CN108018210B - 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂 - Google Patents

一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂 Download PDF

Info

Publication number
CN108018210B
CN108018210B CN201711481166.XA CN201711481166A CN108018210B CN 108018210 B CN108018210 B CN 108018210B CN 201711481166 A CN201711481166 A CN 201711481166A CN 108018210 B CN108018210 B CN 108018210B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protective agent
salmonella choleraesuis
vaccine
vaccine strain
percent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201711481166.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN108018210A (zh
Inventor
杨利国
梁爱心
于垚垚
刘文浩
牛凯峰
王力军
刘爽
王亚平
姜婷婷
乔同
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong Agricultural University filed Critical Huazhong Agricultural University
Priority to CN201711481166.XA priority Critical patent/CN108018210B/zh
Publication of CN108018210A publication Critical patent/CN108018210A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108018210B publication Critical patent/CN108018210B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于动物疫苗辅助制剂制备技术领域，涉及一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及专用保护剂。筛选得到一种在液氮条件下保藏猪霍乱沙门氏疫苗菌株的方法，其特征在于，在猪霍乱沙门氏疫苗菌的保藏期间向所述的猪霍乱沙门氏疫苗菌菌液中加入按质量比计的保护剂，该保护剂的组分按质量比计为蔗糖2.5％，葡聚糖7％，二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。所述的专用保护剂组成包括如下组分：按质量比计，蔗糖2.5％、葡聚糖7％、二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。该专用保护剂具有渗透性、半渗透性、非渗透性和抗氧化性的效果，在所筛选出的保护剂配方下不同浓度疫苗菌不同保存时间的存活率无显著差异，存活率均保持在70％以上。

