JP2019071890A - 微生物用集塊状培地を作製する方法、及びその組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮出願特許第61/680,449号(2012年8月7日出願)及び米国仮出願特許第61/773,852号(2013年3月7日出願)に記載の利益を主張するものであり、これらは参照によりその全体が本願に援用される。
本開示の方法は、集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させる工程を含む。粉末状栄養分は、微生物(例えば、細菌、酵母、カビ)の増殖を促進する少なくとも1つの栄養成分を含む。任意の実施形態では、栄養成分は、微生物の増殖を促進する2つ以上の栄養分の混合物を含み得る。好適な栄養分の非限定例としては、炭水化物(例えば、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、又は多糖類)、タンパク質、タンパク質加水分解物、細胞抽出物(例えば、酵母エキス)、塩、緩衝剤成分、選択剤(例えば、抗生物質)、及び前述の栄養分のうち2つ以上の組み合わせが挙げられる。
集塊液は、より小さな個々の栄養成分粒子(例えば、粉末粒子)の、より大きな集塊状粒子への集塊を促進するため、集塊チャンバに噴霧される。任意の実施形態では、集塊液は、水(例えば、滅菌及び/又は脱イオン水)を含み得る。任意の実施形態では、集塊液は、本質的に水(例えば、滅菌及び/又は脱イオン水)から構成され得る。任意の実施形態では、集塊液は、水(例えば、滅菌及び/又は脱イオン水)から構成され得る。任意の実施形態では、集塊液は、有機溶媒(例えば、エタノール、イソプロパノール)を含み得る。
実施形態Aは、流動性の集塊状栄養培地を作製するための方法であり、方法は、
微生物の増殖を促進する栄養成分を含む粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することと、
流動化ガスをチャンバに貫流することと、
集塊チャンバ内で、粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることにより栄養培地組成物を生成する工程、及び、
チャンバから組成物を回収する工程、を含み、
組成物は、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に、非集塊状粉末状栄養分を含み、
粒子群は少なくとも約30重量%集塊状栄養粒子約250〜400ミクロンの有効粒子径を有する。
第1及び第2主表面を有する自己支持性防水基材と、
第1主表面の少なくとも一部分上に配置された接着層と、
接着層の少なくとも一部分上に配置された実施形態S〜Wのいずれか1つに記載の組成物を含むコーティングと、
栄養培地により流動式に接触されるよう配置された乾燥型冷水溶解性ゲル化剤と、を含む、装置である。
集塊化したサンプルの粒度測定:
実施例1〜6及び実施例9のため、集塊化したサンプルを20、40、60、及び140メッシュのスクリーンに通過させた。各スクリーニング手順に関し、スクリーンを通過しなかった材料画分を回収し、計量した。
サンプル物質を50mLメスシリンダーの20mLのメモリまで注ぎ入れた。加えた物質の正味重量を記録し、かつゆるみかさ密度を、サンプルの体積に対するサンプル重量(g/mL)の比として求めた。各サンプルに関し、複数の測定値を得て、かさ密度を平均値として記録した。
BPW(ISO)サンプルに関し、室温に維持した脱イオン水100mLを入れたガラス瓶(直径4cm)に、固体材料(2.55g)を1度に加えた。液体の撹拌は行わなかった。視認により測定したときに、サンプルが完全に溶解するまでにかかった時間を溶解時間として記録した。各サンプルに関し、複数の測定値を得て、溶解時間を平均値として記録した。
カール・フィッシャー解析によりサンプルの含水量(水%)を分析した。10mL無水メタノール(Avantor Performance Materials,Center Valley,PA)を入れたバイアルに0.1gのサンプル材料を入れ、試験サンプルを調製した。バイアルを密閉し、一晩乾燥ボックス内で保管した(窒素雰囲気下)。各サンプルに関し、バイアルは重複させて2つずつ調製した。各バイアルから抽出物のアリコート(0.1〜0.3g)を回収し、モデル756 KF電量計(Metrohm AG,Herisau,Switzerland)に注入した。Aquastar(登録商標)Coulomat A(EMD Millipore,Billerica,MA)を分析質として使用した。含水量の測定は各バイアル3回ずつ行った。試験サンプルは重複させて2つずつ調製したことから、各サンプルの測定値は、計6つずつ存在した。試験方法は、NIST SRM 2890 certified Hydranal(登録商標)Water Standard 1.00(1.001+/−0.003mg/g,Sigma−Aldrich Corporation,St.Louis,MO)を使用して標準化した。
