JP2022505965A - 安定な微生物組成物及び乾燥プロセス - Google Patents

Abstract

冷却、湿度調整、又は特別包装することなく周囲条件下で長期保存するための微生物を安定化するための製剤及びプロセス条件に関する組成物及び方法が、記載されている。
【選択図】図１

Description

本組成物及び方法は、冷却、湿度調整、又は特別包装することなく、周囲条件下で長期保存するための、微生物を安定化するための製剤及びプロセス条件に関する。

細菌、真菌、及び酵母などの微生物は、成長を刺激することにより、栄養及び免疫を強化することにより、並びに疾患及び害虫によるダメージを制御することにより、動物及び植物に利益をもたらし得る。宿主の動物又は植物との密接な関連で見出された場合、これらの微生物は、そのような本質的又は有益な利益を宿主に提供する。近年、それらの有益な機能をより一貫して、若しくは典型的には、内因的に存在するものを超えて提供するために、又は更にはミクロビオームのバランスを変更して、病原性若しくはそうでなくとも宿主生物に有害な微生物によるコロニー形成を阻害若しくは排除するために、プロバイオティクス又はバイオティクスと呼ばれることも多いそのような有益な微生物を外因的に供給することに、かなりの商業的関心が高まっている。

有益な微生物を製品の形態で植物及び動物に送達するには、その生物学的有効性の保証だけでなく、製造、保存、及び使用中のそれらの生存能力及び有効性の維持も必要である。頑強な栄養細胞又は胞子など、微生物の特定の微生物構造は本質的に安定している。米国特許第５，９２９，５０７号明細書には、微生物をアルギネートなどの可溶性非架橋多糖類と組み合わせることにより、植物種子接種剤として使用する微生物を安定化するのに好適な組成物が記載されている。ただし、アルギネートカプセル化の有用性は、例示された接種菌（例えば、リゾビア・ジャポニカ（Ｒｈｉｚｏｂｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）及びセラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｉｆａｃｉｅｎｓ））が、特別な保護安定剤を添加することなく、周囲条件下で熱的に安定しており、非常によく生存するという事実によって緩和され、制限される。

しかしながら、多くの有益な微生物は、温度、湿度、酸素、及びその他の環境ストレスに敏感であるため、急速に、時には数時間又は数日以内に生存能力を失う傾向がある。一般に、生育可能な微生物の貯蔵寿命は、冷却、乾燥形態、水分活性の低い状態、又は湿度及び透過性が制御されたパッケージングで保存することによって確保又は改善できることが知られている。微生物の水分活性は、凍結乾燥又はフリーズドライなどの乾燥プロセスによって、一般に保護安定剤の添加と組み合わせて、低レベル、例えば、０．４、０．２、又は更には０．１未満に減らすことができる。米国特許第９，４６９，８３５号明細書には、ガラス化プロセスによる、細菌及び真菌を含む微生物の生存能力の安定化手段が記載されている。この特許には、最初に真空下で、氷点下に近い温度で部分的に凍結したスラッシュ状態から、次に４０℃超の温度で、非常に低い含水量及び低い水分活性が達成されるまで乾燥させることによる二段階乾燥プロセスが記載されている。このプロセスは、ガラス転移温度（Ｔ_ｇ）が有意に上昇した機械的に安定した発泡体を生成すると断言されているため、生物はＴ_ｇほど高い温度にさらされることはない。

米国特許出願公開第２０１４／０００４０８３号明細書は、特定の範囲の比率でイノシトールと組み合わせたトレハロースなどの非還元糖を添加し、その後乾燥保存のために組成物を凍結、真空乾燥、又はフリーズドライすることにより、乳酸菌などの微生物を保存するための凍結保護物質系を開示している。米国特許第９，３０８，２７１号明細書は、トレハロース、イヌリン、及び加水分解カゼインをアルギネートの非存在下で添加し、その後組成物をフリーズドライし、最大３５℃及び０．３以下の水分活性で組成物を保存することにより、乳酸菌を保存するための凍結保護物質系を記載している。微生物組成物がフリーズドライ又は真空乾燥されたこのような場合、微生物組成物を、水蒸気透過性の低いバリア材料で構成されたカプセル、ボトル、又はパウチ内に包装することにより、低い水分活性を維持することができる。

フリーズドライ又は特別包装することなく、周囲温度及び湿度での保存中に微生物の生存能力を保護する組成物を提供する試みがいくつか行われている。米国特許出願公開第２０１２／０１４２５３号明細書は、乾燥した生物を含むコア粒子を生成し、リン酸塩の混合物などの吸湿性塩でコア粒子をコーティングすることにより、脱水微生物を安定化するための組成物及びプロセスを記載している。吸湿性塩のコーティングは、実質的に、水のデコイとして機能し、環境から水分を引き寄せて、コア粒子内の脱水微生物に拡散し得る前にトラップする。これらの例は、適度な湿度条件での保存中の安定性の向上のいくつかの証拠を提供するが、吸湿性塩層は最終的に吸収された水で飽和し、最終的には、水分に敏感な微生物が水を取り込んで生存能力を失うのを防ぐ能力を失う。従って、水の継続的な取り込みを制限し、それによって、微生物の低水分活性を冷却して維持するための特別包装又はその他の手段を必要とせずに、周囲温度及び湿度条件で保存された微生物の生存能力を保護するための頑強で持続的な方法の必要性が依然として存在する。

冷却、湿度調整、及び特別包装手段は、特定の用途、例えば、ヒト治療薬、機能性食品、栄養補助食品、又は食品において好適且つ経済的であるが、制御された温度及び湿度条件下、又は水蒸気の透過性が低い特別包装を用いた微生物製品を包装又は保存することが実用的又は経済的でない重要な産業用途がいくつか存在する。

例えば、農作物用途では、植物の成長を刺激するか又は植物の害虫及び病気を制御することを目的とした微生物製品は、典型的には、液体又は乾燥製剤のいずれかとして製剤化され、冷却又は耐湿性包装することなく保存され、種子コーティング、葉面散布、又は溝内粉末若しくは顆粒を介して開放環境で適用される。作物用途用の液体製剤には、水溶液又は懸濁液、並びにオイル、エマルション、及びサスポエマルションなどの非水性製剤が含まれる。乾燥製剤には、畑で直接適用するか、又は希釈して植物に噴霧できる噴霧可能な溶液又は懸濁液を形成できる水和剤及び顆粒剤が含まれる。

飼料動物の健康用途では、健康を改善するか又は疾患から保護することを目的とした微生物製品は、典型的には、飲料水に導入されるか、又は遊離水分含有量が大きい穀物で構成される乾燥飼料マッシュに混合される。乾燥飼料マッシュは、多くの場合、生蒸気が飼料と混合され、８０～１００℃の温度でダイを通して押し出される蒸気ペレット化プロセスによって更にペレットに成形される。微生物製品は、そのまま又はペレット化された又はペレット化されていない動物飼料のいずれかであり、冷却、湿度制御、又は特別包装することなく倉庫に保存されている間、３～１２か月以上生存し続けなければならない。

食品及び飲料用の場合、微生物は、プロバイオティクスの利点を提供するために組み込まれることが多い。スナックバーなどの湿った食品、又はヨーグルト若しくはフルーツジュースなどの飲料では、組み込まれた微生物は、数か月又はそれ以上の生存期間を維持する必要がある。プロバイオティクス生物はまた、乾燥ドッグフードなどのペットフードに組み込まれる。これらの用途では、多くの場合、湿気から保護するための冷却保存又は特別包装は用意されていない。

上記の適用において有益な薬剤として好適な微生物としては、任意の細菌、酵母、又は真菌が含まれ、栄養細胞、菌糸体、胞子、又は嚢胞を含む複数の異なる細胞形態を含み得る。特定の種に応じて、これらの形態のいくつかは、保存安定性が大幅に向上している可能性がある。例えば、多くの細菌種及び真菌種は、発芽条件下で再活性化するまで、長期間の休眠期間中、数か月又は更には数年間生存能力を保持する胞子を生成する。

しかし、多くの微生物構造は、周囲条件、即ち、約１０℃超の温度、最も典型的には２０～３０℃、及び湿度／１０％超ＲＨ、最も典型的には３０～６０％ＲＨの環境下では、長期間の保存、即ち、１日より長く、最も典型的には３～５２週間、生存能力を維持しない。例えば、多くの栄養細菌細胞、真菌胞子、及び真菌微小菌核は、これらの条件で拡張された生存能力を示さない。

周囲条件、例えば、冷却、湿度制御、又は特別包装を必要としない条件での保存中の微生物の生存能力の改善を保証する、保存安定性微生物製剤及びそのような製剤を生成するプロセスが必要とされている。

