CN108977379B - 一种微生物低温保存保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。微生物低温保存保护剂的成分为：非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水。本发明还建立了卡介菌低温长期保存的技术方法，为深入开展卡介菌的相关研究提供了技术支撑。

Description

一种微生物低温保存保护剂

本申请为2016年12月7日提交的，发明名称为“一种微生物低温保存保护剂”的中国专利申请201611120538.1的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。

背景技术

冷冻干燥是一种常用的实现微生物长保质期的方法(CarcobaR，2000)，被广泛视为是最适合的细菌脱水过程之一，其目的在于获得稳定的最终试剂(Carvalho AS，2004)，也是用于贮存微生物细胞培养物的最常见方法之一。冷冻干燥后的细胞存活率反映了细胞抵抗快速冷冻和干燥的影响(Miyamoto-ShinoharaY，2008)。一般认为，大多数无保护的细菌在冷冻干燥后都会被杀死，而存活的那些在进行贮存时迅速死亡。要想获得理想的冷冻及冻干效果，除工艺外，筛选和使用适宜的冷冻保护剂也是十分重要的。适宜的冻干保护剂能够使微生物在冻干以及解冻的过程中降低死亡率，减轻冷冻干燥以及解冻时所引起的菌体损伤。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配置方法对微生物的保存效果有明显的影响。Harrison(1963)推荐冻干保护剂应具有以下条件：1)保护剂应含有能形成骨架的物质；2)它应含有限制剩余水分的缓冲物质；3)电解质的含量应少等。

已进行了多种尝试来增加冻干和贮存后存活的细菌的数量，但仅取得有限的成功。

选择适当的干燥介质/冷冻保护剂混合物是增加微生物尤其是细菌微生物在冻干和后续贮存过程中存活率的关键因素(Carvalho AS，2004)。现有技术中，CN101108164A报告了卡介菌多糖核酸在冻干中的几项研究。Castro等人评估了5％的海藻糖对保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)在冷冻干燥后存活率的有益效果，相比起在单独的水中的约1％的留存率，它们显示25％的留存率。2003年，Carvalho等人证明了谷氨酸钠对冻干和3-6个月的后续贮存期间的存活的稳定作用，但所报导的微生物存活率仍然很低。

卡介菌(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)源自具有致病性的牛型结核杆菌经230代次连续传代后形成的减毒菌株。我国目前涉及卡介菌的上市或临床研究中生物制品主要有皮内注射用卡介苗、卡介菌多糖核酸注射液(BCG-PSN)、卡介菌纯蛋白衍生物(BCG-PPD)、治疗用卡介苗、卡介菌CpG-DNA等。这些产品均涉及卡介菌活菌的收获与应用，因此现行版药典均对其种子批传代代次有要求，目的是降低细菌变异的风险。尤其对于活菌制品的菌种传代代次要求基本为：自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。然而国内卡介苗产品的代次多数为12代，国外卡介苗制品的代次则多为3-5代，这种差别的主要原因是菌种首次复苏后活菌量少，只能通过增加培养代次来满足生产需要。解决该问题的首要关键之一是如何提高卡介菌菌种首次复苏的活菌含量。正常情况下，接种的活菌含量越多，菌种复苏所需的时间越短，形成的菌苔或菌膜的质量越高，反之，活菌含量越低，所需要的复苏时间就越长，进一步影响后续的传代与收获。卡介苗菌种所含的活菌数量与菌种的保存形式有关。菌种的保存形式有两种，一种为冻干保存，一种为液体冷冻保存。冻干菌种为卡介菌培养物加冻干保护剂后经过低温冷冻真空干燥制备而成，冻干后活菌较稳定，可在2-8℃保藏与运输，在室温下也能保持相对稳定；但冻干后菌种活菌含量下降，平均仅为冻干前液体菌种的16％-20％左右，且菌株经干燥后复苏时间也较长。菌种的另一种保存方式为液体冷冻保存菌种，即卡介菌新鲜培养物加低温保存保护剂后，在-20℃及以下温度冷藏，该方式具有保持活菌含量高容易复苏的特点。

目前，现有技术中对卡介菌的研究中，多针对卡介菌多糖核酸的保存进行研究，而对卡介菌活菌的菌种保存研究较少，同时，在菌种的保存中，基本都是采用冻干保存，存在冻干菌种复苏慢、保存效率不高等问题。