空気流を130L/分(LPM)(2.2L/秒(L/s))に設定し、65℃の吸気温度を使用して予熱した、VFC−Lab Micro Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation,Marion,IA)の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水(ISO)粉末(50g)を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=120LPM(2L/s);噴出器ノズルの空気圧=265mbar(26500Pa);初期入口温度=65℃;初期排気温度=41℃;フィルター・パルス=1秒;初期ポンプ速度=5rpm。排気温度を39〜42℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。30.1gの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が45℃に達するまで(約5〜10分)流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した(表2)。20〜140メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した(表3)。
空気流を130L/分(LPM)(2.2L/秒(L/s))に設定し、65℃の入り口温度を使用して予熱した、VFC−Lab Micro Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation,Marion,IA)の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水(ISO)粉末(50g)を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付けた。5%(重量/体積)BPW水溶液(脱イオン水)を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=131LPM(2.2L/s);噴出器ノズルの空気圧=315mbar(31500Pa);初期入口温度=65℃;初期排気温度=41℃;フィルター・パルス=1秒;初期ポンプ速度=5rpm。排気温度を39〜42℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。20.0gの5% BPW溶液の使用後、噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が45℃に達するまで(約5〜10分)流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した(表4)。20〜140メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度に関し試験した(表5)。
5%(重量/体積)BPW水溶液(脱イオン水)の代わりに、7.5%溶液を集塊液として使用したこと以外は、実施例2において記載されるのと同様の手順を行った。粒度分布を表6に掲載する。20〜140メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度に関し試験した(表7)。
空気流を130L/分(LPM)(2.2L/s)に設定し、65℃の入り口温度を使用して予熱した、VFC−Lab Micro Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation,Marion,IA)の集塊チャンバに、トリプチックソイブロス粉末(50g)を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=170LPM(2.8L/s);噴出器ノズルの空気圧=250mbar(25000Pa);初期入口温度=65℃;初期排気温度=41℃;フィルター・パルス=1秒;初期ポンプ速度=5rpm。排気温度を39〜42℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。30.0gの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が45℃に達するまで(約5〜10分)流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した(表8)。20〜140メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した(表9)。
