CN113528400B - 一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌及用途 - Google Patents
一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物菌种领域，涉及一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌及用途，发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）Ds45，保藏编号：CGMCC No.21667。可用于青贮饲料的发酵，发酵过程中还原青贮饲料中残留的六价铬离子为三价铬离子。有益效果：具有六价铬还原能力，能够将青贮饲料、土壤等中的六价铬离子还原为三价铬离子，是环保的处理方式，减少铬离子积累对家畜和人体产生的毒害。
Description
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，涉及具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌。
背景技术
自然环境情况下，种植土壤和灌溉水中常因环境污染而积累六价铬离子。六价铬离子具有强氧化性，被动物采食后会对动物造成不可逆的氧化损伤。并且由于六价铬难以经过一般生物代谢途径排出体外，其损伤会随动物采食被六价铬污染的饲草而逐渐积累。最终可经由食物链在人类体内积累，对人体造成损伤。
通过现有手段去除苜蓿等青贮饲料中残留的六价铬操作繁琐且成本较高，较长的处理时间影响了影响制作青贮饲料的过程，因此寻找一个合适的减少饲料中铬污染的方法具有重要的意义。
乳酸菌作为一种应用广泛的益生菌，其广泛作为食品、饮料和饲料的的添加剂。乳酸菌作为食品和饮品的调味剂，发酵饲料的添加剂等，在现代人类生产和生活中已是不可或缺的生物产品。大量研究表明，一些乳酸菌表现出较强的抗氧化的潜力。前人也曾报道过筛选出大量具有抗氧化能力的乳酸菌，并将他们应用于食品、保健和动物饲料添加等多种领域，取得了一定的成效。然而，抗氧化乳酸菌对环境中重金属铬的还原却鲜见报道。筛选出具备六价铬离子还原能力的菌株，是一个减少六价铬危害的有效方法。
发明内容
本发明的目的是提出一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌，同时提出其用途。
本发明的技术方案：一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌，该发酵乳杆菌为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）Ds45，保藏编号：CGMCC No.21667。
该发酵乳杆菌，可以用于青贮饲料的发酵，发酵过程中还原青贮饲料中残留的六价铬离子为三价铬离子，降低铬中毒的风险。可将该发酵乳杆菌制成菌剂，用常规的发酵乳杆菌的培养、保存方式加以保存、运输、添加使用，方便使用。
保藏信息：发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）Ds45，保藏编号：CGMCCNo.21667。保藏日期：2021年1月19日。保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。
本发明的有益效果：本发明的发酵乳杆菌具有六价铬还原能力，能够将青贮饲料、土壤等中的六价铬离子还原为三价铬离子。对于饲料而言，既保证基本的青贮饲料发酵质量，又有效减少青贮饲料中六价铬离子的残留，提高了青贮饲料在取用过程中的安全性。
三价铬离子是人体必需的微量元素，在肌体的糖代谢和脂代谢中发挥特殊作用，具有维持人体健康的重要作用。本发明的发酵乳杆菌能将高毒性的六价铬离子还原为对人体有益的三价铬离子，从而达到减少因铬离子积累对家畜和人体产生的毒害作用的目的。用该菌株处理六价铬污染是一种很环保的方式。