为了克服现有技术中存在的缺点，本发明人通过长期的研究，发明了一种微生物低温保存保护剂，该保护剂可以有效的提高微生物的液体冷冻保存效率，尤其是能提高卡介菌活菌样品低温冷藏或冷冻后的活菌含量，进而提高卡介菌生产用活菌菌种首次复苏质量，解决现有技术中的上述问题，弥补了满足生产需要收获物传代代次多的缺陷。

发明内容

本发明提供了一种微生物低温保存保护剂，可以用于但不限于卡介菌菌种、卡介菌活菌样品等卡介菌活菌或其他细菌、微生物的低温冷藏，用以提高微生物，例如卡介菌生产用菌种，首次复苏质量，解决冻干菌种复苏慢等技术难题。为了最大限度地提高微生物，例如卡介菌生产用菌种，冷冻存活率，在低温保存前将低温保存保护剂添加到微生物培养物中。

本发明涉及一种微生物低温保存保护剂，由非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水组成；其中，所述微生物低温保存保护剂各组分含量为1单位浓度含量；并且，1单位浓度含量中非还原性糖的量为4％到16％(w/v)，优选5％到15％(w/v)；甘油的量为0.9％到11％(v/v)，优选1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.4％到2.5％(v/v)，优选0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.15％到1％(w/v)，优选0.2％到0.8％(w/v)。

在本发明的一个实施例中，1单位浓度含量中非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到1％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.2％到0.4％(w/v)。

在本发明的另一个实施例中，1单位浓度含量中非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为1％到2％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.4％到0.8％(w/v)。

在本发明的一个实施例中，还涉及一种微生物低温保存保护剂原液，其各组分含量为上述微生物低温保存保护剂的1单位浓度含量的倍数。

优选的，微生物低温保存保护剂原液的各组分含量为1单位浓度含量的1.5倍～10倍，进一步优选为2倍～5倍，例如1.5倍、2倍、2.5倍或3倍等。

在微生物低温保存保护剂原液的制备方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要进行调整，如保存剂原液可以为1单位浓度的(包括但不限于)1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍等。

在使用时，本领域技术人员可以根据实际工作的需要，将保存液原液进行稀释，例如稀释10倍、9倍、8倍、7倍、5倍、4倍、3倍、2倍、1倍等，使最终保存液使用时的浓度为上述微生物低温保存保护剂的1单位浓度含量。

更优选的，所述微生物低温保存保护剂原液中，非还原性糖的量为10％到30％(w/v)；甘油的量为2％到20％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为1％到4％(v/v)；钾盐的量为1％到4％(w/v)；并且谷氨酸盐的量为0.4％到1.6％(w/v)。

在本发明的一个实施例中，所述微生物低温保存保护剂原液中，非还原性糖的量为10％到30％(w/v)；甘油的量为2％到20％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为1％到4％(v/v)；钾盐的量为1％到2％(w/v)；并且谷氨酸盐的量为0.4％到0.8％(w/v)。

在本发明的另一个实施例中，所述微生物低温保存保护剂原液中，非还原性糖的量为10％到30％(w/v)；甘油的量为2％到20％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为1％到4％(v/v)；钾盐的量为2％到4％(w/v)；并且谷氨酸盐的量为0.8％到1.6％(w/v)。

本文中所使用的“非还原性糖”可以是海藻糖，棉籽糖，蔗糖等。在本发明的优选实施方案中，非还原性糖是海藻糖。

本文中所使用的“非离子型表面活性剂”可以是聚山梨酯20，聚山梨酯40，聚山梨酯60和聚山梨酯80中的一种或几种的组合。在本发明的优选实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨酯80。

本文中所使用的“钾盐”可以是硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钾和氯化钾中的一种或几种的组合。在本发明的优选实施方案中，钾盐是氯化钾或磷酸氢二钾。

本文中所使用的“谷氨酸盐”通常是指可食用的谷氨酸的水溶性盐。这类“可食用的”盐是被批准用于人类食品中且是食品级的那些，如谷氨酸的钠盐、谷氨酸的钾盐。在本发明的优选实施方案中，谷氨酸盐是谷氨酸钠。

