KR20150038573A - 응집 미생물 배지의 제조 방법 및 이의 조성물 - Google Patents

응집 미생물 배지의 제조 방법 및 이의 조성물 Download PDF

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KR20150038573A
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쓰리엠 이노베이티브 프로퍼티즈 컴파니
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Abstract

유동성 응집 영양 배지를 제조하는 방법이 제공된다. 본 방법은 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계, 유동화 가스를 챔버를 통해 유동시키는 단계, 및 응집 챔버 내에서, 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계에 의해 영양 배지 조성물을 형성하는 단계; 및 조성물을 챔버로부터 수집하는 단계를 포함한다. 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진한다. 본 방법에 의해 형성되는 조성물은 응집 영양 배지 입자들의 집단 및 선택적으로 비응집 분말형 영양소를 포함한다. 집단은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터인 응집된 영양소 입자들을 약 30 중량% 이상 포함한다. 건조된 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물, 박막 배양 장치 및 키트가 또한 제공된다.

Description

응집 미생물 배지의 제조 방법 및 이의 조성물{METHOD OF MAKING AGGLOMERATED MICROBIOLOGICAL MEDIA AND COMPOSITIONS THEREOF}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2012년 8월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/680,449호 및 2013년 3월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/773,852호의 이익을 주장하며, 이들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
영양 배지 제형은 동물, 식물 및 미생물 세포를 포함하는 다수의 세포 유형의 배양에 사용되어 왔다. 배양 배지에서 배양된 세포는 이용가능한 영양소를 이화시키며, 유용한 생물학적 물질, 예컨대 단클론 항체, 호르몬, 성장 인자, 바이러스 등을 생성한다. 그러한 생성물은 치료적 응용을 가지며, 재조합 DNA 기술의 출현으로, 세포는 다량의 이들 생성물을 생성하도록 엔지니어링될(engineered) 수 있다. 따라서, 시험관 내에서 세포를 배양하는 능력은 세포 생리학의 연구에 중요할 뿐만 아니라, 비용-효과적인 수단에 의해서는 달리 수득될 수 없는 유용한 물질의 생성에 필요하다.
미생물 배양 배지의 전형적인 성분은 단백질 가수분해물, 무기 염, 비타민, 미량 금속, 및 탄수화물을 포함할 수 있으며, 이의 유형 및 양은 주어진 미생물 종의 특정 요건에 따라 달라질 수 있다. 이들 성분은 탈수 형태에서 더 안정한 경향이 있기 때문에, 상기 성분은 빈번하게는 건조 분말형 제형으로 제공된다. 분말형 제형은 물에 첨가되며, 선택적으로, 사용 전에 살균된다.
전형적으로 배양 배지는 액체 형태 또는 분말형 형태로 생성된다. 이들 형태 각각은 특별한 이점 및 불리한 점을 갖는다.
예를 들어, 액체 배양 배지는 이것이 (영양소 또는 다른 성분에 의한 보충이 필요하지 않다면) 즉시 사용가능한 것으로 제공되고 제형은 특정 세포 유형용으로 최적화되었다는 이점을 갖는다. 그러나, 액체 배지는, 특정 미생물의 배양에 있어서 최적 성능을 위하여 보충제 (예를 들어, 비타민 또는 보조 인자, 및 항생제)의 첨가를 요구할 수 있다는 불리한 점을 갖는다. 더욱이, 대부분의 액체 배지는 일부 유형의 살균 (예를 들어, 오토클레이빙(autoclaving), 여과)을 요구하며, 이는 시간 소비적이고/이거나 고가인 공정일 수 있다.
상기 불리한 점들 중 일부를 극복하기 위하여, 액체 배양 배지는 농축된 형태로 제조될 수 있으며; 상기 농축물은 사용 전에 작업 농도(working concentration)로 희석될 수 있다. 이러한 접근법은 표준 배양 배지보다 더 큰 그리고 더 가변적인 배치(batch) 크기의 가능성을 제공하며, 농축 배지 제형 또는 이의 성분은 흔히 더 긴 보관 수명을 갖는다. 미국 특허 제5,474,931호는 배양 배지 농축 기술에 관한 것이며, 이는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 그러나, 이들 이점에도 불구하고, 농축 액체 배지는 이것이 보충제의 첨가를 필요로 한다는 불리한 점을 여전히 가지며, 경제적으로 살균하는 것이 어려울 수 있다.
액체 배지에 대한 대안으로서, 분말형 배양 배지가 흔히 사용된다. 이러한 접근법은 더 큰 배치 크기가 생성될 수 있고, 분말형 배지가 전형적으로 액체 배지보다 더 긴 보관 수명을 갖고, 배지가 제형화 후 조사 (예를 들어, 감마 또는 자외 방사선) 또는 에틸렌 옥사이드 침투에 의해 살균될 수 있다는 이점을 갖는다. 그러나, 분말형 배지는 몇몇 불리한 점을 갖는다. 예를 들어, 분말형 배지의 일부 성분은 동결 건조시에 불용성으로 되거나 응집체로 되어서 재가용화가 어렵거나 불가능해진다. 더욱이, 전형적으로 분말형 배지는 미세 분진 입자를 포함하며, 상기 입자는 배지가 물질의 일부 손실 없이 이전되고/되거나 재구성되는 것을 특히 어려워지게 할 수 있고, 추가로, 배지가 일부 환경에서 사용하기에 비실용적이게 할 수 있다.
재수화성 배지에 있어서의 진보에도 불구하고, 영양적으로 복합적인 안정한 건조 분말 영양 배지 및 배지 보충제를 빠르게 용해시킬 필요성이 여전히 존재하는데, 이는 가변성 벌크(bulk) 양으로 제조될 수 있고 살균될 수 있다.
일반적으로 본 발명은 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진하는 데 사용되는 영양 배지에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 1가지 이상의 분말형 영양 성분을 응집시켜 건조된 응집 영양 배지(agglomerated nutrient medium)를 생성하는 방법을 제공한다. 본 방법은 선택된 화학 조성, 크기, 밀도, 물 함량, 또는 전술한 특성들 중 임의의 2가지 이상의 조합을 갖는 응집된 입자를 제공하는 공정 조건을 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 방법에 따라 제조된 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다. 다른 태양에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 임의의 건조된 응집 영양 조성물을 포함하는 물품 및 키트를 제공한다.
유리하게는, 본 발명의 조성물은 수성 용매에 의한 입자의 표면의 습윤을 촉진하는 화학 조성을 갖는다. 더 유리하게는, 본 발명의 조성물은 수성 용매 중 입자의 침잠(submersion)을 촉진하도록 선택되는 밀도 (예를 들어, 벌크 밀도(bulk density))를 갖는다. 더욱 더 유리하게는, 본 발명의 건조된 응집 영양 배지는 수성 용매 중 입자의 빠른 용해를 촉진하도록 선택되는 입자 크기 분포를 갖는다.
일 태양에서, 본 발명은 유동성(flowable) 응집 영양 배지의 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 분말형 영양소를 유동층형(fluidized bed-type) 응집 챔버에 넣는 단계, 유동화 가스를 챔버를 통해 유동시키는 단계, 및 응집 챔버 내에서, 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계에 의해 영양 배지 조성물을 형성하는 단계; 및 조성물을 챔버로부터 수집하는 단계를 포함하며; 조성물은 응집 영양 배지 입자들의 집단 및 선택적으로 비응집 분말형 영양소를 포함하고, 집단은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터인 응집 영양소 입자들을 약 30 중량% 이상 포함한다. 분말형 영양소는 미생물의 성장을 촉진하는 영양 성분을 포함한다. 본 방법의 임의의 실시 형태에서, 집단 내의 입자들 중 약 70 중량% 이상은 유효 입자 직경이 약 105 내지 841 마이크로미터일 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 집단 내의 입자들 중 10 중량% 미만은 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 이하일 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 본 방법은 응집 영양 배지 입자들의 하위집단(subpopulation)을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 하위집단은 사전결정된 유효 입자 직경을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 하위집단을 단리하는 단계는 유효 입자 직경이 약 149 마이크로미터 내지 약 841 마이크로미터인 하위집단을 단리하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 결합제 및/또는 미생물의 성장을 촉진하는 영양소가 용해된 용매를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 분말형 영양소를 넣는 단계는 사전결정된 질량의 분말형 영양소를 넣는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계는 분말형 영양소를 사전결정된 부피의 응집 액체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 응집 영양 배지 입자들의 집단은 평균 수분 함량이 약 5.5 중량% 이하일 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 응집 영양 배지 입자들의 집단은 루스 벌크 밀도(loose bulk density)가 약 0.2 내지 약 0.5 g/㎤일 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 1가지 이상의 분말형 영양소는 단백질 가수분해물, 탄수화물, 염, 및 이들의 임의의 2가지 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 영양소를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 본 방법은 건조된 응집 영양 배지에 대해, 건조된 응집 영양 배지 중의 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 건조된 응집 영양 배지에 대해, 건조된 응집 영양 배지 중의 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계는 건조된 응집 영양 배지를 이온화 방사선에 또는 에틸렌 옥사이드 증기에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 분말형 영양소는, 재수화될 때, 완충 펩톤수(buffered peptone water; BPW) 배지를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 브로쓰(soy broth)를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 락토스 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, UVM 변형 리스테리아(Listeria) 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 효모 추출물 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스(Rappaport-Vassiliadis) 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 R10 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트(Selenite)-시스틴(Cystine) 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, EC 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 영양 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 레틴 브로쓰(Letheen broth)를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 데이(Dey)/엔글리(Engley) 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 뇌 심장 주입 브로쓰(Brain Heart Infusion broth)를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 절반-강도 데미-프레이저 브로쓰(half-strength Demi-Fraser broth)를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 조성물을 제공한다. 본 조성물은 상기 방법들 중 어느 하나에 의해 생성되는 건조된 유동성 응집 영양 배지를 포함할 수 있다. 조성물의 임의의 실시 형태에서, 특정 질량의 건조된 응집 영양 배지는, 응집 영양 배지가 그로부터 제조된 동일 질량의 분말형 영양소보다 더 빠르게 수성 용매에 용해된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 조성물을 제공한다. 본 조성물은 수성 매질과 배합될 때 미생물의 성장을 촉진하는 혼합물을 형성하는 응집 입자들을 포함하는 응집 영양 배지를 포함할 수 있으며, 집단 내의 입자들 중 약 30 중량% 이상은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터이며, 벌크 입자 밀도는 약 0.2 내지 약 0.5 g/㎤이다. 임의의 실시 형태에서, 집단 내의 입자들 중 약 70 중량% 이상은 유효 직경이 약 105 내지 841 마이크로미터일 수 있다.
