CN116491503A - 稳定的微生物组合物和干燥工艺 - Google Patents

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Abstract

描述了组合物和方法，其涉及在环境条件下长期储存而无需冷藏、控制湿度或特殊包装的制剂和工艺条件。

Description

稳定的微生物组合物和干燥工艺
本申请是申请日为2019年10月24日、发明名称为“稳定的微生物组合物和干燥工艺”的中国专利申请201980085873.8(国际申请号PCT/US2019/057823)的分案申请。
技术领域
本发明的组合物和方法涉及用于稳定微生物以在环境条件下长期储存而无需冷藏、控制湿度或特殊包装的制剂和工艺条件。
背景技术
微生物(如细菌、真菌和酵母)可通过刺激生长、通过增强营养和免疫力、以及通过控制疾病和有害生物的破坏，为动物和植物提供益处。当发现于密切关联的宿主动物或植物时，这些微生物为宿主提供此类必需或有益的服务。近年来，人们发现外源提供此类有益微生物(通常被称作益生菌或生物制剂)比通常存在的内源微生物更一致地、更好地提供其有益功能，甚至改变微生物组平衡，以抑制或排除对宿主生物体可致病或有害的微生物的定殖，可产生可观的商业利益。
以产品的形式向植物和动物递送有益微生物不仅需要保证产品的生物学有效性，同时还需要保持微生物在产品的生产、储存和使用期间的生活力和有效性。微生物的某些微生物结构具有固有稳定性，如强健的营养细胞、或芽孢/孢子。美国专利号5,929,507描述了一种组合物，通过将微生物和可溶性未交联多糖(如褐藻胶)组合，该组合物适合于稳定用作植物种子接种剂(inoculant)的微生物褐藻胶。然而，藻酸盐封装的实用性受到以下事实的制约和限制：示例性接种菌(如，根瘤菌(Rhizobia japonica)和液化沙雷氏菌(Serratia liquifaciens))具有热稳定性并且在环境条件下无需添加特殊保护性稳定剂就可以很好地存活。
不过，很多有益微生物对温度、湿度和氧气以及其他环境压力敏感，因此易于在数小时或数天内迅速失去生活力。通常，已知可以通过在冷藏下、以干燥形式、以低水活度或在湿度和渗透性受控包装中储存来确保或延长活微生物的有效期。通过干燥工艺(如冻干或冷冻干燥)，通常结合保护性稳定剂的添加，可将微生物的水活度降低至低水平，如低于0.4、0.2甚至低于0.1。美国专利号9,469,835描述了一种通过玻璃化工艺稳定各种微生物(包括细菌和真菌)的手段。该专利描述了一种两步干燥工艺，首先是在真空下，在接近零度以下温度从部分冻结浆状物开始干燥，然后在高于40℃的温度干燥，直至达到非常低的含水量和低水活度。已确认此工艺可生产具有显著升高的玻璃化转变温度(Tg)的机械稳定泡沫，从而使生物决不会经受和Tg一样高的温度。
美国专利公开号2014/0004083公开了一种用来保存微生物(例如乳酸菌)的冷冻保护体系，通过添加与肌醇按特定范围的比率组合的非还原糖(例如海藻糖)，并且随后冷冻、真空干燥或冷冻干燥组合物以干燥储存。美国专利号9,308,271描述了一种冷冻保护体系，该体系通过在不存在褐藻胶的情况下添加海藻糖、菊粉和水解酪蛋白，然后冷冻干燥该组合物，并在温度高达35℃且水活度为0.3或更小条件下储存该组合物，从而保存乳酸菌。在微生物组合物已经被冷冻干燥或真空干燥的情况下，可以通过将微生物组合物包装在由具有低水蒸气渗透性的阻隔材料制成的胶囊、瓶子或小袋中来维持其低水活度。
已经做出了一些尝试，以提供在环境温度和湿度下而无需冷冻干燥或特殊包装储存期间可保持微生物生活力的组合物。美国专利公开号2012/014253号描述了一种组合物和方法，该组合物和方法通过生产包含干燥生物的核心粒子并用吸湿性盐(如磷酸盐的混合物)对该核心粒子进行涂覆来稳定经脱水的微生物。吸湿性盐涂层实际上起着水诱饵的作用，其可以在水分扩散至核心粒子中的经脱水的微生物之前从环境中吸收并捕获水分。尽管这些实例提供了在中等湿度条件下在储存期间稳定性增强的一些证据，但吸湿性盐层将逐渐被所吸收的水份饱和，并最终失去保护湿度敏感微生物不吸收水分进而失活的能力。因此，仍然需要一种稳健且持久的方式来限制水的持续吸收，从而保持在环境温度和湿度条件下储存的微生物的生活力，而无需特殊包装或采取其他措施来冷冻和维持微生物的低水活度。
虽然冷藏、湿度控制和特殊包装措施在某些应用(例如，人类治疗剂、营养保健品、膳食补充剂或食品)中是合适且经济的，但仍然存在几个重要的工业应用，其中在受控温度和湿度条件下储存，或使用水蒸气渗透性较低的特殊包装储存微生物不实际或不经济。
例如，在农作物应用中，旨在刺激植物生长或控制植物病虫害的微生物产品通常以液体或干燥制剂配制(无需冷藏或防潮包装储存)，并经由种子涂层、叶面喷雾或犁沟粉末或颗粒在开放式环境中施用。用于农作物施用的液体制剂包括水溶液或混悬液以及非水制剂，例如油、乳剂和悬乳剂。干制剂包括可湿性粉剂和颗粒剂，可直接在田间施用或稀释以形成可喷雾的溶液或混悬液，可将其喷施至植物上。
在饲料动物健康应用中，通常将旨在改善健康或防止疾病的微生物产品引入饮用水中或混入由游离含水量很高的谷物组成的干燥动物饲料糊状物中。通常经蒸汽制粒工艺将干燥饲料糊状物进一步制成球粒，其中新鲜蒸汽与饲料混合并在80℃-100℃的温度挤压通过模具。纯的、或呈球粒的或未呈球粒的动物饲料的微生物产品在没有冷藏、湿度控制或特殊包装的仓库中在储存3-12个月或更长时间期间必须保持活力。
对于食品和饮料应用，通常直接掺入微生物以提供益生菌益处。在湿润食品(如零食条)或饮料(如酸奶或果汁)中，掺入的微生物必须在几个月或更长时间内保持活力。益生菌微生物也可以掺入宠物食品(如粗磨食物)中。在这些应用中，通常不提供冷藏储存或特殊包装来防潮。
在上述应用中适合用作有益试剂的微生物包括任何细菌、酵母或真菌，并且可以包含多种不同的细胞形态(包括营养细胞、菌丝体、芽孢/孢子或孢囊)。根据特定的物种，这些形态中的某些形态可以具有显著增强的储存稳定性。例如，许多细菌和真菌物种产生的芽孢/孢子可在长时间的休眠期(几个月甚至几年)期间保持生活力，直到在萌发条件下重新活化。
但是，许多微生物结构在环境条件下，即，温度高于约10℃(最典型为20℃-30℃)和湿度高于10％ RH(最典型为30％-60％ RH)，在长时间储存时，即超过一天(最典型为3-52周)不能保持活力。例如，很多营养细菌细胞、真菌孢子和真菌微核菌在这些条件下均未显示延长的生活力。
需要在有效期内稳定的微生物制剂和生产这种制剂的工艺，以确保在环境条件下储存，例如在无需冷藏、湿度控制或特殊包装条件下储存时制剂中的微生物的生活力得到改善。
发明内容
本发明的组合物和方法涉及用于延长微生物储存期限的赋形剂和工艺条件。