在本发明的另一个实施例中涉及一种微生物低温保存保护剂或其原液，其中非还原性糖为海藻糖；所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80；所述钾盐为磷酸氢二钾和氯化钾中的至少一种；和/或谷氨酸盐为谷氨酸钠。

优选的微生物低温保存保护剂，每一百毫升1单位浓度中含有：海藻糖：4-16g，优选5-15g；甘油：0.9-11mL，优选1-10mL；聚山梨酯80：0.4-2.5mL，优选0.5-2.0mL；氯化钾或磷酸氢二钾：0.5-2g；谷氨酸钠：0.15-1g，优选0.2-0.8g。

更优选的，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5-15g，甘油9-11mL，优选10mL、聚山梨酯80 0.4-0.6mL，优选0.5mL、氯化钾或磷酸氢二钾1-2g、谷氨酸钠0.4-0.8g；或者，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5-10g，甘油0.9-2mL，优选1mL、聚山梨酯80 1.5-2.5mL，优选2mL、氯化钾或磷酸氢二钾1-2g、谷氨酸钠0.4-0.8g；

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5g，甘油10mL、聚山梨酯80 0.5mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.4g；

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.4g；

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.4g。

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油5mL、聚山梨酯80 1mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.4g。

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、磷酸氢二钾1g、谷氨酸钠0.4g。

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.4g。

在本发明的另一个实施例中，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.8g。

在本发明的一个实施例中，还公开了一种低温保存保护剂原液，每一百毫升所述保护剂原液中含有：海藻糖：8-32g，优选10-30g；甘油：1.8-22mL，优选2-20mL；聚山梨酯80：0.8-5mL，优选1-4mL；氯化钾或磷酸氢二钾：1-4g；和谷氨酸钠：0.3-2g，优选0.4-1.6g。

进一步优选，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖10-30g，甘油18-22mL，优选20mL、聚山梨酯80 0.8-1.2mL，优选1mL、氯化钾或磷酸氢二钾2-4g、谷氨酸钠0.8-1.6g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖10-20g，甘油1.8-4mL，优选2mL、聚山梨酯80 3-5mL，优选4mL、氯化钾或磷酸氢二钾2-4g、谷氨酸钠0.8-1.6g。

更优选的，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖10g，甘油20mL、聚山梨酯80 1mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯80 4mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖10g，甘油2mL、聚山梨酯80 4mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖20g，甘油10mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯80 4mL、磷酸氢二钾2g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯80 4mL、氯化钾4g、谷氨酸钠0.8g；或者，每一百毫升保护剂原液中含有海藻糖20g，甘油2mL、聚山梨酯80 4mL、氯化钾2g、谷氨酸钠1.6g。

优选的，本发明的保护剂或其原液的pH值为7-8，例如7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.7，7.8，7.9，8.0。可采用本领域常规的pH调节手段调节保护剂的pH值到所需范围，例如可以用盐酸和/或氢氧化钠、氢氧化钾溶液调节。

在本发明的一个实施例中，低温保存保护剂或其原液的保存条件为2-8℃。

同时，本发明涉及一种低温保存微生物的方法，包括使用上述微生物低温保存保护剂或微生物低温保存保护剂原液。

优选的，将待低温保存的微生物悬浮液与低温保存保护剂原液混合，或者将待低温保存的微生物与低温保存保护剂混合，得到待低温保存的微生物混合液，所述混合液中微生物低温保存保护剂的各组分含量为1单位浓度含量。

所述低温保存是指液体低温冷藏或液体冷冻保存中的一种。

如下文实施例详细解释的，在所述的低温保存保护剂的存在下，低温保存后获得高存活细胞或细菌数。令人惊讶的是，低温保存后菌或细胞的存活率最高可以达到95％左右。特别是，与现有的冷冻保存剂相比，本发明的低温保存保护剂尤其适用于长期冷冻保存以及需要反复冻融操作下的微生物的冷冻保存。

在本发明中，所述微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、衣原体、螺旋体。

在本发明的一个实施例中，所述微生物为细菌，优选为分枝杆菌，包括但不限于：结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、麻风分枝杆菌。更优选为结核分枝杆菌。