本組成物及び方法は、微生物の保存寿命を延長するための賦形剤及びプロセス条件に関する。
１．一態様では、蒸発した懸濁液を形成するマトリックスに埋め込まれた発酵固体を含む微生物組成物であって：非吸湿性マトリックス及び発酵固体を重量で少なくとも１：１の比で有することを特徴とし、マトリックスは、水分調節結合剤及び粘着防止剤を重量で１：５～５：１の比で、及び任意選択的に、７５重量％以下の保護安定剤を含み；蒸発した懸濁液は、５０％の相対湿度及び２０℃の温度で保存した場合に、少なくとも１重量％及び最大３０重量％の含水量の水を有する、組成物が提供される。
２．段落１の組成物のいくつかの実施形態では、結合剤、粘着防止剤、及び任意選択的な保護安定剤は、各々、５０％、任意選択的に７５％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある。
３．段落１又は２の組成物のいくつかの実施形態では、マトリックス及び発酵固体は、重量基準で、少なくとも６：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、及び更には少なくとも１００：１、又はそれ以上の比である。
４．いくつかの実施形態では、段落１～３のいずれか１つに記載の組成物は、２０℃で少なくとも０．３５の水分活性を有する。
５．いくつかの実施形態では、段落１～４のいずれか１つに記載の組成物は、５０％の相対湿度及び２０℃の温度で保存した場合に、１重量％超、３重量％超、及び更には５重量％超、並びに最大３０重量％の水を更に有する。
６．いくつかの実施形態では、段落１～５のいずれか１つに記載の組成物は、実質的に、保護安定剤を含まない。
７．いくつかの実施形態では、段落１～６のいずれか１つに記載の組成物は、保護安定剤を含む。
８．段落１～７のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、発酵固体は、マトリックス内に分布している。
９．段落１～８のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、結合剤は、ポリビニルアルコールである。
１０．段落１～９のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、粘着防止剤は、タルクである。
１１．段落１～１０のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、保護安定剤は、トレハロース又はソルビトールである。
１２．段落１～１１のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、発酵固体は、細菌及び／又は真菌の微生物構造を含む。
１３．段落１～１２のいずれか１つに記載の組成物のいくつかの実施形態では、発酵固体は、昆虫病原糸状菌の微生物構造を含む。
１４．別の態様では、段落１～１３のいずれか１つに記載の組成物を含む粒子又は顆粒が提供される。
１５．いくつかの実施形態では、段落１４に記載の粒子又は顆粒は、一体的な構造を有する。
１６．いくつかの実施形態では、段落１４に記載の粒子又は顆粒は、複合構造を有する。
１７．別の態様では、段落１～１６のいずれか１つに記載の組成物を含む種子処理剤、葉面処理剤、インファロー処理剤、動物飼料サプリメント、ヒトプロバイオティクス、又はパーソナルケア製品が提供される。
１８．別の態様では、マトリックスに埋め込まれた発酵固体を含む組成物を調製して蒸発した懸濁液を形成する方法であって：（ａ）重量基準で、発酵固体を非吸湿性マトリックスと１：１又はそれ以上の比で組み合わせ、少なくとも５０重量％の含水量を有する発酵固体を含有する懸濁液を形成することと、（ｂ）得られた蒸発した懸濁液が周囲条件下で０．３５以上の水分活性に達するまで０℃～５０℃の温度で発酵固体を含有する懸濁液を部分的に乾燥させることと、を含む方法が提供される。
１９．段落１８に記載の方法のいくつかの実施形態では、マトリックスは、水分調節結合剤及び粘着防止剤を、重量基準で、１：５～５：１の比で含み、マトリックス中７５％以下の保護安定剤を含む。
２０．段落１９に記載の方法のいくつかの実施形態では、保護安定剤、結合剤、及び粘着防止剤は、各々、５０％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある。
２１．段落２０に記載の方法のいくつかの実施形態では、保護安定剤、結合剤、及び粘着防止剤は、各々、７５％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある。
２２．段落１８～２１のいずれか１つ記載のいくつかの実施形態では、蒸発した懸濁液は、１重量％超、３重量％超、及び更には５重量％超、並びに最大３０重量％の水を有する。
２３．段落１８～２２のいずれか１つに記載の方法のいくつかの実施形態では、発酵固体は、マトリックス内に分布している。
２４．段落１８～２２のいずれか１つに記載の方法のいくつかの実施形態では、発酵固体は、中間の乾燥工程を経ることなく、マトリックスと接触する。
２５．いくつかの実施形態では、段落１８～２４のいずれか１つに記載の方法は、蒸発した懸濁液を含む顆粒を生成する工程を更に含む。
２６．段落２５に記載の方法のいくつかの実施形態では、顆粒は一体的な構造を有する。
２７．段落２５に記載の方法のいくつかの実施形態では、顆粒は複合構造を有する。
２８．段落１８～２７のいずれか１つに記載の方法のいくつかの実施形態では、蒸発した懸濁液は、段落１～１３のいずれか１つに記載の蒸発した懸濁液である。

本組成物及び方法のこれら及び他の態様及び実施形態は、本説明から明らかになるであろう。

図１は、説明と一致する安定な微生物組成物を示す。

Ｉ．定義及び略語
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当該技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。

本明細書で使用する場合、用語「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）」は、細菌又は真菌などであるがこれらに限定されない、微視的な単細胞又は多細胞生物を指すために同じ意味で用いられる。

本明細書で使用する場合、用語「微生物構造」は、細胞、菌糸、胞子、及び微小菌核、又はそれらの任意の組み合わせなどであるがこれらに限定されない微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）又は微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の任意の構造を指す。

本明細書で使用する場合、用語「微小菌核」は、菌糸の密集した集合体で構成され、時にはメラニン化された真菌構造であり、成長の好機が訪れるまで休眠状態のままである小さな菌核を指す。

本明細書で使用する場合、「昆虫病原糸状菌」は、昆虫に対して病原性があり、それによって昆虫を無力化又は殺すことができる真菌である。

本明細書で使用する場合、「発酵固体」には、生細胞又は死細胞、細胞断片、細胞デブリ、栄養細胞、胞子、菌糸体、微小菌核、又は任意のその他の微生物構造、並びに微生物発酵ブロス中の、又は微生物発酵ブロスに由来する他の可溶性及び不溶性物質で、収穫、又は更に処理されたものが含まれ、任意の追加の回収助剤（沈殿剤、凝集剤、細胞死滅試薬、可溶化剤など）を含むが、微生物構造を安定化する目的で追加された任意のマトリックスコンポーネントは除く。

本明細書で使用する場合、「生存能力」は、生存及び／又は生きる能力を指す。

本明細書で使用する場合、「安定性」は、時とともに生存能力を維持する能力を指す。

本明細書で使用する場合、「周囲」条件は、２０～３０℃及び３０～６０％ＲＨとして定義される。定義された試験又は比較ベンチマークの目的で、「周囲条件」は、より具体的には、２０℃、１．０ａｔｍ、及び５０％ＲＨと規定される。

本明細書で使用する場合、「高い」湿度は、６０～１００％ＲＨとして定義される。定義された試験又は比較ベンチマークの目的で、「高い」湿度は特に、７５％ＲＨと規定される。

本明細書で使用する場合、「高い」温度は、３０～６０℃として定義される。定義された試験又は比較ベンチマークの目的で、「高い」温度は特に ３７℃と規定される。

本明細書で使用する場合、用語「水溶性」は、２０℃で水１００グラム当たり少なくとも１グラムの水への溶解度を有する溶質を指す。

本明細書で使用する場合、用語「水溶液」は、少なくとも５０重量％の水を含有する溶質の溶液を指す。

本明細書で使用する場合、用語「水分活性（ａＷ）」は、組成物の水の部分蒸気圧を、示された時間又は示された期間における水の標準状態の部分蒸気圧で割ったものを指す。標準状態は、ほとんどの場合、同じ温度での純水の部分蒸気圧として定義される。特に指示がない限り、水分活性は２０℃で測定される。

本明細書で使用する場合、組成物に関する用語「相対湿度」（「ＲＨ」）は、同じ温度で飽和するのに必要な量のパーセンテージとして表される空気中に存在する水蒸気の量を指す。