Description

一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂
技术领域
本发明属于疫苗产品辅助制剂的制备技术领域，具体涉及一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌的保藏方法及其专用保护剂。
背景技术
本发明的前期工作是制备了一种名为C500/pGS/2SS疫苗菌(专利申请号：2008101979818，菌株保藏号：CCTCC NO:M208194)，该菌是一种缺失asd基因和crp基因的减毒沙门氏菌，其包含非抗性筛选乙肝表面抗原S基因与双拷贝生长抑素(SS)基因质粒，主要功能是促进动物生长，对于缩短育肥猪的出栏时间、提高饲料利用率以及降低生产成本具有重要意义。
本发明的前期研究表明C500/pGS/2SS疫苗株在小鼠、牛、猪等动物上取得了良好的免疫效果，同时具有良好的安全性(梁爱心2009；石昭意2015；张剑2010)。目前该疫苗现已进入农业转基因生物安全的生产性试验阶段，但如何长期高效稳定地保藏该疫苗菌株是当前兽医疫苗领域亟待解决的技术问题。
在本申请提出以前，申请人对疫苗菌C500/pGS/2SS的保藏方法进行了初步探讨，认为采用冷冻干燥保存法是比较适宜疫苗菌的保藏(李冲，2014)，但该方法保藏的疫苗菌菌株存活率比较低。而且利用冷冻干燥保藏法还存在诸如设备要求高、生产周期长和成本高等缺点，难以进行规模化生产。有关资料显示，-130℃是微生物变异终点，在该温度以下，微生物处于代谢停滞状态，可以长期保存微生物，液氮超低温冷冻保存菌种就是利用该原理。与冻干保存法相比，液氮超低温冷冻保存菌种过程中的损伤主要是冻融损伤，而冻干过程中除冻融损伤外，还存在干燥损伤，因此，采用液氮超低温冷冻保存法常常会取得更好的保藏效果。但目前关于液氮超低温冷冻保存沙门氏菌的研究还未见报道。
前人的研究表明，在液氮超低温冷冻的过程中需要注意保持适宜的降温速率，若降温速率太快，则细胞内水分来不及流出细胞，形成大量的细胞内冰晶，加大了对细胞膜和胞内功能蛋白的机械损伤(Gwo et al 2005)。而降温速率太慢又会导致细胞的过度脱水，胞内溶质浓度升高，增大溶质损伤(Fields et al 1997)。目前本领域针对不同的降温速率，常用的液氮超低温冷冻保藏方法主要为三种，一是一步冷冻法(即直接将疫苗菌投入液氮罐中保藏)；二是两步冷冻法(即，先将疫苗菌在-80℃冷冻，然后置于液氮罐中)；三是三步冷冻法(即，疫苗菌先在-20℃下冻藏，然后在-80℃保藏，最后转入液氮罐中保藏)，研究表明，两步冷冻法是较一步冷冻法和三步冷冻法更优化的保藏方法(Santiago-Vázquez etal 2007)。
保护剂按作用类型不同，可分为渗透性保护剂、半渗透性保护剂、非渗透性保护剂和抗氧化剂等。渗透性保护剂既可以透过细胞壁也可以透过细胞膜，防止细胞内大冰晶的形成以及细胞过度脱水所造成的溶质损伤；而半渗透性保护剂能通过细胞壁而不能通过细胞膜，可使细胞在冷冻前先部分脱水，保护剂在细胞壁和细胞膜之间浓缩，形成缓冲层，从而机械性的保护细胞；非渗透性保护剂既不能通过细胞壁也不能通过细胞膜，其保护作用主要体现在细胞外；而抗氧化剂主要作用是防止菌种储存过程中的氧化变质。由于不同类型保护剂的保护作用不同，因此一般不单独使用，通常是多种类型保护剂复配后才能对菌种起到最大程度的保护。
发明内容
本发明的任务在于克服现有猪霍乱沙门氏菌疫苗菌保藏方法和保护剂存在的的缺陷，研制一种适合猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株保藏方法及其专用保护剂，以达到长期保藏猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株，提高猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率，实现规模化生产的目的。在本发明中申请人以疫苗菌(例如沙门氏菌C500/pGS/2SS)的存活率为攻关指标，针对不同浓度下几种常见的渗透性、半渗透性、非渗透性保护剂(或称抗氧化剂)的保护效果进行了筛选，在四种保护剂的最适浓度周围设置三个水平，通过正交设计筛选出了最佳保护剂配方为：按配方的质量比计，蔗糖2.5％、葡聚糖7％、二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。利用所述的上述最佳保护剂对不同浓度下猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的存活率均在70％以上。
本发明的具体步骤如下所述：
(1)将不同浓度的保护剂与浓度为109CFU/ml猪霍乱沙门氏菌菌液等以体积混合，置于冻存管中，于-80℃下放置12h后迅速投入-196℃的液氮罐中，保存7天后将菌液取出，置于37℃水浴锅中30min，采用细菌平板计数法对菌种的存活率进行检测，筛选出保藏效果最好的保护剂和保存效果最佳时的保护剂浓度。
(2)采用步骤(1)的冷冻方法，在步骤(1)筛选出的四种保护剂最适浓度附近再设置3个浓度水平的保护剂试验，通过L934正交试验、极差分析和方差分析，筛选出了与该冷冻保藏法相匹配的专用保护剂。
(3)利用步骤(2)筛选出的专用保护剂，检测了不同浓度保藏的猪霍乱沙门氏菌菌株在-196℃液氮超低温冷冻保藏一周、四周后的保存率，评价保护剂的保护效果和储存稳定性。
本发明的有益成果如下：
(1)本发明获得了一种保存猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株液氮超低温冷冻保存法，与常用的冻干保存法相比，本发明对保藏设备要求更低、操作更简便，有利于基层单位推广应用。
(2)本发明获得了一种与液氮超低温冷冻保存法相适应的专用保护剂。与常用冻干保存法相比，本发明的保护剂对液氮超低温冷冻下保藏猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的存活率更高，储存稳定性更好。
附图说明
图1：不同保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较。附图标记说明：图1中的A图显示不同渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较；图1中的B图显示不同半渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较；图1中的C图显示不同非渗透性保护剂最佳保存浓度下疫苗菌存活率的比较。
图2：液氮超低温冷冻保存后pVGS/2SS-asd质粒双酶切电泳图。附图标记说明：泳道1：DNA Maker；泳道2-3：质粒pVGS/2SS-asd经EcoRI和HindIII双酶切。
