BR102012011033B1 - Micropartícula de saccharomyces boulardii, processo de preparo e usos das mesmas - Google Patents

Abstract

micropartícula de levedura e seu uso esta invenção se destina à indústria farmacêutica, alimentícia e bebidas, bem como na indústria de insumos para medicamentos, alimentos e bebidas, e refere-se a micropartículas compreendendo a levedura saccharomyces boulardii, as quais são obtidas pela técnica de spray drying, e seu uso. a levedura é encapsulada em um material encapsulante gastrorresistente, de modo que a administração oral do probiótico ocorre sem que haja perdas da eficácia pela passagem no trato gastrointestinal.

Description

Campo da invenção:

[001] A presente invenção se insere na área de medicamentos, alimentos e bebidas, bem como na indústria de insumos para medicamentos, alimentos e bebidas, e refere-se a micropartículas que compreendem a levedura Saccharomyces boulardii, as quais são obtidas pela técnica de spray drying, e seu uso.

[002] A levedura é encapsulada em um material gastrorresistente, de modo que a administração oral do probiótico ocorre sem que haja perdas da eficácia pela passagem no trato gastrointestinal.

Fundamentos da técnica:

[003] A Saccharomyces boulardii é uma levedura tropical não-patogênica, a qual foi primeiramente isolada da fruta silvestre lichia, na Indochina, nos anos 50.

[004] Desde então, após ter demonstrado capacidade de manter e restaurar a flora intestinal nos intestinos delgado e grosso, a levedura S. boulardii tem sido adicionada à dieta alimentar com finalidade terapêutica.

[005] Testes clínicos demonstraram o uso da levedura no tratamento de diarreias, tais como a diarreia associada à antibioticoterapia, diarreia aguda em crianças e adultos, diarreia do viajante, diarreia associada à alimentação enteral contínua, diarreia causada por rotavírus e diarreia associada à AIDS.

[006] A S. boulardiié capaz de produzir efeitos protetores contra patógenos entéricos, tais como a Vibrio cholerae e a Escherichia coli, estimulando as defesas imunes do hospedeiro e inibindo a resposta inflamatória induzida por enterotoxinas.

[007] Além disso, o micro-organismo é clinicamente efetivo na prevenção e no tratamento da enterite infecciosa e enterocolopatias associadas ao Clostridium difficile e estudos sugerem que a levedura possa, também, exercer efeitos benéficos a outras patologias intestinais, como a doença de Crohn e a colite ulcerativa.

[008] Comercialmente, a S. boulardii apresenta-se na forma farmacêutica de cápsula, na qual é encontrada liofilizada.

[009] Além de ser utilizada como medicamento, a levedura S. boulardii apresenta grande potencial para ser utilizada como probiótico. Probióticos são alimentos que apresentam micro-organismos vivos, capazes de melhorar ativamente a saúde.

[010] No entanto, para que um micro-organismo administrado via oral alcance o cólon de modo viável, é necessário desenvolver meios que o protejam da destruição mediante a passagem pelo trato gastrointestinal, bem como meios de liberação no sítio-alvo.

[011] A levedura S. boulardiié comumente apresentada como um micro-organismo geneticamente resistente a antibióticos, à proteólise e à acidez estomacal. Contudo, conforme a literatura, exposições a pHs inferiores a 2 pelo período de uma hora é letal para cerca de 25% do micro-organismo. Ainda, testes laboratoriais apontaram morte de mais de 80% das leveduras não encapsuladas ao serem expostas a pH 1,1 por 2h.

[012] Desse modo, faz-se necessário criar estratégias que garantam uma proteção à levedura, evitando sua destruição na passagem pelo estômago e garantindo que uma quantidade suficiente de micro-organismos viáveis alcance o intestino, tornando possível, assim, uma administração em dosagens mais baixas.