조성물의 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 응집 영양 배지는 분말형 영양소를 포함할 수 있으며, 분말형 영양소는, 재수화될 때, 완충 펩톤수 배지를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 락토스 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, UVM 변형 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 완충된 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 효모 추출물 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 R10 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트-시스틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, EC 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 영양 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 레틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 데이/엔글리 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 뇌 심장 주입 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 절반-강도 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 조성물의 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태를 포함하는 캡슐, 정제, 또는 사쉐(sachet)를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 본 키트는 캡슐, 정제, 사쉐 및/또는 조성물의 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태를 포함할 수 있다. 키트의 임의의 실시 형태에서, 조성물은 사전결정된 질량의 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 패키지(package) 내에 배치될 수 있으며, 사전결정된 질량은 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L, 또는 3.375 L의 수성 희석제와 혼합되어 미생물의 성장을 촉진할 수 있는 재구성 배지(reconstituted medium)를 생성하도록 선택된다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 키트는 백(bag), 보틀(bottle), 및 샘플 획득 기구로 이루어진 군으로부터 선택되는 물품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 키트는 선택제 및/또는 지시 시약을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 박막 배양 장치를 제공한다. 본 박막 배양 장치는 제1 주 표면(major surface) 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 방수 기재(self-supporting waterproof substrate), 제1 주 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착제 층, 접착제 층의 적어도 일부분 상에 배치된 조성물의 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태를 포함하는 코팅, 및 영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 냉수 용해성의 건조형 겔화제를 포함할 수 있다. 박막 배양 장치의 상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 본 장치는 기재의 적어도 일부분에 결합된 커버 시트(cover sheet)를 추가로 포함할 수 있으며, 커버 시트는 제1 주 표면과 대면하는 제1 면(side)을 갖는다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 소정의 환경 하에서 소정의 이득을 제공할 수 있는 본 발명의 실시 형태를 말한다. 그러나, 동일한 또는 다른 상황 하에서 다른 실시 형태가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 실시 형태의 언급은 다른 실시 형태가 유용하지 않다는 것을 의미하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 실시 형태를 배제하고자 하는 것은 아니다.
용어 "포함하는" 및 그의 변형은 이들 용어가 상세한 설명 및 특허청구범위에서 나타나는 경우 제한적 의미를 갖지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형 용어, "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, "입자"는 "하나 이상의" 입자를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 모두, 또는 열거된 요소들 중 임의의 둘 이상의 조합을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 종점(endpoint)에 의한 수치 범위의 설명은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
본 발명의 상기의 개요는 본 발명의 각각의 개시된 실시 형태 또는 모든 구현예를 설명하고자 하는 것은 아니다. 이하의 기재는 예시적인 실시 형태를 더 구체적으로 예증한다. 본 출원 전체에 걸쳐 여러 곳에서, 예들의 목록을 통해 지침이 제공되며, 상기 예들은 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 각각의 경우에, 열거된 목록은 단지 대표적인 군으로서의 역할을 하며, 배타적인 목록으로 해석되어서는 안된다.
이들 및 다른 실시 형태의 추가 상세 사항이 첨부 도면 및 이하의 상세한 설명에 설명된다. 다른 특징, 목적 및 이점들이 상세한 설명 및 도면과 특허청구범위로부터 명확하게 될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 박막 배양 장치의 일 실시 형태의 부분 단면 상면 사시도.
본 발명의 임의의 실시 형태를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 그의 응용에 있어서 하기의 설명에 기재된 구성요소들의 구성 및 배열의 상세 사항으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 본 발명은 기타 실시 형태 및 다양한 방식으로 실행되거나 실시될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용된 어법 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며, 제한으로서 여겨져서는 안된다는 것이 이해되어야 한다. 본 명세서에서 "구비하는", "포함하는", 또는 "갖는" 및 이들의 변형의 사용은 그 뒤에 열거된 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것으로 의도된다. 다른 실시 형태가 이용될 수 있으며, 구조적 또는 논리적 변화가 본 발명의 범주로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "벌크 밀도", "루스 벌크 밀도", 및 "겉보기 밀도(apparent density)"는 상호교환가능하게 다져지지 않은 상태의(untamped) 벌크 밀도 값을 말한다. 본 명세서에서 언급되는 벌크 밀도 및 겉보기 밀도는, 예를 들어 본 명세서의 실시예에 기술된 "루스 벌크 밀도" 방법과 같은, 다져지지 않은 상태의 벌크 밀도를 결정하는 종래의 방법에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "응집 입자"는 원래의 아이덴티티(identity)가 최종 응집 형태에서 여전히 확인될 수 있는 일차 입자들이 함께 연결되거나 결합됨으로써 형성되는 입자를 말한다.
본 명세서에서 언급되는 모든 유효 입자 크기 (즉, "유효 입자 직경")는 미국 표준국(U.S. Bureau of Standards)에 의해 정해진 미국 표준 체 시리즈 규격을 기반으로 한다 (예를 들어, http://www.wirecloth.com/howto/convert/ussieve.html 참조). 따라서, 예를 들어, 유효 입자 직경이 약 400 마이크로미터인 입자는 400 마이크로미터의 특정된 개구를 갖는 40-메시(mesh) 스크린을 통과할 것이고, 354 마이크로미터의 특정된 개구를 갖는 45-메시 스크린에 의해 보유될 것이다.
일반적으로, 본 발명은 수용성 분말로 제조되는 건조된 유동성 응집 입자 및 상기 응집체의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 실시 형태에서, 본 방법은 미생물의 성장을 촉진하기 위한 영양 배지의 제조에 사용될 수 있다. 응집 입자가 그로부터 제조되는 분말들 중 적어도 하나와는 대조적으로, 그리고 다른 응집 입자 조성물과는 대조적으로, 본 발명의 응집된 입자들의 집단은 유리하게는 하기 2가지의 고도로 바람직한 특성을 보유한다: 1) 수성 액체의 표면 상에 부어질 때, 응집된 입자들은 빠르게 (즉, 즉각적으로 또는 거의 즉각적으로) 그리고 실질적으로 정량적으로 수성 액체의 표면 아래로 침강되고, 2) 응집된 입자들은 수성 액체에 빠르게 용해된다. 이론에 의해 구애됨이 없이, 이들 고도로 바람직한 특성은 본 발명에 따라 생성되는 응집된 입자들의 집단들에서 발견되는, 평균 크기, 다공도, 표면적, 밀도 및/또는 전술한 물리적 속성들 중 2가지 이상의 독특한 조합에서 생기는 것으로 믿어진다. 따라서, 일 태양에서, 본 발명은 수동 또는 기계적 교반을 거의 이용하지 않고서 또는 상기 교반을 전혀 이용하지 않고서 수성 액체 내에 빠르게 분산되고 용해되는 영양 배지를 제공한다.
따라서 본 발명은 미생물의 회복 및/또는 성장을 촉진하는 데 적합한 응집 영양 배지의 제조 방법을 제공하며, 본 방법은 i) 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계 및 ii) 상기 응집 챔버 내에서, 상기 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계에 의해 영양 배지 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 본 방법은 본 조성물을 상기 챔버로부터 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 영양 배지 조성물을 형성한 후, 조성물은 응집 영양 배지 입자들의 집단 및, 선택적으로, 비응집 분말형 영양소를 포함하며, 상기 집단은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터인 응집 영양소 입자들을 약 30 중량% 이상 포함한다. 본 발명의 방법에 따르면, 영양 성분 (예를 들어, 1가지 이상의 분말형 영양소)은 미생물의 성장을 촉진한다.
응집 액체의 적용 및 유동층에서의 분말형 영양소의 습식-덩어리화(wet-massing)가 건조된 유동성 영양 배지의 제조에 적합한 응집 입자들의 집단으로 이어진다는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 장치는 문헌[Srivastava and Mishra, "Fluid Bed Technology: Overview and Parameters for Process Selection"; Int. J. Pharma. Sci. and Drug Res.; 2010; Vol. 2, pp. 236-246]에 기재된 유동층 응집기를 포함하며; 상기 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 특히 적합한 장치는 상기 문헌에 기재되어 있는 "톱 스프레이(top spray)" 및 "탄젠셜 스프레이(tangential spray)" 유형 장치를 포함한다.
전형적으로, 톱 스프레이 응집 공정에서, 소정의 질량 (예를 들어, 사전결정된 질량)의 분말 성분 (예를 들어, 1가지 이상의 분말형 영양소)이 과립화 챔버 내에 로딩된다. 분말 성분은 분말 성분을 통해 유동화 가스 (예를 들어, 공기, 질소)를 통과시킴으로써 유동화되어 분말 성분의 유동층을 생성한다. 분말이 유동화되는 동안, 응집 액체는 응집 챔버 내에 스프레이되며, 여기서 상기 응집 액체는 유동화 분말 성분 및/또는 응집 영양 배지 입자들과 접촉한다. 접촉시에, 응집 액체는 응집된 입자를 형성하도록 다른 분말 입자와 접촉할 수 있는 분말 성분 입자의 표면의 적어도 일부분 상에 코팅을 형성할 수 있다. 후속적으로 및/또는 동시에, 유동화 가스는 응집 액체의 증발을 촉진하며, 이럼으로써 응집된 입자를 건조시킨다. 따라서, 이론에 의해 구애됨이 없이, 응집은 하기 기작들 중 1가지 이상을 통해 일어난다: 1) 입자 표면 상의 고정 응집 액체가 2개 이상의 입자들 사이에서 (예를 들어, 접착력 및 응집력으로 인해) 가교체를 형성함, 2) 이동 응집 액체 (예를 들어, 인접 입자들 사이에서 계면 및/또는 모세관 힘에 의해 이동)가 2개 이상의 입자들 사이에서 가교체를 형성함, 및 3) 건조 동안 용해된 물질 (예를 들어, 응집 액체가 입자의 표면과 접촉함에 따라 응집 액체 내에 용해됨)의 결정화로 인하여, 고체 가교체가 2개 이상의 입자들 사이에서 형성됨.
당업자라면, 이용되는 장치의 크기에 따라, 응집 챔버에 로딩되는 분말 조성물의 질량과, 유동화 가스의 유량 및 응집 액체의 유량이 달라질 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명에 따른 방법은 응집 영양 배지 (예를 들어, 건조된 습식-응집 영양 배지)의 제조에 사용된다. 응집 영양 배지는 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진하는 미생물용 응집 영양 배지일 수 있다. 본 발명의 방법은 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계를 포함한다. 분말형 영양소는 미생물의 성장을 지원하는 영양 성분을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계는 사전결정된 질량의 분말형 영양소를 상기 응집 챔버에 넣는 단계를 포함할 수 있다. 영양 성분은 본 명세서에 기재된 임의의 적합한 영양 성분일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 영양 성분은 2가지 이상의 분말형 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 응집 챔버 내에서 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 분말형 영양소를 응집 액체와 접촉시키는 단계는 상기 분말형 영양소 (예를 들어, 사전결정된 질량의 분말형 영양소)를 사전결정된 부피의 응집 액체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 당업자라면, 소정의 공정 파라미터 (예를 들어, 분말 입자의 양, 입자의 유동화, 분무 압력(atomization pressure), 응집 챔버의 온도, 분말형 영양소 질량에 대한 응집 액체 부피의 비, 및 응집 액체의 유량)를 조정하여 응집 액체가 상부에 배치된 입자들 사이의 접촉의 증가를 촉진하고, 이럼으로써 더 큰 응집체의 형성을 촉진할 수 있음을 인식할 것이다. 역으로, 당업자라면, 상기에 열거된 것을 비롯한 소정의 공정 파라미터를 조정하여 응집 액체가 상부에 배치된 입자들 사이의 접촉을 감소시키고, 이럼으로써 더 작은 응집체의 형성을 촉진할 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 응집 액체의 분무 압력은 응집 공정에 의해 형성된 조성물 중 더 작은 응집체 (약 105 내지 약 400 마이크로미터의 유효 직경)의 백분율의 증가를 위하여 증가될 수 있다.