1.一方面，提供了一种微生物组合物，其包含包埋在基质中形成经蒸发混悬液的发酵固体，该微生物组合物特征在于：按重量计至少1:1的比率的非吸湿性基质和发酵固体；其中所述基质包含按重量计1:5与5:1之间比率的水分调节粘合剂和防粘剂，以及任选地不超过按重量计75％的保护性稳定剂；其中当在50％的相对湿度和20℃的温度储存时，所述经蒸发混悬液具有按重量计至少1％的含水量和至多30％的水。
2.在段落1所述的组合物的一些实施例中，所述粘合剂、防粘剂和任选的保护性稳定剂各自在50％和任选75％相对湿度具有小于10％的水吸收。
3.在段落1或2所述的组合物的一些实施例中，所述基质和发酵固体的比率为按重量计至少6:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1、甚至至少100:1或更高。
4.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的组合物在20℃的水活度为至少0.35。
5.在一些实施例中，当在50％的相对湿度和20℃的温度储存时，如前述段落中任一项所述的组合物还具有按重量计大于1％、大于3％、甚至大于5％和高达30％的水。
6.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的组合物基本上不含保护性稳定剂。
7.在一些实施例中，如前述段落中任一项所述的组合物含保护性稳定剂。
8.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述发酵固体分布在所述基质内。
9.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述粘合剂是聚乙烯醇。
10.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述防粘剂是滑石。
11.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述保护性稳定剂是海藻糖或山梨糖醇。
12.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述发酵固体包含细菌和/或真菌的微生物结构。
13.在前述段落中任一项所述的组合物的一些实施例中，所述发酵固体包含病原真菌的微生物结构。
14.在另一方面，提供了一种粒子或颗粒，所述粒子或颗粒包前述段落中任一项所述的组合物。
15.在一些实施例中，如段落14所述的粒子或颗粒具有单一结构。
16.在一些实施例中，如段落14所述的粒子或颗粒具有复合结构。
17.在另一方面，提供了包含前述段落中任一项所述的组合物的种子处理、叶面处理、犁沟处理、动物饲料补充剂、人益生菌或个人护理产品。
18.在另一方面，提供了用于制备包含包埋在基质中以形成经蒸发混悬液的发酵固体的组合物的方法，所述方法包括：(a)将发酵固体与非吸湿性基质以按重量计1:1或更高的比率组合，以形成包含具有按重量计至少50％的含水量的发酵固体的混悬液；和(b)在0℃与50℃之间的温度将含有发酵固体的混悬液部分地干燥，直到在环境条件下所得的经蒸发混悬液的水活度不低于0.35。
19.在段落18所述的方法的一些实施例中，所述基质包含按重量计1:5与5:1之间比率的水分调节粘合剂和防粘剂以及基质中不大于75％的保护性稳定剂。
20.在段落19所述的方法的一些实施例中，所述保护性稳定剂、粘合剂和防粘剂，在50％相对湿度各自具有小于10％的水吸收。
21.在段落20所述的方法的一些实施例中，所述保护性稳定剂、粘合剂和防粘剂，在75％相对湿度各自具有小于10％的水吸收。
22.在段落18-21中任一项所述的方法的一些实施例中，所述经蒸发混悬液具有按重量计大于1％、大于3％、甚至大于5％和高达30％的水。
23.在段落18-22中任一项所述的方法的一些实施例中，所述发酵固体分布在所述基质内。
24.在段落18-22中任一项所述的方法的一些实施例中，所述发酵固体与基质接触，未经中间干燥步骤。
25.在段落18-24中任一项所述的方法的一些实施例中，所述方法进一步包括制备包含所述经蒸发混悬液的颗粒的步骤。
26.在段落25所述的方法的一些实施例中，所述颗粒具有单一结构。
27.在段落25中所述的方法的一些实施例中，所述颗粒具有复合结构。
28.在段落18-27中任一项所述的方法的一些实施例中，所述蒸发混悬液为段落1-13中任一项所述的经蒸发混悬液。
根据说明书，本发明的组合物和方法的这些和其他方面和实施例将是显而易见的。
附图说明
图1表示与说明书一致的稳定的微生物组成。
具体实施方式
I.定义和缩写
在详细地描述本发明的菌株和方法之前，为了清楚起见定义以下术语。未定义的术语应当符合相关领域中所使用的常规含义。
如本文所使用的，术语“微生物(microbes和microorganisms)”可互换使用，是指微观的单细胞或多细胞生物，例如但不限于细菌或真菌。
如本文所使用的，术语“微生物结构”是指微生物的任何结构，例如但不限于细胞、菌丝、芽孢/孢子和微菌核或其任何组合。
如本文所使用的，术语“微菌核”是指小菌核，其是由紧凑的菌丝聚集体(有时是黑化真菌(melanized))组成的真菌结构，其保持休眠直至遇到有利的生长机会。
如本文所使用的，“致病真菌”是对昆虫具有致病性因此可以使昆虫失活或杀灭昆虫的真菌。
如本文所使用的，“发酵固体”包括活细胞或死细胞、细胞片段、细胞碎片、营养细胞、芽孢/孢子、菌丝体、微菌核或任何其他微生物结构、以及收获或进一步加工的微生物发酵液中或从微生物发酵液中衍生的其他可溶和不可溶性物质，包括任何添加的回收助剂(例如沉淀剂、絮凝剂、细胞杀灭剂和增溶剂)，但不包括为稳定微生物结构添加的任何基质成分。
如本文所使用的，“生活力”是指生存和/或存活的能力。
如本文所使用的，“稳定性”是指随时间推移保持生活力的能力。
如本文所使用的，“环境”条件定义为20℃-30℃和30％-60％ RH。出于定义的测试或比较基准的目的，更特别地将“环境条件”规定为20℃、1.0atm和50％ RH。
如本文所使用的，“升高的”湿度定义为60％-100％ RH。出于定义的测试或比较基准的目的，更特别地将“升高的”湿度规定为75％ RH。
如本文所使用的，“升高的”温度定义为30℃-60℃。出于定义的测试或比较基准的目的，更特别地将“升高的”温度规定为37℃。
如本文所使用的，术语“水溶性”是指在20℃在水中的溶解度为每100克水至少1克的溶质。
如本文所使用的，术语“水溶液”是指含有按重量计至少50％水的溶质的溶液。
如本文所使用的，术语“水活度(aW)”是指在指定的时间或在指定的时间段内，组合物中水的分蒸气压除以水的标准分蒸气压的结果。标准状态通常定义为相同温度时纯水的分蒸气压。除非另有说明，否则水活度为在20℃测量的结果。
如本文所使用的，关于组合物的术语“相对湿度”(“RH”)是指空气中存在的水蒸气的含量，表示为在相同温度时饱和所需的量的百分比。
如本文所使用的，术语“含水量”或“水分含量”是指组合物中水的百分比，重量分析地表示为％w/w或wt％。