空気流を130L/分(LPM)(2.2L/秒(L/s))に設定し、65℃の入り口温度を使用して予熱した、VFC−Lab Micro Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation,Marion,IA)の集塊チャンバに、改変リステリア回復ブロス(50g)を装填した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=190LPM(3.2L/s);噴出器ノズルの空気圧=250mbar(25000Pa);初期入口温度=65℃;初期排気温度=43℃;フィルター・パルス=1秒;初期ポンプ速度=5rpm。排気温度を40〜43℃に維持するため、集塊プロセス中には入口温度及びポンプ速度を調節した。30.0gの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が45℃に達するまで(約5〜10分)流動層で乾燥した。次に、乾燥した生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した(表10)。20〜140メッシュ間に回収された材料を、ゆるみかさ密度及び溶解時間に関し試験した(表11)。
室温に維持した脱イオン水100mLを入れた150mLガラスビーカー(直径6cm)に、実施例1のBPW(ISO)集塊生成物(2.55gの20〜140メッシュサンプル)を一度に手早く加えた。撹拌せずに30秒間静置した後、ブフナー漏斗を使用し、Whatman(商標)#54濾紙(直径55mm)によりビーカーの内容物を真空濾過した。回収された固体材料を炉(60℃)で3時間乾燥させた後、計量した。
室温に維持した脱イオン水50mLを入れた150mLガラスビーカー(直径6cm)に、実施例5のトリプチックソイブロス(TSB)集塊生成物(1.5gの20〜140メッシュサンプル)を一度に手早く加えた。撹拌せずに30秒間静置した後、ブフナー漏斗を使用し、Whatman(商標)#54濾紙(直径55mm)によりビーカーの内容物を真空濾過した。回収された固体材料を炉(60℃)で3時間乾燥させた後、計量した。
空気流を62LPM(1L/s)に設定し、70℃の入り口温度を使用して予熱した、Vector FL−M−1 Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation,Marion,IA)の集塊チャンバに、緩衝化ペプトン水(ISO)粉末(1Kg)を装填した。流動層からの混入を防ぐため、標準的なボトム・スクリーンに加えて、2枚目に微細なオランダ織スクリーンメッシュを使用した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=108LPM(1.8L/s);噴出器ノズルの空気圧=827mbar(82700Pa);初期入口温度=70℃;初期排気温度=41℃;初期ポンプ速度=8〜10秒;フィルター・パルス=10〜20秒。集塊プロセス中、排気温度はモニターし、入口温度及びポンプ速度を調節することにより39〜42℃に維持した。450gの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が43℃に達するまで(約5分)流動層で乾燥した。乾燥した、集塊化した生成物のゆるみかさ密度は0.40g/mLであった。次に、乾燥した集塊化生成物をスクリーンを通して篩分けし、粒度分布を決定した(表14)。集塊化した生成物、並びに篩分けにより調製された各種画分の溶解時間は、上記の試験法を用い求めた。結果を表15に示す。
上記の試験方法を使用し、以降の各材料の平均含水量(水%)を求めた:BPW集塊(ISO)材料(実施例1、2及び8由来);TSB集塊材料(実施例4由来);BPW(ISO)粉末(3M Corporationから供給);及びTSB粉末(Becton,Dickinson Companyから供給)。結果を表16に示す。
実施例1のBPW集塊(ISO)生成物(20〜140メッシュサンプル2.56g)を蒸留水(100mL)に希釈することにより培養培地ブロスを調製した。得られた溶液を、0.2ミクロンのSupor(登録商標)シリンジフィルタ(Pall Life Sciences,Ann Arbor,MI)により濾過滅菌した。溶液pHは、約7.0(Beckman Ф350pHメーター)として測定した。アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(Manassas,VA)から細菌株大腸菌(E. coli)0157:H7(ATCC 700728)、大腸菌(E. coli)(ATCC 25922)、腸炎菌(S. enteriditis)(ATCC13076)、チフス菌(S. typhi)(ATCC14028)、及び緑膿菌(P. aeruginosa)(ATCC 27853)を得た。微生物の純粋培養物をトリプチックソイブロス(Becton,Dickinson Co.,Franklin Lakes,NJ)に植菌し、37℃で一晩インキュベートして、細菌懸濁液を調製した。次に、各細菌株懸濁物を、Butterfield希釈剤(3M Company,St.Paul,MN)により濃度約105cfu/mLに希釈した。