图3：不同浓度猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株在氮冷冻保存4周后存活率的比较。
具体实施方式
实施例1：液氮超低温冷冻条件下疫苗菌保护剂的筛选
1.1菌液的发酵与浓缩
取酶切鉴定正确的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株的菌液(猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株为C500/pGS/2SS)按照体积比为1:100的比例接种于5ml，LB液体LB培养基中，置于37℃气浴恒温摇床200r/min振荡培养14h，随后将振荡培养的菌液按照体积比为1:100的比例接种于350ml，LB液体LB培养基中，于37℃，200r/min振荡培养15h，4000r/min离心10min，弃去上清液，用无菌磷酸盐缓冲液(简称PBS，即磷酸盐缓冲液，pH7.2，浓度0.01M：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H 2O)2.90g，磷酸二氢钾0.20g，氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，加水充分溶解后定容至1L，在121℃高温高压蒸汽下灭菌30min备用)溶解，调节菌液浓度至109CFU/ml。
1.2液氮超低温冷冻保存猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株C500/pGS/2SS保护剂的筛选
将调整后的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌疫苗菌株菌液与以下各保护剂按照1:1(体积比)的比例等体积混合分装于冻存管中，使菌悬液中各保护剂的终浓度如表1所示。
表1本发明的专用保护剂及其浓度设计
Figure BDA0001533827930000041
1.3冷冻和复温程序
冷冻程序为先将与保护剂混合均匀的菌悬液置于冻存管中-80℃冰箱放置12h，然后将其投入液氮中保存一周，复苏过程是将液氮保存的菌液立即置于37℃水浴锅中，水浴30min，然后细菌平板计数检测细菌存活率。
1.4细菌平板计数
在超净工作台下取0.5mL待测菌液加入4.5mL灭菌PBS，pH7.2，浓度为0.01M的溶液，按照十倍(体积比)递增比例进行梯度稀释并从中选取合适的三个稀释比例，然后吸取1mL的稀释菌液加入平皿中(直径为9cm)，将溶解并冷却至适宜温度的LB固体培养基加入平皿中摇匀，待其凝固后于37℃条件下恒温培养48h。最后，选取25-250之间的菌落数计算，并将此菌落数乘以菌液稀释度计算出平均值，即可得出原菌液的活细胞数。
1.5菌种存活率的计算
菌种存活率(％)＝冷冻后的活菌数/冷冻前的活菌数×100％
1.6渗透性保护剂的筛选
表2不同渗透性保护剂及浓度保存一周后猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率(％)
Figure BDA0001533827930000051
注：同一行中字母完全不同者为差异显著(P<0.05)，有相同字母者为差异不显著(P>0.05)，下同。
由表2可知，乙二醇、二甲基甲酰胺和二甲基乙酰胺分别在15％、9％和6％的条件下获得了最佳的保存率，分别为45.13％、28.09％和50.29％。结合图1中的A图可发现在其最佳保护浓度下，乙二醇、二甲基乙酰胺与二甲基甲酰胺之间疫苗菌的存活率差异显著(P<0.05)，而乙二醇和二甲基乙酰胺的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率没有显著性差异(P>0.05)，但二甲基乙酰胺猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保存率更高。
1.7半渗透性保护剂的筛选
表3不同半渗透性保护剂及浓度保存一周后猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率(％)
Figure BDA0001533827930000052
注：表3中的海藻糖、蔗糖、乳糖的浓度由1到5分别为15％、12.5％、10％、7.5％、5％，甘露醇浓度由1到5分别为9％、7％、5％、3％、1％,海藻酸钠浓度由1到5分别为2％、1.5％、1％、0.5％、0.25％。
由表3分析可知，海藻糖和甘露醇在高浓度范围取得了较好的保存效果，而蔗糖和乳糖在较低的浓度范围内取得了较好的保存效果。海藻糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和海藻酸钠分别在15％、7.5％、10％、9％以及0.25％的浓度下取得了做好的保存效果，最佳保存率分别为46.07％、60.86％、57.31％、54.78％和25.84％。结合表3和图1中的B图可发现，7.5％蔗糖的保存效果最好，乳糖、甘露醇次之，但三者之间差异不显著(P>0.05)，蔗糖最佳保存率显著高于海藻糖和海藻酸钠(P<0.05)，而海藻糖、乳糖和甘露醇保存率之间没有显著性差异(P>0.05)，海藻酸钠的保存效果显著低于其他几种保护剂(P<0.05)。
1.8非渗透保护剂的筛选
表4不同非渗透性保护剂及浓度保存一周后猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率(％)
Figure BDA0001533827930000061
注：表4中：浓度编号由1到5，明胶、PVP浓度分别为10％、7.5％、5％、2.5％、1％，葡聚糖的浓度为11％、9％、7％、5％、2.5％，脱脂奶粉的浓度为25％、20％、15％、10％、5％，牛血清白蛋白浓度分别为5％、3.75％、2.5％、1.25％、0.5％。(见图3)
由表4分析可知，明胶、PVP、葡聚糖、脱脂奶粉和牛血清白蛋白分别在10％、7.5％、2.5％、20％、2.5％的浓度下取得了最佳保存率，最佳保存率分别为38.77％、22.85％、45.23％、44.95％和30.06％。结合图1C可发现，最佳浓度下，保存效果较好的非渗透性保护剂分别是葡聚糖、脱脂奶粉和明胶，三者之间差异不显著(P>0.05)，但葡聚糖和脱脂奶粉的保存率要高于明胶。PVP和牛血清白蛋白的保存率则显著低于葡聚糖和脱脂奶粉(P<0.05)。因此，在非渗透性保护剂中，2.5％的葡聚糖和20％的脱脂奶粉是较好的保护剂。
1.9抗氧化剂的筛选
表5不同抗氧化剂保存一周后猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率(％)
Figure BDA0001533827930000071
