CN106929421B - 定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法 - Google Patents

定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明实施例涉及一种定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法，所述制备方法包括：将目标菌株经营养琼脂接种及单菌落营养肉汤增菌后，获取对数生长期后期的微生物菌液；将微生物菌液进行稀释，并使用600nm波长的光吸收辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液；将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液；将菌悬液与保护剂溶液进行混合，得到混合液；其中，混合液的菌浓度为102cfu/50μl～106cfu/50μl；取定量的混合溶液，利用液氮将混合溶液冷冻成球，然后迅速进行预冻；其中，预冻时间不少于2小时，预冻温度为‑80℃～‑20℃；将预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到冷冻干燥小球。

Description

定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物冷冻技术领域，尤其涉及一种定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法。
背景技术
由于培养基品质、培养条件、菌液混匀程度、微生物吸附损失、吸取液体体积、菌落计数准确性、不同人员操作差异性等，微生物活菌的定量结果有很大的不确定性。
卫监督发〔2010〕29号《食品检验机构资质认定条件》第七章仪器设备和标准物质中规定，第二十五条食品检验机构应当配备满足所开展的检验活动必需的仪器设备、样品前处理装置以及标准物质(参考物质)或标准菌(毒)种等。第二十六条食品检验机构使用仪器设备(包括软件)、标准物质(参考物质)或标准菌(毒)种等有专人管理，满足溯源要求。因此，为保证微生物定量结果的准确与可比，需要在微生物计数过程中使用定量标准物质。
目前已有的市售质控菌株，多数是以冻干粉的形式存在，且多用于定性。因此需要一种能准确控制菌数，稳定性好，使用便捷的菌株定量制备保藏方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术所存在的缺陷，提供一种定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法，能够制备出含菌量50～108CFU/球的冷冻干燥小球，且冷冻干燥小球间菌数的相对标准偏差小于25％，能在-20℃保持至少3个月，-80℃保持至少6个月的稳定性。此外，该工艺简单，成本低，此方法使用本制备方法所得的冷冻干燥小球外观完整，数量可控，稳定性佳，复溶性好，无需复活即可直接使用，有广泛的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了一种定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法，包括：
将目标菌株经营养琼脂接种及单菌落营养肉汤增菌后，获取对数生长期后期的微生物菌液；
将所述微生物菌液进行稀释，并使用600nm波长的光吸收辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液；
将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液；其中，所述保护剂溶液中包括5g/ml～20g/ml的蛋白质、2g/ml～15g/ml的水溶性糖、0.5g/ml～10g/ml的谷氨酸钠和0g/ml～5g/ml的表面活性剂；
将所述菌悬液与所述保护剂溶液进行混合，得到混合液；其中，所述混合液的菌浓度为102cfu/50μl～106cfu/50μl；
取定量的所述混合溶液，利用液氮将所述混合溶液冷冻成球，然后进行预冻；其中，所述预冻时间不少于2小时，预冻温度为-80℃～-20℃；
将所述预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到所述冷冻干燥小球。
优选的，所述将预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到所述冷冻干燥小球具体为：
将预冻后的小球在-50℃～-35℃保存4小时～6小时进行定型，使所述小球内的水分部分升华；
再将所述小球在-35℃～-20℃进行主干燥；其中，所述主干燥的时间为8小时～12小时；
将所述主干燥后的小球在10℃～25℃进行解析干燥；其中，所述解析干燥的时间为7小时～10小时。
优选的，所述方法还包括：将所述冷冻干燥小球在冻干机内进行真空密封保存；其中，所述保存温度为-80℃～-20℃。
优选的，在所述将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液之前，所述方法还包括：
将所述保护剂用伽马射线进行辐照灭菌。
优选的，所述蛋白质为人血清白蛋白、胎牛血清、脱脂奶粉、全脂奶粉、卵清蛋白、酪蛋白中的至少一种。