[013] A técnica mais utilizada na proteção de probióticos é a microencapsulação. Várias metodologias são empregadas na obtenção de micropartículas, tais como: atomização por spray drying, spray cooling, coacervação, polimerização interfacial, suspensão, emulsão, extrusão, recobrimento em leito fluidizado, lipossomas, complexação por inclusão, entre outros.

[014] A seleção do método depende de diversos fatores, tais como: a aplicação da micropartícula, o tamanho da partícula desejada, o mecanismo de liberação da mesma e as propriedades físico-químicas do material encapsulado e do agente encapsulante.

[015] Quando comparada a outras técnicas de encapsulação, o spray drying se mostra o mais adequado, sendo o equipamento de fácil aquisição, a técnica de fácil transposição de escala e o custo de produção baixo. Ainda, ao contrário de outros métodos de microencapsulação, a técnica é rápida, com etapas reduzidas, e não necessita de etapa adicional de pulverização, promovendo a obtenção de micropartículas esféricas e com tamanho uniforme.

[016] Assim, a presente invenção descreve micropartículas contendo a levedura Saccharomyces boulardii encapsulada em um material gastrorresistente, as quais são obtidas pela técnica de spray drying, de modo que a administração oral do probiótico ocorre sem que haja perdas da eficácia pela passagem no trato gastrointestinal.

Estado da técnica:

[017] O documento de anterioridade GB 1064212 A relata a encapsulação de leveduras utilizando a técnica de spray drying, com o objetivo de obter leveduras secas para o preparo de pão. Diferentemente da presente invenção, este documento sugere o uso de leite como agente encapsulante e alguns sais ou alcoóis como estabilizadores.

[018] O documento de anterioridade GB 1459085 A descreve a obtenção de leveduras encapsuladas utilizando o processo de secagem em leito fluidizado, técnica diferente do ponto de vista físico e industrial, daquela utilizada na presente invenção.

[019] O documento de anterioridade JP 2002300861 se refere ao desenvolvimento de uma formulação para uso enteral com auxílio de sonda, a qual utiliza levedura seca, nutrientes e minerais, sem que haja microencapsulação.

[020] O documento de anterioridade US 2004087022 A1 trata de métodos para produzir formulações em pó de meio de cultura para crescimento de células, suplementos, tampões e outros. Os pós, embora obtidos por meio do leito fluidizado ou spray drying, não se relacionam à microencapsulação de leveduras, uma vez que as leveduras que fazem parte da formulação estão mortas, sendo apenas fonte nutriente.

[021] O artigo de revisão “Physicochemical differences in dehydrated Saccharomyces boulardii yeast as a function of the dehydration process” relata a secagem de leveduras e a análise das diversas medidas físico-químicas entre os processos de secagem.

[022] O artigo “Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms” discute as vantagens da microencapsulação de probióticos por meio de diversas técnicas.

[023] Nenhum dos documentos do estado da técnica propõe o uso da técnica de spray drying para a obtenção da levedura Saccharomyces boulardii encapsulada, com o objetivo de promover gastrorresistência à mesma.

Sumário da invenção:

[024] A presente invenção refere-se a micropartículas compreendendo a levedura Saccharomyces boulardii, as quais são obtidas pela técnica de spray drying, e seu uso.

Breve descrição das figuras:

[025] A Figura 1 é uma fotomicrografia das micropartículas visualizadas pela microscopia eletrônica de varredura em um aumento de 7000 vezes.

[026] A Figura 2 é uma fotomicrografia das micropartículas visualizadas pela microscopia óptica em um aumento de 4000 vezes.

Descrição detalhada da invenção:

[027] A presente invenção faz referência a micropartículas, as quais compreendem a levedura Saccharomyces boulardii encapsulada em um agente encapsulante gastrorresistente.