为了提高疫苗菌C500(pVGS/2SS-asd)储存过程中的稳定性，需要在保护剂配方中加入抗氧化剂，由表5可以看出，蛋氨酸的保存率最高，为5.24％，但与其他抗氧化剂相比，无显著差异(P>0.05)。
实施例2：液氮超低温冷冻保存疫苗菌C500/pGS/2SS保护剂的配伍优化
2.1正交设计
表6 L9(34)正交设计表
Figure BDA0001533827930000072
表7液氮超低温冷冻多因素优化试验安排
Figure BDA0001533827930000073
将调整后的菌液与以上保护剂配方按照体积比为1:1的比例等体积混合使其终浓度如表所7示，然后分装于冻存管，每组三个重复，置于-80℃冰箱放置12h然后将其投入液氮中保存一周，随后将液氮保存的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的菌液立即置于37℃水浴锅中，水浴30min，然后检测细菌存活率，筛选出保护效果最佳的保护剂配方。
2.2液氮超低温冷冻保存猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500/pGS/2SS菌液保护剂配方的筛选试试效果见表8。
表8液氮超低温冷冻多因素优化实验极差分析表
Figure BDA0001533827930000081
表9液氮超低温冷冻保存多因素优化试验方差分析
Figure BDA0001533827930000082
Figure BDA0001533827930000091
a.R方＝0.956(调整R方＝0.925)
从表8的极差分析表可以看出，组合A3B2C2D3组保护效果最好，结合表9的试验方差分析可以看出，蔗糖、葡聚糖、二甲基乙酰胺的各个水平差异极显著(P<0.01)，蛋氨酸的各个水平差异显著(P<0.05)，表明这4个因素水平即为最优水平，不能被其他水平替代，综合考虑，疫苗菌C500(pVGS/2SS-asd)液氮超低温冷冻保存的最优保护剂组合为A3B2C2D3，即猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500(pVGS/2SS-asd)在按质量比计，蔗糖2.5％、葡聚糖7％、二甲基乙酰胺6％、蛋氨酸0.025％的条件下保存效果最佳。
实施例3：猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500/pGS/2SS储存稳定性检测
3.1试验设计
在所筛选出最佳的保护剂配方下，对不同浓度猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500/pGS/2SS的菌液进行检测，并对其保存1周、4周的储存稳定性进行了检测，并在试验末期检测质粒稳定性。
3.2质粒小量提取和酶切鉴定
在超净工作台上，用移液器取1ml菌液(疫苗菌C500/pGS/2SS)，按照天根生化(北京)科技有限公司生产的质粒小提试剂盒说明书操作，提取质粒。具体操作步骤如下：
(1)取1.5mL菌液于2mL干净离心管中，12000rpm离心1min，弃上清，收集菌沉。
(2)向留有细菌沉淀的离心管中加入250μLP1，重悬菌体沉淀，涡旋震荡至菌体彻底悬浮。
(3)再加入250μLP2裂解菌体，温和上下翻转10次，使菌体彻底裂解。
(4)随后向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和上下翻转6-8次，此时会出现白色絮状沉淀，在12000rpm下离心10min。
(5)将上一步收集的上清移入离心吸附柱中，在12000rpm离心1min，弃收集管废液。
(6)往离心吸附柱中加入600μL漂洗液(试剂盒自带)，12000rpm离心1min，弃收集管废液；重复漂洗步骤一次，弃收集管废液，2000rpm离心2min，尽量除去漂洗液WB。
(7)将吸附柱放入干净离心管内，在吸附柱中央部位加30μLEB洗脱液，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(8)将洗脱所得液体重新加入吸附柱中，重复以上步骤。将质粒溶液收集到离心管中。
(9)质粒的酶切鉴定
将所提质粒进行酶切鉴定。酶切体系见表10。
表10酶切鉴定体系
Figure BDA0001533827930000101
在37℃的水浴锅中恒温水浴2h，用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统仪上观察酶切结果。
3.3不同浓度猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500/pGS/2SS菌液储存的稳定性。结果见表11。
表11不同保存时期下不同浓度保护剂对猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500(pVGS/2SS-asd)的存活率
Figure BDA0001533827930000102
由表11可以看出，按照筛选出的最佳保护剂配方保存上述猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株后，各浓度下上述猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株均取得了较高的保存率，并且随着保存时间的延长，上述猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率并未发生明显改变(P>0.05)，体现出了良好的储存稳定性。结合图3可以看出不同浓度的猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株菌液氮超低温冷冻保存后的存活率之间差异不显著(P>0.05)。以上结果表明，利用液氮超低温冷冻方法可以应用于疫苗菌C500(pVGS/2SS-asd)的保存，特别是在猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500(pVGS/2SS-asd)的长期保存方面具有很大优势，并且在适宜的浓度范围内，猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的存活率并不会发生显著变化。
3.4猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500/pGS/2SS液氮超低温冷冻保存后质粒稳定性检测
由图2可以看出，猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株C500(pVGS/2SS-asd)经液氮超低温冷冻后所提质粒经EcoRI和HindIII双酶切后，出现一条780bp左右的条带，与目的条带(S/2SS)一致，说明疫苗菌经液氮超低温冷冻后质粒仍能保持良好的稳定性，没有发生基因的变异。