유동층에 공급되는 유동화 가스는 일반적으로 공기이지만, 응집되는 분말들에 대하여 불활성인 임의의 다른 가스, 예를 들어 질소가 사용될 수 있다. 일반적으로 유동화 가스는 (예를 들어, 하나 이상의 입구를 통해) 약 0℃ 내지 약 140℃, 바람직하게는 약 20℃ 내지 약 140℃의 입구 온도에서 응집 챔버 내에 도입된다. 응집 챔버 내에 도입되는 유동화 가스는 예를 들어 약 50℃ 내지 약 140℃, 바람직하게는 약 50℃ 내지 약 90℃로 가열되는 것이 바람직할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 응집 입자의 제조에 사용되는 분말 성분은 응집 액체가 응집 챔버 내에 도입되기 전에 사전규정된 기간 (예를 들어, 20분) 동안 응집 챔버 내에서 (예를 들어, 실온에서) 블렌딩될 수 있다. 유리하게는, 이러한 블렌딩 단계는, 응집될 때, 응집 입자에서 상당한 균일성을 생성할 수 있는 각각의 분말 성분들의 더 균일한 혼합물을 생성할 수 있으며, 이는 본 명세서에 기재된 실시예 11에 의해 입증되는 바와 같다.
전형적으로, 유동화 가스는 응집 공정 동안 응집 챔버를 통과하여 밖으로 나온다. 따라서, 응집 챔버는 전형적으로 유동화 가스가 응집 챔버 밖으로 나오게 하는 하나 이상의 출구 포트를 갖는다. 유동화 가스가 응집 챔버를 통과할 때, 이것은 응집 액체의 증발을 야기하며, 이럼으로써 그의 온도가 강하된다. 따라서, 임의의 실시 형태에서, 유동화 가스가 응집 챔버를 빠져나갈 때의 유동화 가스의 온도는 입구 포트에서의 유동화 가스의 온도보다 더 낮을 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 유동화 가스가 응집 챔버를 빠져나갈 때의 유동화 가스의 온도는 약 35℃ 내지 약 50℃일 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 응집 공정은 유동화 가스의 입구 온도를 조정하고 (예를 들어, 응집 챔버의 스프레잉 구역(spraying zone) 내에서의) 유동화 가스의 제2 온도를 사전결정된 온도 범위 (예를 들어, 약 35℃ 내지 약 50℃) 내에 유지하도록 응집 액체의 스프레이 속도를 유지함으로써 제어될 수 있다.
응집 액체의 적절한 적용이 분말형 영양소를 습식-덩어리화하기 위해, 응집 챔버 내에 도입되는 응집 액체의 부피 및 유량이 또한 중요한 파라미터이다. 보통, 응집 액체는 하나 이상의 에어로졸 노즐을 통해 본 조성물 상에 스프레이된다. 당업자라면, 상기 액체 유량이 예를 들어 노즐에서의 상기 액체 압력을 제어함으로써 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 임의의 실시 형태에서, 상기 액체 유량은 유동화 가스의 사전결정된 출구 온도를 유지하도록 제어될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 응집 챔버 내에서 분말형 영양소 (예를 들어, 사전결정된 질량의 분말형 영양소)를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계는 상기 분말형 영양소를 사전결정된 부피의 응집 액체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
선택적으로, 응집 챔버로부터 꺼낸 후에, 응집 영양 배지에 대해, 적합한 건조 챔버 내에서의 건조가 실시될 수 있다. 건조 챔버는 배치식(batch wise)으로 또는 연속식으로 작동될 수 있고, 선택적으로, 2개 이상의 독립-제어되는 건조 구역으로 구분될 수 있으며, 상기 구역들은 상이한 온도에서 작동된다. 임의의 실시 형태에서, 건조 조건 (예를 들어, 온도, 시간, 및 가스 또는 공기의 유동)은 사전선택된 평균 수분 함량 및/또는 사전선택된 수분 함량 범위를 갖는 응집 영양 배지 입자를 생성하도록 선택될 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 건조된 응집 영양 배지에 대해, 건조된 응집 영양 배지 중의 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 건조된 응집 영양 배지는 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 생존가능 미생물의 수를 감소시키기 위하여 에틸렌 옥사이드 증기로 처리될 수 있다. 에틸렌 옥사이드 증기로 처리한 후, 영양 배지는 에틸렌 옥사이드-처리된 응집 배지 중 잔류 에틸렌 옥사이드를 감소시키거나 제거하기 위하여 사용 전에 통기되게 될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 건조된 응집 영양 배지는 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 생존가능 미생물의 수를 감소시키기 위하여 이온화 방사선 (예를 들어, 감마 방사선) 또는 자외광의 공급원으로 처리될 수 있다. 건조된 응집 배지는 미국 특허 제6,383,810호에 기술된 바와 같이 감마 방사선의 공급원에 노출될 수 있으며, 상기 미국 특허는 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.
영양 성분
본 발명의 방법은 응집 챔버 내에서 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계를 포함한다. 분말형 영양소는 미생물 (예를 들어, 박테리아, 효모, 곰팡이)의 성장을 촉진하는 1가지 이상의 영양 성분을 포함한다. 임의의 실시 형태에서, 영양 성분은 미생물의 성장을 촉진하는 2가지 이상의 영양소들의 혼합물을 포함할 수 있다. 적합한 영양소의 비제한적 예에는 탄수화물 (예를 들어, 단당류, 이당류, 삼당류, 올리고당류 또는 다당류), 단백질, 단백질 가수분해물, 세포 추출물 (예를 들어, 효모 추출물), 염, 완충제 성분, 선택제 (예를 들어, 항생제), 및 전술한 영양소들 중 임의의 2가지 이상의 배합물이 포함된다.
임의의 실시 형태에서, 영양 성분은 실질적으로 건조한 제형 (예를 들어, 실질적으로 건조한 분말)일 수 있다. 전형적으로 분말형 배지는 혼합 공정, 예를 들어 볼-밀링(ball-milling)을 통해 배양 배지의 건조된 성분들을 혼합함으로써, 또는 사전제조된 액체 배양 배지를 동결건조시킴으로써 생성된다. 본 발명의 방법에서 사용되는 예시적인 영양 배지는 완충 펩톤수이며, 이는 예를 들어 쓰리엠 헬스 케어(3M Health Care; 미국 미네소타주 세인트 폴 소재), 옥소이드 리미티드(Oxoid Limited; 영국 햄프셔 소재) 및 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich; 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)를 포함하는 다양한 공급원으로부터 분말로서 구매가능하다.
본 발명에 따라 응집될 수 있는 다른 분말형 영양 배지 제형에는 트립티카아제 소이 브로쓰, 락토스 브로쓰, UVM 변형 리스테리아 풍부화 브로쓰, 완충된 리스테리아 풍부화 브로쓰, 트립티카아제 소이 효모 추출물 브로쓰, 라파포트-바실리아디스 풍부화 브로쓰, 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 R10 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트-시스틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, EC 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 영양 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 레틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 데이/엔글리 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 셀레나이트 브로쓰, 뇌 심장 주입 브로쓰, 절반-강도 데미-프레이저 브로쓰, 프레이저 브로쓰, 데미-프레이저 브로쓰, 및 다른 미생물용 영양 배지 제형이 포함된다.
전형적으로, 유동층에 공급되는 분말 성분은 5 내지 200 μm의 범위의 평균 입자 직경을 갖지만, 더욱 더 큰 입자 크기 (예를 들어, 최대 300 μm 또는 심지어 400 μm)를 갖는 분말 성분이 사용될 수 있다. 유동층에 공급되는 분말 성분은 일반적으로 건조 중량을 기준으로, 응집 영양 배지의 60 중량% 이상을 형성하며, 흔히 응집 영양 배지의 80 중량% 초과, 최대 95 중량% 또는 100 중량%를 형성한다.
응집 액체
응집 액체는 영양 성분의 더 작은 개별 입자들 (예를 들어, 분말 입자들)의 더 큰 응집 입자들로의 응집을 촉진하도록 응집 챔버 내에 스프레이된다. 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 물 (예를 들어, 증류수 및/또는 탈이온수)을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 본질적으로 물 (예를 들어, 증류수 및/또는 탈이온수)로 이루어질 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 물 (예를 들어, 증류수 및/또는 탈이온수)로 이루어질 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 유기 용매 (예를 들어, 에탄올, 아이소프로판올)를 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 용해된 물질 (예를 들어, 하기에 논의된 바와 같이 영양소, 영양 배지, 및/또는 결합제)을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는, 이것이 응집 챔버 내에 주입될 때, 예를 들어 0℃ 또는 20℃로부터 100℃ 또는 110℃까지의 온도일 수 있다. 응집 액체가 (예를 들어, 응집을 돕기 위한) 용해된 물질을 전혀 함유하지 않을 때, 응집 액체 (예를 들어, 물)는 예를 들어 50 내지 110℃로 가열되는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로 스팀이 응집 촉진에 있어서 적어도 고온수만큼 효과적이다.
선택적으로, 임의의 실시 형태에서, 결합제, 특히 수용성 결합제가 영양 성분의 응집 촉진에 유용할 수 있다. 결합제는 (예를 들어, 예컨대 분말과 같은 실질적으로 건조한 입자의 형태로) 영양 성분에 첨가될 수 있거나, 이것은 응집 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다.
선택적으로, 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 응집된 입자의 용해 (예를 들어, 적어도 부분적인 용해)를 촉진하기 위하여 습윤제 (예컨대, 계면활성제, 예를 들어 트윈(TWEEN))를 추가로 포함할 수 있다.
적합한 결합제의 비제한적인 예에는 생체적합성 중합체 (예를 들어, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 다당류, 덱스트란, 덱스트린, 말토덱스트린, 미정질 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 전분, 및 전술한 중합체들 중 임의의 중합체의 생체적합성 유도체) 및 당류 (예를 들어, 덱스트로스, 프룩토스, 글루코스, 이노시톨, 에리트리톨, 아이소말트, 락티톨, 락토스, 말티톨, 말토스, 만니톨, 소르비톨, 수크로스, 타가토스, 트레할로스, 및 자일리톨)가 포함된다. 임의의 실시 형태에서, 결합제는 미생물의 성장을 촉진하는 물질 (예를 들어, 1가지 이상의 영양소를 함유하는 완전 배지 또는 희석제)일 수 있다. 예로서, 응집된 완충 펩톤수 배지에 적합한 응집 액체는 1 내지 50 중량%의 완충 펩톤수의 용액일 수 있으며, 응집된 트립티카아제 소이 브로쓰 배지에 적합한 응집 액체는 1 내지 50 중량%의 트립티카아제 소이 배지의 수성 용액일 수 있다.