优选的，所述水溶性糖为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一种。
优选的，所述表面活性剂为Triton WR-1339、甘油、Macrocyclon、吐温80中的至少一种。
优选的，所述菌悬液与所述保护剂溶液的混合比例为3:7～1:9。
优选的，所述得到冷冻干燥小球的含菌量为50CFU/球～108CFU/球。
本发明实施例提供的定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法，能够制备出含菌量50～108CFU/球的冷冻干燥小球，且冷冻干燥小球间菌数的相对标准偏差小于25％，能在-20℃保持至少3个月，-80℃保持至少6个月的稳定性。此外，该方法制备得到的冷冻干燥小球稳定性好，菌种存活率高，具有合理的活菌含量，且球状的形态便于使用并可避免取样损失，解决了微生物菌种保藏、复活的繁琐及质量控制的不确定性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法流程图。
具体实施方式
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
图1为本发明实施例提供的定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法流程图，下面结合图1，对本发明实施例提供定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法进行说明。
本发明实施例提供的制备方法包括如下步骤：
S101，将目标菌株经营养琼脂接种及单菌落营养肉汤增菌后，获取对数生长期后期的微生物菌液。
S102，将微生物菌液进行稀释，并使用600nm波长的光吸收辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液。
具体的，将微生物菌液进行适当稀释，并使用600nm波长的光吸收(OD600)辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液。
S103，将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液。
具体的，保护剂的成分可以包括蛋白质、水溶性糖、谷氨酸钠和表面活性剂。优选的，在保护剂与无菌水配制成保护剂溶液之前，保护剂的各成分需要经过伽马射线辐照进行灭菌。
在配置成的保护剂溶液中各组分的成分如下：5g/ml～20g/ml的蛋白质、2g/ml～15g/ml的水溶性糖、0.5g/ml～10g/ml的谷氨酸钠和0g/ml～5g/ml的表面活性剂。
其中，蛋白质可以为人血清白蛋白、胎牛血清、脱脂奶粉、全脂奶粉、卵清蛋白、酪蛋白中的一种或多种。
水溶性糖可以为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的一种或多种。
表面活性剂可以为Triton WR-1339、甘油、Macrocyclon、吐温80中的一种或多种。需要说明的是，表面活性剂是非必须存在的，本领域技术人员可以根据需要对表面活性剂的用量进行选择。
S104，将保护剂溶液与菌悬液进行混合，得到混合液。
具体的，将S102获得的一定菌浓度的菌悬液与S103制得的保护剂液体混合均匀，从而得到混合液。
其中，菌悬液与保护剂溶液的混合比例为3:7～1:9；菌悬液与保护剂溶液混合得到的混合液的菌浓度为102cfu/50μl～106cfu/50μl。
S105，取定量的混合溶液，利用液氮将混合溶液冷冻成球，然后进行预冻。
具体的，将利用液氮成型后的小球迅速进行预冻。
其中，预冻时间不少于2小时，预冻温度为-80℃～-20℃；优选的，预冻温度为-80℃～-50℃。
S106，将预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到冷冻干燥小球。
具体的，首先，将预冻后的小球在-50℃～-35℃保存4小时～6小时进行定型，使小球内的水分部分升华，以保证在主干燥期间的持续升温阶段小球不变形；定型温度优选为-45℃，时间优选为4小时；其次，再将小球在-35℃～-20℃进行主干燥，主干燥的时间为8小时～12小时；主干燥温度优选为-20℃，时间优选为11小时；最后，将主干燥后的小球在10℃～25℃进行解析干燥，解析干燥的时间为7小时～10小时；解析干燥温度优选为25℃，时间优选为10小时。经检测，真空冷冻干燥后，常温下(20℃～25℃)冷冻干燥小球的水活度在0.05～0.25范围内。
其中，制备得到的冷冻干燥小球的含菌量为50CFU/球～108CFU/球。
制备得到的冷冻干燥小球还需要进行真空密封；优选的，冷冻干燥小球在冻干机内进行真空密封保存；其中，保存温度可以为-80℃～-20℃，优选为-80℃。
采用上述方法制得的冷冻干燥小球外观完整，数量可控，稳定性佳，复溶性好，无需复活即可直接使用，有广泛的应用前景。且经检测，上述方法制得的冷冻干燥小球可以在-20℃至少保持3个月的稳定性，-80℃至少保持6个月的稳定性，且活菌计数结果(对数值)的相对标准偏差小于25％。