本明細書で使用する場合、用語「含水量」又は「水分含有量」は、組成物中の水のパーセンテージを指し、重量測定法で％ｗ／ｗ又は重量％で表される。

本明細書で使用する場合、用語「水取り込み能力」は、所与の温度及び湿度で保存される物質の平衡含水量として定義される。これはＷＵＣ_{（Ｔ，ＲＨ）}として記号化でき、ここで、Ｔは温度であり、ＲＨは物質の保存の相対湿度である。一定の湿度及び温度の保存条件下で、少なくとも２４時間の間隔で含水量の測定値の変化が２％ｗ／ｗ未満の場合、平衡状態が十分に確立されていると見なされる。

本明細書で使用する場合、用語「非吸湿性」は、５０％ＲＨ及び２０℃で最大１０％ｗ／ｗ、即ち、ＭＵＣ_{（Ｔ，ＲＨ）}≦１０％の水取り込み能力を有する物質の性質を指す。

本明細書で使用する場合、用語「吸湿性」は、５０％ＲＨ及び２０℃で１０％ｗ／ｗ超、即ち、ＭＵＣ_{（Ｔ，ＲＨ）}≧１０％の水取り込み能力を有する物質の性質を指す。

本明細書で使用する場合、用語「水分調節結合剤」又は単に「結合剤」は、水溶性であるが、非吸湿性のポリマーを指す。

本明細書で使用する場合、用語「粘着防止剤」は、結合剤の粘着性又は接着性を低減する無機又は有機化合物を指す。粘着防止剤は、例えば、充填剤、潤滑剤、水分バリア、分散剤、又は密度調整剤として、マトリックスに追加の機能を追加的に提供することができる。

本明細書で使用する場合、用語「保護安定剤」は、周囲又は周囲に近い条件で保存された場合、生存能力の期間を延長するために、膜及び細胞内タンパク質などの微生物及び微生物構造の構造、生物活性、及び生殖能力を保護する化合物を指す。

本明細書で使用する場合、用語「マトリックスコンポーネント」又は単に「マトリックス」は、発酵固体成分を除いた、水分調節結合剤、粘着防止剤、及び保護安定剤を含む組成物を指す。

本明細書で使用する場合、用語「蒸発した懸濁液」は、得られる組成物が、１％ｗ／ｗ超、３％ｗ／ｗ超、又は５％ｗ／ｗ超であるが、最大３０％ｗ／ｗの比較的安定した含水量を維持する程度まで水が蒸発した発酵固体及びマトリックスコンポーネントを組み合わせた懸濁液を指す。蒸発した懸濁液は、マトリックスに埋め込まれた発酵固体を含む。

本明細書で使用する場合、用語「賦形剤」は、本明細書に記載のマトリックスコンポーネントを含むがこれらに限定されない従来の製剤成分を指す。

本明細書で使用する場合、「部分的に乾燥」又は「部分乾燥」は、組成物が１％ｗ／ｗ超の水、３％ｗ／ｗ超の水、好ましくは５％ｗ／ｗ超の水を保持する範囲までのみ、組成物から水を出すことを指す。

本明細書で使用する場合、「中間の乾燥」は、マトリックスと組み合わせる前に、発酵固体が、５０％ｗ／ｗ未満の水、３０％ｗ／ｗ未満の水、又は更には１０％ｗ／ｗ未満の水を保持する程度まで発酵固体から水を出すことを指す。

本明細書で使用する場合、「緩慢乾燥」は、１時間当たりの水分損失が５％ｗ／ｗ以下になる乾燥プロセスを指す。

本明細書で使用する場合、「種子処理剤」は、コーティング組成物であり、典型的には、殺虫剤、殺微生物剤（即ち、殺菌剤）、成長促進剤、又は種子が植え付け前に処理、コーティング、若しくは「ドレッシング」される他の化学的若しくは生物学的材料を含む。本組成物及び方法の場合のように、種子処理剤は殺虫性であり得る。

本明細書で使用する場合、温度に関して「保持された」とは、撹拌の有無にかかわらず、特定の温度で維持することを意味する。

容易に参照されるように、本組成物及び方法の要素は、１つ以上の見出しの下に並べることができる。見出しの各々の下の組成物及び方法は、他の見出しの下の組成物及び方法にも該当することに留意されたい。

本明細書で使用する場合、単数の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を包含する。本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の略語／頭字語は、他に特に規定しない限り、以下の意味を有する。
ＡＴＣＣ アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関
ａｔｍ 気圧
ａＷ 水分活性
ＣＦＵ コロニー形成単位
℃ 摂氏度
Ｇ 重力
ｇ グラム
ｇ／Ｌ １リットル当たりのグラム数
ｇ／モル １モル当たりのグラム数
ｈｒ又はｈ 時間
ｋｇ キログラム
ＬＢ ルリアブロス
Ｍ モル
ｍｇ ミリグラム
ｍＬ又はｍｌ ミリリットル
ｍｉｎ 分
ｍｍ ミリメートル
μｍ マイクロメートル
μｇ マイクログラム
μＬ及びμｌ マイクロリットル
ＭＵＣ 水分取り込み能力
ＭＳ 微小菌核
ＰＤＡ ポテトデキストロース寒天
ｐｓｉｇ ポンド／平方インチ、ゲージ
ＰＶＡ ポリビニルアルコール
Ｔ_ｇ ガラス転移温度
ＴＳＢ トリプシン大豆ブロス
ｒｐｍ 毎分回転数
ＲＨ 相対湿度
ｗｔ％又は％ｗ／ｗ 重量パーセント（重量基準）
ＹＥ酵母抽出物
ＹＥＧ酵母抽出物 グルコース
ＹＰＤ酵母 ペプトンデキストロース

ＩＩ．微生物の安定化のための組成物及び方法
Ａ．概要
本組成物及び方法は、水分調節結合剤、粘着防止剤、及び保護安定剤を含む非吸湿性マトリックス内に発酵固体を埋め込み、適度な量の水を保つように、部分的に、マトリックス／発酵固体組成物を乾燥させることにより微生物構造の安定化の問題を解決する。周囲温度及び湿度条件下で保存した場合、得られた蒸発した懸濁液は、微生物構造を長期間保護する。

本蒸発した懸濁液の重要な特徴は、周囲条件下での処理中及び保存中に適度な含水量及び水分活性を保持することである。微生物を安定化するための前述の組成物及び方法は、非常に低い水分活性レベルへの乾燥、湿度制御パッケージの使用、冷却、ガラス化、又は埋め込みマトリックスのガラス状態を「ロックイン」する水置換に依存している。このような前述の組成物及び方法では、最終組成物が高いガラス転移温度（Ｔ_ｇ）を有することを確実にするために、乾燥温度及び水の除去の程度を高めることが重要である。高温での乾燥プロセスを完了する前に、フリーズドライを保護安定剤の使用を組み合わせて、高真空及び低温での昇華によってほとんどの水を除去することが一般的である。

対照的に、本組成物及び方法は、様々な微生物の微生物構造が、マトリックスコンポーネントのＴ_ｇよりも十分に高い温度で、少量から中程度の量の遊離水又は移動水を含むマトリックスに埋め込まれ得るという驚くべき観察に基づく。保護安定剤は、埋め込まれた微生物構造の安定性を高めることができるが、選択したマトリックスコンポーネントの吸湿性が低いため、大幅な安定化が達成される。その上、凍結、高温への暴露、並びに低含水量及び低水分活性での極度の乾燥によって引き起こされる物理的ストレスは、より穏やかで微生物構造へのダメージが少ない周囲温度又は周囲温度に近い部分乾燥プロセスの使用によって回避される。

構成コンポーネントを更に詳細に説明するマトリックスの量は、蒸発した懸濁液中の発酵固体の量と少なくとも一致し、好ましくはそれを超えなければならない。例えば、全マトリックスコンポーネントの発酵固体に対する比は、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも４：１、少なくとも６：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、及び更には少なくとも１００：１又はそれ以上であり得る。

Ｂ．水分調節結合剤
本組成物及び方法のマトリックスには、２０℃の温度にて、約５０％ＲＨで約１～３０％ｗ／ｗの水、又は更には約７５％ＲＨで約１～３０％ｗ／ｗの水の含水量を維持する微小環境で発酵固体をカプセル化又は埋め込む目的で少なくとも１つの水分調節結合剤が含まれる。この微小環境は、周囲条件下で保存される微生物構造の安定性を拡張するのに好適であることが判明した。水分調節結合剤の更なる機能は、顆粒又は他の固体用途での製剤に好適な機械的に密着した膜を提供することである。