各成分から出発して、集塊化した緩衝化ペプトン水を作製した。全ての成分は粉末形態であった(粉末は、100メッシュの篩を通過させるのに十分微細であった)。リン酸一カリウム(15g)、リン酸一水素二ナトリウム(30g)、塩化ナトリウム(50g)、ペプトン(Alpha Biosciences(Baltimore、MD)のものを100g)、及び追跡用色素のフェノールレッド(Sigma−Aldrich Corporationのものを0.6g)を、VFC−Lab Micro Flo−Coater(登録商標)(Freund−Vector Corporation、Marion、IA)の集塊チャンバに装填した。空気流は70LPM(1.2L/s)とし、集塊チャンバ内で室温で20分間材料を配合した。配合工程後、実施例1に記載のプロセスと類似の方法で材料を集塊化した。空気流の設定は90LPM(1.5L/s)とし、入口温度85℃を使用し、ユニットを加熱した。流動層システムの頂部には噴出口を取り付け、脱イオン水を集塊液として使用した。次の装置設定を使用し、集塊を実施した:空気流=90LPM(1.5L/s);噴出器ノズルの空気圧=265mbar(26500Pa);初期入口温度=85℃;初期排気温度=45℃;フィルター・パルス=16rpm;初期ポンプ速度=1秒。集塊プロセス中、排気温度はモニターし、入口温度及びポンプ速度を調節することにより42〜45℃に維持した。50gの脱イオン水の使用後、脱イオン水噴霧を停止した。得られた集塊化したサンプルを、排気温度が45℃に達するまで(約5〜10分)流動層で乾燥した。集塊化した生成物を、集塊化した材料中の各成分の均一な分布について評価した。バルク材料から、3つのサンプル(1g)をランダムに選択した。濃度0.1g/mLになるよう各サンプルを水に溶解させ、UV−可視分光光度計を使用して550nmで吸光度を測定した。3つのサンプルの平均吸光度は0.520(標準偏差0.009)であったことから、バルク生成物において各成分が均一に分布していることが示された。
実施例1の集塊方法により作製した、集塊化した生成物並びに篩分けにより作製された各種画分の溶解時間を、サンプルの吸光度に基づく試験方法を使用して求めた。50mLの脱イオン水(水温23℃)を入れた100mLのビーカーを、手動式昇降台(垂直方向の様々な高さに昇降する装置)のプラットフォームに配置した。16.5インチ(41.91cm)ステンレス鋼のバスケットシャフト(カタログ番号11010−006,VWR Scientific,Radnor,PA)を備えるIKA RW 20デジタル式オーバーヘッド・スターラー(IKA Works Inc.(Wilmington,NC))をビーカー上に配置した。集塊化した材料(2.0g)を、注意深く100メッシュ・ステンレス鋼バスケット(カタログ番号89049−188,VWR Scientific)に加え、シャフト上のバネ式クリップを使用して、バスケットをシャフト端部に取り付けた。450rpmで回転するよう回転シャフトを設定し、実験用昇降台を手早く上昇させて、回転バスケットの全てのメッシュ部分を水中に浸漬した(全サンプルが確実に水に浸漬されるようにした)。バスケットを水に接触させた瞬間から時間の記録を開始した。30、60、120、180、300、及び600秒の時点で、ビーカーからアリコート(500μL)を分取した。各サンプルを、透明96ウェルプレートのウェルに分注し、BioTek Synergy MXマイクロプレートリーダー(BioTek US,Winooski,VT)により310nmで吸光度測定を行った。溶解結果を表22に掲載する。各時点での吸光度を、吸光度1.0で正規化したところ、各サンプルに関し測定される吸光度は最大であることが示された。
室温に維持した脱イオン水100mLを入れた150mLガラスビーカー(直径6cm)に、実施例1の手順を用い作製したBPW(ISO)集塊生成物(2.55gの20〜140メッシュサンプル)を一度に手早く加えた。撹拌せずに30秒間静置した後、予め計量したWhatman(商標)#54濾紙(直径55mm)を取り付けたブフナー漏斗を使用して、ビーカーの内容物を真空濾過した。5秒未満で真空濾過工程を完了した。回収された、集塊状BPW(ISO)生成物の入った濾紙を、注意深く漏斗から取り外し、炉(80℃)で15時間乾燥させ、乾燥機内で室温で冷却した。乾燥生成物と濾紙を計量し、その重量から濾紙の重量を減算して、未溶解の集塊状BPW(ISO)生成物の重量を求めた。
Claims (20)
- 流動性の集塊状栄養培地を作製するための方法であって、
微生物の増殖を促進する栄養成分を含む粉末状栄養分を流動層式集塊チャンバに配置することと、
流動化ガスをチャンバに貫流することと、