영양소를 포함하는 조성물 중 결합제의 농도는 이용되는 특정 결합제에 따라 큰 범위에 걸쳐 달라질 수 있지만, 일반적으로 이것은 약 0.1% 내지 약 40% (w/w), 예를 들어 약 0.2 내지 약 35% (w/w), 약 0.3 내지 약 30% (w/w) 또는 약 0.4 내지 약 25% (w/w) 또는 약 0.4 내지 약 24.2% (w/w)이다. 소르비톨의 경우, 그 농도는 보통 약 20 내지 30% (w/w)이며, 소르비톨 이외의 당 알코올의 경우, 그 농도는 보통 약 30 내지 약 40% (w/w)와 같이 더 높은 범위이다.
바람직하게는, 응집 액체는 수성 매질이다. 결합제가 응집 액체 중에 포함되는 경우, 응집 액체는 결합제를 물에 용해시킴으로써 제조된다. 대안적으로, 결합제는 상기 분말에 대하여 건조 형태로 혼합될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 미생물의 성장을 촉진하는 영양 배지를 포함할 수 있다. 예를 들어, 일 실시 형태에서, 응집 액체는 완충 펩톤수 브로쓰 (물, 10.0 g/L의 펩톤, 5.0 g/L의 염화나트륨, 9.0 g/L의 오르토인산수소이나트륨 12H2O, 및 1.5 g/L의 오르토인산이수소칼륨)를 포함할 수 있다.
본 방법의 임의의 실시 형태에서, 응집 액체는 미생물의 성장을 촉진하는 1가지 이상의 용해된 영양소를 포함할 수 있다. 용해된 영양소는 단백질 (예를 들어, 단백질, 정제된 단백질, 및/또는 단백질 가수분해물의 혼합물)을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 응집 액체는 완충 펩톤수를 포함한다.
당업자라면 공정 조건들 (예를 들어, 상기 공정에서 사용되는 영양소 분말의 질량, 상기 공정에서 사용되는 응집 액체의 질량, 응집 액체 스프레이 속도, 및/또는 응집 챔버 내의 온도) 중 적어도 일부가 본 발명의 방법에 의해 제조되는 생성된 응집 영양 배지 입자의 물리화학적 특성들 중 하나 이상에 영향을 줄 수 있음을 인식할 것이다. 이들 물리화학적 특성은 유효 입자 직경, 입자 형상, 평균 입자 질량, 평균 입자 수분 함량, 유효 입자 직경의 범위, 입자 질량의 범위, 및/또는 입자 수분 함량의 범위를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 하나의 물리화학적 특성 또는 물리화학적 특성들 중 임의의 2가지 이상의 조합이 건조된 응집 영양 배지 입자의 유체역학적 특성 (예를 들어, 수성 액체에서의 입자 침강 속도, 수성 액체 중 입자 용해 시간)에 영향을 줄 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법은 평균 유효 입자 직경 및 제1 입자 크기 분포 범위를 갖는 건조된 응집 영양 배지 입자들의 집단을 생성한다. 임의의 실시 형태에서, 제1 입자 크기 분포 범위는 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 내지 약 2000 마이크로미터인 응집된 입자를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 제1 입자 크기 분포 범위는 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 내지 약 1000 마이크로미터인 응집된 입자를 포함할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 생성되는 응집된 입자들의 조성물은 응집된 입자들의 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 응집된 입자들 중 약 70 중량% 이상은 약 105 마이크로미터 내지 약 841 마이크로미터의 유효 입자 직경을 갖는다. 임의의 실시 형태에서, 본 발명의 방법을 이용하여 생성되는 응집된 입자들은 응집된 입자들의 제1 집단을 포함할 수 있으며, 여기서 응집된 입자들 중 약 10 중량% 미만은 약 105 마이크로미터 이하의 유효 입자 직경을 갖는다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 본 발명의 방법에 따라 생성되는 조성물 중 상대적으로 큰 (예를 들어, >841 마이크로미터의 유효 입자 직경을 갖는) 입자의 중량%를 제한하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 공정은 유효 입자 직경이 > 841 마이크로미터인 입자가 4 중량% 미만인 응집된 입자들의 집단을 생성할 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 400 내지 841 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 입자들의 비율을 풍부화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 공정 조건은 응집된 입자들 중 약 1.5 중량% 내지 약 40 중량%가 400 내지 841 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 응집된 입자들의 집단을 생성하도록 선택될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 250 내지 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 입자들의 비율을 풍부화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 공정 조건은 응집된 입자들 중 약 35 중량% 내지 약 55 중량%가 250 내지 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 응집된 입자들의 집단을 생성하도록 선택될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 105 내지 250 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 입자들의 비율을 풍부화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 공정 조건은 응집된 입자들 중 약 15 중량% 내지 약 55 중량%가 105 내지 250 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)의 유효 입자 직경을 갖는 응집된 입자들의 집단을 생성하도록 선택될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 본 발명의 방법에 따라 생성되는 조성물 중 상대적으로 작은 (예를 들어, <105 마이크로미터의 유효 입자 직경을 갖는) 입자의 중량%를 제한하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 공정은 유효 입자 직경이 <105 마이크로미터인 입자가 5 중량% 미만인 응집된 입자들의 집단을 생성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 공정은 유효 입자 직경이 <105 마이크로미터인 입자가 1 중량% 미만인 응집된 입자들의 집단을 생성할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 방법에 있어서의 공정 조건은 유효 입자 직경이 >841 마이크로미터인 입자 약 0 내지 4 중량%; 유효 입자 직경이 400 내지 841 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 입자 약 1.5 내지 40 중량%; 유효 입자 직경이 250 내지 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 입자 약 35 내지 50 중량%; 유효 입자 직경이 105 내지 250 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 입자 약 15 내지 55 중량%; 및 유효 입자 직경이 <105 마이크로미터인 입자 <5 중량%를 갖는 응집된 입자들의 집단을 생성하도록 선택될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 방법은 응집된 건조 영양 배지 입자들의 하위집단을 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 하위집단은 제2 입자 크기 분포 범위 내에 있는 유효 입자 직경을 갖고/갖거나 사전선택된 평균 유효 입자 직경을 갖는다. 상기 하위집단은 본 기술 분야에 공지된 입자 크기-선택 방법을 이용하여 (예를 들어, 사전결정된 유효 입자 직경을 갖는 입자의 보유 또는 통과를 가능하게 하는 체를 사용하여) 단리될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 하위집단은 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 내지 약 841 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 입자들을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 하위집단은 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 내지 약 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 입자들을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 하위집단은 유효 입자 직경이 약 125 마이크로미터 내지 약 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 입자들을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 상기 하위집단은 유효 입자 직경이 약 150 마이크로미터 내지 약 250 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 입자들을 포함할 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 조성물을 또한 제공한다. 본 조성물은 유동성 응집 영양 배지를 포함한다. 본 조성물은 본 명세서에 개시된 방법의 임의의 실시 형태를 사용하여 제조될 수 있다. 본 조성물은 샘플 (예를 들어, 임상 샘플, 환경 샘플, 식품 샘플, 음료 샘플, 물 샘플) 중 미생물의 회복 및/또는 성장을 촉진하는 영양 배지를 제조하는 데 사용될 수 있다. 게다가, 본 조성물은 미생물 배양용 물품에 사용될 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 조성물은 유동성이며 (예를 들어, 하나의 컨테이너(container)로부터 다른 것 내로 부어질 수 있음), 분진 (예를 들어, 응집 배지가 그로부터 제조되는 영양소의 더 작은 입자)이 실질적으로 존재하지 않으며, 응집 배지가 1가지 이상의 수용성 분말을 포함하는 실질적으로 건조한 출발 물질로 만들어질 때, 응집 배지는 출발 물질보다 실질적으로 더 빠르게 물에 용해될 수 있다.
본 방법의 임의의 실시 형태에서, 본 조성물의 건조된 응집 영양 배지 입자는 수성 용매 중 조성물의 분산 및 용해를 촉진하는 선택된 평균 수분 함량 (예를 들어, 중량% 단위로 표현되는 수분)을 가질 수 있다. 평균 수분 함량은 예를 들어 칼 피셔(Karl Fischer) 적정법을 이용하여 측정될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 수분의 평균 중량%는 약 5 중량% 미만의 수분이 되도록 사전선택될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 수분의 평균 중량%는 약 3 중량% 이하의 수분이 되도록 사전선택될 수 있다. 당업자라면, 평균 수분 함량이, 예를 들어, 응집 공정 동안 및/또는 응집 공정 후에, 응집된 입자들의 습식-덩어리화에 사용되는 물의 양을 제어함으로써 그리고/또는 건조 조건을 제어함으로써 조정될 수 있음을 인식할 것이다.
본 방법의 임의의 실시 형태에서, 건조된 응집 영양 배지 입자는 수성 용매 중 응집된 입자들의 분산을 촉진하는 루스 벌크 밀도를 가질 수 있다. 건조된 응집 영양 배지 입자의 루스 벌크 밀도는 예를 들어 사전규정된 부피 (예를 들어, 20 mL)의 입자를 눈금이 매겨진 50-mL의 실린더 내에 붓고, 중력-패킹된(gravity-packed) 입자의 질량을 측정하여 평균 밀도를 계산함으로써 측정될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 루스 벌크 밀도는 약 0.2 g/㎤ 내지 약 0.5 g/㎤일 수 있다.
유리하게는, 본 발명의 조성물은 수성 용매에 빠르게 분산되고 용해된다. 2.55 g 내지 4.44 g의 건조된 응집 영양 배지 (예를 들어, 예컨대 완충 펩톤수, 트립티카아제 소이 브로쓰, 또는 변형 리스테리아 회복 배지의 제조에 사용되는 건조된 응집 영양 배지)를 100 mL의 탈이온수를 수용하는 용기 내에 붓고, 상기 용기를 교반 없이 실온에서 유지함으로써 용해 시간이 측정될 때, 건조된 응집 배지는 5분 미만 내에 용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 건조된 응집 배지는 4분 미만 내에 용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 건조된 응집 배지는 3분 미만 내에 용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 건조된 응집 배지는 2분 미만 내에 용해될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 건조된 응집 배지는 1분 미만 내에 용해될 수 있다.