水分調節結合剤、又は単に「結合剤」は、水溶性であるが、２０℃で１００ｍＬ当たり少なくとも１グラムの水への溶解度を有する、非吸湿性ポリマーである。例示的な水分調節結合剤は、４％のＭＵＣ_{（２０、５０）}を有するポリビニルアルコール（ＰＶＡ）及び１％のＭＵＣ_{（２０、５０）}を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましい水分調節結合剤は、ＰＶＡである。水分調節結合剤としての使用に好適ではないポリマーとしては、１８％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有するポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、及び
２０％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有するアルギン酸カルシウムが挙げられる。本組成物及び方法の好ましい実施形態は、好ましいポリマーを含み、上述の不適当なポリマーを除外する。

Ｃ．粘着防止剤
本組成物及び方法のマトリックスには、水分調節結合剤の粘着性又は接着性を低減する目的で少なくとも１つの粘着防止剤が含まれる。粘着防止剤は、水と結合せず、水をはじかない無機又は有機化合物である。粘着防止剤は、例えば、充填剤、潤滑剤、水分バリア、分散剤、又は密度調整剤として、マトリックスに追加の機能を追加的に提供することができる。

無機粘着防止剤としては、タルク、マイカ、ケイ酸マグネシウムなどの鉱物、並びにカオリン、モンモリロナイト、及びアタパルジャイトなどの粘土が含挙げられる。有機粘着防止剤としては、アニオン性及びエトキシル化界面活性剤又は分散剤が挙げられる。効果的な粘着防止剤は、わずかに疎水性又は両親媒性である傾向があり、親水性ポリマー膜の表面に会合又は層を形成する傾向がある。ゼオライト及びその他の分子ふるいなど、周囲湿度又は高湿度で大量の水を吸収又は結合する乾燥剤は、粘着防止剤として好適ではない。好ましい粘着防止剤は、タルクである。本組成物及び方法の好ましい実施形態は、好ましい粘着防止剤を含み、上述の不適当な粘着防止剤を除外する。

粘着防止剤は、水分調節結合剤に対して、約１：５～５：１、例えば、少なくとも１：５、少なくとも１：４、少なくとも１：３、少なくとも１：２、少なくとも１：１、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、又は更には少なくとも５：１の重量比でマトリックス中に存在しなければならない。

Ｄ．保護安定剤
本組成物及び方法のマトリックスには、周囲又は周囲に近い条件下での生存能力の期間を延長するために、細胞膜及び細胞内タンパク質などの細胞より小さい微生物コンポーネントを保護することにより、微生物構造、生物活性、及び微生物の生存能力を保存する目的で、少なくとも１つの保護安定剤が含まれ得る。

保護安定剤としては、トレハロース、スクロース、及びソルボースなどの非還元単糖及び二糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、及びイソマルトなどの糖アルコール、コムギデンプン又はマルトデキストリンなどの多糖、プロリン、アルギニン、若しくはグルタミン酸などのアミノ酸、又はそれらの塩、ピルベートなどのα－ケト酸、ホエイタンパク質及びカゼインなどのタンパク質、緩歩動物タンパク質などの天然変性タンパク質、並びに上記のコンポーネントの複雑な天然混合物、例えば、噴霧乾燥ミルク粉末などが挙げられる。好ましい保護安定剤は、トレハロース及びソルビトールである。

水分調節結合剤及びマトリックス全体の非吸湿性を維持するために、保護安定剤はそれ自体が非吸湿性でなければならない、即ち、５０％ＲＨ及び２０℃で最大１０％の水分取り込み能力を有さなければならない。例示的な保護安定剤のいくつかを参照すると、トレハロースは、１％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、ソルビトールは５％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、マンニトールは３％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、キシリトールは２％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、エリスリトールは２％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、イソマルトは１％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、マルトデキストリン（ＤＥ１７－２１）は７％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、コムギデンプンは９％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、ホエイタンパク質は６％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有し、噴霧乾燥ミルク粉末は１％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有する。

他に、乾燥（ｄｒｙ）、乾燥した（ｄｅｓｉｃｃａｔｅｄ）系で微生物を安定化させることが知られている特定の糖（例えば、還元糖）、ポリオール、アミノ酸、及びタンパク質は、吸湿性であり、組成物及び方法において保護安定剤として使用するのに好適ではない。例えば、グリセロールは、２８％のＭＵＣ_{（２０，５０）}を有する単純なポリオールである。ゼオライト及びその他の分子ふるいなど、周囲湿度で大量の水を吸収又は結合する乾燥剤は、また、安定剤として好適ではない。本組成物及び方法の好ましい実施形態は、好ましい安定剤を含み、上述の不適切な安定剤は除外する。

マトリックスは、マトリックスの少なくとも２５％ｗ／ｗが結合剤及び粘着防止剤の組み合わせを含むように、０％～７５％ｗ／ｗの保護安定剤を含まなければならない。マトリックス中に保護安定剤を含むことが好ましいが、必須ではなく、したがって任意選択的である。当業者であれば、所与の微生物及び保存又は使用条件について、結合剤及び粘着防止剤が安定剤なしで十分な保護を与えるかどうか、及び安定剤の追加の利点がそれを含めるコストを正当化するかどうかを判断することができる。

Ｅ．蒸発した懸濁液の含水量及び水分活性
本組成物及び方法によれば、マトリックス組成物を発酵固体に添加し、得られた製剤化された発酵固体を乾燥させて、周囲条件下で水分活性（ａＷ）を０．３５超、０．４０超、０．４５超、又は更には０．５０超に維持する蒸発した懸濁液を形成する。本文脈において、用語「超」は、「～より低くない」と同義である。乾燥は、製剤化された発酵固体の温度を５０℃未満、４５℃未満、４０℃未満、及び更には３５℃未満に維持しながら、静的又は対流空気で行われる。好ましくは、乾燥プロセスはゆっくりと行われ、１時間の乾燥で除去される水は５％ｗ／ｗ未満である。

本発明の乾燥プロセスは、上記の温度限界内で操作できる任意の従来の静的又は対流乾燥法によって実施することができる。乾燥は、造粒又は粒子形成プロセスと同時に行うこともできる。好適な乾燥法としては：噴霧乾燥；流動床乾燥、スプレーコーティング、噴霧造粒又は噴霧集塊；ドラム造粒、又は高剪断造粒が挙げられるが、これらに限定されない。

蒸発した懸濁液の最終含水量は、２０℃の温度にて、約５０％ＲＨ、又は更には約７５％ＲＨで、１％超、３％超、及び更には５％超、最大３０％の水でなければならない。

Ｆ．微生物及び微生物構造
以下に例示する微生物（即ち、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、トリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、及びメタリジウム・アニソプリエ（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ））の数から明らかなように、本組成物及び方法は、異なる門の微生物に幅広く適用できるようである。グラム陽性バチルス網、酵母、及び糸状菌は、全て、本組成物及び方法により保護される。細胞、菌糸、胞子、及び微小菌核、又はそれらの任意の組み合わせなどであるがこれらに限定されない微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓ）又は微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）の任意の構造は、全て本組成物及び方法によって保護される。本組成物及び方法が、同様の結果に対する合理的な期待以上の期待なしに、他の微生物又は微生物構造に適用できないと予想する理由はない。

Ｇ．更なる製剤
本蒸発した懸濁液は、概して、保存に好適であり、様々な用途にすぐに使用できる。あるいは、蒸発した懸濁液は、取り扱いを容易にし、粉塵を減らすために、粒子又は顆粒に更に製剤化することができる。顆粒は、蒸発した懸濁液が他のコンポーネントと分散してコアを形成するマトリックス顆粒、又は蒸発した懸濁液がコアにコーティングされた顆粒であり得る。

図１は、本発明の２つの可能な代替的微生物組成物構造を、蒸発した懸濁液を含む均一な単一粒子として、及び蒸発した懸濁液を組成物のただ１つの要素として、例えば、任意選択のコーティングを有する任意選択のコア上の層として含む複合構造として、示す。蒸発した懸濁液がいくつかの部分又はコンポーネントの１つにすぎない、他の構造も可能であり、複数の蒸発した懸濁液を有する構造を含む。

その他のコンポーネント又はコアは、肥料、酵素、抗生物質などの更なる活性剤を含んでもよい。顆粒は、１つ以上の追加のコーティング層を更に含んでもよく、これは更に活性成分を含んでもよい。

Ｈ．用途及び使用
本蒸発した懸濁液、又はその更なる製剤は、種子処理剤、葉面処理剤、インファロー処理剤、動物飼料サプリメント、ヒトプロバイオティクス、及び／又はパーソナルケア製品としての使用に好適である。微生物構造を含有する蒸発した懸濁液は、栄養素、肥料、殺虫剤、抗生物質などを含む他の活性成分と組み合わせることができる。