附图说明
图1是具有六价铬还原能力的乳酸菌的六价铬还原率图示；
图2是不同培养基菌株生长曲线；
图3是最小抑菌浓度的检测结果；
图4是不同培养时间的菌上清液对六价铬残留的影响。
具体实施方式
菌的获取：从申请人实验室菌库中筛选获得具有六价铬还原能力的菌，筛选出的具有六价铬还原能力的菌种分别编号，并在实验室冻存。
菌的培养方法：
乳酸细菌培养基（MRS）：蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，柠檬酸氢二铵2g，葡萄糖20 g，吐温80 1mL，乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.2-6.6。制法：将除琼脂外所有成分加入水中加热溶解，调 pH6.2～6.4，加入琼脂，121℃灭菌15 min，趁热倒平板。
磷酸缓冲液（PBS）：磷酸二氢钾0.24 g，磷酸氢二钾1.44 g，氯化钠8 g，氯化钾0.2 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2-7.4。制法：将上述成分混合，蒸馏水溶解后调pH，121℃灭菌15 min，冷却备用。
二苯胺基脲（DPC）：DPC粉末0.2 g，丙酮50 mL，去离子水50 mL。制法：将DPC粉末0.2 g用丙酮溶解后，去离子水定容到100 mL，现配现用（若DPC溶液颜色变深，则不能使用）。
将菌液20 uL接种到1000 uL的MRS培养基中，并在37℃静置培养8～12小时。将培养后的菌液置于高速离心机中，室温12000 rpm离心10 min，获得发酵上清液。该发酵上清液即具有六价铬还原能力。
菌种六价铬还原能力的验证：
配制含有重铬酸钾的PBS缓冲液：将配置的缓冲液121℃，15min高压灭菌后，将配置好的一定浓度的重铬酸钾溶液通过0.22 μm有机滤膜过滤后加入PBS缓冲液中，轻摇瓶身以使溶液混匀。
DPC显色剂配制：称取0.1 g DPC试剂粉末，溶解于25 mL丙酮。DPC粉末溶解完成后，用去离子水定容到50 mL。DPC见光和受热易分解，其粉末应置于棕色试剂瓶中，4℃保存。试验中使用的DPC溶液应该现配现用，若DPC溶液颜色变深，则不能使用。
取实验室菌库中具有六价铬还原能力的冻存菌种，使用MRS培养基活化3次。室温下离心（12000 rpm，10 min）。取上清液200 uL与配制好的重铬酸钾PBS溶液800 uL混合。37℃恒温培养箱中反应24 h，并使用DPC法检测六价铬离子的残留量。
从图1中可以看出，菌株13-7和Ds45发酵24h的上清液在0.2mM和0.4mM的六价铬还原试验中均表现出可观的还原能力。当六价铬浓度为0.2mM时，有13-7、19-5x-Ds45和am21的上清液六价铬还原率在50%以上，13-7、Ds45培养24h后，其上清液对0.2mM六价铬离子的还原率最高可达88%。进一步使用浓度为0.4mM 六价铬的溶液进行上清液还原性对比，此时仅有13-7和Ds45的还原率超过50%，其中13-7的上清液对0.4mM六价铬的还原率为54.5%，Ds45的发酵上清液对0.4mM六价铬的还原率为55%。由于该菌的还原基于上清液中的代谢产物，在实际应用中与当前多数以吸附作用为主来处理六价铬污染的乳酸菌具有不同的应用前景，也可以与具有吸附作用的乳酸菌联合使用，以达到更好的六价铬处理效果。因此选定这两株菌作为后续试验的菌株。
菌株13-7和Ds45的特性试验
MRS液体培养基：葡萄糖20g，牛肉膏10g，酵母粉5g，无水乙酸钠 5g，柠檬酸氢二铵2g，磷酸氢二钾 2g 七水合硫酸镁 0.58g，一水合硫酸锰 0.17g，聚山梨酸酯-80 1mL。加入1L 蒸馏水。