본 발명은 영양 배지의 응집된 입자들의 조성물에 있어서의 용해 시간이 특정 유효 입자 직경을 갖는 조성물을 수득하도록 공정 조건을 조정하고/하거나 선택적 단리 공정 (예를 들어, 체질)을 이용함으로써 선택될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 유효 입자 직경이 400 내지 841 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 완충 펩톤수 배지는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 실온수에서 약 90 내지 120초 내에 용해될 수 있으며; 유효 입자 직경이 250 내지 400 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 완충 펩톤수 배지는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 실온수에서 약 30초 내에 용해될 수 있으며; 유효 입자 직경이 105 내지 250 마이크로미터 (언급된 수치들을 포함함)인 응집된 완충 펩톤수 배지는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 실온수에서 약 15초 내에 용해될 수 있으며; 유효 입자 직경이 <105 마이크로미터인 응집된 완충 펩톤수 배지는 실시예 8에 나타낸 바와 같이 실온수에서 약 90 내지 120초 내에 용해될 수 있으며; 이는 응집된 BPW 영양 배지를 제조하는 데 사용되는 분말들의 혼합물이 실온수에서 용해되는 데 >10분이 요구될 때 그러하다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 조성물은 회복 배지 (즉, 화학적 및/또는 환경적 스트레스로부터 미생물이 회복하는 것을 가능하게 하는 데 사용될 수 있는 수성 배지)를 형성하도록 재구성될 수 있는 분말들로 만들어진다. 일부 실시 형태에서, 회복 배지는 미생물의 배양 (예를 들어, 성장)에 사용될 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 회복 배지는 희석제로서 사용될 수 있다. 스트레스를 받은 미생물의 회복 및/또는 성장을 촉진하는 데 특히 바람직한 회복 배지는 단백질 가수분해물, 염, 및 pH 7.2로 조정된 인산염 완충 시스템을 포함하는 완충 펩톤수(BPW) 배지이다. 특정 질량의 응집 BPW 배지는 본 명세서의 실시예에 나타낸 바와 같이 15초만큼 적은 시간 내에 용해될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 응집 영양 배지의 조성물은 본 기술 분야에 공지된 방법에 따라 캡슐, 정제 또는 사쉐를 제조하는 데 사용될 수 있다. 유리하게는, 캡슐, 정제 또는 사쉐는 조성물이 수화되어 재구성 영양 배지를 형성할 컨테이너에 사전결정된 질량 (예를 들어, "단위 용량")의 조성물을 전달하는 편리한 수단을 제공할 수 있다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 미생물 배양용 물품을 제공한다. 본 발명에 따른 물품의 비제한적 예로는 미국 특허 제4,565,783호 및 제5,089,413호에 기재된 분말-코팅된 장치와 유사한 박막 배양 장치가 있으며; 상기 미국 특허들은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 발명의 건조된 응집 영양 배지는 박막 배양 장치에서 분말형 영양소 대신 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 박막 배양 장치의 일 실시 형태를 나타낸다. 배양 장치(10)는 상부 표면 및 하부 표면을 갖는 자가-지지형 방수 기재(12)를 포함하는 몸체 부재를 포함한다. 기재(12)는 바람직하게는 물을 흡수하지 않거나 달리 물에 의해 영향을 받지 않을 폴리에스테르, 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌과 같은 재료의 상대적으로 강성인 필름이다. 대략 0.004 내지 0.007 인치(0.1 내지 0.18 mm) 두께의 폴리에스테르 필름, 대략 0.004 내지 0.008 인치(0.1 내지 0.2 mm) 두께의 폴리프로필렌 필름 및 대략 0.015 인치(0.38 mm) 두께의 폴리스티렌 필름이 잘 작용하는 것으로 밝혀졌다. 다른 적합한 기재는 폴리에틸렌 또는 다른 방수 코팅을 포함하는 종이를 포함한다. 적합한 폴리에틸렌 코팅지 기재의 예로는 "쉘러 타입(Schoeller Type) MIL" 사진 인화지 (미국 뉴욕주 뉴욕 소재의 쉘러 풀라스키(Schoeller Pulaski)로부터 구매가능함)가 있다. 기재(12)는 박테리아 콜로니를 기재를 통해 관찰하기를 원하는지에 따라 투명하거나 불투명할 수 있다. 박테리아 콜로니의 계수를 촉진하기 위하여, 바람직하게는 기재(12)는 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 바와 같이 그 위에 정사각형 격자 패턴이 인쇄되어 있다.
기재(12)는 그의 상부 표면이 접착제(14) 층으로 코팅되며, 상기 접착제 층은 용이한 수화를 위하여 건조형 겔화제 및/또는 영양소를 균일한 단층으로 유지하는 역할을 한다. 접착제(14)는 수불용성이고, 미생물의 성장에 대하여 비저해성이어야 한다. 바람직하게는, 접착제는 습윤될 때 접착제로 코팅된 필름을 통해 박테리아 콜로니의 관찰이 가능하기에 충분히 투명하다. 접착제(14)는 감압성인 것이 바람직하다. 그러나, 더욱 낮은 융점의 물질이 더욱 높은 융점의 물질 상에 코팅된 열활성화 접착제가 또한 사용될 수 있다. 수분 활성화 접착제, 예를 들어 고무풀이 또한 유용할 수 있다.
접착제(14)는 바람직하게는 분말형 겔화제 및/또는 영양소의 입자의 직경보다 작은 두께로 기재(12) 상에 코팅되어야 한다. 그 목적은 상기 입자를 기재에 부착시키기에 충분하지만 입자를 접착제 중에 완전히 매립되게 할 만큼 많은 것은 아니도록 접착제를 도포하는 것이다. 분말(16)의 균일한 단층은 충분한 표면적이 수화를 위해 노출되는 것이 요망된다. 일반적으로, 0.0002 내지 0.0005 인치의 두께 범위의 접착제 층이 적합하다. 본 발명의 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 분말들은 예를 들어 미국 특허 제4,565,783호에 기재된 바와 같이 접착제 층 상에 코팅될 수 있다.
몸체 부재의 스페이서(spacer)(18)의 하나의 에지에는 선택적 커버 시트(22)가 접착된다. 커버 시트(22)는 바람직하게는 투명하여서 박테리아 콜로니의 계수를 용이하게 하며, 박테리아 및 수증기에 대해서는 실질적으로 불투과성이다. 본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, "박테리아 및 수증기에 대하여 실질적으로 불투과성"은 본 장치의 보관 및 사용 동안 탈수된 배지의 원하지 않는 오염을 방지하고 인큐베이션 기간 동안 미생물의 성장을 지원할 환경을 제공하는 커버 시트를 나타낸다. 일반적으로, 이것은 기재(12)와 동일한 특성을 가질 것이지만, 강성일 필요는 없을 것이다.
도 1의 도시된 실시 형태가 본 장치에 부착된 커버 시트(22)를 포함하지만, 분말-함유 실시 형태는 덮여져 있지 않고 단순히 보관 및 인큐베이션 동안 살균 환경 내에 배치될 수 있음이 본 발명의 범주 내에서 또한 고려된다. 선택적으로, 커버 시트(22)는 접착제 층 (도시되지 않음) 및 분말 (도시되지 않음)을 추가로 포함할 수 있다. 커버 시트에 접착된 분말 및 접착제는 상기에 기재된 분말(16) 및 접착제(14)와 유사한 (또는 동일한) 특성 및/또는 조성을 가질 수 있으며, 분말(16) 및 접착제(14)가 기재(12)에 적용되는 것과 동일한 방식으로 커버 시트에 적용될 수 있다.
다른 태양에서, 본 발명은 키트를 제공한다. 본 키트는 본 명세서에 기재된 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 임의의 조성물을 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 키트는 건조된 응집 영양 배지의 사용 설명서를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 키트는 샘플의 수득, 샘플의 처리 및/또는 미생물의 배양을 위한 물품을 추가로 포함할 수 있다. 본 물품은 백, 보틀, 샘플 획득 기구 (예를 들어, 피펫, 면봉, 스펀지), 및 전술한 물품들 중 임의의 2가지 이상의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 키트는 하나의 유형의 미생물의 성장을 다른 유형의 미생물에 비하여 유리하게 하는 선택제 (예를 들어, 항생제)를 추가로 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 선택제는 용액으로 또는 실질적으로 건조한 형태로 제공될 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 선택제는 사전결정된 부피의 샘플에 첨가될 수 있는 단위-용량 형태 (예를 들어, 정제, 튜브 또는 앰풀)로 제공될 수 있다.
임의의 실시 형태에서, 키트는 샘플 중 미생물의 존재 또는 부재의 탐지에 사용되는 지시 시약을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 지시 시약에는 예를 들어 pH 지시제 (예를 들어, 페놀 레드, 클로로페놀 레드, 메틸 레드, 뉴트랄(neutral) 레드, 브롬티몰 블루, 브롬크레솔 퍼플), 레독스 지시제 (예를 들어, 트라이페닐테트라졸륨 클로라이드, 메틸렌 블루), 색소 생성 효소 기질 (예를 들어, 글리코시다아제 효소 활성, 포스파타아제 효소 활성, 리파아제 효소 활성, 또는 아미노펩티다아제 효소 활성을 검출하기 위한 색소 생성 효소 기질), 또는 형광 생성 효소 기질 (예를 들어, 글리코시다아제 효소 활성, 포스파타아제 효소 활성, 리파아제 효소 활성, 또는 아미노펩티다아제 효소 활성을 검출하기 위한 형광 생성 효소 기질)이 포함된다.
상기 실시 형태들 중 임의의 실시 형태에서, 키트는 사전결정된 질량의 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 패키지를 포함할 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 사전결정된 질량은 미생물의 성장을 촉진할 수 있는 재구성 배지를 생성하도록 사전결정된 부피 (예를 들어, 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L, 또는 3.375 L)의 수성 희석제와 혼합되기에 충분한 양일 수 있다. 임의의 실시 형태에서, 사전결정된 질량의 조성물은 캡슐, 정제 또는 사쉐의 형태로 키트 내에 제공될 수 있다.
본 발명의 방법, 조성물, 물품 및 키트의 소정 실시 형태가 하기의 실시 형태 목록에 기술되어 있다.
실시 형태
실시 형태 A는 유동성 응집 영양 배지를 제조하는 방법으로서, 본 방법은
미생물의 성장을 촉진하는 영양 성분을 포함하는 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계,
유동화 가스를 챔버를 통해 유동시키는 단계,
응집 챔버 내에서, 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계에 의해 영양 배지 조성물을 형성하는 단계; 및
조성물을 챔버로부터 수집하는 단계를 포함하며,
조성물은 응집 영양 배지 입자들의 집단 및 선택적으로 비응집 분말형 영양소를 포함하고,
집단은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터인 응집 영양소 입자들을 약 30 중량% 이상 포함한다.
실시 형태 B는 집단 내의 입자들 중 약 70 중량% 이상이 약 105 내지 841 마이크로미터의 유효 입자 직경을 갖는, 실시 형태 A의 방법이다.
실시 형태 C는 집단 내의 입자들 중 약 10 중량% 미만이 약 105 마이크로미터 이하의 유효 입자 직경을 갖는, 실시 형태 A 또는 실시 형태 B의 방법이다.
실시 형태 D는 응집 영양 배지 입자들의 하위집단을 단리하는 단계를 추가로 포함하며, 하위집단은 사전결정된 유효 입자 직경을 갖는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 E는 하위집단을 단리하는 단계가 약 149 마이크로미터 내지 약 841 마이크로미터의 유효 입자 직경을 갖는 하위집단을 단리하는 단계를 포함하는, 실시 형태 D의 방법이다.
실시 형태 F는 응집 액체가 물로 이루어지는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 G는 응집 액체가 결합제 및/또는 미생물의 성장을 촉진하는 영양소가 용해된 용매를 포함하는, 실시 형태 A 내지 실시 형태 E 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 H는 분말형 영양소가 2가지 이상의 분말형 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 포함하는, 실시 형태 G의 방법이다.
