生成物、並びに篩分けにより調製された各種画分の溶解時間は、上記の試験法を用い求めた。結果を表１５に示す。

（実施例９）
上記の試験方法を使用し、以降の各材料の平均含水量（水％）を求めた：ＢＰＷ集塊（ＩＳＯ）材料（実施例１、２及び８由来）；ＴＳＢ集塊材料（実施例４由来）；ＢＰＷ（ＩＳＯ）粉末（３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから供給）；及びＴＳＢ粉末（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙから供給）。結果を表１６に示す。

（実施例１０）
実施例１のＢＰＷ集塊（ＩＳＯ）生成物（２０〜１４０メッシュサンプル２．５６ｇ）を蒸留水（１００ｍＬ）に希釈することにより培養培地ブロスを調製した。得られた溶液を、０．２ミクロンのＳｕｐｏｒ（登録商標）シリンジフィルタ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）により濾過滅菌した。溶液ｐＨは、約７．０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ф３５０ｐＨメーター）として測定した。アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から細菌株大腸菌（E. coli）０１５７：Ｈ７（ＡＴＣＣ ７００７２８）、大腸菌（E. coli）（ＡＴＣＣ ２５９２２）、腸炎菌（S. enteriditis）（ＡＴＣＣ１３０７６）、チフス菌（S. typhi）（ＡＴＣＣ１４０２８）、及び緑膿菌（P. aeruginosa）（ＡＴＣＣ ２７８５３）を得た。微生物の純粋培養物をトリプチックソイブロス（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に植菌し、３７℃で一晩インキュベートして、細菌懸濁液を調製した。次に、各細菌株懸濁物を、Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄ希釈剤（３Ｍ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）により濃度約１０^５ｃｆｕ／ｍＬに希釈した。

Ｆａｌｃｏｎ（商標）透明９６ウェルＭｉｃｒｏｔｅｓｔ（商標）プレート（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｃｏ．）を使用し、２５μＬの各細菌希釈液（１０５ｃｆｕ／ｍＬ）を２２５μＬ培養培地ブロスに添加した（各細菌株毎に４つずつ複製を作製した）。ＰｏｗｅｒＷａｖｅ（商標）Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）で、マイクロタイタープレートを、３７℃で２４時間インキュベートした。１時間間隔で吸光度（６４０ｎｍ）を測定し、各細菌株の増殖速度を求めた。各測定の前には５秒間マイクロタイタープレートを振盪した。各細菌株の吸光度読み取り値を表１７〜２１に掲載する。

培養培地ブロスの調製に、集塊状ＢＰＷ（ＩＳＯ）の代わりにＢＰＷ（ＩＳＯ）粉末（供給元３Ｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用したことを除き、上記のものと同様の手順を用い、比較目的のため各細菌株に対し同様の増殖試験を実施した。これらの試験の比較結果も表１７〜２１に示す。このデータは、集塊状ＢＰＷ培地を希釈した培地では、粉末ＢＰＷを希釈した培地とほぼ同程度の速さで各生物が増殖したことを意味する。

（実施例１１）
各成分から出発して、集塊化した緩衝化ペプトン水を作製した。全ての成分は粉末形態であった（粉末は、１００メッシュの篩を通過させるのに十分微細であった）。リン酸一カリウム（１５ｇ）、リン酸一水素二ナトリウム（３０ｇ）、塩化ナトリウム（５０ｇ）、ペプトン（Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）のものを１００ｇ）、及び追跡用色素のフェノールレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのものを０．６ｇ）を、ＶＦＣ−Ｌａｂ Ｍｉｃｒｏ Ｆｌｏ−Ｃｏａｔｅｒ（登録商標）（Ｆｒｅｕｎｄ−Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｒｉｏｎ、ＩＡ）の集塊チャンバに装填した。空気流は７０ＬＰＭ（１．２Ｌ／ｓ）とし、集塊チャンバ内で室温で２０分間材料を配合した。配合工程後、実施例１に記載のプロセスと類似の方法で材料を集塊化した。空気流の設定は９０ＬＰＭ（１．５Ｌ／ｓ）とし、入口温度８５℃を使用し、ユニットを加熱した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した：空気流＝９０ＬＰＭ（１．５Ｌ／ｓ）；噴出器ノズルの空気圧＝２６５ｍｂａｒ（２６５００Ｐａ）；初期入口温度＝８５℃；初期排気温度＝４５℃；フィルター・パルス＝１６ｒｐｍ；初期ポンプ速度＝１秒。集塊プロセス中、排気温度はモニターし、入口温度及びポンプ速度を調節することにより４２〜４５℃に維持した。５０ｇの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が４５℃に達するまで（約５〜１０分）流動層で乾燥した。集塊化した生成物を、集塊化した材料中の各成分の均一な分布について評価した。バルク材料から、３つのサンプル（１ｇ）をランダムに選択した。濃度０．１ｇ／ｍＬになるよう各サンプルを水に溶解させ、ＵＶ−可視分光光度計を使用して５５０ｎｍで吸光度を測定した。３つのサンプルの平均吸光度は０．５２０（標準偏差０．００９）であったことから、バルク生成物において各成分が均一に分布していることが示された。