[028] Dentre os agentes encapsulantes gastrorresistentes utilizados na presente invenção, têm-se: ácido metacrílico e copolímeros de ácido metacrílico, acetoftalato de celulose (CAP), ftalato de hidroxipropil metilcelulose (FHPMC), hidroxipropilmetil celulose (HPMC), polivinilacetato ftalato, acetotrimeliato de celulose, quitosana, látex, pseudolátex, acetato succinato de celulose, acetato succinato de hidroxipropilmetil celulose, metil metacrilato, metil celulose, carboximetil celulose de sódio, poli(±)lactídeo, polilactídeo-co-glicolídeo, acetato succinato de hipromelose, ftalato de hipromelose, alginato de sódio e ácido esteárico. Todos estes materiais são polímeros gastrorresistentes e pH dependentes considerados seguros para uso oral.

[029] Agentes anti-adesivos reduzem a força adesiva entre as partículas, podendo ser também utilizados. Dentre eles, pode-se destacar: o dióxido de silício coloidal, estearato de magnésio, estearato de cálcio, ácido esteárico, talco, óleo vegetal hidrogenado, silicato de magnésio alumínio, celulose microcristalina, amido, sucrose, goma xantana e gelatina hidrolisada.

[030] Sendo assim, as micropartículas da presente invenção compreendem:- 10 a 80 % de levedura S. boulardii; - 10 a 80 % de agente encapsulante;- 1 a 50 % de agente anti-adesivo.

[031] Em uma modalidade específica dessa invenção,o micro-organismo foi encapsulado utilizando ácido metacrílico - copolímero etil acrilato na proporção de 1:1(comercialmente disponível como Eudragit L30 D55) comoagente encapsulante gastrorresistente e dióxido de silício coloidal como agente anti-adesivo, em que a proporção do dióxido de silício e a massa celular foi mantida em 1:1 (mistura A). A proporção entre o ácido metacrílico - copolímero etil acrilato foi mantida em 1:1 (mistura B) e a mistura A variaram de 1:2, 1:1 e 3:2.

[032] Opcionalmente, as micropartículas da presenteinvenção podem ainda compreender adjuvantes crioprotetores em uma concentração de 0,1 a 45%, os quais podem ser selecionados do grupo que consiste em dimetilsulfóxido; monoalcóois e seus derivados, como álcool polivinílico, metanol ou etanol; dióis e derivados, como etilenoglicol, propilenoglicol, trimetilenoglicol, dietilenoglicol,polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou óxidopolietilênico; trióis, como glicerol; poliálcoois, como manitol, sorbitol ou dulcitol; monossacarídeos, como glicose ou xilose; dissacarídeos, como sucrose, lactose, maltose ou trealose; trissacarídeos, como rafinose; polissacarídeos, como dextrana, manan, dextrina, ficol, goma arábica ou amido hidroxietílico; amidas; N-alquil amidas; imidas, como acetamida, metilacetamida, dimetil formamida,dimetilacetamida ou succinimida; compostos heterocíclicos, como metilpirrolidona ou polivinil pirrolidona; aminoácidos e ácidos carbônicos, como prolina, glicina, ácido glutâmico, ácido aminobutírico, ácido glutárico, acetato de amônio ou EDTA; proteínas; peptídeos; polipeptídeos e glicoproteínas, como albuminas, gelatina, peptona, soro sanguíneo, extrato de concha, glicoproteínas, mucina, valinomicina ou gradimicina e substratos complexos, como extrato de levedura, extrato de malte, mel, leite desnatado ou leite.

[033] Ainda, as micropartículas podem também compreender agentes surfactantes em uma concentração de 0,1 a 45%, os quais podem ser selecionados do grupo que compreende polissorbatos, polissorbatos (poli)etoxilados, ésteres de polietilenoglicol, poliglucosídios, alcoxilatos, docusato de sódio, lauril sulfato de sódio, cetrimida, cloreto de cetilpiridínio, ácido láurico, gliceril monooleato, alquil éteres de polioxietileno, derivados polioxietilênicos de óleo de castor, sorbitano, trietil citrato e ésteres de trietil citrato.

Obtenção da cultura de levedura:

[034] A levedura Saccharomyces boulardii (Fundação André Toselo CCT 4308) foi submetida ao crescimento utilizando um meio de cultura composto por 10 g/L de glicose, 2 g/L de peptona de carne, 2 g/L de extrato de levedura, 0,6 g/L de KH2PO4, 0,36 g/L de ureia, 0,12 g/L de sulfato de amônia e 0,24 g/L de sulfato de magnésio, ajustado em pH 7,0 e esterilizado em autoclave por 20 minutos a 121° C.

[035] Em frascos apropriados, foram inoculadas 2.107 cél/mL em 25 mL de meio de cultura. A incubação foi realizada a 30°C, sob agitação de 200 rpm em shaker por 20 h.

Microencapsulação das partículas:

[036] As micropartículas contendo S. boulardii sãoobtidas através da técnica de spray drying.

[037] As condições iniciais do processo de spraydrying foram definidas conforme descrito na Tabela 1 abaixo:Tabela 1: Parâmetros utilizados.

[038] Em uma modalidade preferencial destainvenção, os parâmetros foram definidos conforme descrito naTabela 2:Tabela 2: Parâmetros preferencialmente utilizados.

[039] Para os experimentos, as formulações foram preparadas de modo a conter uma faixa de 0,1 a 60% de teor de sólidos em água, preferencialmente 10% de teor de sólidos.

[040] Como adjuvantes, utilizou-se ácido metacrílico - copolímero etil acrilato (na proporção de 1:1) e dióxido de silício coloidal. A proporção entre o dióxido de silício e a massa celular foi mantida em 1:1 (mistura A). A proporção entre o ácido metacrílico - copolímero etil acrilato foi mantida em 1:1 (mistura B) e a mistura A variaram conforme descrito na Tabela 3 abaixo.Tabela 3: Proporção entre a mistura B (ácido metacrílico e copolímero etil acrilato 1:1) e a mistura A (dióxido de silício e a massa celular 1:1) e a temperatura de secagem utilizada.

[041] As formulações foram preparadas de modo aconter de 0,1 a 60% de teor de sólidos em água,preferencialmente 10% de teor de sólidos.

[042] Após o processo de spray drying das formulações, foram obtidos pós finos brancos a levemente amarelados.

[043] A concentração de células no pó final foi de:- 5,60.108 células para formulações F1A, F1B e F1C;- 3,73.108 células para formulações F2A, F2B e F2C; e- 4,48.108 células para formulações F3A, F3B e F3C.

[044] Os valores acima citados correspondem àquantidade de células para cada 1 grama de pó das formulações.

Caracterização das micropartículas obtidas: - Teor de Umidade:

[045] O teor de umidade é um indicador de qualidadepara materiais secos. São aceitos apenas teores em torno de 5%, uma vez que possibilita a preservação do micro-organismo durante o armazenamento e evita a contaminação.

[046] O teor de umidade das micropartículas foideterminado gravimetricamente por meio de uma balança analisadora de umidade com lâmpada de halogênio e está descrito na tabela 4 abaixo.Tabela 4: Teor de umidade das micropartículas

- Morfologia das micropartículas:

[047] Para a avaliação morfológica das partículas, as mesmas foram submetidas à diluição em água, para determinação de sua morfologia por microscopia ótica (MO), e metalização em ouro para determinação de sua morfologia pela técnica de microscopia eletrônica de varredura (MEV).

[048] Para a obtenção de imagens, o microscópio eletrônico de varredura foi utilizado em aumento de 7000 vezes e o microscópio ótico foi utilizado em aumento de 4000 vezes.

[049] Todas as micropartículas (formulações F1A, F1B, F1C, F2A, F2B, F3B, F3A, F3B, F3C) foram analisadas.

[050] As Figuras 1 e 2 correspondem, respectivamente, às fotomicrografias das micropartículas contendo S. boulardii da amostra F1A, as quais foram obtidas por meio de um microscópio eletrônico de varredura e um microscópio ótico.

[051] Conforme é possível observar, as partículasobtidas apresentaram formato esférico.

- Avaliação do tamanho da partícula:

[052] Para a avaliação do tamanho dasmicropartículas, foi utilizada a técnica de tamisação.

[053] Para tal fim, foram sobrepostos tamises comabertura de malha decrescente de cima para baixo. Após agitação, as partículas se distribuíram pelos vários tamises em função da sua tenuidade e o tamanho das mesmas foi determinado.

[054] As partículas obtidas apresentaram tamanhoque variou entre 16 e 250 μm, com um tamanho de partícula médio de 53,9 μm.

[055] No entanto, partículas com diferentestamanhos podem ser obtidas a partir da escolha de diferentes condições operacionais do equipamento de spray drying.

- Viabilidade das partículas:

[056] As micropartículas obtidas foram submetidas aensaio frente à mudança de pH.

[057] Para verificar a viabilidade da levedura empH similar aquele do trato gastrointestinal, as micropartículas foram dispostas em uma solução tampão HCl 0,1N (pH 1,1) (correspondente a 2g/L), por 2 horas a 37°C, sob agitação.

[058] Após esse período, as micropartículas foramfiltradas e amostras contendo 2.106 cél/mL foram transferidas para meio de cultura em pH 8,0 e incubadas por 20 horas a 30°C sob agitação de 200 rpm em shaker.

[059] A contagem das células de cada experimento foi comparada ao controle positivo (levedura não encapsulada, incubada, sem passar pelo HCl) e ao controle negativo (levedura não encapsulada que passou por HCl antes da incubação). Os resultados obtidos estão dispostos na tabela 5 abaixo:Tabela 5: Viabilidade e rendimento das partículas.

[060] De acordo com os resultados obtidos, observou-se que a levedura não encapsulada, submetida a pH 1,1 por 2 horas, apresentou viabilidade de apenas 12,83% após incubação no meio de cultura com pH 8,0.

[061] Já as micropartículas obtidas pelo processo de spray drying, após o mesmo ensaio, demonstraram viabilidade entre 6,13 e 92,40%.

[062] Esses resultados são muito superiores aos obtidos pela levedura não encapsulada e demonstram a efetividade do método escolhido na proteção do microorganismo durante a passagem estomacal, garantindo que uma quantidade maior de leveduras viáveis chegue ao sítio de ação no trato gastrointestinal.

[063] Desta forma, a presente invenção propõe a obtenção de micropartículas compreendendo S. boulardii, obtidas pela técnica de spray drying, as quais são altamente vantajosas para a administração oral deste probiótico sem que haja perdas da eficácia do produto pela passagem no trato gastrointestinal.

[064] Embora a versão preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, deve ser compreendido que a invenção não é limitada. Diversas modificações, mudanças, variações, substituições e equivalentes poderão ocorrer, sem desviar do escopo da presente invenção.

Claims (8)

1) Micropartícula de levedura caracterizadapor compreender:- 10 a 80 % de levedura Saccharomyces boulardii;- 10 a 80 % de agente encapsulante ácido metacrílico ecopolímeros de ácido metacrílico em mistura;- 1 a 50 % de agente anti-adesivo dióxido de silício.

2) Micropartícula de levedura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que o agente encapsulante é o ácido metacrílico - copolímero etil acrilato na proporção de 1:1.

3) Micropartícula de levedura, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que a proporção do dióxido de silício e a massa celular é mantida em 1:1.

4) Micropartícula de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadapelo fato de que é produzida utilizando a técnica de spray drying.

5) Micropartícula de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizadapelo fato de que a partícula apresenta, um tamanho médio de 16 a 250 μm.

6) Micropartícula de levedura, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizadapelo fato de ser utilizada como probiótico.

7) Uso da micropartícula de levedura conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadapor ser no preparo de medicamentos e insumos dos mesmos.

8) Uso da micropartícula de levedura conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizadaporser aplicada em alimentos, bebidas e insumos dos mesmos.

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