MRS 固体培养基：在MRS液体培养基的基础上，每1L液体培养基添加 15g 琼脂粉，121℃ 灭菌20min后，稍放置降温并倒入一次性培养皿中。配制好的固体培养基在超净台中倒置放置备用。
PBS缓冲液：BS缓冲液：磷酸二氢钾 0.24g，磷酸氢二钠 1.44g，氯化钠 8g，氯化钾0.2g。使用800 mL去离子水溶解上述粉末，并HCl调pH至7.4，再定容到1 L。
生理盐水：每100mL 蒸馏水中加入0.85g氯化钠，配制后121℃灭菌 20min。
含重铬酸钾的MRS液体培养基配制：将普通MRS液体培养基分装至蓝口瓶中，121℃灭菌20 min。在超净工作台中使用0.22 um的有机相滤膜将所需浓度的重铬酸钾溶液过滤后，添加到灭菌的MRS液体培养基中，轻轻摇匀，室温保存备用。
含重铬酸钾的MRS固体培养基配制：在普通MRS液体培养基的基础上，先将MRS培养基按照100 mL/瓶分装到蓝口瓶中，再在每个小瓶中加入1.5g琼脂粉，放入高压灭菌锅中灭菌121℃灭菌 20min。在等待灭菌的同时配制重铬酸钾梯度溶液。先按照100 mL的容积配置最高48mM的重铬酸钾溶液，然后依次按照1/2的梯度稀释12份。之后在超净工作间中使用0.22 um的无菌有机滤膜过滤，配制好的固体培养基在超净台中倒置放置备用。待灭菌完成后，将培养基稍微放置一段时间，待培养基降温至可握持瓶身的温度后，在超净工作间内加入不同浓度的重铬酸钾溶液，并倒平板。每个瓶培养基至少应制6个平板。
菌株生长曲线的测定：将菌株13-7和Ds45从-80℃冰箱中取出，划线培养24-48h，待平板上单菌落生长至合适的大小和密度后，观察平板上菌落形态是否一致，并在超净工作台将单菌落挑至1 mL MRS液体培养基中，过夜培养。
准备10 mL离心管若干，将过夜培养的菌株按照1%的接种量接种到5mL普通MRS培养基或含重铬酸钾的MRS培养基中。每一个检测的时间点单独使用试验组，检测后该管即可废弃。
由于乳酸菌生长前期到对数生长期结束前生长速度较快，因此前期的检测时间点设置更加密集，中后期的检测时间点设置相对松散。接种后的10 mL离心管应使用封口膜或胶带等封口，否则离心管盖可能因为乳酸菌生长时产生的气体物质产生的压强差而打开或密封不严，致使空气和其他其他杂菌进入管中，影响试验菌株生长，最终影响试验结果的准确性。
每次检测前需将分光光度计提前开启，预热约30min。每次倒入比色皿容积1/3-2/3的液体，使用600nm 检测吸收波长。未预热的分光光度计也可能导致试验结果出现偏差。每次向比色皿中添加样品时应使用蒸馏水清洗比色皿，并预先使用待测样品润洗比色皿，否则可能因为上一个样品残留或蒸馏水残留而影响比色结果。
菌株生长曲线测试结果如图2所示。将菌株按照一般方法划线活化后，在10 mL离心管中分批培养以检测菌株的生长曲线。为了检测菌株在培养基溶液中对六价铬的抗性，同时使用加入0.4mM 六价铬溶液的等体积MRS溶液，检测菌株在具有六价铬的MRS培养基中的生长曲线。基于细菌前期生长缓慢，进入对数生长期后生长速度较快，在经过对数生长期后菌株的增长即基本停止的特性，设置了前期较密集，后期较松散的检测时间点。根据菌株检测的生长曲线结果可知，在MRS培养基中添加0.2mM 的重铬酸钾不会影响菌株的正常生长能力，反而能少量提高菌株在对数生长期的生长速度。菌株在添加了重铬酸钾的MRS培养基中生长时，其达到对数生长期、进入稳定期及进入稳定期后的最终菌数均与未添加重铬酸钾的MRS培养基相同。
六价铬还原菌株最小抑菌浓度的测定：从-80℃冰箱取出菌株13-7和菌株Ds45并在固体培养基上划线活化，培养24-48h。挑单菌落到1 mL MRS液体培养基中培养6-12h，达到对数生长期后停止培养。将培养后的菌液在离心机中8000rpm离心2-5min，并在超净台中弃上清，用生理盐水重悬。此处也可使用MRS培养基重悬，但涂布后可能因为平板上残留的普通MRS培养基而导致菌株生长就较多，对试验结果造成影响。