如本文所使用的，术语“水吸收容量”是指在给定温度和湿度储存的物质的平衡含水量。其可以表示为WUC(T、RH)，其中T是物质储存的温度，RH是相对湿度。当在恒定的湿度和温度储存条件下，至少24小时的时间间隔内的含水量测量值变化小于2％w/w，则认为平衡条件已充分建立。
如本文所使用的，术语“非吸湿性”是指在50％ RH和20℃具有最大10％w/w水吸收容量(即MUC(T，RH) <10％)的物质的性质。
如本文所使用的，术语“吸湿性”是指在50％ RH和20℃具有大于10％w/w的水吸收容量(即MUC(T，RH)>10％)的物质的性质。
如本文所使用的，术语“水分调节粘合剂”或简称“粘合剂”是指水溶性但非吸湿性的聚合物。
如本文所使用的，术语“防粘剂”是指降低粘合剂的粘着性或粘附性的无机或有机化合物。防粘剂可以额外为基质(例如作为填充剂、润滑剂、防潮层、分散剂或密度调节剂)提供额外的功能。
如本文所使用的，术语“保护性稳定剂”是指可保护微生物和微生物结构(如膜和细胞内蛋白)的结构、生物学活性和生殖活力以延长微生物在环境或接近环境条件储存时的活力持续时间的化合物。
如本文所使用的，术语“基质组分”，或简称“基质”是指组合物，该组合物包含除发酵固体组分之外的水分调节粘合剂、防粘剂和保护性稳定剂。
如本文所使用的，术语“经蒸发混悬液”是指发酵固体和基质组分的组合混悬液，从中蒸发水至一定程度，使得所得组合物保持大于1％、大于3％、或大于5％w/w，但仅高达30％w/w的相对稳定的含水量。经蒸发混悬液包含包埋在基质中的发酵固体。
如本文所使用的，术语“赋形剂”是指常规制剂组分，包括但不限于本文所述的基质组分。
如本文所使用的，“部分地干燥”或“部分干燥”是指仅按组合物保留大于1％w/w的水、大于3％w/w的水、且优选大于5％w/w的水的程度从组合物中吸去水。
如本文所使用的，“中间干燥”是指在与基质混合前，按发酵固体保留少于50％w/w的水、少于30％w/w的水或甚至少于10％w/w的水的程度从发酵固体中吸去水。
如本文所使用的，“缓慢干燥”是指使每小时失水量不超过5％w/w的干燥工艺。
如本文所使用的，“种子处理”是涂层组合物，所述组合物通常包含杀有害生物剂、杀生物剂(即杀真菌剂)、生长刺激剂或其他化学或生物材料，所述组合物在播种前被用于对种子进行处理、涂覆或“拌种(dressed)”。本发明的组合物和方法中，种子处理可以是杀昆虫处理。
如本文所使用的，关于温度的“保持”简单地意指在搅拌或不搅拌时保持在特定温度。
为了便于参考，可以将本发明的组合物和方法的要素排列在一个或多个标题下。要注意的是，每个标题下的组合物和方法也适用于其他标题下的组合物和方法。
如本文所使用的，单数冠词“一个/一种(a/an)”以及“所述”涵盖复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。本文引用的所有参考文献均通过引用以其全文特此并入。除非另外说明，以下缩写/首字母缩略词具有以下含义：
ATCC 美国典型培养物保藏中心
atm 大气压
aW 水活度
CFU 菌落形成单位
℃ 摄氏度
G 重力
g 克
g/L 克/升
g/mol 克/摩尔
hr或h 小时
kg 千克
LB 卢里亚肉汤培养基(Luria broth)
M 摩尔
mg 毫克
mL或ml 毫升
min 分钟
mm 毫米
μm 微米
μg 微克
μL和μl 微升
MUC 水分吸收容量
MS 微菌核
PDA 马铃薯右旋糖琼脂
psig 磅/平方英寸，标准尺寸
PVA 聚乙烯醇
Tg 玻璃化转变温度
TSB 胰蛋白酶大豆液体培养基
rpm 转数/分钟
RH 相对湿度
wt％或％w/w 重量百分比(按重量计)
YE 酵母提取物
YEG 酵母提取物葡萄糖
YPD 酵母蛋白胨右旋糖琼脂
II.用于稳定微生物的组合物和方法
A.介绍
本发明的组合物和方法通过将发酵固体包埋在包括水分调节粘合剂、防粘剂和保护性稳定剂的非吸湿性基质中，并将所述基质/发酵固体组合物部分地干燥，使其保留适当含量的水，从而解决了稳定微生物结构的问题。当在环境温度和湿度条件下储存时，所得经蒸发混悬液可以长时间保护微生物结构。
本发明的经蒸发混悬液的关键特征在于在整个加工以及在环境条件下的储存期间，其可保持适度的含水量和水活度。先前描述的用于稳定微生物的组合物和方法依赖于干燥至非常低的水活度水平、使用湿度控制的包装、冷藏、玻璃化或水置换以“锁定”在玻璃态的嵌入基质中。在这种先前的组合物和方法中，为确保最终组合物具有升高的玻璃化转变温度(Tg)，提高干燥温度和除水程度非常重要。通常将冷冻干燥和保护性稳定剂结合，以便在较高的温度下完成干燥工艺之前，经由在高真空和低温升华来去除大部分水。
相反地，本发明的组合物和方法基于令人惊讶的观察结果，即各种微生物的微生物结构可以在远高于基质组分的Tg的温度包埋在基质中，所述基质包含低至中等的游离水或流动水。虽然保护性稳定剂可以增强包埋的微生物结构的稳定性，但由于所选基质成分具有低吸湿性，因此可以实现显著的稳定作用。此外，通过使用环境温度或接近环境温度的部分干燥工艺，可以避免因冷冻、暴露于升高的温度以及在低含水量和低水活度的极度干燥下引起的物理应力，所述工艺较温和且对微生物结构的损害较小。
基质的量至少应与蒸发混悬液中发酵固体的量一致，并且优选应超过发酵固体的量，所述基质的组成组分将进一步详细描述。例如，总基质组分与发酵固体的比率可以为至少1:1、至少2:1、至少4:1、至少6:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1、甚至至少100:1或更高。
B.水分调节粘合剂
本发明的组合物和方法的基质包括至少一种水分调节粘合剂，出于将发酵固体包封或包埋在微环境中的目的，该微环境在20℃的温度在约50％ RH保持约1-30％w/w水的含水量，或甚至在约75％ RH，保持约1-30％w/w水的含水量。已经发现这种微环境适用于延长在环境条件下储存的微生物结构的稳定性。水分调节粘合剂的另一个功能是提供适合于颗粒或其他固体应用的制剂的机械附着膜。
水分调节粘合剂，或简称“粘合剂”是水溶性但非吸湿性的聚合物，其在20℃在水中的溶解度为至少1克/100mL。示例水分调节粘合剂是MUC(20、50)为4％的聚乙烯醇(PVA)和MUC(20、50)为1％的聚乙二醇(PEG)。优选水分调节粘合剂是PVA。不适合用作水分调节粘合剂的聚合物包括MUC(20，50)为18％的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和MUC(20，50)为20％的褐藻胶。本发明的组合物和方法的优选实施例包括优选的聚合物，并且排除上述不合适的聚合物。
C.防粘剂
本发明的组合物和方法的基质包含至少一种防粘剂，其目的是降低水分调节粘合剂的粘着性或粘附性。防粘剂是既不结合水也不排斥水的无机或有机化合物。防粘剂可以额外为基质(例如作为填充剂、润滑剂、防潮层、分散剂或密度调节剂)提供额外的功能。