本发明实施例提供的定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法，能够制备出含菌量50～108CFU/球的冷冻干燥小球，且冷冻干燥小球间菌数的相对标准偏差小于25％，能在-20℃保持至少3个月，-80℃保持至少6个月的稳定性。此外，该工艺简单，成本低，此方法使用本制备方法所得的冷冻干燥小球外观完整，数量可控，稳定性佳，复溶性好，无需复活即可直接使用，有广泛的应用前景。
下面以具体的例子说明本实施例提供的制备方法定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备过程。
首先，将处于目标菌株经营养琼脂接种及单菌落营养肉汤增菌后，获取对数生长期后期的微生物菌液；再将获取到的微生物菌液进行稀释，并使用600nm波长的光吸收辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液。
其次，将保护剂的组成成分进行伽马射线辐照灭菌后，与无菌水混合配成均匀的保护剂溶液，再与一定菌浓度的菌悬液混合得到混合液；其中，保护剂溶液的组成成分包括5g/ml～20g/ml的脱脂奶粉、2g/ml～15g/ml的水溶性糖、0.5g/ml～10g/ml的谷氨酸钠和0g/ml～5g/ml的表面活性剂；菌悬液与保护剂溶液的混合比例为3:7～1:9；菌悬液与保护剂溶液混合得到的混合液的菌浓度为102cfu/50μl～106cfu/50μl。
再次，使用液氮辅助定量混合液进行冷冻成球，迅速转移至-50℃以下预冻至少2小时。
最后，将预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到冷冻干燥小球，并在冻干机内进行真空密封；其中，冷冻干燥分为3个阶段，首先在-45℃保持4h进行定型，升华部分水分，以保证在主干燥持续升温阶段小球不变形；然后在-20℃保持11h完成主干燥后；进入解析干燥阶段25℃保持10h。制备得到的冷冻干燥小球在冻干机内进行真空密封保存；其中，保存温度可以为-80℃。
制备得到的微生物菌种冻干球可以在-20℃至少保持3个月的稳定性，-80℃至少保持6个月的稳定性，且活菌计数结果(对数值)的相对标准偏差小于25％。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种定量保存微生物的冷冻干燥小球的制备方法,其特征在于，所述制备方法包括：
将目标菌株经营养琼脂接种及单菌落营养肉汤增菌后，获取对数生长期后期的微生物菌液；
将所述微生物菌液进行稀释，并使用600nm波长的光吸收辅助控制菌浓度，获得定量浓度的均匀菌悬液；
将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液；其中，所述保护剂溶液中包括5g/ml～20g/ml的蛋白质、2g/ml～15g/ml的水溶性糖、0.5g/ml～10g/ml的谷氨酸钠和0g/ml～5g/ml的表面活性剂；
将所述菌悬液与所述保护剂溶液进行混合，得到混合液；其中，所述菌悬液与所述保护剂溶液的混合比例为3:7～1:9，所述混合液的菌浓度为102cfu/50μl～106cfu/50μl；
取定量的所述混合溶液，利用液氮将所述混合溶液冷冻成球，然后进行预冻；其中，所述预冻时间不少于2小时，预冻温度为-80℃～-20℃；
将所述预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到所述冷冻干燥小球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述将预冻后的小球进行真空冷冻干燥，得到所述冷冻干燥小球具体为：
将预冻后的小球在-50℃～-35℃保存4小时～6小时进行定型，使所述小球内的水分部分升华；
再将所述小球在-35℃～-20℃进行主干燥；其中，所述主干燥的时间为8小时～12小时；
将所述主干燥后的小球在10℃～25℃进行解析干燥；其中，所述解析干燥的时间为7小时～10小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述冷冻干燥小球在冻干机内进行真空密封保存；其中，所述保存温度为-80℃～-20℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述将保护剂与无菌水混合配成保护剂溶液之前，所述方法还包括：
将所述保护剂用伽马射线进行辐照灭菌。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白质为人血清白蛋白、胎牛血清、脱脂奶粉、全脂奶粉、卵清蛋白、酪蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性糖为蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、果糖、海藻糖、乳糖、半乳糖中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂为Triton WR-1339、甘油、Macrocyclon、吐温80中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述得到冷冻干燥小球的含菌量为50CFU/球～108CFU/球。
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