通过分光光度计检测稀释调整菌数到108CFU/mL，调零时使用蒸馏水。在超净台中使用生理盐水梯度稀释105倍。每个平板使用移液枪滴加100μL 稀释后的菌液，并用玻璃涂布棒将菌液均匀涂开，直到固体培养基表面没有液体为止。每一个梯度每个菌做3-4个重复组，以避免在菌株生长过程中出现偶然情况影响试验结果。
使用事先配置好的梯度MRS培养基，将涂布完成的固体培养基用保鲜膜包裹后从超净间取出，放入37℃培养箱中培养48h后对培养皿中的单菌落进行计数，以最低的菌无法生长的重铬酸钾浓度作为该菌的最小抑菌浓度。
由图3可见，利用具有梯度浓度重铬酸钾的MRS固体培养基来检测两株试验菌株对六价铬的抗性，两株菌仅在1.5mM和6mM的六价铬浓度下生长情况由显著差异。菌株Ds45在12mM 的六价铬浓度下仍有一个单菌落生长，菌株13-7在同等浓度的六价铬下已经没有菌落生长。因此认为菌株Ds45的最小抑菌浓度为24mM六价铬，13-7的最小抑菌浓度为12mM六价铬。另外，当六价铬浓度低于0.75mM时，对照菌PA在平板上生长超过300个菌落，且较存在多个菌落生长在一起的情况，因此无法准确计数。根据图3可以看出，两株菌对六价铬均有较强的耐性，最高可以耐受12mM 的重铬酸钾浓度，即24mM 的六价铬离子。两株菌在生长过程中产生的代谢产物均已被验证具有一定的六价铬还原能力，因此即使在固体培养基中生长，但其代谢产物仍可以一定程度上，减轻培养基中的六价铬对菌体造成的损伤。且两株菌的生长活性较强，在铬离子浓度不高的平板中可以依托基础菌数迅速繁殖，并依靠自身对六价铬的还原能力，清理周围的六价铬，减弱培养基的毒性，以使得后续菌株能够更加正常的生长。而在含有较高浓度重铬酸钾的MRS培养基中，由于使用了生理盐水洗菌，菌体无法积累还原性物质，因此当六价铬浓度超过菌体本身的承受能力时，菌体即不再生长和繁殖。
菌株培养时间与上清液还原能力的关系的测定：从-80℃冰箱中取出菌株13-7和菌株Ds45，在MRS固体培养基上划线活化，培养24-48h后，挑单菌落到1 mL MRS液体培养基中，再重复活化两次，最后一次活化后在37℃培养箱中培养24h，在培养时间达到1、2、3、4、5、6、8、10、12、24h时取出样品，并使用高速离心机12000 rpm离心2-5min，在超净工作台内将100 μL的上清液加入900 μL提前配制好的PBS-重铬酸钾溶液中。放入37℃培养箱中，静置24h，并使用DPC法检测还原后溶液的六价铬残留。
由图4可见，两株菌均在培养24h后达到筛选时的理论还原率。两株菌的上清液所处理的六价铬溶液中六价铬的残留量整体趋势皆为逐渐下降，即随培养时间的增加，上清液对六价铬的还原能力逐渐增强。上清液的培养时间在3h内时，Ds45处理的溶液六价铬残留更高，当时间达到4h后，两者处理的上清液中六价铬残留没有显著差异，直到12h后13-7处理的溶液中六价铬残留高于Ds45。且在培养过程中，13-7于前3h，Ds45于前4h所处理溶液的六价铬残留量存在轻微上升趋势。
本发明具有六价铬离子还原能力的菌，也可用于食品工业和铬污染处理。具备作为益生菌添加剂，在饲料生产和食品添加中使用的潜力。可以将本菌加入需要发酵的食品中，如酸奶、酸菜中。还可以将具有六价铬离子还原能力的菌该制成菌剂，散播于铬污染的土壤或水体中，将高毒性六价铬离子还原为三价铬离子，降低铬污染的危害。
Claims (2)
1.一种具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum），其特征是：该菌为发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）Ds45，保藏编号：CGMCC No.21667。
2.一种含有权利要求1所述的具有六价铬离子还原能力的发酵乳杆菌的菌剂，用常规的发酵乳杆菌的培养、保存方式加以保存、运输、添加使用。
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