以下の実施例は本組成物及び方法の実施形態を例示することを意図しており、限定するものと決して解釈されるべきではない。

実施例１．発酵固体中のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及びトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）の生存能力の評価方法
連続希釈プレーティング及びＣＦＵ測定を使用して、発酵固体中の細菌及び真菌の生存能力を測定した。発酵固体を、１０ｍｇの発酵固体当たり５ｍＬの希釈バッファー中に再懸濁した（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用ＴＳＢブロス、Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）用ＰＤＢブロス、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用ＹＰＤブロス、及びＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）用ＹＥＧ）。懸濁液をボルテックスすることにより混合し、同じバッファーを使用して１０倍連続希釈を行った。懸濁液の一部を、寒天培地（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）用ＬＢ寒天、Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）用ＰＤＡ、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）用ＹＰＤ寒天、及びＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）用ＹＥＧ寒天）を入れたペトリ皿の表面に均一に分布させた。接種した寒天プレートをインキュベーターでインキュベートした（Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）については３７℃で一晩、Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）については２５℃で２日間、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）については３０℃で一晩、及びＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）については２８℃で２日間）。この間、発酵固体からの生存可能な微生物構造により、プレート上にコロニーが生成された。コロニーをカウントして、発酵固体１ｍｇ当たりのＣＦＵとして報告した。

実施例２．賦形剤用いたＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）を含有する発酵固体の安定化
Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株の微生物構造の生存能力及び安定性を、製剤賦形剤のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、タルク、及びトレハロースの存在下及び非存在下で試験した。Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の発酵は、米国特許第７ ７１３ ７２５号明細書に詳述されているように実施され、およそ４％の発酵固体含有量を有するブロスを得た。

Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）の非濾過、非濃縮ブロスを、表１に列挙されている質量パーセント比率で、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、トレハロース、及び水と混合し、混合物を手作業でホモジナイズして、全ての不溶性コンポーネントを完全に懸濁させた。均質混合を促進するために、懸濁液を調製する前に、固体ＰＶＡを１５重量％の固体濃度で水に溶解した。マイクロピペットを使用して、懸濁液を１ｍＬアリコートで固体表面に成膜させ、およそ２００μｍの厚さの薄膜を生成した。次いで、これらの薄膜を層流フード内で室温で一晩乾燥させ、含水量を１％～１０％にし、それにより、賦形剤及び残留水を含むマトリックス内に発酵固体を埋め込んだ。成膜から約１時間後、薄膜の水分活性は０．８を超えた。一晩乾燥させた後、薄膜の水分活性は約０．５３で、乾燥プロセス中の周囲の相対湿度に近かった。乾燥前及び乾燥後の薄膜の最終組成をそれぞれ表１及び表２に示す。

これらの薄膜を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、及び７日間保存し、実施例１に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりに生存能力を測定した。微生物の生存能力は、懸濁液混合物中の Ｔ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表３に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、又は７日間インキュベートした後の各製剤の含水量及び生存能力をまとめている。３日及び７日のインキュベーション後の膜の水分活性は０．５０～０．５５の範囲内であり、均一な含水量を維持しながら、インキュベーター内の相対湿度で膜の水分活性を平衡化することを示唆する。製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、及びトレハロースを含有する膜は、賦形剤を含まない膜と比較して含水量が増加していることを示しているが、製剤賦形剤を含む膜は、非製剤化膜よりも生存能力の向上を示しており、各時点でＣＦＵ測定値は少なくとも１対数高い。

実施例３．賦形剤を用いたＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含有する発酵固体の安定化
発酵固体におけるＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株の微生物構造の生存能力及び安定性を、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、ゼオライト、トレハロース、及びソルビトールの存在下及び非存在下で試験した。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発酵は、１０ｇ／ＬのＹＥ、２０ｇ／Ｌのバクトペプトン、及び２０ｇ／Ｌのグルコースを含有する培地（３２℃、１５０ｒｐｍでサイドバッフル付き三角フラスコ５００ｍＬフラスコに１００ｍＬの培地を入れたもの）中で行われ、これにより発酵ブロスがもたらされ、次いでこれを遠心分離して、およそ１％の発酵固体含有量に達した。

Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の非濾過ブロスを、表４に列挙されている質量パーセント比率で、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、トレハロース、ゼオライト、ソルビトール、及び水と混合し、混合物を手作業でホモジナイズして、全ての不溶性コンポーネントを完全に懸濁させた。均質混合を促進するために、懸濁液を調製する前に、固体ＰＶＡを１５重量％の固体濃度で水に溶解した。マイクロピペットを使用して、懸濁液を１ｍＬアリコートで固体表面に成膜させ、およそ２００μｍの厚さの薄膜を生成した。次いで、これらの薄膜を層流フード内で室温で一晩乾燥させ、含水量を０％～１５％にし、それにより、賦形剤及び残留水を含むマトリックス内に発酵固体を埋め込んだ。成膜から約１時間後、薄膜の水分活性は０．８を超えた。一晩乾燥させた後、薄膜の水分活性は約０．５０～０．６０の範囲であり、乾燥プロセス中の周囲の相対湿度に近かった。乾燥後の薄膜の最終組成及び水分活性を表５に示す。

これらの薄膜を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、７、１４、及び２１日間保存し、実施例１に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりに生存能力を測定した。微生物の生存能力は、懸濁液混合物中のＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表６に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、７、１４、及び２１日間インキュベートした後の各製剤の含水量及び生存能力をまとめている。含水量は、３日又は２１日の時点で測定されなかった；しかし、他の時点で測定された含水量は、膜の含水量がインキュベーション中に比較的安定していたことを示唆している。７日及び１４日のインキュベーション後の膜の水分活性は０．５０～０．５５の範囲内であり、均一な含水量を維持しながら、インキュベーター内の相対湿度で膜の水分活性を平衡化することを示唆する。ほとんどの製剤におけるＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）微生物構造の生存能力は、非製剤化の乾燥したＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生存能力よりも少なくとも１桁高いままを維持し、ゼオライトを含む製剤（＃ＳＣ２）及び結合剤又は粘着防止剤を含まない製剤（＃ＳＣ７）のみで、製剤化がない場合よりも安定性が劣っている。更に、非製剤化の乾燥したＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の生存能力は、０日から２１日の時点で２桁を超えて低下するが、いくつかの製剤（＃ＳＣ１、＃ＳＣ３、＃ＳＣ４、＃ＳＣ６）におけるＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）微生物構造の生存能力は、同じ期間に１桁未満しか低下せず、ＰＶＡ及びタルクと他の賦形剤との組み合わせに対する安定化効果を証明している。実施例２で生成されたＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）膜と同様に、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物構造の生存能力及び安定性は、成膜後の膜の水分含有量に依存せず、水を保持するか又は乾燥を助けるかのいずれかをする賦形剤の能力ではなく、安定化のための化学的効果を示唆する。膜＃ＳＣ４及び＃ＳＣ６は、どちらも乾燥及びインキュベーション後に１０％以上の水を含むが、それにも関わらず、時間の経過とともに高い活性を維持し、これは、生物を取り巻く環境を完全に乾燥させることは、安定性を確保するために必須ではないことを示唆している。＃ＳＣ３及び＃ＳＣ４と比較して増加した量のトレハロース及びソルビトールを含む膜＃ＳＣ５及び＃ＳＣ６は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ）微生物構造安定性の有意な増加は示さず、安定化効果を達成するために必要な賦形剤の量には限界があることを示唆している。

実施例４．賦形剤を用いたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含有する発酵固体の安定化
発酵固体におけるＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）菌株の微生物構造の生存能力及び安定性を、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、ゼオライト、トレハロース、及びソルビトールの存在下及び非存在下で試験した。Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の発酵は、トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）培地（３７℃、１５０ｒｐｍでサイドバッフル付き三角フラスコ５００ｍＬフラスコに１００ｍＬの培地を入れたもの）中で行われ、これにより発酵ブロスがもたらされ、次いでこれを遠心分離して、およそ３％の発酵固体含有量に達した。顕微鏡検査により、発酵ブロスには細菌細胞のみが含まれていることが明らかになった；胞子は存在しなかった。

Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の無濾過の全ブロスを、表７に列挙されている質量パーセント比率で、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、トレハロース、ゼオライト、ソルビトール、及び水と混合し、混合物を手作業でホモジナイズして、全ての不溶性コンポーネントを完全に懸濁させた。均質混合を促進するために、懸濁液を調製する前に、固体ＰＶＡを１５重量％の固体濃度で水に溶解した。マイクロピペットを使用して、懸濁液を１ｍＬアリコートで固体表面に成膜させ、およそ２００μｍの厚さの薄膜を生成した。次いで、これらの薄膜を層流フード内で室温で一晩乾燥させ、含水量を０％～２０％にし、それにより、賦形剤及び残留水を含むマトリックス内に発酵固体を埋め込んだ。成膜から約１時間後、薄膜の水分活性は０．８を超えた。一晩乾燥した後、薄膜の水分活性は約０．５０～０．６０の範囲で、乾燥プロセス中の周囲の相対湿度に近かった。乾燥後の薄膜の最終組成及び水分活性を表８に示す。