在本发明的一个具体实施例中，所述微生物为卡介菌菌种或卡介菌活菌。

本文中所使用的“卡介苗”或“卡介菌”通常是指一种减毒的活性牛型结核杆菌。

在本发明的优选实施方案中，卡介菌活菌包括但不限于牛型结核杆菌-BCG-Russia(Mycobaxteriumbovis-BCG-Russia)、牛型结核杆菌-BCG-Moreau(Mycobaxteriumbovis-BCG-Moreau)、牛型结核杆菌-BCG-Japan(Mycobaxterium bovis-BCG-Japan)、牛型结核杆菌-BCG-Sweden(Mycobaxteriumbovis-BCG-Sweden)、牛型结核杆菌-BCG-Birkhaug(Mycobaxteriumbovis-BCG-Birkhaug)、牛型结核杆菌-BCG-Prague(Mycobaxteriumbovis-BCG-Prague)、牛型结核杆菌-BCG-Glaxo(Mycobaxteriumbovis-BCG-Glaxo)、牛型结核杆菌-BCG-Denmark(Mycobaxteriumbovis-BCG-Denmark)、牛型结核杆菌-BCG-Tice(Mycobaxteriumbovis-BCG-Tice)、牛型结核杆菌-BCG-Frappier(Mycobaxteriumbovis-BCG-Frappier)、牛型结核杆菌-BCG-Connaught(Mycobaxteriumbovis-BCG-Connaught)、牛型结核杆菌-BCG-Phipps(Mycobaxteriumbovis-BCG-Phipps)和/或牛型结核杆菌-BCG-Pasteur(Mycobaxteriumbovis-BCG-Pasteur)、卡介菌D2PB302(CMCC95050)卡介菌BCG NIFDC945SⅢ(CMCC94103)、卡介菌BCG NIFDC945SⅡ(CMCC94102)。

在本发明的一个实施例中，所述低温保存微生物方法的步骤包括将微生物低温保存保护剂与待保存的微生物混合，然后将混合后的物料置于保存温度下。

在本发明的一个实施例中，低温保存卡介菌活菌的方法为，将微生物低温保存保护剂与卡介菌活菌混合，将混合后的物料在0℃至5℃之间的任意温度下放置2-24h，再将混合后的物料转移置于零下25℃至零下15℃之间的任意温度下放置2-24h，最后将混合后的物料放置于零下50℃或以下温度中保存。

在本发明的一个具体实施例中，低温保存卡介菌活菌的步骤为：收获卡介菌菌体，研磨后测定浓度得细菌原液；用低温保存保护剂将细菌原液稀释至所需浓度，例如，每1ml含菌量0.1mg得半成品；分装，例如，每支冻存管0.5ml，4℃预冻12小时以上，-20℃预冻12小时以上，-70℃冷藏保存。

本发明提供的微生物低温保存保护剂实现了冷冻保存的微生物，尤其是卡介菌活菌，在不同温度下的长期保存的稳定性。由此卡介菌活菌在储存2个月、储存4个月、储存6个月、储存9个月、储存12个月、储存1年半、储存2年，储存3年，储存4年，储存5年，储存6年，储存7年，储存8年，储存9年，储存10年，储存11年，储存12年，储存13年，储存14年，储存15年，储存20年后保留的存活率超过10％、优选超过20％、更优选超过30％，更优选超过40％，更优选超过50％，更优选超过60％，更优选超过70％，更优选超过80％，更优选超过90％。

在使用保存剂的比例方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要进行调整，如保存剂原液可以占低温保存体系总体积的(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，90％等。

在相关方面，本发明还提供了一种低温保存保护剂的制备方法，包括称取各组分并溶解于适量水中，定容并调节pH为7-8，灭菌。

在一个实施方案中，当按照本发明制造的低温保存保护剂和微生物的混合物表达抗原时，本发明也可提供疫苗。

“疫苗”这一术语是指药学上可接受的组合物，其当以有效量施用给动物或人类受试者时，能在受试者中诱导针对疫苗内包含的免疫原的抗体和/或激发保护性免疫。

另一方面，本发明还涉及所述低温保存保护剂在低温保存微生物中的应用。所述微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次体、衣原体、螺旋体。

在本发明的一个实施例中，所述微生物为细菌，优选为分枝杆菌，包括但不限于：结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、瘰疠分枝杆菌、鸟-胞内分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、麻风分枝杆菌。更优选为结核分枝杆菌。