（実施例１２）
実施例１の集塊方法により作製した、集塊化した生成物並びに篩分けにより作製された各種画分の溶解時間を、サンプルの吸光度に基づく試験方法を使用して求めた。５０ｍＬの脱イオン水（水温２３℃）を入れた１００ｍＬのビーカーを、手動式昇降台（垂直方向の様々な高さに昇降する装置）のプラットフォームに配置した。１６．５インチ（４１．９１ｃｍ）ステンレス鋼のバスケットシャフト（カタログ番号１１０１０−００６，ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒａｄｎｏｒ，ＰＡ）を備えるＩＫＡ ＲＷ ２０デジタル式オーバーヘッド・スターラー（ＩＫＡ Ｗｏｒｋｓ Ｉｎｃ．（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ））をビーカー上に配置した。集塊化した材料（２．０ｇ）を、注意深く１００メッシュ・ステンレス鋼バスケット（カタログ番号８９０４９−１８８，ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、シャフト上のバネ式クリップを使用して、バスケットをシャフト端部に取り付けた。４５０ｒｐｍで回転するよう回転シャフトを設定し、実験用昇降台を手早く上昇させて、回転バスケットの全てのメッシュ部分を水中に浸漬した（全サンプルが確実に水に浸漬されるようにした）。バスケットを水に接触させた瞬間から時間の記録を開始した。３０、６０、１２０、１８０、３００、及び６００秒の時点で、ビーカーからアリコート（５００μＬ）を分取した。各サンプルを、透明９６ウェルプレートのウェルに分注し、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ ＭＸマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ ＵＳ，Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ）により３１０ｎｍで吸光度測定を行った。溶解結果を表２２に掲載する。各時点での吸光度を、吸光度１．０で正規化したところ、各サンプルに関し測定される吸光度は最大であることが示された。

粉末ＢＰＷ（ＩＳＯ）及び顆粒ＢＰＷ（ＩＳＯ）を使用して、同様の手順を実施した。

(実施例１３)
室温に維持した脱イオン水１００ｍＬを入れた１５０ｍＬガラスビーカー（直径６ｃｍ）に、実施例１の手順を用い作製したＢＰＷ（ＩＳＯ）集塊生成物（２．５５ｇの２０〜１４０メッシュサンプル）を一度に手早く加えた。撹拌せずに３０秒間静置した後、予め計量したＷｈａｔｍａｎ（商標）＃５４濾紙（直径５５ｍｍ）を取り付けたブフナー漏斗を使用して、ビーカーの内容物を真空濾過した。５秒未満で真空濾過工程を完了した。回収された、集塊状ＢＰＷ（ＩＳＯ）生成物の入った濾紙を、注意深く漏斗から取り外し、炉（８０℃）で１５時間乾燥させ、乾燥機内で室温で冷却した。乾燥生成物と濾紙を計量し、その重量から濾紙の重量を減算して、未溶解の集塊状ＢＰＷ（ＩＳＯ）生成物の重量を求めた。

ＢＰＷ集塊（ＩＳＯ）生成物の更に６つの篩分け画分に、同様の手順を実施した（＜２０メッシュ、２０〜４０メッシュ、４０〜６０メッシュ、６０〜１００メッシュ、１００〜１４０メッシュ、及び＞１４０メッシュ）。粉末ＢＰＷ（ＩＳＯ）及び顆粒ＢＰＷ（ＩＳＯ）を使用して、同様の手順を実施した。ＢＰＷ（ＩＳＯ）の集塊生成物を、粉末ＢＰＷ（ＩＳＯ）及び顆粒ＢＰＷ（ＩＳＯ）と比較することにより得られる溶解効率を表２３に掲載する。

本明細書に引用する全ての特許、特許出願及び公開公報、並びに電子的に入手可能な資料の開示内容の全体を援用する。本出願の開示内容と本明細書に援用されるいずれかの文書の開示内容との間になんらかの矛盾が存在する場合には、本出願の開示内容が優先するものとする。上記の詳細な説明及び実施例は、あくまで理解を助ける明確さのために示したものである。これらによって不要な限定をするものと理解されるべきではない。本発明は、示され記載された厳密な詳細事項に限定されるべきではないが、それは当業者に対して明らかな変形が特許請求の範囲において規定された本発明の範囲に包含されるからである。

全ての見出しは、読者の利便性のためであり、指定のない限り、その見出しに続く本文の意味を限定するために使用するべきではない。

本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な改変を行うことが可能である。これら及び他の実施形態は以下の「特許請求の範囲」に含まれる。

Claims (1)

1. 流動性の集塊状栄養培地を作製するための方法であって、
   微生物の増殖を促進する栄養成分を含む粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することと、流動化ガスをチャンバに貫流することと、前記集塊チャンバ内で、前記粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることと、により、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に非集塊状粉末状栄養分とを含む栄養培地組成物を生成する工程、
   前記チャンバから前記組成物を回収する工程、及び
   前記組成物から集塊状栄養培地粒子の分集団を単離する工程
   を含み、
   前記集塊状栄養培地の粒子群は、２５０〜４００ミクロンの有効粒子径を有する集塊状栄養粒子を、少なくとも３０重量％の量で含み、
   前記集塊状栄養培地粒子の分集団は、１０５ミクロン〜８４１ミクロンの有効粒子径を有する、方法。

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