无机防粘剂包含矿物质，例如滑石、云母、硅酸镁、以及粘土，例如高岭土、蒙脱石和绿坡缕石。有机防粘剂包含阴离子和乙氧基化表面活性剂或分散剂。有效的防粘剂具有轻微的疏水性或两亲性，易于在亲水性聚合物膜的表面结合或形成层。在环境湿度或更高的湿度下吸收或结合大量水的干燥剂(例如沸石和其他分子筛)不适合用作防粘剂。优选的防粘剂是滑石。本发明的组合物和方法的优选实施例包括优选的防粘剂，并且排除上述不合适的防粘剂。
相对于水分调节粘合剂，防粘剂应以约1:5至5:1的重量比率存在于基质中，例如至少1:5、至少1:4、至少1:3、至少1:2、至少1:1、至少2:1、至少3:1、至少4:1或甚至至少5:1。
D.保护性稳定剂
本发明的组合物和方法的基质可以包括至少一种保护性稳定剂，其目的是通过保护亚细胞微生物组分(例如细胞膜和细胞内蛋白)来保护微生物的微生物结构、生物学活性和生活力，从而延长微生物在环境或接近环境条件的活力持续时间。
保护性稳定剂包含非还原单糖和二糖，例如海藻糖、蔗糖和山梨糖；糖醇，例如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇和异麦芽酮糖醇；多糖，例如小麦淀粉或麦芽糊精；氨基酸，例如脯氨酸、精氨酸或谷氨酸或其盐；α-酮酸(例如丙酮酸)，蛋白质(例如乳清蛋白和酪蛋白)；固有无序蛋白，例如tardigrade蛋白质；以及上述组分的复杂天然混合物，例如喷雾干燥的奶粉。优选的保护性稳定剂是海藻糖和山梨糖醇。
为了保持水分调节粘合剂和整个基质的非吸湿性，保护性稳定剂本身应为非吸湿性物质，即，在50％ RH和20℃的水分吸收容量至多为10％。关于一些示例性保护性稳定剂，海藻糖的MUC(20，50)为1％、山梨糖醇的MUC(20，50)为5％、甘露糖醇的MUC(20，50)为3％、木糖醇的MUC(20，50)为2％、赤藓糖醇的MUC(20，50)为2％、异麦芽酮糖醇的MUC(20，50)为1％、麦芽糊精(DE17-21)的MUC(20，50)为7％、小麦淀粉的MUC(20，50)为9％、乳清蛋白的MUC(20，50)为6％、并且喷雾干燥的奶粉的MUC(20，50)为1％。
已知在干的干燥系统中可稳定微生物某些糖(例如，还原糖)、多元醇、氨基酸和蛋白质具有吸湿性，不适合用作本发明的组合物和方法中的保护性稳定剂。例如，甘油是MUC(20，50)为28％的简单多元醇。在环境湿度下会吸收或结合大量水的干燥剂(例如沸石和其他分子筛)也不适合用作稳定剂。本发明的组合物和方法的优选实施例包括优选的稳定剂，并且排除上述不合适的稳定剂。
基质应包含0％与75％w/w之间的保护性稳定剂，从而使至少25％w/w的基质包含粘合剂和防粘剂的组合。尽管优选地在基质中包含保护性稳定剂，但保护性稳定性不是必需的而是可选的。对于给定的微生物和储存或使用条件，本领域技术人员可以确定在不存在稳定剂的情况下，粘合剂和防粘剂是否能提供足够的保护，以及稳定剂的附加益处是否可证明引入稳定剂的成本的合理性。
E.经蒸发混悬液的含水量和水活度
根据本发明的组合物和方法，将基质组合物添加到发酵固体中，并将所得配制的发酵固体进行干燥以形成蒸发混悬液，该混悬液在环境条件下保持水活度(aW)高于0.35、高于0.40、高于0.45或甚至高于0.50。在本文中，术语“高于”与“不低于”同义。在静态或对流空气下进行干燥，以保持配制的发酵固体的温度低于50℃、低于45℃、低于40℃、甚至低于35℃。优选地，干燥工艺是缓慢进行的，每小时干燥除去少于5％w/w的水。
本发明的干燥工艺可以通过能够在上述温度范围内操作的任何常规的静态或对流干燥方法进行。干燥工艺也可以与制粒或颗粒形成工艺同时进行。合适的干燥方法包括但不限于：喷雾干燥；流化床干燥、喷涂，喷雾制粒或聚结；转鼓制粒或高剪切制粒。
在约50％ RH或甚至约75％ RH在20℃的温度，经蒸发混悬液的最终含水量应大于1％、大于3％、甚至大于5％、并且高达30％的水。
F.微生物和微生物结构
从下面示例的多种微生物(即枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)和绿僵菌(Metarhiziumanisopliae))中可以明显看出，本发明的组合物和方法似乎对不同门的微生物具有广泛的适用性。革兰氏阳性杆菌、酵母和丝状真菌均受本发明的组合物和方法的保护。微生物的任何结构，例如但不限于细胞、菌丝、芽孢/孢子和微菌核、或其任何组合，均受本发明的组合物和方法的保护。在没有对相似结果的更合理预期的情况下，没有理由预期本发明的组合物和方法不能应用于其他微生物或微生物结构。
G.另外的制剂
本发明的经蒸发混悬液通常适合于储存并即用于各种应用。或者，可以将蒸发混悬液进一步配制成粒子或颗粒，以方便处理和减少粉尘。颗粒可以是基质颗粒，其中经蒸发混悬液与其他组分一起分布以形成核、或涂覆的颗粒，其中经蒸发混悬液涂覆在核上。
图1示出了本发明的两种可能的可替代的微生物组合物结构，其为均匀单个粒子(包含蒸发混悬液)和复合结构(包含经蒸发混悬液作为组合物的唯一组成要素)，例如，作为可选的核上的一层并且具有可选涂层。其他结构是可能的，其中经蒸发混悬液只是几个部分或组分之一，包括具有一个以上蒸发混悬液的结构。
其他组分或核可以包括额外的活性剂，例如肥料、酶、抗生素等。颗粒可以进一步包括一个或多个额外的涂覆层，其可以进一步括含活性成分。
H.应用和用途
本发明的经蒸发混悬液或另外的制剂适合用作种子处理、叶面处理、犁沟处理、动物饲料补充剂、人益生菌和/或个人护理产品。含有微生物结构的经蒸发混悬液可以与其他活性成分组合，所述活性成分包含营养素、肥料、杀有害生物剂、抗生素等。
实例
以下实例旨在说明本发明的组合物和方法的实施例，而不应以任何方式解释为限制性的。
实例1.用于评估发酵固体中枯草芽孢杆菌、葡萄糖杆菌(Gluconobactercerinus)、酿酒酵母和里氏木霉生活力的方法
使用连续稀释板和CFU测定法确定发酵固体中细菌和真菌的生活力。将发酵固体重悬于5mL稀释缓冲液(枯草芽孢杆菌为TSB液体培养基、葡萄糖杆菌为PDB液体培养基、酿酒酵母为YPD液体培养基并且里氏木霉为YEG培养基)中，每10mg发酵固体。通过涡旋将混悬液混合，并使用相同的缓冲液进行10倍系列稀释。将部分混悬液均匀分布于含琼脂培养基(枯草芽孢杆菌为LB琼脂培养基、葡萄糖杆菌为PDA培养基、酿酒酵母为YPD琼脂培养基并且里氏木霉为YEG培养基)的培养皿表面上。将接种的琼脂板在培养箱中孵育(枯草芽孢杆菌在37℃孵育过夜、葡萄糖杆菌在25℃孵育2天、酿酒酵母在30℃孵育过夜、并且里氏木霉在28℃孵育2天)。在此期间，来自发酵固体的活微生物结构在板上形成菌落。对菌落进行计数，并报告为每毫克发酵固体的CFU。
实例2.使用赋形剂稳定含里氏木霉的发酵固体