在本发明的一个具体实施例中，所述微生物为卡介菌菌种或卡介菌活菌。

本发明的低温保存保护剂提高了微生物低温保存效率，尤其是卡介菌活菌低温保存的存活率，采用微生物冻干保护中常用的蔗糖、明胶等制成液态冷冻保护剂，得到的样品存活率仅为20％左右，而使用本发明的低温保存保护剂样品活菌存活率范围在33％-99％之间；并且，与其他冷冻保护剂相比，本发明的低温保存保护剂非常适用于反复冻融情况下的细菌保存。因此，本发明的低温保存保护剂赋予了卡介菌活菌在低温冷藏条件下更好的存活率，提高了卡介苗活菌冷藏样品首次复苏后的活菌含量，有利于改善卡介苗活菌样品的首次复苏质量，有利于后续的培养与收获。

本文中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成份、元素或方法步骤。

用端点值表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点值。

当描述一个可测量的值，例如参数、量、时间期限等时，本文中所使用的术语“约”意欲涵盖与指定值相差±20％或更少、优选±10％或更少、更优选±5％或更少、更优选±1％或更少，更优选±0.1％或更少的变化，此类变化适宜在所披露的发明中使用。

本说明书中列举的所有文件以其全文通过引用并入本文。具体来说，本文中特别提到的所有文件的教导通过引用并入本文。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，其后的定义用于更好地理解本发明的教导。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，所用卡介菌为D2PB302(CMCC95050)，其他试剂都从商购途径获得。

实施例1配置海藻糖、甘油、聚山梨酯-80、氯化钾和谷氨酸钠含量不同的低温保存保护剂原液

按表1中的组分含量，取相应物质，溶解于适量超纯水中，定容至100mL并用盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值至7.4；115℃30min灭菌，制得不同配比的本发明的低温保存保护剂原液。

表1低温保存保护剂原液配比表(每100ml)

	海藻糖(g)	甘油(ml)	聚山梨酯80(ml)	氯化钾(g)	谷氨酸钠(g)
						配方1	10	20	1	2	0.8
配方2	10	10	2	2	0.8
						配方3	10	2	4	2	0.8
配方4	20	20	1	2	0.8
						配方5	20	10	2	2	0.8
配方6	20	2	4	2	0.8
						配方7	30	20	1	2	0.8
配方8	30	10	2	2	0.8
						配方9	30	2	4	2	0.8

对照1

称取以下物质：明胶2g、蔗糖2g、氯化钾2g,谷氨酸钠0.8g；将上述物质溶解于适量超纯水，定容至100mL并用盐酸和氢氧化钠溶液调节pH值至7.4；115℃30min灭菌，即得。

实施例2低温保存保护剂的效果研究

收获生长于液体苏通培养基表面的卡介菌菌膜，以无菌生理盐水洗涤，压干后称重，根据湿菌重量加入生理盐水，在含钢珠球形瓶中研磨至菌液为均一菌液，取样品进行浓度测定。以生理盐水稀释菌液浓度为0.2mg/ml,分别取相同体积的菌液与实施例1中配方1-9和对照1的低温保存保护剂原液1：1混合均匀，得半成品，卡介菌浓度为0.1mg/ml，分装，每支冻存管0.5ml，4℃预冻12小时以上，-20℃预冻12小时以上，-70℃冷冻，得成品。另外，设置一组无保护剂组，采用生理盐水将卡介菌浓度调整为0.1mg/ml，同样的方式冷冻。

取对照保护剂卡介菌样品，以10倍稀释法进行活菌数检测，结果作为冻前活菌数对照。

活菌数检测法为：将样品稀释至10-5mg/ml、10-6mg/ml，分别取2个稀释度样品各0.1ml接种至培养基表面，每个稀释度5复管，37±1℃培养四周后计数菌落形成单位(CFU)个数，计算后换算为每mg细菌含的CFU数。