실시 형태 I는 분말형 영양소를 넣는 단계가 사전결정된 질량의 분말형 영양소를 넣는 단계를 포함하는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 J는 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계가 분말형 영양소를 사전결정된 부피의 응집 액체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 K는 유동화 가스가 응집 챔버에 진입할 때 유동화 가스가 제1 온도를 가지며, 유동화 가스의 제1 온도는 약 50℃ 내지 약 90℃인, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 L은 유동화 가스가 응집 챔버의 스프레잉 구역에서 제2 온도를 가지며, 유동화 가스의 제2 온도는 약 35℃ 내지 약 50℃인, 실시 형태 J의 방법이다.
실시 형태 M은 응집 영양 배지 입자들의 집단이 약 5.5 중량% 이하의 평균 수분 함량을 갖는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 N은 응집 영양 배지 입자들의 집단이 약 0.2 내지 약 0.5 g/㎤의 루스 벌크 밀도를 갖는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 O는 1가지 이상의 분말형 영양소가 단백질 가수분해물, 탄수화물, 염, 및 이들의 임의의 2가지 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 영양소를 포함하는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 P는 건조된 응집 영양 배지에 대해, 건조된 응집 영양 배지 중의 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함하는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 Q는 건조된 응집 영양 배지에 대해, 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계가 건조된 응집 영양 배지를 이온화 방사선에 또는 에틸렌 옥사이드 증기에 노출시키는 단계를 포함하는, 실시 형태 P의 방법이다.
실시 형태 R은 분말형 영양소가, 재수화될 때, 완충 펩톤수 배지를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 락토스 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, UVM 변형 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 완충된 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 효모 추출물 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 R10 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트-시스틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, EC 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 영양 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 레틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 데이/엔글리 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 뇌 심장 주입 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 절반-강도 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법이다.
실시 형태 S는 전술한 실시 형태들 중 어느 한 실시 형태의 방법에 의해 생성되는 건조된 유동성 응집 영양 배지를 포함하는 조성물이다.
실시 형태 T는 특정 질량의 건조된 응집 영양 배지가, 응집 영양 배지가 그로부터 제조된 동일 질량의 분말형 영양소보다 더 빠르게 수성 용매에 용해되는, 실시 형태 S의 조성물이다.
실시 형태 U는 수성 매질과 배합될 때 미생물의 성장을 촉진하는 혼합물을 형성하는 응집 입자들을 포함하는 응집 영양 배지를 포함하는 조성물로서, 집단 내의 입자들 중 약 30 중량% 이상은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터이며, 벌크 입자 밀도는 약 0.2 내지 약 0.5 g/㎤인, 조성물이다.
실시 형태 V는 집단 내의 입자들 중 약 70 중량% 이상이 약 105 내지 841 마이크로미터의 유효 직경을 갖는, 실시 형태 U의 조성물이다.
실시 형태 W는 응집 영양 배지가 분말형 영양소를 포함하며, 분말형 영양소는, 재수화될 때, 완충 펩톤수 배지를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 락토스 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, UVM 변형 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 완충된 리스테리아 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 트립티카아제 소이 효모 추출물 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 풍부화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 라파포트-바실리아디스 R10 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트-시스틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, EC 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 영양 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 레틴 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 데이/엔글리 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 중화 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 셀레나이트 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 뇌 심장 주입 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 절반-강도 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 재수화될 때, 프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물; 및 재수화될 때, 데미-프레이저 브로쓰를 형성하는 분말들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 실시 형태 U 또는 실시 형태 V의 조성물이다.
실시 형태 X는 실시 형태 S 내지 실시 형태 W 중 어느 한 실시 형태의 조성물을 포함하는 캡슐, 정제 또는 사쉐이다.
실시 형태 Y는 실시 형태 S 내지 실시 형태 X 중 어느 한 실시 형태의 캡슐, 정제, 사쉐 및/또는 조성물을 포함하는 키트이다.
실시 형태 Z는 조성물이 사전결정된 질량의 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 패키지 내에 배치되며, 사전결정된 질량은 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L, 또는 3.375 L의 수성 희석제와 혼합되어 미생물의 성장을 촉진할 수 있는 재구성 배지를 생성하도록 선택되는, 실시 형태 Y의 키트이다.
실시 형태 AA는 백, 보틀, 및 샘플 획득 기구로 이루어진 군으로부터 선택되는 물품을 추가로 포함하는, 실시 형태 Y 또는 실시 형태 Z의 키트이다.
실시 형태 BB는 선택제 및/또는 지시 시약을 추가로 포함하는, 실시 형태 Y 내지 실시 형태 AA 중 어느 한 실시 형태의 키트이다.
실시 형태 CC는 박막 배양 장치로서, 이는
제1 주 표면 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 방수 기재;
제1 주 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착제 층;
접착제 층의 적어도 일부분 상에 배치된 실시 형태 S 내지 실시 형태 W 중 어느 한 실시 형태의 조성물을 포함하는 코팅; 및
영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 냉수 용해성의 건조형 겔화제를 포함한다.
실시 형태 DD는 기재의 적어도 일부분에 결합된 커버 시트를 추가로 포함하며, 커버 시트는 제1 주 표면과 대면하는 제1 면을 갖는, 실시 형태 CC의 박막 배양 장치이다.
실시 형태 EE는 겔화제가 커버 시트의 제1 면에 접착되는, 실시 형태 DD의 박막 배양 장치이다.
본 발명의 목적과 이점이 하기 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이들 실시예에서 언급되는 특정 물질 및 이의 양뿐만 아니라 다른 조건과 세부사항은 본 발명을 지나치게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예
[표 1]
Figure pct00001
시험 방법
응집된 샘플의 입자 크기 결정:
실시예 1 내지 실시예 6 및 실시예 9에 있어서, 응집된 샘플을 20, 40, 60, 및 140 메시의 스크린을 통과시켰다. 각각의 스크리닝 절차에 있어서, 스크린을 통과하지 못한 물질의 분획물을 수집하고, 칭량하였다.
루스 벌크 밀도:
샘플 물질을 눈금이 매겨진 50 mL의 실린더 내에, 20 mL의 표시까지 부었다. 첨가된 물질의 순 중량을 기록하고, 루스 벌크 밀도를 샘플 부피에 대한 샘플 중량의 비 (g/mL)로서 결정하였다. 이중 측정치를 각각의 샘플에 대하여 취하고, 벌크 밀도를 평균 값으로 기록하였다.
용해 시간:
BPW (ISO) 샘플에 있어서, 고체 물질 (2.55 g)을 실온으로 유지한 100 mL의 탈이온수를 수용하는 유리병 (4 cm의 직경)에 단일 부분으로 첨가하였다. 상기 액체에 교반을 제공하지 않았다. 육안 검사에 의해 결정할 때, 전체 샘플이 용해되는 데 요구되는 시간을 용해 시간으로 기록하였다. 이중 측정치를 각각의 샘플에 대하여 취하고, 용해 시간을 평균 값으로 기록하였다.
TSB에 있어서 3.4 g의 샘플을 사용하고 mLRB에 있어서 4.4 g의 샘플을 사용한 것을 제외하고는 TSB 및 mLRB 응집 샘플에서 동일한 절차를 이용하였다.
수분 함량:
샘플들을 칼 피셔 분석법에 의해 수분 함량 (물 (%))에 대하여 분석하였다. 시험 샘플은 10 mL의 무수 메탄올 (미국 펜실베이니아주 센터 밸리 소재의 아반토르 퍼포먼스 머티리얼즈(Avantor Performance Materials))을 수용하는 바이알(vial)에 0.1 g의 샘플 물질을 첨가함으로써 제조하였다. 상기 바이알을 밀봉하고, (질소 분위기 하에서) 드라이 박스(dry box) 내에 하룻밤 보관하였다. 이중 바이알을 각각의 샘플에 대하여 제조하였다. 추출물(0.1 내지 0.3 g)의 분취물을 각각의 바이알로부터 꺼내고, 모델 756 KF 쿨로미터(Coulometer) (스위스 헤리사우 소재의 메트롬 아게(Metrohm AG)) 내에 주입하였다. 아쿠아스타(Aquastar)(등록상표) 쿨로맷(Coulomat) A (미국 매사추세츠주 빌레리카 소재의 이엠디 밀리포어)를 분석 용액으로서 사용하였다. 수분 함량의 측정을 각각의 바이알에 대하여 삼중으로 하였다. 이중 시험 샘플을 제조할 때, 각각의 샘플에 대하여 행해진 총 측정수는 6회였다. 시험 방법은 NIST SRM 2890 공인된 하이드라날(Hydranal)(등록상표) 워터 스탠다드(Water Standard) 1.00 (1.001 +/- 0.003 mg/g, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 코포레이션(Sigma-Aldrich Corporation))을 사용하여 표준화하였다.
실시예 1
완충 펩톤수 (ISO) 분말 (50 g)을, 공기 유동을 130 리터/분(liters per minute; LPM)으로 설정하여, 65℃의 입구 공기 온도를 이용하여 예열한 VFC-랩 마이크로 플로-코터(Lab Micro Flo-Coater)(등록상표) (미국 아이오와주 마리온 소재의 프레운트-벡터 코포레이션(Freund-Vector Corporation))의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템(fluid bed system)의 상부 상에 탑재하고, 탈이온수를 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 120 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 265 mbar; 초기 입구 온도 = 65℃; 초기 배기 온도 = 41℃; 필터 펄스 = 1초; 초기 펌프 속도 = 5 rpm. 응집 공정 동안 입구 온도 및 펌프 속도를 조정하여 39 내지 42℃의 배기 온도를 유지하였다. 30.1 g의 탈이온수를 사용한 후 탈이온수 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 45℃에 도달할 때까지 (약 5 내지 10분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 그 후, 건조된 생성물을 스크린을 통해 체질하여 입자 크기 분포를 결정하였다 (표 2). 20 내지 140 메시에서 수집한 물질을 루스 벌크 밀도 및 용해 시간에 대하여 시험하였다 (표 3).
[표 2]
Figure pct00002
[표 3]
Figure pct00003
실시예 2
완충 펩톤수 (ISO) 분말 (50 g)을, 공기 유동을 130 리터/분(LPM)로 설정하여, 65℃의 입구 온도를 이용하여 예열한 VFC-랩 마이크로 플로-코터(등록상표) (미국 아이오와주 마리온 소재의 프레운트-벡터 코포레이션)의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템의 상부 상에 탑재하였다. 탈이온수 중 BPW의 5% (부피에 대한 중량) 용액을 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 131 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 315 mbar; 초기 입구 온도 = 65℃; 초기 배기 온도 = 41℃; 필터 펄스 = 1초; 초기 펌프 속도 = 5 rpm. 응집 공정 동안 입구 온도 및 펌프 속도를 조정하여 39 내지 42℃의 배기 온도를 유지하였다. 20.0 g의 5% BPW 용액을 사용한 후 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 45℃에 도달할 때까지 (약 5 내지 10분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 그 후, 건조된 생성물을 스크린을 통해 체질하여 입자 크기 분포를 결정하였다 (표 4). 20 내지 140 메시에서 수집한 물질을 루스 벌크 밀도에 대하여 시험하였다 (표 5).
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
실시예 3
탈이온수 중 BPW의 7.5% (부피에 대한 중량) 용액을 5% 용액 대신 응집 액체로서 사용한 것을 제외하고는 실시예 2에 설명한 것과 동일한 절차에 따랐다. 입자 크기 분포가 표 6에 보고되어 있다. 20 내지 140 메시에서 수집한 물질을 루스 벌크 밀도에 대하여 시험하였다 (표 7).