在存在和不存在制剂赋形剂聚乙烯醇(PVA)、滑石和海藻糖的情况下，测试里氏木霉菌株的微生物结构的生活力和稳定性。如美国专利号7,713,725中所详细描述的方法进行里氏木霉的发酵，得到发酵固体，含量为约4％的液体培养基。
将未过滤、未浓缩的里氏木霉的液体培养基与制剂赋形剂PVA、滑石、海藻糖和水按表1所列的质量百分比混合，并将混合物手动均质以完全悬浮所有不溶性成分。为了促进均匀混合，在制备混悬液之前，将固体PVA以15wt％的固体浓度溶解于水中。使用微量移液器将混悬液以1mL等分试样沉积在固体表面上，以产生厚度约为200μm的薄膜。然后将这些薄膜在层流罩中在室温干燥过夜使含水量在1％与10％之间，从而将发酵固体包埋在包含赋形剂和残留水的基质中。沉积后约1小时，薄膜的水活度高于0.8。过夜干燥后，薄膜的水活度约为0.53，接近干燥工艺期间的环境相对湿度。干燥之前和之后的薄膜的最终组成分别在表1和2中列出。
表1.干燥前含有里氏木霉发酵固体的薄膜涂层混合物的组成
表2.干燥后含有里氏木霉发酵固体的薄膜的组成和水活度
如实例1所述，将这些薄膜在24℃和51％ RH储存0、3和7天，并在每个孵育期结束时测量生活力。微生物的生活力表示为悬浮混合物中每毫克里氏木霉发酵固体的CFU。表3总结了24℃和51％ RH孵育0、3或7天后每种制剂的含水量和生活力。孵育3和7天后，膜的水活度在0.50-0.55的范围内，表明膜的水活度与培养箱中的相对湿度平衡，同时含水量保持恒定。尽管相对于不含赋形剂的薄膜，含有制剂赋形剂PVA、滑石和海藻糖的薄膜显示出更高的含水量，但是与不含制剂赋形剂的薄膜相比，含有制剂赋形剂的薄膜还显示出改善的生活力，在每个时间点的CFU测量值高至少一个对数。
表3.通过在24℃和51％ RH孵育7天，含有里氏木霉发酵固体的薄膜的含水量和生活力
实例3.使用赋形剂稳定含酿酒酵母的发酵固体
在存在和不存在制剂赋形剂PVA、滑石、沸石、海藻糖和山梨糖醇的情况下，测试发酵固体中酿酒酵母菌株的微生物结构的生活力和稳定性。酿酒酵母的发酵在含有10g/LYE、20g/L细菌蛋白胨和20g/L葡萄糖的培养基中进行(带侧挡板的Erlenmeyer 500mL烧瓶，具有100mL培养基，在32℃在150rpm)，得到发酵液，然后将其离心使发酵固体的含量达到约1％。
将未过滤的酿酒酵母的液体培养基与制剂赋形剂PVA、滑石、海藻糖、沸石、山梨糖醇和水按表4中所列的质量百分比混合，并将混合物手动均质以完全悬浮所有不溶性成分。为了促进均匀混合，在制备混悬液之前，将固体PVA以15wt％的固体浓度溶解于水中。使用微量移液器将混悬液以1mL等分试样沉积在固体表面上，以产生厚度约为200μm的薄膜。然后将这些薄膜在层流罩中在室温干燥过夜使含水量在0％与15％之间，从而将发酵固体包埋在包含赋形剂和残留水的基质中。沉积后约1小时，薄膜的水活度高于0.8。干燥过夜后，薄膜的水活度在0.50-0.60范围内，接近干燥工艺期间的环境相对湿度。干燥后薄膜的最终组成和水活度列于表5。
如实例1所述，将这些薄膜在24℃和51％ RH储存0、3、7、14和21天，并在每个孵育期结束时测量生活力。微生物的生活力表示为悬浮混合物中每毫克酿酒酵母发酵固体的CFU。表6总结了在24℃和51％RH孵育0、3、7、14和21天后每种制剂的含水量和生活力。在3天或21天时间点未测量含水量；不过，在其他时间点测量的含水量表明膜的含水量在孵育期间相对稳定。孵育7和14天后，膜的水活度在0.50-0.55的范围内，表明膜的水活度与培养箱中的相对湿度平衡，同时含水量保持恒定。大多数制剂中，酿酒酵母微生物结构的生活力比未配制的干燥酿酒酵母至少高一个量级，制剂中仅含有沸石(#SC2)以及制剂中没有粘合剂或防粘剂(#SC7)的制剂的稳定性比未配制的酿酒酵母更差。此外，虽然未配制的干燥酿酒酵母的生活力在0天和21天时间点之间下降了两个数量级以上，但几种制剂(#SC1、#SC3、#SC4、#SC6)中酿酒酵母微生物结构的生活力在同一时期内下降幅度小于一个数量级，证明了PVA和滑石与其他赋形剂的组合具有稳定作用。与实例2中产生的里氏木霉薄膜一样，酿酒酵母微生物结构的生活力和稳定性不取决于沉积后薄膜的水分含量，这表明稳定作用为化学作用，而不是赋形剂的能力以保留水或帮助干燥。薄膜#SC4和#SC6在干燥和孵育后均含有10％或更高的水，但其随时间延长仍保持较高的活性，这表明不必完全干燥生物周围的环境以确保稳定性。膜#SC5和#SC6的海藻糖和山梨糖醇含量比#SC3和#SC4高，但并未显示酿酒酵母微生物结构稳定性显著提高，这表明实现稳定作用所需的赋形剂数量是有限的。
表4.干燥前含有酿酒酵母发酵固体的薄膜涂层混合物的组成
表5.干燥后含酿酒酵母发酵固体的薄膜的组成和水活度
表6.通过在24℃和51％ RH孵育21天，含有酿酒酵母发酵固体的薄膜的含水量和生活力
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实例4.使用赋形剂稳定含枯草芽孢杆菌的发酵固体
在存在和不存在制剂赋形剂PVA、滑石、沸石、海藻糖和山梨糖醇的情况下，测试发酵固体中枯草芽孢杆菌菌株的微生物结构的生活力和稳定性。枯草芽孢杆菌在胰蛋白酶大豆液体(TSB)培养基中进行发酵(带侧挡板的Erlenmeyer 500mL烧瓶，具有100mL培养基，在37℃在150rpm)，得到发酵液，然后将其离心使发酵固体的含量达到约3％。显微镜检查显示发酵液仅含有细菌细胞；没有芽孢存在。
将未过滤的枯草芽孢杆菌的全液体培养基与制剂赋形剂PVA、滑石、海藻糖、沸石、山梨糖醇和水按表7中所列的质量百分比混合，并将混合物手动均质以完全悬浮所有不溶性成分。为了促进均匀混合，在制备混悬液之前，将固体PVA以15wt％的固体浓度溶解于水中。使用微量移液器将混悬液以1mL等分试样沉积在固体表面上，以产生厚度约为200μm的薄膜。然后将这些薄膜在层流罩中在室温干燥过夜使含水量在0％与20％之间，从而将发酵固体包埋在包含赋形剂和残留水的基质中。沉积后约1小时，薄膜的水活度高于0.8。干燥过夜后，薄膜的水活度在0.50-0.60范围内，接近干燥工艺中的环境相对湿度。干燥后薄膜的最终组成和水活度列于表8。