各样品在-70℃冷冻两周、四周后复苏，其中冻存四周后的一部分样品复苏后再反复冻融3次，分别进行活菌数测定，与冻前活菌数结果比较，计算存活率，结果如下：

表2卡介菌冷冻保存前后活菌数对比表

注：存活率＝(冷冻后活菌数/冷冻前活菌数)×100％

活菌数单位：×10⁴CFU/mg

上述结果表明，利用实施例1中配方1-9的低温保存保护剂原液冷冻制备的卡介菌活菌样品，冷冻后活菌存活率比对照保护剂(对照1)要高，配方1-9尤其适合长时间的低温保存，并且能够降低反复冻融后细菌的死亡率。

实施例3低温保存保护剂的长期低温保存和反复冻融的保存效果

按照实施例1的制备方法，以表3的组成含量配制对照冻存液原液和本发明的低温保存保护剂原液：

表3低温保存保护剂原液配比表(每100ml)

按照实施例2的制备方法，分别取相同体积的卡介菌菌液与配方10-15和对照2-4的低温保存保护剂原液1：1混合均匀，得半成品，卡介菌浓度为0.1mg/ml，分装，每支冻存管0.5ml，4℃预冻12小时以上，-20℃预冻12小时以上，-70℃冷冻，得成品。取对照2保护剂卡介菌样品，以10倍稀释法进行活菌数检测，结果作为冻前活菌数对照。

各样品在-70℃冷冻四周后复苏，其中冻存四周后的一部分样品复苏后再反复冻融3次，分别进行活菌数测定，与冻前活菌数结果比较，计算存活率，结果如下：

表4卡介菌冷冻保存前后活菌数对比表

注：存活率＝(冷冻后活菌数/冷冻前活菌数)×100％

活菌数单位：×10⁴CFU/mg

上述结果表明，利用配方10-15的低温保存保护剂冷冻制备的卡介菌活菌样品长时间冷冻后存活率高，反复冻融后细菌的存活率更是明显高于对照2-4。

本发明的低温保存保护剂能明显提高卡介菌活菌的存活率，从而在复苏菌种与卡介菌活菌样品时能从样品本身的方面促进复苏质量。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一种卡介菌活菌液体冷冻保存保护剂，其特征在于由非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水组成；所述非还原性糖为海藻糖；所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80；所述钾盐为磷酸氢二钾或氯化钾；所述谷氨酸盐为谷氨酸钠；其中，所述卡介菌活菌液体冷冻保存保护剂各组分含量为1单位浓度含量，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5-10g，甘油0.9-2mL，聚山梨酯80 1.5-2.5mL，氯化钾或磷酸氢二钾1-2g，谷氨酸钠0.4-0.8g。

2.一种卡介菌活菌液体冷冻保存保护剂原液，其特征在于所述保护剂原液中非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐和谷氨酸盐各组分含量为权利要求1所述的保护剂的1单位浓度含量中各组分的2倍～5倍。

3.如权利要求1所述的保护剂或权利要求2所述的保护剂原液，其特征在于，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油0.9-1mL，聚山梨酯80 1.5-2.5mL，氯化钾或磷酸氢二钾1-2g，谷氨酸钠0.4-0.8g。

4.如权利要求3所述的保护剂或保护剂原液，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾1g、谷氨酸钠0.4g；

或者，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、磷酸氢二钾1g、谷氨酸钠0.4g；

或者，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖10g，甘油1mL、聚山梨酯80 2mL、氯化钾2g、谷氨酸钠0.4g。

5.如权利要求4所述的保护剂或保护剂原液，其特征在于，所述保护剂或原液的pH值为7-8。

6.一种液体冷冻保存卡介菌活菌的方法，其特征在于使用权利要求1-5任一项所述的保护剂或保护剂原液。

7.如权利要求6所述的方法，将待液体冷冻保存的卡介菌活菌的悬浮液与保护剂原液混合，或者将待液体冷冻保存的卡介菌活菌与保护剂混合，得到待液体冷冻保存的卡介菌活菌混合液，所述混合液中液体冷冻保存保护剂的各组分含量为1单位浓度含量。

8.如权利要求7所述的方法，将液体冷冻保存保护剂与卡介菌活菌混合，将混合后的物料在0℃至5℃之间的任意温度下放置2-24h，再将混合后的物料转移置于零下25℃至零下15℃之间的任意温度下放置2-24h，最后将混合后的物料放置于零下50℃或以下温度中保存。

9.如权利要求1-5任一项所述的保存保护剂或保存保护剂原液在液体冷冻保存卡介菌活菌中的应用。