Claims (2)

1.一种在液氮超低温冷冻保藏猪霍乱沙门氏菌疫苗株C500/pGS/2SS菌株的方法，其特征在于，采用两步冷冻法，按配方量的保护剂与浓度为109CFU/ml猪霍乱沙门氏菌菌疫苗株C500/pGS/2SS菌液以等体积混合，置于冻存管中，于-80℃下放置12h后迅速投入-196℃的液氮罐中做长期保藏，其中所述猪霍乱沙门氏菌疫苗株C500/pGS/2SS菌液与保护剂的体积比为1：1，所述保护剂的组分按质量比计为蔗糖2.5％，葡聚糖7％，二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％；所述猪霍乱沙门氏菌疫苗株C500/pGS/2SS的保藏编号为CCTCC NO:M208194。
2.一种专用于权利要求1所述方法的保护剂，其特征在于，所述保护剂组分按质量比计为，蔗糖2.5％，葡聚糖7％，二甲基乙酰胺6％和蛋氨酸0.025％。
CN201711481166.XA 2017-12-30 2017-12-30 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂 Active CN108018210B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711481166.XA CN108018210B (zh) 2017-12-30 2017-12-30 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711481166.XA CN108018210B (zh) 2017-12-30 2017-12-30 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108018210A CN108018210A (zh) 2018-05-11
CN108018210B true CN108018210B (zh) 2020-11-06

Family

ID=62072356

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711481166.XA Active CN108018210B (zh) 2017-12-30 2017-12-30 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108018210B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020030572A1 (en) * 2018-08-07 2020-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Processes and vaccines
CN110596227B (zh) * 2019-08-08 2021-11-23 河北省食品检验研究院（国家果类及农副加工产品质量监督检验中心、河北省食品安全实验室） 飞行时间质谱即用型斯坦利沙门氏菌定性标准样品的制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2170268A2 (en) * 2007-06-25 2010-04-07 Amgen, Inc. Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor
BR102012011033A2 (pt) * 2012-05-10 2016-04-12 Univ São Paulo Usp micropartícula de levedura e seu uso