如实例1所述，将这些薄膜在24℃和51％ RH储存0、3、7、14和21天，并在每个孵育期结束时测量生活力。微生物的生活力表示为悬浮混合物中每毫克枯草芽孢杆菌发酵固体的CFU。表9总结了在24℃和51％ RH孵育0、3、7、14和21天后每种制剂的含水量和生活力。孵育3或21天后未测量含水量；不过，在其他时间点测量的含水量表明膜的含水量在孵育期间相对稳定。孵育7和14天后，膜的水活度在0.50-0.55的范围内，表明膜的水活度与培养箱中的相对湿度平衡，同时含水量保持恒定。除#BS2和#BS7以外的所有制剂中枯草芽孢杆菌的生活力比未配制的干燥枯草芽孢杆菌至少高一个数量级。这些制剂在酿酒酵母微生物结构稳定性方面也是表现最差，这表明在存在PVA和滑石且不存在沸石的情况下可获得最佳制剂。制剂#BS7不含有粘合剂或防粘剂，因此会产生薄的纸状薄膜，该薄膜无法有效将微生物悬浮在保护性基质中，并且难以配制以用于任何固体应用。此外，虽然未配制的干燥枯草芽孢杆菌在0天和21天时间点之间的生活力下降了三个数量级以上，但所有含有山梨糖醇或海藻糖的PVA-滑石基质制剂的生活力(#BS3、#BS4、#BS5、#BS6)在同一时期内的下降幅度均小于两个数量级，强烈表明这两种赋形剂起稳定剂的作用，该结论还得到了多种生物的实验数据的支持。与实例2和3中所述的里氏木霉和酿酒酵母薄膜一样，枯草芽孢杆菌的稳定性与沉积后薄膜的水分含量无关，这表明稳定作用为化学作用，而不是通过赋形剂控制薄膜中的含水量的简单的物理作用。特别是，干燥后含有少于5％的水的薄膜(#BS3和#BS5)和干燥后含有超过10％的水的薄膜(#BA4和#BS6)具有相似的稳定性，表明制剂赋形剂可用于在高或低水分条件下稳定薄膜中的微生物。但是，未配制的微生物(含水量低于1％)和非基质系统#BS7(含水量高达16％)的稳定性都很差，这表明高或低水分含量均不足以稳定微生物。正确选择赋形剂系统对于在各种水分条件时达到所需的稳定性至关重要。
表7.干燥前含有枯草芽孢杆菌发酵固体的薄膜涂层混合物的组成
表8.干燥后含枯草芽孢杆菌发酵固体的薄膜的组成和水活度
表9.通过在24℃和51％ RH孵育21天，含有枯草芽孢杆菌发酵固体的薄膜的含水量和生活力
实例5.评估绿僵菌微生物结构的生活力的方法
使用两步测定法来确定绿僵菌(M.anisopliae)发酵固体中绿僵菌微生物结构(包括但不限于微菌核、菌丝体和芽孢/孢子)的生活力。第一步为确定在确定条件下由一定量的绿僵菌发酵固体产生的分生孢子总数，第二步为确定来自第一步的活分生孢子总数。第二步的额外益处在于，如果可以基于菌落形态进行区分，则可以鉴定出真菌污染物。因此，通过每毫克绿僵菌发酵固体产生的分生孢子CFU表示绿僵菌发酵固体的生活力。
两步测定法从将10mg绿僵菌发酵固体转移至锥形管中开始，然后添加5mL稀释缓冲液。稀释缓冲液含0.9％的氯化钠和0.05％的吐温80。通过涡旋将混悬液混合，并使用相同的缓冲液进行10倍系列稀释。将混悬液的部分均匀分布在含有水-琼脂培养基的培养皿表面。水-琼脂培养基含有2％的琼脂，并补充有100μg/mL链霉素以防止污染物生物生长。将接种的水琼脂板置培养箱中，在28℃黑暗条件下培养8天。在此期间，来自绿僵菌发酵固体的活微生物结构在板上形成菌落，并且在无性循环激活后产生了气生分生孢子。通过在板表面倾注10mL缓冲液收获分生孢子，然后使用“曲棍球棒”涂布器将分生孢子轻轻悬浮在稀释缓冲液中。将混悬液转移至锥形管中并涡旋混合。由分生孢子混悬液制备系列稀释液，并从每个系列的每份稀释液中取一部分均匀铺在Vogel基本培养基板上。Vogel基本培养基是本领域已知的。将接种板在光照培养箱中，按光照12小时/黑暗循环持续5天进行孵育。进行菌落计数，并报告为CFU/毫克绿僵菌发酵固体，这反映了从水琼脂平板上收集的活分生孢子的总数，所述水琼脂板接种了确定量的绿僵菌发酵固体。
如上所述的两步测定的重现性约为一个对数，即10CFU/毫克绿僵菌发酵固体，这足以评估活绿僵菌发酵固体的储存稳定性。
实例6.使用赋形剂稳定绿僵菌发酵固体
在存在和不存在制剂赋形剂PVA、滑石、沸石、海藻糖和山梨糖醇的情况下，测试发酵固体中绿僵菌菌株ATCC 90448的生活力和稳定性。根据按照美国专利公开号2009/0074809对绿僵菌进行发酵，得到发酵固体含量约为3％的发酵液。显微镜检查显示发酵液含菌丝体、芽孢/孢子和微菌核。经由离心浓缩发酵液，并弃去上清液。浓缩后液体培养基的发酵固体含量为约12％。浓缩后，发酵液的微菌核含量从1.1×105MS/mL增加至3.0×105MS/mL。
将浓缩的绿僵菌发酵固体与制剂赋形剂PVA、滑石、海藻糖、沸石、山梨糖醇和水按表10中所列的质量百分比混合，并将混合物手动均质以完全悬浮所有不溶性成分。为了促进均匀混合，在制备混悬液之前，将固体PVA以20wt％的固体浓度溶解于水中。使用微量移液器将混悬液以1.0-1.5mL等分试样沉积在固体表面上，以产生厚度约为200μm的薄膜。然后将这些薄膜在层流罩中在室温干燥过夜使含水量在0％与10％之间，从而将发酵固体包埋在包含赋形剂和残留水的基质中。薄膜的水活度性质与实例2、3和4中所述的相似。沉积后约1小时，薄膜的水活度高于0.80。干燥过夜后，薄膜的水活度在0.50-0.60范围内，接近干燥工艺中的环境相对湿度。干燥后薄膜的最终组成列于表11。
如实例5所述，将这些薄膜在24℃和51％ RH储存0、3和7天，并在每个孵育期结束时测量绿僵菌发酵固体中微生物结构的生活力。如实例2、3和4所述，孵育后，薄膜的水活度在0.50-0.55的范围内，表明膜的水活度与培养箱中的相对湿度平衡，同时含水量保持恒定。薄膜的生活力表示为悬浮混合物中每毫克绿僵菌发酵固体的CFU。表12总结了在24℃和51％ RH孵育0、3和7天后每种制剂的含水量和生活力。尽管未配制的发酵固孵育3天后显示没有生活力，但所有配制的发酵固体通过7天时间点显示极微或几乎没有生活力损失，证明所测试的所有赋形剂都能成功稳定含微菌核的绿僵菌发酵固体浓缩物。在所检测的不同制剂赋形剂中，观察到含沸石(#MA2)的薄膜生活力最低，这表明该赋形剂对PVA-滑石基质的积极作用最小。在实例3和4中的酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的薄膜中观察到沸石的积极作用最小。与酿酒酵母和枯草芽孢杆菌薄膜的实例不同，不存在PVA-滑石基质的单独的海藻糖(#MA5)显示提供稳定作用；然而，由于海藻糖膜对任何底物的粘附性均较差，同时由于其仅包含发酵固体和海藻糖，而不存在PVA和滑石的膜或颗粒的分散性差，因此在单独的海藻糖基质中稳定绿僵菌将对固体制剂带来挑战。薄膜中含水量的变化表明，对于酿酒酵母和枯草芽孢杆菌，可以选择正确的制剂赋形剂，以在各种水分条件稳定含有微核菌的绿僵菌发酵固体。
表10.干燥前含有绿僵菌发酵固体的薄膜涂层混合物的组成
表11.干燥后含绿僵菌发酵固体的薄膜组成
表12.通过在24℃和51％ RH孵育7天，含有绿僵菌发酵固体的薄膜的含水量含量和生活力
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实例7.回收和浓缩条件对绿僵菌发酵固体的稳定性的影响
在存在和不存在制剂赋形剂PVA、滑石、沸石、海藻糖和山梨糖醇的情况下，测试发酵固体中绿僵菌菌株ATCC 90448的生活力和稳定性。根据按照美国专利公开号2009/0074809对绿僵菌进行发酵，得到固体含量约为7％的发酵液。显微镜检查显示发酵液含菌丝体、芽孢/孢子和微菌核。