[표 6]
Figure pct00006
[표 7]
Figure pct00007
실시예 4
트립틱 소이 브로쓰 분말 (50 g)을, 공기 유동을 130 리터/분(LPM)로 설정하여, 65℃의 입구 온도를 이용하여 예열한 VFC-랩 마이크로 플로-코터(등록상표) (미국 아이오와주 마리온 소재의 프레운트-벡터 코포레이션)의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템의 상부 상에 탑재하고, 탈이온수를 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 170 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 250 mbar; 초기 입구 온도 = 65℃; 초기 배기 온도 = 41℃; 필터 펄스 = 1초; 초기 펌프 속도 = 5 rpm. 응집 공정 동안 입구 온도 및 펌프 속도를 조정하여 39 내지 42℃의 배기 온도를 유지하였다. 30.0 g의 탈이온수를 사용한 후 탈이온수 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 45℃에 도달할 때까지 (약 5 내지 10분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 그 후, 건조된 생성물을 스크린을 통해 체질하여 입자 크기 분포를 결정하였다 (표 8). 20 내지 140 메시에서 수집한 물질을 루스 벌크 밀도 및 용해 시간에 대하여 시험하였다 (표 9).
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
실시예 5
변형 리스테리아 회복 브로쓰 분말 (50 g)을, 공기 유동을 130 리터/분(LPM)로 설정하여, 65℃의 입구 온도를 이용하여 예열한 VFC-랩 마이크로 플로-코터(등록상표) (미국 아이오와주 마리온 소재의 프레운트-벡터 코포레이션)의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템의 상부 상에 탑재하고, 탈이온수를 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 190 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 250 mbar; 초기 입구 온도 = 65℃; 초기 배기 온도 = 43℃; 필터 펄스 = 1초; 초기 펌프 속도 = 5 rpm. 응집 공정 동안 입구 온도 및 펌프 속도를 조정하여 40 내지 43℃의 배기 온도를 유지하였다. 30.0 g의 탈이온수를 사용한 후 탈이온수 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 45℃에 도달할 때까지 (약 5 내지 10분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 그 후, 건조된 생성물을 스크린을 통해 체질하여 입자 크기 분포를 결정하였다 (표 10). 20 내지 140 메시에서 수집한 물질을 루스 벌크 밀도 및 용해 시간에 대하여 시험하였다 (표 11).
[표 10]
Figure pct00010
[표 11]
Figure pct00011
실시예 6
실시예 1로부터의 응집된 BPW (ISO) 생성물 (20 내지 140 메시 샘플 2.55 g)을, 실온에서 유지한 100 mL의 탈이온수를 수용하는 150 mL 유리 비커 (6 cm의 직경)에 단일 부분으로 빠르게 첨가하였다. 어떠한 교반도 없이 30초 동안 정치시킨 후, 상기 비커의 내용물을 뷔흐너(Buchner) 깔때기를 사용하여 와트만(Whatman)™ #54 여과지 (55 mm의 직경)를 통해 진공 여과시켰다. 회수된 고체 물질을 오븐 (60℃)에서 3시간 동안 건조시키고, 그 후 칭량하였다.
분말형 BPW (ISO) 및 과립형 BPW (ISO)를 이용하여 동일 절차를 행하였다. 실시예 1의 응집된 BPW (ISO) 생성물과 분말형 BPW (ISO) 및 과립형 BPW (ISO)를 비교한 용해 효율 결과가 표 12에 보고되어 있다.
[표 12]
Figure pct00012
실시예 7
실시예 5로부터의 응집된 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 생성물 (20 내지 140 메시 샘플 1.5 g)을, 실온에서 유지한 50 mL의 탈이온수를 수용하는 150 mL 유리 비커 (6 cm의 직경)에 단일 부분으로 빠르게 첨가하였다. 어떠한 교반도 없이 30초 동안 정치시킨 후, 상기 비커의 내용물을 뷔흐너 깔때기를 사용하여 와트만™ #54 여과지 (55 mm의 직경)를 통해 진공 여과시켰다. 회수된 고체 물질을 오븐 (60℃)에서 3시간 동안 건조시키고, 그 후 칭량하였다.
과립형 TSB 및 분말형 TSB를 이용하여 동일 절차를 행하였다. 실시예 4의 응집된 TSB 생성물과 분말형 TSB 및 과립형 TSB를 비교한 용해 효율 결과가 표 13에 보고되어 있다.
[표 13]
Figure pct00013
실시예 8
완충 펩톤수 (ISO) 분말 (1 Kg)을, 공기 유동을 62 LPM으로 설정하여, 70℃의 입구 온도를 이용하여 예열한 벡터 FL-M-1 플로-코터(등록상표) (미국 아이오와주 마리온 소재의 프레운트-벡터 코포레이션)의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 표준 바닥 스크린에 더하여, 제2 미세 메시 더치 위브(Dutch weave) 스크린을 이용하여 분말이 유동층을 횡단하는 것을 방지하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템의 상부 상에 탑재하고, 탈이온수를 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 108 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 827 mbar; 초기 입구 온도 = 70℃; 초기 배기 온도 = 41℃; 초기 펌프 속도 = 8 내지 10 rpm; 필터 펄스 = 10 내지 20초. 응집 공정 동안, 배기 온도를 모니터링하고, 입구 온도 및 펌프 속도의 조정에 의해 39 내지 42℃에서 유지하였다. 450 g의 탈이온수를 사용한 후, 탈이온수 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 43℃에 도달할 때까지 (약 5분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 건조된 응집 생성물의 루스 벌크 밀도는 0.40 g/mL였다. 그 후, 건조된 응집 생성물을 스크린을 통해 체질하여 입자 크기 분포를 결정하였다 (표 14). 응집된 생성물과, 체질을 통해 제조된 다양한 분획물의 용해 시간을 상기에 설명한 시험 방법을 이용하여 결정하였다. 그 결과가 표 15에 제시되어 있다.
[표 14]
Figure pct00014
[표 15]
Figure pct00015
실시예 9
하기 물질들 각각의 평균 수분 함량 (물 (%))을 상기에 설명한 시험 방법을 이용하여 결정하였다: 응집된 BPW (ISO) 물질 (실시예 1, 실시예 2 및 실시예 8로부터의 것); 응집된 TSB 물질 (실시예 4로부터의 것); BPW (ISO) 분말 (쓰리엠 코포레이션으로부터 획득함); 및 TSB 분말 (벡톤, 디킨슨 컴퍼니로부터 획득함). 그 결과가 표 16에 제시되어 있다.
[표 16]
Figure pct00016
실시예 10
실시예 1의 응집된 BPW (ISO) 생성물 (20 내지 140 메시 샘플 2.56 g)을 증류수 (100 mL)에 희석시킴으로써 배양 배지 브로쓰를 제조하였다. 생성된 용액을 0.2 마이크로미터 수포르(Supor)(등록상표) 시린지 필터 (미국 미시간주 앤 아버 소재의 폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences))를 통한 여과에 의해 살균하였다. 상기 용액의 pH를 측정하였더니 대략 7.0이었다 (베크만(Beckman) Ф350 pH 미터(Meter)). 박테리아 주 이. 콜라이(E.coli) 0157:H7 (ATCC 700728), 이. 콜라이 (ATCC 25922), 에스. 엔테리디티스(S. enteriditis) (ATCC13076), 에스. 타이피(S. typhi) (ATCC14028), 및 피. 아에루기노사(P. aeruginosa) (ATCC 27853)를 미국 버지니아주 머내서스 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)으로부터 획득하였다. 미생물의 순수 배양물을 트립틱 소이 브로쓰 (미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재의 벡톤, 디킨슨 컴퍼니) 내에 접종하고 37℃에서 하룻밤 인큐베이션함으로써 박테리아 현탁액을 제조하였다. 그 후, 개별 박테리아 주 현탁액들 각각을 버터필드 희석제(Butterfield's Diluent) (미국 미네소타주 세인트 폴 소재의 쓰리엠 컴퍼니)를 이용하여 약 105 cfu/mL의 농도로 희석시켰다.
팔콘(Falcon)™ 클리어 96웰 마이크로테스트(Clear 96-Well Microtest)™ 플레이트 (벡톤, 디킨슨 컴퍼니)를 이용하여, 개별 박테리아 희석물 (105 cfu/mL) 25 마이크로리터를 225 마이크로리터의 배양 배지 브로쓰 내에 스파이크하였다(spiked) (각각의 박테리아 주에 대하여 4회 반복). 마이크로타이터(microtiter) 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 파워웨이브(PowerWave)™ 마이크로플레이트 판독기(Microplate Reader) (미국 버몬트주 위누스키 소재의 바이오테크 코포레이션(BioTek Corporation))에서 인큐베이션하였다. 각각의 박테리아 주의 성장 속도를 1시간의 간격으로 흡광도 (640 nm에서)를 측정함으로써 결정하였다. 마이크로타이터 플레이트를 각각의 측정 전 5초 동안 진탕시켰다. 박테리아 주 각각의 흡광도 판독치가 표 17 내지 표 21에 보고되어 있다.
비교 목적을 위하여, 응집된 BPW (ISO) 대신 BPW (ISO) 분말 (공급원: 쓰리엠 코포레이션)을 사용하여 배양 배지 브로쓰를 제조하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 절차를 이용하여 박테리아 주 각각에 대한 유사한 성장 연구를 행하였다. 이들 비교 연구의 결과가 표 17 내지 표 21에 또한 예시되어 있다. 데이터는 각각의 유기체가, 대략적으로 이것이 재구성 분말형 BPW에서 그러한 것만큼 빠르게 재구성 응집 BPW 배지에서 성장하였음을 나타낸다.