前記集塊チャンバ内で、前記粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることとにより栄養培地組成物を生成する工程、及び
前記チャンバから前記組成物を回収する工程、を含み、
前記組成物は、集塊状栄養培地の粒子群と、任意選択的に、非集塊状粉末状栄養分を含み、
前記粒子群は、約250〜400ミクロンの有効粒子径を有する少なくとも約30重量%の集塊状栄養粒子を含む、方法。 - 前記粒子群中の少なくとも約70重量%の粒子が、約105〜841ミクロンの有効粒子径を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記粒子群中の10重量%未満の粒子が、約105ミクロン以下の有効粒子径を有する、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 集塊状栄養培地粒子の分集団を単離することを更に含み、前記分集団が、所定の有効粒子径を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集塊液が、溶媒と、溶媒に溶解した結合剤及び/又は微生物の増殖を促進する栄養分を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粉末状栄養分が、2つ以上の粉末状栄養分の実質的に均一な混合物を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粉末状栄養分を集塊液のエアゾールスプレーと接触させることが、前記粉末状栄養分を所定の体積の集塊液と接触させることを含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集塊チャンバに入るときに、前記流動化ガスが第1温度を有し、前記流動化ガスの第1温度は、約50℃〜約90℃である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集塊チャンバの噴霧ゾーンにおいて前記流動化ガスが、第2温度を有し、前記流動化ガスの第2温度は、約35℃〜約50℃である、請求項8に記載の方法。
- 前記集塊状栄養培地の粒子群が、約5.5重量%以下の平均含水量を有する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記集塊状栄養培地の粒子群が、1立方cm当たり約0.2〜約0.5gのゆるみかさ密度を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 1つ以上の粉末状栄養分が、タンパク質加水分解物、炭水化物、塩、及び前述の粉末状栄養分のうちの任意の2つ以上の混合物からなる群から選択される栄養分を含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記乾燥した集塊状栄養培地に対し、前記乾燥した集塊状栄養培地中の生菌数を減少させるプロセスに供する工程を更に含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記粉末状栄養分を前記流動層式集塊チャンバに配置することが、複数の粉末状栄養分を前記流動層式集塊チャンバに配置することを含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法により作製された、前記流動性の乾燥した集塊状栄養培地を含む、組成物。
- 水性媒質と組み合わせた場合に微生物の増殖を促進する混合物を形成する集塊状粒子を含む集塊状栄養培地を含む組成物であって、前記粒子群中少なくとも約30重量%の粒子は、約250〜400ミクロンの有効粒子径を有し、前記粒子のかさ密度は、1立方cm当たり約0.2〜約0.5gである、組成物。
- 請求項15又は16に記載の組成物を含む、カプセル剤、錠剤、又はサシェ。
- カプセル剤、錠剤、サシェ、及び/又は請求項15〜17のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
- 前記組成物が、所定量の乾燥した集塊状栄養培地を含む包装内に配置され、前記所定量は、9.9mL、10mL、90mL、99mL、100mL、225mL、1.0L、又は3.375Lの水性希釈剤と混合することで、微生物の増殖を促進することのできる培地が再形成されるよう選択される、請求項18に記載のキット。
- 薄膜式培養装置であって、
第1及び第2主表面を有する自己支持性防水基材と、
前記第1主表面の少なくとも一部分上に配置された接着層と、
前記接着層の少なくとも一部分上に配置された請求項15又は16に記載の組成物を含むコーティングと、
前記栄養培地により流動式に接触されるよう配置された乾燥型冷水溶解性ゲル化剤と、を含む、装置。
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