将发酵液以每份液体培养基约1份水(按重量计)稀释，过筛以除去大颗粒(大于1mm)，并经由离心浓缩然后弃去上清液。离心后细胞浆的发酵固体总含量约为10％；其被称为“未洗涤细胞浆”。然后将未洗涤的细胞浆以大约每份细胞浆5份水(按重量计)重悬于水中，通过离心浓缩并再次弃去上清液。其被称为“已洗涤细胞浆”并且发酵固体含量为约7％。然后将已洗涤的细胞浆在称量皿上铺展成薄层，并在环境条件干燥约两天。干燥物质的发酵固体含量为约35％。在每个离心并弃去上清液的步骤之后，从微生物固体的角度来看，发酵固体变得更加浓缩。
将4份绿僵菌发酵固体的浓缩配制品与制剂赋形剂PVA、滑石、海藻糖和水按表13中所列的质量百分比混合，并将混合物手动均质以完全悬浮所有不溶性成分。为了促进均匀混合，在制备混悬液之前，将固体PVA以20wt％的固体浓度溶解于水中。每份样品均含有比率约为3.33:1的海藻糖:绿僵菌发酵固体。使用微量移液器将混悬液以1-1.5mL等分试样沉积在固体表面上，以产生厚度约为200μm的薄膜。然后将这些薄膜在层流罩中在室温干燥过夜使含水量在0％与10％之间，从而将发酵固体包埋在包含赋形剂和残留水的基质中。膜的含水量与先前实验中描述的相似，其中未配制的膜含有约1％或更少的水，而使用PVA-滑石-海藻糖基质制剂的膜含有约4％-5％的水。薄膜的水活度性质与实例2、3和4中所述的相似。沉积后约1小时，薄膜的水活度高于0.80。干燥过夜后，薄膜的水活度在0.45-0.60范围内，接近干燥工艺中的环境相对湿度。干燥后薄膜的最终组成列于表14。
如实例5所述，将这些薄膜在24℃和51％ RH储存0、3、7、14和21天，并在每个孵育期结束时测量生活力。如实例2、3和4所述，孵育后，薄膜的水活度在0.5-0.55范围内，表明膜的水活度与培养箱中的相对湿度平衡，同时含水量保持恒定。MS的生活力表示为悬浮混合物中每毫克绿僵菌发酵固体的CFU。表15总结了24℃和51％ RH孵育0、3、7、14和21天后每种制剂的生活力。没有添加制剂赋形剂的所有样品孵育7天后均显示无生活力，而含制剂赋形剂的所有样品通过21天时间点均显示极微或甚至没有生活力损失，这证明即使在各种不同工艺方法处理后，PVA-滑石-海藻糖基质也可成功稳定绿僵菌发酵固体中的微菌核。在所测试的不同工艺方法中，未配制的干燥发酵固体具有最低的稳定性，孵育3天后显示没有生活力。这表明，在配制前对绿僵菌发酵固体浓缩物进行更少的处理，特别是在再水化之前进行更少的干燥，可实现更优配制结果。
表13.干燥前含有绿僵菌发酵固体的薄膜涂层混合物的组成
表14.干燥后含绿僵菌发酵固体的薄膜组成
表15.通过在24℃和51％ RH孵育7天，含有绿僵菌发酵固体的薄膜的生活力
实例8.稳定颗粒中绿僵菌发酵固体
使用制剂赋形剂PVA、滑石和海藻糖制备含有绿僵菌菌株ATCC 90448发酵固体的颗粒。实例6中所述的浓缩发酵液(具有约12％的、约3.0×105MS/mL的微菌核)用于制备大胶囊。配制前，将浓缩的发酵液穿过800μm筛。显微镜检查显示发酵液含菌丝体、芽孢/孢子和微菌核。
使用Vector VFC-LAB1喷涂机生产含绿僵菌发酵固体的颗粒。通过向喷涂机中装入930g粒径约为200-250μm的盐核来制备颗粒。随后将盐核用含有绿僵菌发酵固体和赋形剂活性层，然后用硫酸钠密封层涂覆。产生的颗粒的最终重量为1680g。表16详细列出了用于生产含绿僵菌发酵固体的颗粒的喷雾条件。所得颗粒含有约47％的硫酸钠核心、8％的绿僵菌发酵固体、12％的滑石、8％的海藻糖、4％的PVA和21％的硫酸钠密封层。颗粒的最终含水量约为1％，如果假定所有水都包含在经蒸发混悬液中(不包括核和密封层)，则单独该层的含水量约为4％，与先前实例中的含有PVA、滑石、海藻糖和微生物的薄膜相当。
表16.用于生产含绿僵菌发酵固体的流化床涂覆粒子的喷雾条件
如实例5所述，将含绿僵菌发酵固体的颗粒在24℃和51％ RH储存0、3、7和14天，并在每个孵育期结束时测量生活力。同时还取出用于涂覆经蒸发混悬液层的PVA-滑石-海藻糖-绿僵菌发酵固体喷雾混合物等分试样，并在与未配制绿僵菌发酵固体等份试样相同的条件下孵育。孵育后每份等分试样的生活力表示为颗粒或喷雾混合物中每毫克绿僵菌发酵固体的CFU。表17总结了24℃和51％ RH孵育0、3、7和14天后每种制剂的生活力。与先前的实例一样，PVA-滑石-海藻糖赋形剂基质明确显示出稳定作用，未配制的发酵固体在7天后显示生活力丧失，而配制的发酵固体在至少14天后显示生活力。包埋在颗粒中的绿僵菌发酵固体显示出与单独包含在PVA-滑石-海藻糖喷雾混合物中的那些相似的稳定性。因此，尽管在流化床中于升高的温度混合、喷雾并保持，但颗粒中的稳定性与单独使用赋形剂所达到的稳定性近似相等。因此，也可以以更实用、且更易于处理的颗粒形式实现先前实例的模型薄膜系统中各种微生物所表现出的稳定性。
表17.通过在24℃和51％ RH孵育14天，含有绿僵菌发酵固体的颗粒的生活力
实例9.稳定颗粒中葡萄糖杆菌发酵固体
使用制剂赋形剂PVA、滑石和海藻糖，在Glatt ProCell LabSystem 5(GlattGmbH，Binzen，德国)喷雾制粒设备上经由连续喷雾制粒，生产含葡萄糖杆菌发酵固体的基质颗粒。与实例8中描述并在图1中以组合物类型2说明的具有复合结构的涂覆的颗粒相反，葡萄糖杆菌基质颗粒代表单一结构，在图1中以组合物类型1说明。
在15L SIP/CIP发酵罐中生产葡萄糖杆菌的发酵液。发酵培养基由酵母提取物的水性混悬液(5-10g/kg)、豆粕(5-10g/kg)、七水硫酸镁(1-3g/kg)、磷酸氢二钾(0.5-2g/kg)、硫酸铵(0.5-1.5g/kg)、与来自Teknova的改良痕量金属溶液相似的痕量元素溶液(2mL/kg)以及消泡剂(1g/kg)组成。灭菌后，添加二水合氯化钙(2-4g/L)和葡萄糖(50g/L)。使用氨水将pH值保持在5.5，并将温度维持在30℃。从30小时开始进料由60％w/w葡萄糖溶液组成的物料，并以0.95g/min的进料速度持续直至运行结束(72小时)。
随后在配备有六个2,000ml旋转容器的Sorvall RC 12BP离心机中离心浓缩发酵液。将总共装有8,000g发酵液的离心容器在10℃的操作温度以4,000x G的转速离心25分钟。倾析出6,400g上清液，并将沉淀物与剩余的上清液重悬，产生与发酵结束时的发酵液相比5倍浓度的发酵固体的混悬液。这产生浓缩的发酵液，其中发酵固体含量为约15.5％并且生活力为2.8×108CFU/mL，这被用于制备颗粒。
使用Glatt ProCell LabSystem 5喷雾制粒设备生产含有葡萄糖杆菌发酵固体的颗粒。通过首先向ProCell设备装入450g尺寸大约在400-600μm之间的惰性颗粒来生产颗粒。惰性颗粒由PVA、滑石、海藻糖和裂解的发酵固体组成。将惰性颗粒置的床被流化，并向该流化床中喷雾由PVA、滑石、海藻糖和葡萄糖杆菌组成的活性喷雾混合物，同时将来自流化床中的颗粒经由再循环通过含有锯齿形筛子的通道从系统中同时去除。喷雾5小时后产生的活性颗粒的最终重量为1200g。随着活性混合物的连续喷雾和床中颗粒的连续移出，惰性颗粒床逐渐被含有葡萄糖杆菌发酵固体的活性颗粒床代替。在连续制粒工艺中不同时间采集颗粒的生活力比较表明，床层已充分再循环以在约90分钟后达到稳态生活力，在这段时间后从床中取出的颗粒显示与运行结束时取出颗粒的相等的生活力。表18详细列出了用于生产含葡萄糖杆菌发酵固体的颗粒的喷雾条件。所得颗粒含约6％w/w的葡萄糖杆菌发酵固体、52％w/w的滑石、12％w/w的海藻糖和26％w/w的PVA，含水量为4％w/w。制粒后立即测量的颗粒水活度为约0.4，并在45％相对湿度储存7天后逐渐增加至约0.45。