[표 17]
Figure pct00017
[표 18]
Figure pct00018
[표 19]
Figure pct00019
[표 20]
Figure pct00020
[표 21]
Figure pct00021
실시예 11
응집 완충 펩톤수를 개별 성분들로부터 출발하여 제조하였다. 성분들 전부는 분말형이었다 (분말은 100 메시 체를 통과하기에 충분히 미세하였다). 제일인산칼륨 (15 g), 인산수소이나트륨 (30 g), 염화나트륨 (50 g), 펩톤 (100 g, 미국 메릴랜드주 볼티모어 소재의 알파 바이오사이언시즈(Alpha Biosciences)), 및 추적 염료인 페놀 레드 (0.6 g, 시그마-알드리치 코포레이션)를 VFC-랩 마이크로 플로-코터(등록상표)(미국 아이오와주 마리온 소재의 프로인트-벡터 코포레이션)의 응집 챔버 내에 로딩하였다. 상기 물질들을 공기 유동을 70 LPM으로 하여 상기 응집 챔버에서 실온에서 20분 동안 블렌딩하였다. 블렌딩 단계 후, 상기 물질들을 실시예 1에 설명된 공정과 유사한 방식으로 응집시켰다. 공기 유동을 90 LPM으로 설정하여, 85℃의 입구 온도를 이용하여 상기 유닛을 가열하였다. 스프레이 포트를 유동층 시스템의 상부 상에 탑재하고, 탈이온수를 응집 액체로서 사용하였다. 하기 기기 설정치를 이용하여 응집을 행하였다: 공기 유동 = 90 LPM; 분무기 노즐 공기 압력 = 265 mbar; 초기 입구 온도 = 85℃; 초기 배기 온도 = 45℃; 초기 펌프 속도 = 16 rpm; 필터 펄스 = 1초. 응집 공정 동안, 배기 온도를 모니터링하고, 입구 온도 및 펌프 속도의 조정에 의해 42 내지 45℃에서 유지하였다. 50 g의 탈이온수를 사용한 후, 탈이온수 스프레이를 중지하였다. 배기 온도가 45℃에 도달할 때까지 (약 5 내지 10분), 생성된 응집된 샘플을 유동층에서 건조시켰다. 응집된 생성물을 응집된 물질 중 개별 성분들의 균일한 분포에 대하여 평가하였다. 3개의 샘플 (1 g)을 벌크 물질로부터 랜덤하게 선택하였다. 각각의 샘플을 0.1 g/mL의 농도로 물에 용해시키고, 흡광도 값을 UV-가시선 분광 광도계를 사용하여 550 nm에서 측정하였다. 3개의 샘플의 평균 흡광도 측정치는 0.520이고, 표준 편차는 0.009였으며, 이는 벌크 생성물 중 개별 성분들의 균일한 분포를 나타내는 것이었다.
실시예 12
샘플 흡광도를 기반으로 한 시험 방법을 이용하여, 실시예 1의 응집 방법에 의해 제조된 응집된 생성물과, 체질을 통해 제조된 다양한 분획물의 용해 시간을 결정하였다. 50 mL의 탈이온수 (23℃의 수온)를 수용하는 100 mL의 비커를 수동 실험실용 잭 (수직 방향으로 가변적 높이 조정)의 플랫폼(platform) 상에 두었다. 16.5 인치의 스테인리스강 바스켓 샤프트(basket shaft) (카탈로그 번호: 11010-006, 미국 펜실베이니아주 래드너 소재의 브이더블유알 사이언티픽(VWR Scientific))를 갖춘 IKA RW 20 디지털 오버헤드 교반기(Digital Overhead Stirrer) (미국 노스캐롤라이나주 윌밍턴 소재의 아이케이에이 웍스 인크.(IKA Works Inc.))를 상기 비커 위에 위치시켰다. 응집된 물질 (2.0 g)을 100 메시의 스테인리스강 바스켓 (카탈로그 번호: 89049-188, 브이더블유알 사이언티픽)에 조심스럽게 첨가하고, 상기 바스켓을 샤프트 상의 스프링 스타일 클립(spring style clip)을 이용하여 샤프트의 단부에 부착시켰다. 교반 샤프트를 450 rpm으로 회전하도록 설정하고, 실험실용 잭을 빠르게 상승시켜서, 회전 바스켓의 전체 메시 부분이 물 중에 침잠되게 하였다 (이는 물 중 전체 샘플의 침잠을 보장함). 시간의 기록은 바스켓이 물과 접촉하는 순간 시작하였다. 분취물 (500 마이크로리터)을 30초, 60초, 120초, 180초, 300초, 및 600초의 시점에 비커로부터 꺼냈다. 각각의 샘플을 투명 96웰 플레이트 내의 웰 내에 분배하고, 바이오테크 시너지(Synergy) MX 마이크로플레이트 판독기 (미국 버몬트주 위누스키 소재의 바이오테크 유에스(BioTek US))를 이용하여 310 nm에서 흡광도 측정치를 취하였다. 용해 결과가 표 22에 보고되어 있다. 각각의 시점에서의 흡광도를, 샘플에 대한 최대 흡광도 측정치를 나타내는 1.0의 흡광도 값을 이용하여 정규화하였다.
분말형 BPW (ISO) 및 과립형 BPW (ISO)를 이용하여 동일 절차를 또한 행하였다.
[표 22]
Figure pct00022
실시예 13
실시예 1의 절차를 이용하여 제조한 응집된 BPW (ISO) 생성물 (20 내지 140 메시 샘플 2.55 g)을, 실온에서 유지한 100 mL의 탈이온수를 수용하는 150 mL 유리 비커 (6 cm의 직경)에 단일 부분으로 빠르게 첨가하였다. 어떠한 교반도 없이 30초 동안 정치시킨 후, 상기 비커의 내용물을 와트만™ #54 여과지 (55 mm의 직경)의 사전칭량된 시트를 갖춘 뷔흐너 깔때기를 사용하여 진공 여과시켰다. 진공 여과 단계를 5초 미만 내에 완료하였다. 회수된 응집 BPW (ISO) 생성물을 포함하는 여과지를 상기 깔때기로부터 조심스럽게 꺼내고, 오븐 (80℃)에서 15시간 동안 건조시키고, 그 후 건조기(dessicator)에서 실온으로 냉각시켰다. 건조된 생성물을 포함하는 여과지를 칭량하고, 여과지의 중량을 이 값으로부터 차감하여 비용해된 응집 BPW (ISO) 생성물의 중량을 제공하였다.
응집된 BPW (ISO) 생성물의 6개의 추가의 체질된 분획물 (<20 메시, 20 내지 40 메시, 40 내지 60 메시, 60 내지 100 메시, 100 내지 140 메시, 및 >140 메시)을 이용하여 동일 절차를 행하였다. 분말형 BPW (ISO) 및 과립형 BPW (ISO)를 이용하여 동일 절차를 또한 행하였다. 응집된 BPW (ISO) 생성물과 분말형 BPW (ISO) 및 과립형 BPW (ISO)를 비교한 용해 효율 결과가 표 23에 보고되어 있다.
[표 23]
Figure pct00023
모든 특허, 특허 출원, 및 공보, 그리고 전자적으로 입수가능한 본 명세서에서 언급된 자료의 완전한 개시 내용이 참고로 포함된다. 본 출원의 개시 내용과 본 명세서에 참고로 포함되는 임의의 문헌의 개시 내용(들) 사이에 임의의 모순이 존재하는 경우, 본 출원의 개시 내용이 좌우할 것이다. 상기 상세한 설명 및 실시예들은 단지 명확한 이해를 위해 주어졌다. 이로부터 어떠한 불필요한 제한 사항도 이해되지 않을 것이다. 당업자에게 자명한 변화가 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명의 범주 내에 포함될 것이므로, 본 발명은 도시되고 설명된 정확한 상세 사항으로 제한되지 않는다.
모든 표제는 독자의 편리함을 위한 것이며, 그렇게 특정되지 않는 한 표제 이후의 본문의 의미를 한정하기 위하여 사용되어서는 안된다.
본 발명의 사상 및 범주로부터 벗어남이 없이 다양한 변경이 이루어질 수 있다. 이들 및 다른 실시 형태는 하기의 특허청구범위의 범주 내에 있다.

Claims (20)

  1. 유동성 응집 영양 배지(agglomerated nutrient medium)를 제조하는 방법으로서,
    미생물의 성장을 촉진하는 영양 성분을 포함하는 분말형 영양소를 유동층형(fluidized bed-type) 응집 챔버에 넣는 단계,
    유동화 가스를 상기 챔버를 통해 유동시키는 단계,
    상기 응집 챔버 내에서, 상기 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계
    에 의해 영양 배지 조성물을 형성하는 단계; 및
    상기 조성물을 상기 챔버로부터 수집하는 단계를 포함하며,
    상기 조성물은 응집 영양 배지 입자들의 집단 및 선택적으로 비응집 분말형 영양소를 포함하고,
    상기 집단은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터인 응집 영양소 입자들을 약 30 중량% 이상 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 집단 내의 입자들 중 약 70 중량% 이상은 유효 입자 직경이 약 105 내지 841 마이크로미터인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 집단 내의 입자들 중 10 중량% 미만은 유효 입자 직경이 약 105 마이크로미터 이하인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 응집 영양 배지 입자들의 하위집단(subpopulation)을 단리하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하위집단은 사전결정된 유효 입자 직경을 갖는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집 액체는 결합제 및/또는 미생물의 성장을 촉진하는 영양소가 용해된 용매를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분말형 영양소는 2가지 이상의 분말형 영양소의 실질적으로 균일한 혼합물을 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분말형 영양소를 응집 액체의 에어로졸 스프레이와 접촉시키는 단계는 상기 분말형 영양소를 사전결정된 부피의 응집 액체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 물품.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유동화 가스는 상기 유동화 가스가 상기 응집 챔버에 진입할 때 제1 온도를 가지며, 상기 유동화 가스의 상기 제1 온도는 약 50℃ 내지 약 90℃인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유동화 가스는 상기 응집 챔버의 스프레잉 구역(spraying zone)에서 제2 온도를 가지며, 상기 유동화 가스의 상기 제2 온도는 약 35℃ 내지 약 50℃인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집 영양 배지 입자들의 집단은 평균 수분 함량이 약 5.5 중량% 이하인, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집 영양 배지 입자들의 집단은 겉보기 밀도(loose bulk density)가 약 0.2 내지 약 0.5 g/cm3인, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1가지 이상의 분말형 영양소는 단백질 가수분해물, 탄수화물, 염, 및 이들의 임의의 2가지 이상의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 영양소를 포함하는, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조된 응집 영양 배지에 대해, 상기 건조된 응집 영양 배지 중의 생존가능 미생물의 수를 감소시키는 공정을 실시하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 분말형 영양소를 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계는 복수의 분말형 영양소를 상기 유동층형 응집 챔버에 넣는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는 건조된 유동성 응집 영양 배지를 포함하는, 조성물.
  16. 수성 매질과 배합될 때 미생물의 성장을 촉진하는 혼합물을 형성하는 응집 입자들을 포함하는 응집 영양 배지를 포함하는 조성물로서, 입자 집단 내의 상기 입자들 중 약 30 중량% 이상은 유효 입자 직경이 약 250 내지 400 마이크로미터이며, 겉보기 밀도는 약 0.2 내지 약 0.5 g/cm3인, 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항의 조성물을 포함하는, 캡슐, 정제, 또는 사쉐(sachet).
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 캡슐, 정제, 사쉐, 및/또는 조성물을 포함하는, 키트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 사전결정된 질량의 건조된 응집 영양 배지를 포함하는 패키지(package) 내에 배치되며, 상기 사전결정된 질량은 9.9 mL, 10 mL, 90 mL, 99 mL, 100 mL, 225 mL, 1.0 L, 또는 3.375 L의 수성 희석제와 혼합되어 미생물의 성장을 촉진할 수 있는 재구성 배지(reconstituted medium)를 생성하도록 선택되는, 키트.
  20. 박막 배양 장치로서,
    제1 주 표면(major surface) 및 제2 주 표면을 갖는 자가-지지형 방수 기재(self-supporting waterproof substrate);
    상기 제1 주 표면의 적어도 일부분 상에 배치된 접착제 층;
    상기 접착제 층의 적어도 일부분 상에 배치된 제15항 또는 제16항의 조성물을 포함하는 코팅; 및
    영양 배지와 유체 접촉하도록 위치된 냉수 용해성의 건조형 겔화제를 포함하는, 박막 배양 장치.
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