これらの薄膜を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、７、１４、及び２１日間保存し、実施例１に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりに生存能力を測定した。微生物の生存能力は、懸濁液混合物中のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表９に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、７、１４、及び２１日間インキュベートした後の各製剤の含水量及び生存能力をまとめている。含水量は、３日又は２１日後に測定されなかった；しかし、他の時点で測定された含水量は、膜の含水量がインキュベーション中に比較的安定していたことを示唆している。７日及び１４日のインキュベーション後の膜の水分活性は０．５０～０．５５の範囲内であり、均一な含水量を維持しながら、インキュベーター内の相対湿度で膜の水分活性を平衡化することを示唆する。＃ＢＳ２及び＃ＢＳ７を除いた全ての製剤におけるＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生存能力は、非製剤化の乾燥したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生存能力よりも少なくとも１桁高いままである。これらの製剤はまた、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）微生物構造の微生物構造について最も悪い性能の１つであり、ＰＶＡ及びタルクの存在下、並びにゼオライトの非存在下で、最適な製剤が達成されることを示唆している。製剤＃ＢＳ７には結合剤又は粘着防止剤が含まれていないため、保護マトリックス内に微生物を効果的に懸濁しない薄い紙のような膜を生成し、任意の固体用途向けに製剤化するのは困難である。更に、非製剤化の乾燥したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の生存能力は、０日から２１日の時点で３桁を超えて低下するが、ソルビトール又はトレハロースを含有する全てのＰＶＡ－タルクマトリックス製剤（＃ＢＳ３、＃ＢＳ４、＃ＢＳ５、＃ＢＳ６）の生存能力は、同じ期間に２桁未満しか低下せず、これら２つの賦形剤が安定剤として機能することを強く示唆しており、これは複数の生物にわたる実験データによって裏付けられている。実施例２及び３で記載されたＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）及びＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）膜と同様に、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の安定性は、成膜後の膜の含水量と関連せず、賦形剤による膜の含水量の単純な物理的制御ではなく、安定化のための化学的効果を示唆している。特に、乾燥後に５％未満の水を含有する膜（＃ＢＳ３及び＃ＢＳ５）及び乾燥後に１０％超の水を含有する膜（＃ＢＡ４及び＃ＢＳ６）の同様の安定化性能は、製剤賦形剤を使用して、高湿度条件又は低湿度条件のいずれかで、薄膜中の微生物を安定化することができることを示す。しかし、非製剤化微生物（含水量１％未満）及び非マトリックス系＃ＢＳ７（含水量最大１６％）の両方の安定性の低さは、高水分含有量又は低水分含有量だけでは微生物を安定化するには不十分であることを示す。様々な水分条件で望ましい安定化を達成するには、賦形剤系を正しく選択することが重要である。

実施例５．Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）微生物構造の生存能力を評価するための方法
二段階アッセイを使用して、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体中のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）微生物構造（微小菌核、菌糸体、及び胞子が挙げられるがこれらに限定されない）の生存能力を測定した。最初の工程では、定義された条件で定義された量のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体から生成された分生胞子の総数を測定するとともに、２番目の工程では、最初の工程からの生存可能な分生胞子の総数を測定する。２番目の工程の更なる利点は、コロニーのモルホロジーに基づいて区別できる場合、真菌汚染物質を識別できることである。従って、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の生存能力は、生成された分生胞子（ｃｏｎｄｉｏｓｐｏｒｅ）ＣＦＵ／Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体のｍｇによって表される。

二段階アッセイは、１０ｍｇのＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体をコニカルチューブに移し、５ｍＬの希釈バッファーを添加するとともに開始する。希釈バッファーは、０．９％の塩化ナトリウム及び０．０５％のＴｗｅｅｎ８０を含有する。懸濁液をボルテックスすることにより混合し、同じバッファーを使用して１０倍連続希釈を行う。懸濁液の一部を、水寒天培地を入れたペトリ皿の表面に均一に分布させた。水寒天培地は、２％の寒天を含有し、汚染生物の増殖を防ぐために、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンが補充されている。接種した水寒天プレートを暗所のインキュベーター内で２８℃にて８日間インキュベートする。この間、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体からの生存可能な微生物構造がプレート上にコロニーを生成し、無性生殖周期の活性化後に空中分生胞子が生成される。１０ｍＬのバッファーをプレート表面に注ぎ、「ホッケースティック」スプレッダーを使用して希釈バッファーに分生胞子を静かに懸濁することにより、分生胞子を収穫する。懸濁液をコニカルチューブに移し、ボルテックスすることにより混合する。連続希釈系列は分生胞子懸濁液から作成され、各系列の各希釈液の一部はフォーゲルの最小培地プレートにプレーティングされる。フォーゲルの最小培地は、当該技術分野において公知である。接種したプレートを、１２時間の明／暗サイクルで５日間、光インキュベーターでインキュベートする。コロニーの数をカウントして、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の１ｍｇ当たりのＣＦＵとして報告し、定義された量のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体を接種した水寒天プレートから収集された生存可能な分生胞子の総数を反映する。

上記の二段階アッセイの再現性は、およそ１ｌｏｇ、即ち、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の１ｍｇ当たりの１０ＣＦＵの係数であり、これは生存可能なＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の保存安定性を評価する目的には十分である。

実施例６．賦形剤を用いたＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の安定化
発酵固体におけるＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）菌株ＡＴＣＣ ９０４４８の生存能力及び安定性を、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、ゼオライト、トレハロース、及びソルビトールの存在下及び非存在下で試験した。Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）の発酵は、米国特許出願公開第２００９／００７４８０９号明細書に列挙されている条件に従って実施し、発酵固体がおよそ３％の発酵ブロスがもたらされた。顕微鏡検査により、発酵ブロスには菌糸体、胞子、及び微小菌核が含まれていることが明らかになった。発酵ブロスを遠心分離により濃縮して、上清を廃棄した。濃縮後のブロスの発酵固体含有量は、およそ１２％であった。濃縮後、発酵ブロスの微小菌核含有量は、１．１×１０^５ＭＳ／ｍＬから３．０×１０^５ＭＳ／ｍＬに増加した。

濃縮されたＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体を、表１０に列挙されている質量パーセント比率で、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、トレハロース、ゼオライト、ソルビトール、及び水と混合し、混合物を手作業でホモジナイズして、全ての不溶性コンポーネントを完全に懸濁させた。均質混合を促進するために、懸濁液を調製する前に、固体ＰＶＡを２０重量％の固体濃度で水に溶解した。マイクロピペットを使用して、懸濁液を１．０～１．５ｍＬアリコートで固体表面に成膜させ、厚さ約２００μｍの薄膜を生成した。次いで、これらの薄膜を層流フード内で室温で一晩乾燥させ、含水量を０％～１０％にし、それにより、賦形剤及び残留水を含むマトリックス内に発酵固体を埋め込んだ。薄膜の水分活性特性は、実施例２、３、及び４で記載されるものと同じである。成膜から約１時間後、薄膜の水分活性は０．８０を超えた。一晩乾燥した後、薄膜の水分活性は約０．５０～０．６０の範囲で、乾燥プロセス中の周囲の相対湿度に近かった。乾燥後の薄膜の最終組成を表１１に示す。

薄膜を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、及び７日間保存し、実施例５に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりにＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体からの微生物構造の生存能力を測定した。実施例２、３、及び４におけるように、インキュベーション後の膜の水分活性は０．５０～０．５５の範囲内であり、均一な含水量を維持しながら、インキュベーター内の相対湿度で膜の水分活性を平衡化することを示唆する。膜の生存能力は、懸濁液混合物中のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表１２に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、及び７日間インキュベートした後の各製剤の含水量及び生存能力をまとめている。非製剤化発酵固体は、インキュベーションの３日後に生存能力を示さなかったことに対して、製剤化された発酵固体は全て、７日の時点で生存能力の損失が最小限又は全くないことを示し、試験された全ての賦形剤は、微小菌核含有Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体濃縮物の安定化に成功していることを証明した。試験された様々な製剤賦形剤の中で、ゼオライトを含む薄膜（＃ＭＡ２）で最も低い生存能力が観察され、これは、この賦形剤がＰＶＡ－タルクマトリックス内で試験されたものの中でポジティブな効果が最も少ないことを示唆している。ゼオライトについての同様の結果が、実施例３及び４のＳ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の薄膜について観察された。Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の薄膜の例とは異なり、トレハロースのみ（＃ＭＡ５）は、ＰＶＡ－タルクマトリックスがなくても、安定化効果を提供することが示されている；しかし、トレハロース単独のマトリックス中でＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）を安定化することは、トレハロース膜の任意の基質への乏しい接着性のために、並びにＰＶＡ及びタルクが存在しない、発酵固体及びトレハロースのみを含む膜又は粒子の乏しい分散性のために、固体製剤の課題を提示する。薄膜の様々な含水量は、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合と同様に、様々な水分条件で、微小菌核含有Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体を安定化するために、製剤賦形剤の正しい選択を選択できることを示唆している。