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101912608B (zh) * 2010-08-17 2012-08-22 北京中海生物科技有限公司 一种仔猪副伤寒活疫苗的生产方法
CN102942619B (zh) * 2012-11-26 2014-06-04 肇庆大华农生物药品有限公司 禽流感血凝素抗原保护剂及提高胚液中禽流感血凝素稳定性的方法
EP3925443A1 (en) * 2012-11-30 2021-12-22 Pharmacosmos Holding A/S Cryoprotecting agent, cryoprotecting and cryopreserved compositions, uses thereof, and methods of cryopreservation
CN103041399B (zh) * 2013-01-07 2014-10-08 江苏省农业科学院 一种耐热保护剂及其应用
CN103520281B (zh) * 2013-10-16 2015-03-25 江声 一种降血糖生物制剂
CN105233296B (zh) * 2015-11-24 2018-08-17 江苏省农业科学院 用于鸭病毒性肝炎活疫苗的耐热冻干保护剂及其制备方法和应用
CN107174663B (zh) * 2017-05-22 2020-06-30 杭州洪晟生物技术股份有限公司 疫苗冻干保护剂

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2170268A2 (en) * 2007-06-25 2010-04-07 Amgen, Inc. Compositions of specific binding agents to hepatocyte growth factor
BR102012011033A2 (pt) * 2012-05-10 2016-04-12 Univ São Paulo Usp micropartícula de levedura e seu uso

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"An evaluation of cryoprotective compounds on bovine spermatozoa";R S Jeyendran等;《Cryobiology》;19801031;第17卷(第5期);第458-464页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108018210A (zh) 2018-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108018210B (zh) 一种猪霍乱沙门氏菌疫苗菌株的保藏方法及其专用保护剂
CN109652357B (zh) 细胞共培养下生长缺陷的牛支原体突变株及应用
CN105801707B (zh) 一种草鱼出血病口服疫苗及其制备与应用
US6610531B1 (en) Viable dried bacteria produced by drying in the presence of trehalose and divalent cation
CN104560851B (zh) 杀鲑气单胞菌活疫苗制剂和冻干疫苗制品的制备方法及应用
CN102311919A (zh) 一种保藏微藻藻种的方法
CN103222458A (zh) 一种猪性别控制精子及其制备方法和应用
Van Kessel et al. Longitudinal study of a clonal, subclinical outbreak of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Cerro in a US dairy herd
CN113230215A (zh) 噬菌体冻干粉制剂及其制备方法、保存方法和应用
CN114181901B (zh) 一种免疫细胞的体外诱导扩增和冻存的方法
CN108977379B (zh) 一种微生物低温保存保护剂
CN101322489B (zh) 一种鹿x/y精子分离冷冻精液及其生产方法和应用
CN103301452B (zh) 一种猪乙型脑炎冻干疫苗及其制备方法
Daskin et al. The effect of different dilution rates of Angora buck semen frozen with Bioxcell® extender on the post-thaw quality
CN103468573B (zh) 迟钝爱德华氏菌的冷冻真空干燥保护剂及其冻干方法
CN105126094A (zh) 一种拟态弧菌菌影疫苗及其制备方法和应用
CN114097770B (zh) 一种免疫细胞冻存液及其应用方法
CN111411087B (zh) 一种鲤疱疹病毒ii型弱毒株及其应用
Morichi et al. Death of freeze-dried Lactobacillus bulgaricus during rehydration
AU2021100063A4 (en) A method for preserving Salmonella choleraesuis vaccine strain and special protective agents thereof
CN108434105B (zh) 基于胞内甜菜碱积累的疫苗制备方法及制剂
CN114381374A (zh) 副猪嗜血杆菌无动物源冻干保护剂及其制备方法和应用
CN103421731B (zh) 一种副猪嗜血杆菌减毒沙门氏菌苗
CN103555860B (zh) 一种鲤春病毒标准样品及其制备方法
US20030044965A1 (en) Long term preservation and storage of viable dried bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant