CN115462369B

CN115462369B - 一种玻璃化冷冻外泌体保存方法

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Publication number: CN115462369B
Application number: CN202211196626.5A
Authority: CN
Inventors: 张贤祚; 王加兴; 杨宁; 朱万博; 葛无非; 朱晨; 方诗元
Original assignee: Anhui Provincial Hospital First Affiliated Hospital Of Ustc
Current assignee: Anhui Provincial Hospital First Affiliated Hospital Of Ustc
Priority date: 2022-09-29
Filing date: 2022-09-29
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-09-29
Also published as: CN115462369A

Abstract

本发明涉及一种玻璃化冷冻外泌体的保存方法。申请人首次发现N‑甲基吡咯烷酮可以作为外泌体的冷冻保护剂，在玻璃化冷冻，复温过程中，减少外泌体所受到的水结晶的破坏，并一步公开了一种优化配方的外泌体冷冻保护剂，由外泌体专用无血清培养基中加入等比例丙二醇，二甲基亚砜和N‑甲基吡咯烷酮各20％组成。可以在外泌体玻璃化冷冻，复温过程中保护外泌体减少溶剂结晶的损伤，保护外泌体的形态和功能完整，保护时间可以长达120天。

Description

一种玻璃化冷冻外泌体保存方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玻璃化冷冻外泌体保存方法。

背景技术

骨是体内一个代谢十分活跃的器官，在整个生命周期中通过成骨细胞(Osteoblast，OB)与破骨细胞(Osteoclast，OC)相互作用不断地进行着吸收与重建。骨的重建对于调节和维持骨骼完整性相当重要，两者协调失衡就会出现病理性骨质缺损或异常的新骨再生。

破骨细胞是一种来源于骨髓单核巨噬细胞系的高度分化的终末细胞，也是唯一一种具有骨吸收功能的细胞，在生理性骨重建和病理性骨吸收中具有重要作用。破骨细胞增多或活性增强，就会导致骨吸收增加，骨重塑失衡，从而引发很多骨骼系统疾病，如：骨质疏松、类风湿关节炎、转移性骨肿瘤等。

破骨细胞(OC)是一种没有突起的多核大细胞，直径为30-100μm，有数十个甚至多达上百个细胞核，其胞核多呈圆形，核膜平整，染色质颗粒分布均匀，着色较浅，内有1-2个核仁。幼稚OC的胞浆呈嗜碱性，成熟后的OC其胞浆呈嗜酸性，并随着细胞的老化胞浆的嗜酸性不断增强。通常胞浆内有丰富的线粒体以及大量的溶酶体与游离的核糖体。

OPG(骨保护素)/RANK(核因子κB受体活化因子)/RANKL(核因子κB受体活化因子配体)系统是在细胞外调节OC分化、成熟和凋亡的一个重要信号调节系统。OPG/RANK/RANKL系统不仅参与生理性骨重建，同样与病理状态下的骨质吸收也有着密切的关系。RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合是破骨前体细胞成熟并进一步向功能性的破骨细胞分化以及发挥骨吸收活性的必须条件。

核因子-кB受体活化因子(RANK,receptor activator of nuclear factor.кB)为I型跨膜蛋白，属于TNF家族成员，RANK高度表达于许多细胞表面，如破骨前体细胞、成熟破骨细胞、哺乳动物腺体上皮细胞、树突状细胞及某些癌细胞之中，如：乳腺癌和前列腺癌，此两种癌症都有很高的骨转移风险。虽然直到现在还没有发现人类存在RANK突变和失活的现象，但RANK自发突变的转基因小鼠与靶向敲除RANK的小鼠表型特征完全相同，证明RANK对破骨细胞形成的重要性。

核因子-кB受体活化因子配体(RANKL，receptor activator of nuclear factor-кB ligand)属于II型同源三聚体跨膜蛋白，有膜结合型和分泌型两种。RANKL高表达于淋巴结、肺和胸腺中，但在骨髓及脾脏中低表达。RANKL的表达受到多种细胞因子以及激素的调节，如甲状旁腺素、1，25二羟维生素D3、前列腺素E2。

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL对于启动OC分化时的基因转录是必不可少的，二者有互补作用。M-CSF可以增加破骨前体细胞池，RANKL则结合到破骨前体细胞及成熟OC表面表达的RANK受体上，促进OC的分化、活化同时抑制其凋亡，许多因子主要通过间接上调OB和其他细胞中M-CSF和RANKL的表达进而促进骨吸收。有研究已经发现RANKL对风湿性关节炎患者的关节损伤有一定的作用。

在骨吸收的过程中，OB在骨吸收因子的刺激下分泌RANKL，RANKL与M-CSF结合到破骨前体细胞表面受体RANK和M-CSFR上，RANK胞内区的特异性位点首先与OC内的肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TNF Receptor Associated Factors，TRAFs)结合，TRAFs6与RANK的结合对于破骨前体细胞和OC有重要作用，敲除TRAFs6基因的小鼠表现出骨硬化症。

一些适配子与TRAFs一起结合到RANK的胞内区后，诱导核因子кB通路(Nuclearfactor-kappa B，NF-кB)或C—JUN末端激酶活化，NF-кB能增加c-Fos基因的表达，c-Fos与NFATcl结合后启动OC特异性基因的转录，从而使破骨前体细胞分化成成熟的OC,从而发挥骨吸收功能。

RANKL可能是唯一能够直接诱导破骨细胞分化的细胞因子，大多数骨代谢调节因子都是间接诱导破骨细胞分化，通过一定的信号传导途径诱导成骨/基质细胞表达RANKL，RANKL是直接联系成骨/基质细胞与前体破骨细胞相互作用的破骨分化因子。而诱发破骨的同时，OB还可以分泌OPG，以旁分泌的方式发挥破骨抑制作用。OPG与RANKL结合阻断OB到OC的信号传递，抑制了OC的分化和成熟，同时诱导OC凋亡。

实验证实，RANK基因敲除鼠由于OC减少，会出现严重的非致命性石骨症。所以，OPG可以抑制OC分化成熟。因此正常的骨重建和骨量的稳定依赖于OPG和RANKL之间的平衡。

破骨细胞前体细胞(Osteoclast precursor cell，OPC)来源于造血细胞，其分化的破骨细胞是由单核细胞祖细胞融合后形成的一种多核细胞。巨噬细胞和破骨细胞有很多共同特点，两者表达部分共同抗原，但其表面抗原或标志物如巨噬细胞表面蛋白(macrophage，Mac)-l,2以及粒细胞(granulocyte，Gr)-1却有明显的差异，表明这是两种不同类型的细胞。

已有研究证实巨噬细胞变成具有骨吸收能力的破骨细胞须有骨髓基质细胞/成骨细胞存在，因其作为辅助细胞，可以表达巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和RANKL这两个促进破骨细胞形成所必须的分子。M-CSF和RANKL与破骨细胞前体细胞(巨噬细胞)上的M-CSF受体和RANK分别结合，发出使巨噬细胞变为破骨细胞的信号，使其存活并增殖。研究表明，破骨细胞生成的信号传导必须发生在破骨细胞的前体细胞和基质细胞或成骨细胞相互接触的情况下，因为基质细胞或成骨细胞产生的RANKL和破骨细胞产生的RANK都位于细胞表面。表达髓系树突细胞早期标志物的细胞，也可分化成破骨细胞，可呈递抗原至T-淋巴细胞的比较成熟的树突细胞，有在体外形成破骨细胞的能力。早有实验证实，一个共同的干细胞可分化为巨噬细胞、破骨细胞和髓系树突细胞，树突细胞在M-CSF和RANKL刺激下亦可分化为破骨细胞。

小鼠单核巨噬细胞瘤RAW264.7细胞是用Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠发生肿瘤后，收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株，诱导后可获得成熟的破骨细胞。RAW264.7细胞贴壁生长紧密，多种培养基均适合其生长。RT-PCR结果表明，RAW264.7细胞能表达成熟破骨细胞表型标志基因如核因子кB受体活化因子(RANK)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)及骨吸收有关的功能基因如组织蛋白酶K(Cathepsin K，Cts-k)、整合素av(integrin av)等。

RAW264.7细胞培养3-2l天，上述基因的mRNA表达不随培养时间改变，而且RAW264.7细胞的瞬时转染报告基因也不影响其分化特性。曾有多种破骨前体细胞系(如HL-60细胞、FDCP、FLG29.1和C7细胞等)用于破骨细胞的研究，而目前公认的唯一成系的破骨细胞前体细胞是RAW264.7，因为不仅该细胞表达的破骨细胞表型标志基因与破骨细胞的基因表达谱极其相似，而且能形成骨吸收陷窝。

外泌体是细胞外囊泡的一种，直径为30-100nm，含有丰富的蛋白质、脂质、mRNAs和miRNAs等多种生物活性物质，可以长时间保持其生物学活性。外泌体作为细胞间通讯的一种媒介，可以将自身所含物质通过内分泌或旁分泌的方式转移到靶细胞中去，介导细胞间的信息交流与物质传递。当外泌体与靶细胞相识别时，其内容物会释放到靶细胞的胞浆中发挥其特性，间接干预靶细胞的表观遗传和蛋白质翻译过程，进而诱导靶细胞的分化和成熟。

外泌体不仅在正常生理过程中发挥着不可替代的作用，如免疫反应、细胞增殖、炎症反应、泌乳和神经功能。而且还在心血管、泌尿、神经及内分泌代谢等系统的病理过程中发挥着作用。

国际细胞外囊泡学会(ISEV)在2014年的提议，外泌体鉴定3个标准：透射电镜(transmission electron microscope，TEM)、粒径(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)、蛋白标志物。其中外泌体蛋白标志物主要检测指标为CD63、CD9、CD81、Tsg101、Alix、HSP70等，针对外泌体的定性检测，至少选择2-3个指标就能满足文章发表。

骨衍生的外泌体在骨细胞间通讯中发挥重要作用，是骨形成和体内平衡的新机制。外泌体介导的骨细胞之间的核酸或蛋白质等生物信息的转移可以通过不同细胞之间的屏障，并且在调节骨稳态的骨细胞之间的串扰中起重要作用。

成熟破骨细胞分泌的外泌体中含有的RANK与成骨细胞RANKL结合，并通过触发RANKL反向信号传导促进骨形成。

外泌体的双层脂膜的囊泡结构，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响,从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性还受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。因此，外泌体的完整保存是研究其在机体内生物学作用和功能的重要前提,也是制约基于外泌体的临床检测技术和治疗载体技术的关键。

外泌体的稳定性低、容易失活，为了维持外泌体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。外泌体生物活性的丧失多发生在贮存保藏阶段，一般制成液体制剂超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度保存稳定的主要挑战之一就是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。另外，超低温保存的时间过长在使用过程中反复冻融或者使用不当，外泌体的生物活性往往会迅速大幅下降，从而限制了它的正常使用。

外泌体被提取后一般悬浮于磷酸盐缓冲液中，其最常用的储存方法为冷冻保存,但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变,也可能导致多层囊泡的形成和聚集,反复冻融和长期冰冻可能导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。

目前的低温冻存外泌体并没有成功地满足科研、生物工程和临床的需要。研究发现，与新鲜分离的外泌体相比，长期低温冻存会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量，并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布。

现有的外泌体的冷冻可以通过两种不同的方法实现，即缓慢冷冻和玻璃化。

缓慢冷冻和玻璃化都涉及将细胞或组织的水环境凝固成非结晶玻璃相。然而，作为一种只需要几秒钟的超快速无冰冷却技术，玻璃化可以更好地控制冷却过程，并且已被证明比慢速冷冻方法产生更好的结果。

冷冻保存过程中的主要限制是在冷冻解冻过程中不可避免的水到冰相变。通常被称为冷冻损伤，与低温和渗透失衡相关的冰晶的形成，生长和重结晶通常导致细胞维持功能和形态学冰损伤。因此，为了克服冷冻损伤，冷冻保存通常添加冷冻保护剂。

冷冻保护剂的主要原理是通过增加细胞中的溶质浓度，影响冰成核的动力学并允许调节细胞外而不是细胞内冰生长。根据其穿透性和分子量，冷冻保护剂主要有两类，即穿透性和非穿透性冷冻保护剂。

根据定义，穿透性冷冻保护剂通过穿透外泌体脂质双层膜在细胞内起作用，其特征在于其低分子量(<100Da)。穿透性冷冻保护剂的主要作用是减少冷冻过程中的冰生长和细胞脱水。常用的穿透性冷冻保护剂包括甘油、DMSO，乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。

(i)甘油是一种穿透性冷冻保护剂，与水分子形成氢键，并使70％甘油和30％水的混合物难以形成冰晶，直到温度低至(-37.8℃)。与其他冷冻保护剂相比，甘油在高浓度下毒性较小，但由于其在可渗透膜上的缓慢移动而具有弱点。

(ii)二甲基亚砜(DMSO)是一种有机硫化合物，在18.5℃下冻结。这意味着，在室温下，DMSO会变成固体，这种物理特性使其最适合作为冷冻保护剂。

(iii)乙二醇与水混合时会改变氢键。纯化的乙二醇的凝固点约为-12℃，但40％的水和60％的乙二醇混合后，混合物的凝固点会下降，混合物变得无法形成结晶物质。这种情况导致凝固点降低到-45℃。乙二醇的这种性质使其成为最有效的冷冻保护剂。

相反，非穿透性冷冻保护剂通过与生物分子形成氢键在细胞外起作用，建立稳定的玻璃基质，覆盖生物分子的外部以实现冷冻保护作用。非穿透性冷冻保护剂通常是具有高分子量(180-594Da)的聚合物，例如聚乙烯二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和非还原性双糖(蔗糖，海藻糖等)，葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。

(i)蔗糖是一种天然存在的碳水化合物。-45℃下的蔗糖通过所需的营养支持保存的细胞，蔗糖与DMSO联合使用可保持良好的细胞保护特性。

(ii)海藻糖(也称为真菌糖或tremalose)是由两个葡萄糖分子组成的天然非还原性二糖。海藻糖的水溶性低于蔗糖，除非在高温(>80℃)下。由于其高保水能力，它可以用作冷冻保护剂。无水形式的海藻糖迅速回收水分以形成二水合物。与标准冷冻程序相比，海藻糖可以提高解冻后的细胞活力。双糖冷冻保护剂因其安全性而成为外泌体冷冻保存的最佳选择，也可用于多种蛋白质和细胞产物。使用海藻糖作为冷冻保护剂可防止生物颗粒中内部冰的形成，从而防止外泌体聚集并提高其胶体稳定性。

在目前表征的冷冻保护剂中，海藻糖是众所周知的不同种类细胞最安全和最好的冷冻保护剂。海藻糖解构了水的四面体氢键网络，显著减缓了水的动力学，并在物理上保护生物分子免受结晶，以便在温度降低时，在水的动力学中产生额外的，较慢的弛豫过程。

如果可以使用的冷冻保护剂的浓度没有限制，细胞将被完美地保存下来。然而，过高浓度的冷冻保护剂可能是有毒的。因此，为了实现最佳的冷冻保存并防止冷冻损伤，值得注意的是，冷冻保护剂的浓度应适当，不宜过高或过低。

穿透性和非穿透性冷冻保护剂的组合也被证明比单独冷冻保护剂具有更低的毒性和更有效。冷冻保护剂组合的一些很好的例子包括甲酰胺-DMSO，糖-DMSO，乙二醇-丙二醇等的混合物。

N-甲基吡咯烷酮是一种有机物，化学式为C₅H₉NO，为无色至淡黄色透明液体，稍有氨气味，与水以任何比例混溶，溶于乙醚，丙酮及酯、卤代烃、芳烃等各种有机溶剂，几乎与所有溶剂完全混合。

溶解性：易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、氯仿和苯，能溶解于大多数有机与无机化合物、极性气体、天然及合成高分子化合物。

本品为优良高级溶剂，具有良好的生物相容性。但是现有技术从未报道过本品可以作为外泌体或其他细胞相关产品冷冻保护剂的用途。

发明内容

发明人长期致力于骨伤的恢复研究。外泌体作新兴的骨伤恢复疗法，受到了越来越多的关注，自然也获得了发明人的关注，对其进行了深入的研究。

本申请首先公开了N-甲基吡咯烷酮作为外泌体冷冻保护剂成分的用途。

其次，本申请公开了一种外泌体冷冻保护剂，为由等体积乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮的外泌体专用无血清培养基组成。

所述外泌体冷冻保护剂中，乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮的加入比例均为20％。

所述外泌体冷冻保护剂尤其适用于破骨细胞外泌体的玻璃化冷冻保存。

最后，为了同时提高外泌体的高恢复性、活力、功能和可扩展性。发明人设计了一种改良优化的外泌体低温保存方法，包括如下步骤：

步骤1)冷冻保护剂(CPA)和复温液的配制

CPA的配制：加入乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮的无血清培养基；

复温液的配制：加入乙二醇、二甲基亚砜的磷酸盐缓冲液；

步骤2)玻璃化冻存的方法

冻存前，外泌体先在21℃的条件下在20％的CPA溶液中培养10分钟，再在4℃条件下在50％的CPA溶液中培育10分钟，继而在100％浓度的CPA溶液中培养10分钟。将外泌体混悬液转移到冷冻盘上，沉淀后吸走多余的CPA溶液，尽量避免囊泡的聚集。

步骤3)将冷冻盘迅速植入液氮低温冻存。

其特征在于，在冷冻保护剂中，乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮在外泌体专用无血清培养基中加入的体积比例为1:1:1。浓度均为20％。

所述冷冻保护剂的配制方法为在容量瓶中依次加入20ml乙二醇，20ml二甲基亚砜，20mlN-甲基吡咯烷酮，以外泌体专用无血清培养基定容至100ml，摇匀即得。

具体的，本申请所述的外泌体的玻璃化冷冻保存方法步骤如下：

步骤1)冷冻保护剂和复温液的配制

CPA的配制：加入20％乙二醇、20％二甲基亚砜和20％N-甲基吡咯烷酮的外泌体专用无血清培养基。

复温液的配制：加入11％乙二醇和11％二甲基亚砜的4％磷酸盐缓冲液

步骤2)玻璃化冻存的方法

冻存前，外泌体先在21℃的条件下在20％的CPA溶液中培养10分钟，再在4℃条件下，加入乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮，使得CPA浓度达到50％，培育10分钟，继而加入乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮，使得CPA浓度达到100％，培养10分钟。将外泌体混悬液转移到冷冻盘上，沉淀后吸走多余的CPA溶液，尽量避免囊泡的聚集。

步骤3)将冷冻盘迅速植入液氮并低温冻存。

本发明的有益效果是：

本申请首次公开N-甲基吡咯烷酮作为外泌体冷冻保护剂成分的用途。并公开了一种新型的外泌体的冷冻保护剂，为含有20％乙二醇、20％二甲基亚砜和20％N-甲基吡咯烷酮的外泌体专用无血清培养基。最后公开了一种应用前述冷冻保护剂的外泌体玻璃化冷冻保存方法。以此方法保存外泌体，在120天内复苏后，具有正常的体外和体内功能。

缩略语表：

OB：Osteoblast，成骨细胞

OC，Osteoclast，破骨细胞

OPG：骨保护素

RANK：receptor activator of nuclear factor.кB，核因子κB受体活化因子

RANKL：receptor activator of nuclear factor-кB ligand，核因子κB受体活化因子配体

M-CSF：巨噬细胞集落刺激因子

TRAFs：TNF Receptor Associated Factors，肿瘤坏死因子受体相关蛋白

c-Fos基因：即刻早期基因

NFATcl：活化T细胞核因子cl

OPC：Osteoclast precursor cell，破骨细胞前体细胞

Mac：macrophage，巨噬细胞表面蛋白

Gr：granulocyte，粒细胞

RT-PCR：实时-聚合酶链式反应

TRAP：抗酒石酸酸性磷酸酶

MMP-9：基质金属蛋白酶-9

Cts-k：Cathepsin K，组织蛋白酶K

integrin av：整合素av

mRNA：信使RNA

miRNAs：微小RNA

DMSO：二甲基亚砜

CPA：冷冻保护剂

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1冷冻保护剂的配制(单位：ml)

组分	乙二醇	二甲基亚砜	N-甲基吡咯烷酮	外泌体无血清培养基定容至
					配方1	/	/	/	100ml
配方2	20	20	/	100ml
					配方3	/	/	20	100ml
配方4	20	20	20	100ml
					配方5	20	20	10	100ml
配方6	20	20	30	100ml
					配方7	20	20	40	100ml
配方8	10	10	10	100ml
					配方9	10	10	20	100ml

。

制备方法：

在容量瓶中依次加入处方量乙二醇，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮，以外泌体专用无血清培养基定容至100ml，摇匀，0.22μm滤膜过滤，备用。

实施例2外泌体的制备和提取

Raw246.7细胞在500ml旋转瓶中培养，并接种1.5亿个细胞(5×10⁵个/ml)在DMEM培养基中加入m-csf和rankl诱导破骨分化，并在37℃，5％CO₂的加湿培养箱中培养3天。每72小时将细胞传代一次，并重悬于新鲜的DMEM培养基中。贴壁细胞培养诱导结束后，去除培养液，加入适量的PBS缓冲液冲洗-次,彻底去除FBS。按每10cm皿(约10⁷个细胞)10ml培养基，换外泌体专用无血清培养基(产品含有羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液，L-谷氨酰胺,白蛋白,次黄嘌呤,胸苷,酚红,葡萄糖，无动物源成分，无血清，无生长因子)培养至少48小时(细胞融合率至少70％以上)，48小时后收集细胞上清，并于3000g离心15min,去除细胞或细胞碎片获得外泌体悬液，并进行鉴定。

实施例3实施例1各配方冷冻保护剂对于外泌体的粒径的影响

以实施例1所得配方1-9冷冻保护剂开展冻存试验：

取实施例2所得外泌体悬液，冻存前，外泌体先在21℃的条件下在20％的CPA溶液(即以外泌体专用无血清培养基稀释的含有20％冷冻保护剂溶液)中培养10分钟，再在4℃条件下，按实施例1配方比例加入乙二醇，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮的混合溶液，使得CPA浓度为50％，培育10分钟，继而继续加入乙二醇，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮的混合溶液，使CPA浓度达到100％，培养10分钟。将外泌体混悬液转移到冷冻盘上，沉淀后吸走多余的CPA溶液，尽量避免囊泡的聚集。将冷冻盘迅速植入液氮并低温冻存。

分别在保存30天，60天，90天，120天，取样品进行复温，检测其粒径。复温方法如下：

复温液的配置：加入11％乙二醇和11％二甲基亚砜的4％磷酸盐缓冲液；

在4℃的复温液中孵育10分钟后，用两倍体积12％磷酸盐缓冲液溶液稀释，并再复苏10分钟。加入10％蔗糖溶液稀释后，再在21℃复苏5分钟，并最终转入DMEM培养基中。

以NTA法，检测复温外泌体悬液中外泌体浓度粒径(即检测单位体积中外泌体个数)，得到如下数据(均值)：

表1冷冻保存30-120天不同配方冷冻保护剂对于外泌体浓度粒径的影响(n＝3)

复温时间	冷冻前	30天	60天	90天	120天
						配方1	1.21×10¹⁰	10.2×10⁹	8.3×10⁹	6.5×10⁹	4.1×10⁹
配方2	1.17×10¹⁰	10.5×10⁹	9.6×10⁹	8.5×10⁹	6.1×10⁹
						配方3	1.35×10¹⁰	10.1×10⁹	9.0×10⁹	8.2×10⁹	6.0×10⁹
配方4	1.20×10¹⁰	11.8×10⁹	11.5×10⁹	10.9×10⁹	10.2×10⁹
						配方5	1.12×10¹⁰	10.6×10⁹	9.5×10⁹	9.0×10⁹	8.1×10⁹
配方6	1.22×10¹⁰	10.3×10⁹	9.4×10⁹	8.8×10⁹	7.6×10⁹
						配方7	1.37×10¹⁰	10.2×10⁹	9.3×10⁹	8.5×10⁹	7.4×10⁹
配方8	1.26×10¹⁰	10.6×10⁹	9.8×10⁹	8.7×10⁹	7.5×10⁹
						配方9	1.35×10¹⁰	10.3×10⁹	10.0×10⁹	8.8×10⁹	8.1×10⁹

。

如上表数据可以看出与不加入冷冻保护剂的配方1相比，加入了冷冻保护剂的外泌体专用无血清培养基对于冷冻复溶的外泌体浓度粒径均具有一定的保护作用。其中，配方4的保护作用最佳。配方2，配方3的保护作用相当，即加入20％N-甲基吡咯烷酮和各加入20％乙二醇和二甲基亚砜的无血清培养基的保护作用相当。配方5的保护作用略低于配方4，从配方角度考虑，是由于N-甲基吡咯烷酮浓度下降至10％的缘故。配方6,7,8保护作用相当，说明当培养基中乙二醇，二甲基亚砜，N-甲基吡咯烷酮的浓度为20％以后，再增加N-甲基吡咯烷酮，保护效果反而下降。并且和三者浓度均为10％的配方8保护作用相当。从另一个侧面说明，N-甲基吡咯烷酮对于外泌体的冷冻具有一定的保护作用，即当保护剂中乙二醇和二甲基亚砜的浓度降低至10％，但是加入了10％N-甲基吡咯烷酮，同样具有一定的保护效果，并且有优于配方2(乙二醇和二甲基亚砜的浓度为20％)。配方9中在乙二醇和二甲基亚砜的浓度均为10％，继续加大N-甲基吡咯烷酮的浓度至20％，对于外泌体的保护作用较配方8更优。

综上，说明N-甲基吡咯烷酮本身具有一定的外泌体冷冻保护作用，并且配方4为最优的保护剂配方，配方中乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮均为20％为最优比例。

实施例4实施例1各配方冷冻保护剂对于外泌体的特征性蛋白的影响(CD63和CD9)

按实施例1-3所述各配方冷冻保护剂，外泌体的提取，冷冻保存和复温的方法，在冷冻保存后30天，60天，90天，120天，取样品进行复温，即取部分实施例3的复温样品，以小鼠CD63分子(CD63)Elisa试剂盒，和小鼠外泌体CD9检测试剂盒分别检测其特征蛋白CD63和CD9，所得荧光强度数据(均值)如下：

表2冷冻保存30-120天不同配方冷冻保护剂对于外泌体特征蛋白CD63的影响(n＝3)

表3冷冻保存30-120天不同配方冷冻保护剂对于外泌体特征蛋白CD9的影响(n＝3)

从表2和表3荧光强度数据同样可以看出以配方4保护剂保护的外泌体悬液经过120天玻璃化冷冻，复溶后的其特征蛋白CD63和CD9的活性最强，证明其保护作用最优。

此外和实施例3的结论一致，配方2，配方3的保护作用相当。配方5的保护作用略低于配方4。配方6,7,8保护作用相当。配方9中在乙二醇和二甲基亚砜的浓度均为10％，继续加大N-甲基吡咯烷酮的浓度至20％，对于外泌体的保护作用较配方8更优。

以上发明内容和实施例描述了本发明专利申请的基本原理和主要特征及本发明专利申请优点，本领域的技术人员应该了解，本发明专利申请不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明专利申请的最优的技术方案，在不脱离本发明专利申请精神和范围的前提下，本发明专利申请还会有各种变化和改进，即以N-甲基吡咯烷酮作为外泌体冷冻保护剂单独或与其他添加剂联合应用，尤其是丙二醇和二甲基亚砜，都落入要求保护的本发明专利申请范围内，本发明专利申请要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种玻璃化冷冻外泌体的保存方法，其特征在于，所述方法中采用冷冻保护剂，冷冻保护剂由乙二醇、二甲基亚砜、N-甲基吡咯烷酮和外泌体专用无血清培养基组成，其中乙二醇、二甲基亚砜和N-甲基吡咯烷酮按体积比例加入，均为20%。

2.如权利要求1所述的保存方法，其特征在于，所述冷冻保护剂的制备方法如下：

在容量瓶中依次加入20ml乙二醇，20ml二甲基亚砜，20mlN-甲基吡咯烷酮，以外泌体专用无血清培养基定容至100ml，摇匀即得。

3.如权利要求1所述的玻璃化冷冻外泌体的保存方法，其特征在于，步骤如下：

步骤1）冷冻保护剂的配制

冷冻保护剂的配制：按体积比加入20%乙二醇、20%二甲基亚砜和20%N-甲基吡咯烷酮的外泌体专用无血清培养基；

步骤2）玻璃化冻存的方法

冻存前，外泌体先在21℃的条件下在20%浓度的所述冷冻保护剂溶液中培养10分钟，再在4℃条件下在50%浓度的所述冷冻保护剂溶液中培育10分钟，继而在100%浓度的所述冷冻保护剂溶液中培养10分钟，将外泌体混悬液转移到冷冻盘上，沉淀后吸走多余的冷冻保护剂溶液，尽量避免囊泡的聚集；

步骤3）将冷冻盘迅速植入液氮低温冻存。

4.如权利要求1-3任一项所述的保存方法，其特征在于，所述外泌体为破骨细胞的外泌体。