実施例７．Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の安定性に対する回収及び濃縮条件の影響
Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）菌株ＡＴＣＣ ９０４４８発酵固体の生存能力及び安定性を、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、ゼオライト、トレハロース、及びソルビトールの存在下及び非存在下で試験した。Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）の発酵は、米国特許出願公開第２００９／００７４８０９号明細書に列挙されている条件に従って実施し、固体がおよそ７％の発酵ブロスがもたらされた。顕微鏡検査により、発酵ブロスには菌糸体、胞子、及び微小菌核が含まれていることが明らかになった。

発酵ブロスをブロス１部当たり水およそ１部（重量）で希釈し、ふるいにかけて大きな粒子（１ｍｍ超）を除去し、遠心分離により濃縮した後、上清を廃棄した。遠心分離後の細胞ペーストの発酵固体含有量はおよそ１０％であり；これは「未洗浄細胞ペースト」と呼ばれる。次いで、未洗浄細胞ペーストを、細胞ペースト１部あたり（重量で）およそ５部の水に再懸濁し、遠心分離により濃縮し、上清を再び廃棄した。これは、「洗浄した細胞ペースト」と呼ばれ、およそ７％の発酵固体含有量を有した。次いで、洗浄した細胞ペーストを秤量ボート上で薄層に広げ、周囲条件でおよそ２日間乾燥させた。乾燥材料の発酵固体含有量は、およそ３５％であった。遠心分離して上清を廃棄する各工程の後、発酵固体は、微生物固体に関してより濃縮された。

４つのＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の濃縮調製物を、表１３に列挙されている質量パーセント比率で、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、トレハロース、及び水と混合し、混合物を手作業でホモジナイズして、全ての不溶性コンポーネントを完全に懸濁させた。均質混合を促進するために、懸濁液を調製する前に、固体ＰＶＡを２０重量％の固体濃度で水に溶解した。各サンプルは、トレハロース：Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体をおよそ３．３３：１の比で含有した。マイクロピペットを使用して、懸濁液を１～１．５ｍＬアリコートで固体表面に成膜させ、厚さ約２００μｍの薄膜を生成した。次いで、これらの薄膜を層流フード内で室温で一晩乾燥させ、含水量を０％～１０％にし、それにより、賦形剤及び残留水を含むマトリックス内に発酵固体を埋め込んだ。膜の含水量は、先の実験で説明したものと同様であり、非製剤化膜は約１％以下の水を含み、膜は約４～５％の水を含むＰＶＡ－タルク－トレハロースマトリックス製剤を使用した。薄膜の水分活性特性は、実施例２、３、及び４で記載されるものと同じである。成膜から約１時間後、薄膜の水分活性は０．８０を超えた。一晩乾燥した後、薄膜の水分活性は約０．４５～０．６０の範囲で、乾燥プロセス中の周囲の相対湿度に近かった。乾燥後の薄膜の最終組成を表１４に列挙する。

薄膜を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、７、１４、及び２１日間保存し、実施例５に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりに生存能力を測定した。実施例２、３、及び４におけるように、インキュベーション後の膜の水分活性は０．５～０．５５の範囲内であり、均一な含水量を維持しながら、インキュベーター内の相対湿度で膜の水分活性を平衡化することを示唆する。ＭＳの生存能力は、懸濁液混合物中のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表１５に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、７、１４、及び２１日間インキュベートした後の各製剤の生存能力をまとめている。製剤賦形剤なしでは、７日間のインキュベーション後に生存能力を示したサンプルはなかったとともに、製剤賦形剤を含む全てのサンプルは、２１日の時点で生存能力の損失が最小限又は全くないことを示しており、様々な異なる処理方法の後であっても、ＰＶＡ－タルク－トレハロースマトリックスがＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の微小菌核の安定化に成功していることを証明している。試験される様々な処理方法の中で、非製剤化の乾燥した発酵固体は最も低い安定性を有し、３日間のインキュベーション後、生存能力を示さなかった。これは、製剤化前のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体濃縮物の処理が少なく、特に再水和前の乾燥が少ないほど、優れた製剤結果が得られることを示唆している。

実施例８．顆粒におけるＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体の安定化
Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）菌株ＡＴＣＣ ９０４４８発酵固体を含有する顆粒を、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、及びトレハロースを用いて生成した。発酵固体含有量がおよそ１２％であり、微小菌核含有量が３．０×１０^５ＭＳ／ｍＬである実施例６に記載された濃縮発酵ブロスを使用して、マクロカプセルを調製した。製剤化前に、濃縮した発酵ブロスを８００μｍのふるいにかけた。顕微鏡検査により、発酵ブロスには菌糸体、胞子、及び微小菌核が含まれていることが明らかになった。

Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体を含有する顆粒を、Ｖｅｃｔｏｒ ＶＦＣ－ＬＡＢ１スプレーコーターを使用して生成した。顆粒は、スプレーコーターに９３０ｇのおよそ２００～２５０μｍサイズの塩コアを充填することによって生成した。続いて、塩コアを、Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体及び賦形剤を含む活性層でコーティングし、続いて硫酸ナトリウムのシーリング層でコーティングした。生成された顆粒の量は１６８０ｇであった。Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体－含有顆粒を生成するのに使用される噴霧条件を表１６に詳述した。得られた顆粒は、およそ４７％の硫酸ナトリウムコア、８％のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体、１２％のタルク、８％のトレハロース、４％のＰＶＡ、及び２１％の硫酸ナトリウムシーリング層を含んでいた。顆粒の最終含水量は約１％であり、全ての水が蒸発した懸濁液（コア及びシーリング層を除く）に含まれていると仮定する場合、この層のみの含水量は約４％になり、ＰＶＡ、タルク、トレハロース、及び微生物を含有する薄膜の先の実施例と同等である。

Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体含有顆粒を２４℃及び５１％ＲＨで０、３、７、及び１４日間保存し、実施例５に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりに生存能力を測定した。蒸発した懸濁液層をコーティングするために使用したＰＶＡ－タルク－トレハロース－Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体噴霧混合物のアリコートも採取し、非製剤化Ｍ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体のアリコートと同様に、同じ条件でインキュベートした。インキュベーション後の各アリコートの生存能力は、顆粒又は噴霧混合物中のＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体１ミリグラム当たりのＣＦＵとして表される。表１７に、２４℃及び５１％ＲＨで、０、３、７、及び１４日間インキュベートした後の各製剤の生存能力をまとめている。先の実施例のように、ＰＶＡ－タルク－トレハロース賦形剤マトリックスは安定化効果を明確に示し、非製剤化の発酵固体は７日後に生存能力の損失を示し、製剤化された発酵固体は少なくとも１４日まで生存能力を示す。顆粒にカプセル化されたＭ．アニソプリエ（Ｍ．ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ）発酵固体は、ＰＶＡ－タルク－トレハロース噴霧混合物のみに含まれるものと同様の安定性を示す。従って、流動床での混合、噴霧、及び高温での保持の追加のストレスにもかかわらず、顆粒の安定化は、賦形剤のみを使用して達成された安定化とほぼ同等である。従って、先の実施例でモデル薄膜系の様々な微生物について示された安定化は、より実用的で扱いやすい顆粒形態でも達成することができる。

実施例９．顆粒におけるグルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体の安定化
Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体を含有するマトリックス顆粒は、製剤賦形剤のＰＶＡ、タルク、及びトレハロースを使用して、Ｇｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ＬａｂＳｙｓｔｅｍ ５（Ｇｌａｔｔ ＧｍｂＨ，Ｂｉｎｚｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）噴霧造粒装置での連続噴霧造粒により生成した。実施例８に記載され、図１に組成タイプ２として示されている複合構造でコーティングされた顆粒とは対照的に、Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）マトリックス顆粒は、図１に組成タイプ１として示されている単一構造を表す。

Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）の発酵は、１５ＬのＳＩＰ／ＣＩＰ発酵槽で行った。発酵培地は、酵母抽出物（５～１０ｇ／ｋｇ）、大豆粕（５～１０ｇ／ｋｇ）、硫酸マグネシウム七水和物（１～３ｇ／ｋｇ）、一塩基性リン酸カリウム（０．５～２ｇ／ｋｇ）、硫酸アンモニウム（０．５～１．５ｇ／ｋｇ）、消泡剤（１ｇ／ｋｇ）とともにＴｅｋｎｏｖａの修飾微量元素溶液と類似した微量元素（２ｍＬ／ｋｇ）の水性懸濁液からなる。塩化カルシウム二水和物（２～４ｇ／Ｌ）及びグルコース（５０ｇ／Ｌ）を滅菌後に添加した。アンモニア水を使用してｐＨを５．５に維持し、温度を３０℃に維持した。６０％ｗ／ｗグルコース溶液からなる供給物を、３０時間で供給開始し、０．９５ｇ／分の速度で実行の最後（７２時間）まで続けた。

その後、発酵ブロスを、２，０００ｍＬのスウィング容器６個を備えた Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ １２ＢＰ遠心分離機での遠心分離によって濃縮した。合計８，０００グラムの発酵ブロスを保持する遠心分離器容器を、１０℃の操作温度にて４，０００×Ｇで２５分間回転させた。６，４００グラムの上清をデカントし、沈殿物を残りの上清で再懸濁し、発酵終了ブロスと比較して発酵固体の５倍に濃縮された懸濁液を得た。これは、発酵固体含有量がおよそ１５．５％であり、生存能力が２．８×１０^８ＣＦＵ／ｍＬである濃縮発酵ブロスを生成し、これを使用して顆粒を調製した。

Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体を含有する顆粒を、Ｇｌａｔｔ ＰｒｏＣｅｌｌ ＬａｂＳｙｓｔｅｍ ５噴霧造粒装置を使用して生成した。顆粒は、最初に、ＰｒｏＣｅｌｌ装置におよそ４００～６００μｍ範囲のサイズの不活性顆粒を４５０ｇ充填することによって生成した。不活性顆粒は、ＰＶＡ、タルク、トレハロース、及び溶解した発酵固体からなった。不活性顆粒床を流動化し、この流動床に、ＰＶＡ、タルク、トレハロース、及びＧ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）からなる活性噴霧混合物を噴霧するとともに、床からの顆粒を、ジグザグシフターを含む通路を通した再循環によって系から同時に除去した。噴霧５時間後に生成された活性顆粒の最終量は、１２００ｇであった。活性混合物が連続的に噴霧され、床から顆粒が連続的に除去されるにつれて、不活性顆粒床は、Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体を含む活性顆粒床と徐々に交換された。連続造粒プロセス中の様々な時点で採取された顆粒の生存能力の比較は、床が十分に再循環して約９０分後に定常状態の生存能力に到達したことを示唆しており、この時間後に床から取り出された顆粒は実行の最後に取り出されたものと同等の生存能力を示した。Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体－含有顆粒を生成するのに使用される噴霧条件を表１８に詳述した。得られた顆粒は、およそ６％ｗ／ｗのＧ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体、５２％ｗ／ｗのタルク、１２％ｗ／ｗのトレハロース、及び２６％ｗ／ｗＰＶＡを含有し、含水量は４％ｗ／ｗであった。造粒直後の顆粒の水分活性は約０．４であり、相対湿度４５％で７日間保存した後、約０．４５まで徐々に増加した。

Ｇ．セリナス（Ｇ．ｃｅｒｉｎｕｓ）発酵固体含有顆粒を２２℃及び４５％ＲＨで０、７、３３、及び１０４日間保存し、実施例１に記載されているように、各インキュベーション期間の終わりにサンプルのアリコートの生存能力を測定した。表１９に、２２℃及び４５％ＲＨで、０、７、３３、及び１０４日間インキュベートした後の顆粒の生存能力をまとめている。濃縮物、顆粒、及び噴霧混合物は全て、この温度で１０４日間保存した後でも生存能力の低下は見られなかった。更に、保存された顆粒の含水量は、元の４％ｗ／ｗから認識可能な程度までの変化はなかった。従って、流動床での混合、噴霧、及び高温での保持の追加のストレスにもかかわらず、顆粒の安定化は、微生物の液体調製物の安定性とほぼ同等である。更に、単位発酵固体当たり０日後の顆粒中の微生物の生存能力は、製剤化及び非製剤化液体の生存能力とほぼ同等であり、噴霧造粒プロセスで生存能力が失われなかったことを示唆している。従って、先の実施例でモデル薄膜システムの様々な微生物について示された安定化は、より実用的で扱いやすい水に容易に分散しやすい顆粒形態でも達成することができる。

Claims (28)

1. 蒸発した懸濁液を形成するマトリックスに埋め込まれた発酵固体を含む微生物組成物であって：非吸湿性マトリックス及び発酵固体を重量で少なくとも１：１の比で有することを特徴とし、前記マトリックスは、水分調節結合剤及び粘着防止剤を重量で１：５～５：１の比で、及び任意選択的に、７５重量％以下の保護安定剤を含み；前記蒸発した懸濁液は、５０％の相対湿度及び２０℃の温度で保存した場合に、少なくとも１重量％及び最大３０重量％の含水量の水を有する、組成物。
2. 前記結合剤、粘着防止剤、及び任意選択的な保護安定剤が、各々、５０％、任意選択的に７５％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある、請求項１に記載の組成物。
3. 前記マトリックス及び発酵固体が、重量基準で、少なくとも６：１、少なくとも１０：１、少なくとも２０：１、少なくとも５０：１、及び更には少なくとも１００：１、又はそれ以上の比である、請求項１又は２に記載の組成物。
4. ２０℃で少なくとも０．３５の水分活性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
5. ５０％の相対湿度及び２０℃の温度で保存した場合に、１重量％超、３重量％超、及び更には５重量％超、並びに最大３０重量％の水を更に有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
6. 実質的に前記保護安定剤を含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 前記保護安定剤を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
8. 前記発酵固体が、前記マトリックス内に分布している、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
9. 前記結合剤が、ポリビニルアルコールである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記粘着防止剤が、タルクである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記保護安定剤が、トレハロース又はソルビトールである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記発酵固体が、細菌及び／又は真菌の微生物構造を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記発酵固体が、昆虫病原糸状菌の微生物構造を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物を含む、粒子又は顆粒。
15. 一体的な構造を有する、請求項１４に記載の粒子又は顆粒。
16. 複合構造を有する、請求項１４に記載の粒子又は顆粒。
17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の組成物を含む種子処理剤、葉面処理剤、インファロー処理剤、動物飼料サプリメント、ヒトプロバイオティクス、又はパーソナルケア製品。
18. マトリックスに埋め込まれた発酵固体を含む組成物を調製して蒸発した懸濁液を形成する方法であって、
    （ａ）重量基準で、発酵固体を非吸湿性マトリックスと１：１又はそれ以上の比で組み合わせ、少なくとも５０重量％の含水量を有する発酵固体を含有する懸濁液を形成することと、
    （ｂ）得られた前記蒸発した懸濁液が周囲条件下で０．３５以上の水分活性に達するまで０℃～５０℃の温度で発酵固体を含有する前記懸濁液を部分的に乾燥させることと、
    を含む、方法。
19. 前記マトリックスが、水分調節結合剤及び粘着防止剤を、重量基準で、１：５～５：１の比で含み、前記マトリックス中７５％以下の保護安定剤を含む、請求項１８に記載の方法。
20. 前記保護安定剤、結合剤、及び粘着防止剤が、各々、５０％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある、請求項１９に記載の方法。
21. 前記保護安定剤、結合剤、及び粘着防止剤が、各々、７５％の相対湿度で、１０％未満の水の取り込みがある。請求項２０に記載の方法。
22. 前記蒸発した懸濁液が、１重量％超、３重量％超、及び更には５重量％超、並びに最大３０重量％の水を有する、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記発酵固体が、前記マトリックス内に分布している、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記発酵固体が、中間の乾燥工程を経ることなく、前記マトリックスと接触する、請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記蒸発した懸濁液を含む顆粒を生成する工程を更に含む、請求項１８～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記顆粒が一体的な構造を有する、請求項２５に記載の方法。
27. 前記顆粒が複合構造を有する、請求項２５に記載の方法。
28. 前記蒸発した懸濁液が、請求項１～１３のいずれか一項に記載の蒸発した懸濁液である、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の方法。

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