表18.用于生产含葡萄糖杆菌发酵固体的喷雾制粒颗粒的喷雾条件
如实例1所述，将含葡萄糖杆菌发酵固体的颗粒在22℃和45％ RH储存0、7、33和104天，并在每个孵育期结束时测量样品的各等份试样的生活力。表19总结了在22℃和45％RH孵育0、7、33和104天后颗粒的生活力。在该温度下储存104天后，浓缩物、颗粒和喷雾混合物均未显示生活力损失。此外，所储存颗粒的含水量与初始值4％w/w相比没有明显变化。因此，尽管在流化床中于升高的温度混合、喷雾并保持，但颗粒中的稳定性与微生物的液体制剂的稳定性近似相等。此外，0天后，每单位发酵固体中颗粒中微生物的生活力与配制的和未配制的液体中的大致相当，这表明微生物在喷雾制粒工艺中没有丢失生活力。因此，也可以用更实用、且更易于处理的易于在水中分散的颗粒形式实现先前实例的模型薄膜系统中各种微生物所表现出的稳定性。
表19.通过在22℃和45％ RH孵育104天，含有葡萄糖杆菌发酵固体的颗粒的生活力
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Claims (28)

1.一种微生物组合物，其包含包埋在基质中形成经蒸发混悬液的发酵固体，其特征在于所述微生物组合物具有：按重量计至少1:1的比率的非吸湿性基质和发酵固体；其中所述基质包含按重量计1:5与5:1之间比率的水分调节粘合剂和防粘剂，以及任选地不超过按重量计75％的保护性稳定剂；其中当在50％的相对湿度和20℃的温度储存时，所述经蒸发混悬液具有按重量计至少1％的含水量和至多30％的水。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述粘合剂、防粘剂和任选的保护性稳定剂各自在50％和任选75％相对湿度具有小于10％的水吸收。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述基质和发酵固体的比率为按重量计至少6:1、至少10:1、至少20:1、至少50:1、甚至至少100:1或更高。
4.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其在20℃的水活度为至少0.35。
5.如前述权利要求中任一项所述的组合物，当在50％的相对湿度和20℃的温度储存时，其还具有按重量计大于1％、大于3％、甚至大于5％和高达30％的水。
6.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其基本上不含所述保护性稳定剂。
7.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其包含所述保护性稳定剂。
8.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述发酵固体分布在所述基质中。
9.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述粘合剂是聚乙烯醇。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述防粘剂是滑石。
11.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述保护性稳定剂是海藻糖或山梨糖醇。
12.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述发酵固体包含细菌和/或真菌的微生物结构。
13.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述发酵固体包含病原真菌的微生物结构。
14.一种粒子或颗粒，其包含如前述权利要求中任一项所述的组合物。
15.如权利要求14所述的粒子或颗粒，其具有单一结构。
16.如权利要求14所述的粒子或颗粒，其具有复合结构。
17.一种包含如前述权利要求中任一项所述的组合物的种子处理、叶面处理、犁沟处理、动物饲料补充剂、人益生菌或个人护理产品。
18.一种用于制备包含包埋在基质中形成经蒸发混悬液的发酵固体的组合物的方法，所述方法包括：
(a)将发酵固体与非吸湿性基质以按重量计1:1或更高的比率组合，以形成包含具有按重量计至少50％的含水量的发酵固体的混悬液；以及
(b)在0℃与50℃之间的温度将包含发酵固体的混悬液部分地干燥，直到在环境条件下所得的经蒸发混悬液的水活度不低于0.35。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述基质包含按重量计1:5与5:1之间比率的水分调节粘合剂和防粘剂以及在所述基质中的不超过75％的保护性稳定剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述保护性稳定剂、粘合剂和防粘剂在50％的相对湿度各自具有低于10％的水吸收。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述保护性稳定剂、粘合剂和防粘剂在75％的相对湿度各自具有低于10％的水吸收。
22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中所述经蒸发混悬液具有按重量计大于1％、大于3％、甚至大于5％和高达30％的水。
23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述发酵固体分布在所述基质中。
24.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中使所述发酵固体与所述基质接触，而无需中间干燥步骤。
25.如权利要求18-24中任一项所述的方法，其进一步包括制备包含所述经蒸发混悬液的颗粒的步骤。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒具有单一结构。
27.如权利要求25所述的方法，其中所述颗粒具有复合结构。
28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中所述经蒸发混悬液是如权利要求1-13中任一项所述的经蒸发混悬液。
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