CN108998387B - 一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂及其应用，所述的乳酸菌组合制剂由植物乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌按一定比例组合制备而成，所述的乳酸菌组合制剂在甘蔗尾叶青贮饲料中的应用，即采用所述的乳酸菌组合制剂青贮甘蔗尾叶。本发明所提供的乳酸菌组合制剂在青贮甘蔗尾叶中的应用能有效改善甘蔗尾叶青贮的有氧稳定性，提高甘蔗尾叶青贮的干物质回收率，降低甘蔗尾叶青贮的氨态氮占总氮的比值和丁酸含量。

Description

一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂及其应用
技术领域
本发明属于青贮饲料制作技术领域，具体是一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂及其应用。
背景技术
广西是我国甘蔗主要种植区，冬季是甘蔗的收割期，有大量甘蔗尾叶可供利用，青贮是有效保存甘蔗尾叶饲料养分的贮存方式。
甘蔗尾叶的干物质含量为28.5％-36.60％，粗蛋白质含量为5.13％-5.97％，是一种中等质量的粗饲料。在广西，甘蔗的收割季从11月份一直持续到来年的4月份，正处于广西湿度比较大的时间段，因此，晒制甘蔗尾叶制成干草不现实，堆放又易造成霉变，焚烧不仅污染空气而且造成资源浪费，而青贮不仅能避免季节性甘蔗尾叶堆积带来的弊端，又可软化坚硬的甘蔗尾叶，提高动物适口性。
甘蔗尾叶自然青贮后外观评分较高，但是暴露空气后有氧稳定性较差，主要是由于自然青贮甘蔗尾叶饲料的氨态氮含量和丁酸含量较高，而氨态氮则代表了饲料中蛋白质和氨基酸的分解情况，氨态氮占总氮的比值越小，说明饲料营养价值保存的越好。
青贮饲料的干物质回收率是评价青贮饲料质量的重要指标，这个指标含量高就说明可有效地抑制有害微生物对青贮料中营养成分的消耗，较大程度地保留了营养物质，进一步改善了发酵品质。
通过添加乳酸菌青贮甘蔗尾叶可以在一定程度上降低甘蔗尾叶青贮饲料氨态氮占总氮的比值和丁酸含量，提高甘蔗尾叶青贮饲料干物质回收率，改善甘蔗尾叶青贮饲料暴露空气后有氧稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂及其应用，通过乳酸菌来提高甘蔗尾叶青贮品质，降低甘蔗尾叶青贮饲料的氨态氮占总氮比值和丁酸含量，提高甘蔗尾叶青贮饲料的干物质回收率，改善甘蔗尾叶青贮饲料暴露空气后的有氧稳定性。
本发明的技术方案是：一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂，所述的乳酸菌组合制剂由植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)组合而成，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018437；干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018435；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018438；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018436。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
所述乳酸菌均是筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中。
所述的乳酸菌组合制剂的各乳酸菌数量均达到106CFU/g。
所述的乳酸菌组合制剂的乳酸菌组合有以下形式：(1)植物乳杆菌+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌，(2)植物乳杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，(3)植物乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，(4)干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌。
所述的乳酸菌组合制剂的4种乳酸菌组合均为各乳酸菌取扩大培养的菌液10mL,按照体积等比例混合均匀。
在使用所述乳酸菌组合制剂进行甘蔗尾叶青贮前，需要将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮，且底部有白色沉淀物为止。
所述的新鲜甘蔗尾叶的原材料化学物质组成：干物质27.57％，粗蛋白质4.60％；中性洗涤纤维65.57％，酸性洗涤纤维34.66％，半纤维素29.26％，粗灰分6.33％，有机物93.67％。
所述的甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂在青贮甘蔗尾叶中的应用，采用添加由植物乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和干酪乳杆菌组成的乳酸菌制剂进行甘蔗尾叶青贮，添加的乳酸菌组合制剂的各乳酸菌数量均达到106CFU/g，青贮甘蔗尾原料中，植物乳杆菌数量达到3.85×106CFU/g，发酵乳杆菌数量达到2.60×106CFU/g，鼠李糖乳杆菌数量达到2.55×106CFU/g，干酪乳杆菌数量达到4.48×106CFU/g。
所述的甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂在青贮甘蔗尾叶中的应用，甘蔗尾叶青贮料的制作步骤如下，将新鲜甘蔗尾叶切短至1cm～4cm长度，将乳酸菌混合制剂均匀喷洒到新鲜甘蔗尾原料上，并立即在青贮罐或青贮窖或青贮壕中填充、压实，密封，密度达到450kg/m3，在平均环境温度为15～28℃条件下厌氧发酵，发酵时间为70天。
本发明的有益效果是：
1、以4种组合形式添加乳酸菌，任一组合形式的甘蔗尾叶青贮饲料未检测到丁酸含量，表明添加乳酸菌组合的甘蔗尾叶青贮发酵品质优于未添加乳酸菌的甘蔗尾叶青贮饲料。
2、添加本发明提供的4种乳酸菌组合的任一组合的甘蔗尾叶青贮饲料中氨态氮占总氮比值均低于未添加的，说明添加乳酸菌青贮能够降低青贮原料中粗蛋白被破坏分解的程度，改善甘蔗尾叶青贮饲料的发酵品质。
3、添加本发明提供的4种乳酸菌组合的任一组合的甘蔗尾叶青贮饲料的干物质回收率均高于未添加的，表明添加乳酸菌制剂可有效地抑制有害微生物对青贮料中营养成分的消耗，较大程度地保留了营养物质，进一步改善了发酵品质。
4、添加本发明提供的4种乳酸菌组合的任一组合的甘蔗尾叶青贮饲料中有氧稳定性均高于未添加的，表明本发明中提供的4种不同乳酸菌组合添加均能提高甘蔗尾青贮有氧稳定性，但提高效果不同。这可能与采用多种乳酸菌种联合青贮有关，多种乳酸菌之间产生了相互协同的作用效果不同，因而提高甘蔗尾叶青贮的有氧稳定性的效果略有差异。
5、所提供的乳酸菌组合制剂和甘蔗尾叶青贮饲料制作方法可降低甘蔗尾叶青贮饲料氨态氮占总氮比值、丁酸含量，提高甘蔗尾叶青贮饲料干物质回收率，改善甘蔗尾叶青贮饲料暴露空气后有氧稳定性的乳酸菌组合，解决了自然青贮甘蔗尾叶饲料的氨态氮占总氮比值和丁酸含量较高，干物质回收率低，有氧稳定性差等问题。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
生物材料的来源及记载出处。
本发明的新鲜甘蔗尾叶来源于广西大学农学院试验田，对甘蔗尾叶进行人工切割，切短长度为1～4cm。甘蔗品种为新台糖22号。
实施例1
本发明所述的一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂，乳酸菌组合有以下4种形式：(1)植物乳杆菌+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌，(2)植物乳杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，(3)植物乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，(4)干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌。
所用的乳酸菌组合制剂的4种乳酸菌组合，需要将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止。
所用的乳酸菌组合制剂的4种乳酸菌组合均为各乳酸菌取扩大培养的菌液10mL,按照体积等比例混合均匀。
所用的乳酸菌组合制剂中，需要保证青贮甘蔗尾叶原料中植物乳杆菌数量达到3.85×106CFU/g，发酵乳杆菌数量达到2.60×106CFU/g，鼠李糖乳杆菌数量达到2.55×106CFU/g，干酪乳杆菌数量达到4.48×106CFU/g。所用的乳酸菌均是筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018437；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018435；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018438；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018436。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
实施例2
采用本发明所述植物乳杆菌+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌组合制剂对新鲜甘蔗尾叶进行青贮制作观察其青贮品质
1试验材料
青贮原料：新鲜甘蔗尾叶来源于广西大学农学院试验田，对甘蔗尾进行人工切割，切短长度为1～4cm。品种：新台糖22号。青贮原料甘蔗尾叶的化学成分见表1。
表1甘蔗尾叶原材料化学成分(％)
Figure GDA0001852777260000041
菌种来源：植物乳杆菌、干酪乳杆菌和发酵乳杆菌均筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018437；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018435；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018438。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
培养基：MRS液体培养基(北京陆桥，货号CM 187)，用于3种乳酸杆菌的活化和扩大培养；MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)，用于3种乳酸杆菌的平板计数,乳酸菌数量达到106CFU/g。
2试验方法，包括如下步骤：
(1)试验菌种活化和扩大培养
将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止。
采用0.9×0.9cm一次性塑料无菌平板对接种菌液进行涂平板计数，乳酸菌数量达到106CFU/g。
(2)试验设计
对照组：:新鲜的甘蔗尾叶+100ml生理盐水
试验组：新鲜的甘蔗尾叶+植物乳杆菌+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+70ml生理盐水。
本试验中各试验组和对照组分别设置4个重复，每个重复以1200g新鲜甘蔗尾叶中，按照试验设计，取各菌种扩大培养液10ml，按照等体积比例混合均匀；以保证青贮甘蔗叶尾叶原料中，乳酸菌数量达到106CFU/g。
对照组和试验组乳酸菌计数结果如表2所示。
表2青贮处理甘蔗尾叶微生物添加剂的菌落单位(CFU/g)
Figure GDA0001852777260000051
(3)青贮制作
将切割好的甘蔗尾叶，每组按试验设计取菌液稀释到相应的生理盐水中，混匀后均匀喷洒到1200g甘蔗尾叶上，并装到的2.5L磨砂口带盖的广口玻璃瓶中，灌装密度达到450kg/m3。对照组只添加相应生理盐水。装满压实后，盖好对应的密封盖，并用封口膜再次缠绕密封，避光放置于室内青贮70d，室内平均环境温度15～28℃。
(4)常规营养成分的测定
a、常规营养成分指标：干物质(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、半纤维素(HC)、有机物(OM)和干物质回收率(DMR)。
b、干物质(DM)的测定
称取约400g样品，在恒温干燥器中105℃烘2h，然后将温度调至65℃烘干48h至恒重，自然冷却至室温后称重，计算测定样品中干物质的含量。将样品烘干后，粉碎，以进行常规营养成分的测定分析，参照杨胜(1993)的方法，仪器(电热恒温干燥器，博泰)。
c、粗蛋白(CP)的测定：参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(全自动凯氏定氮仪)。
d、中性洗涤纤维(NDF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
e、酸性洗涤纤维(ADF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
f、干物质回收率(DMR)
DMR＝(青贮后原料质量×青贮后干物质率)/装袋时原料质量×原料干物质率。
(5)青贮发酵产物的测定
发酵指标：pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。
样品准备：青贮的甘蔗尾叶开瓶以后将样品混合均匀，每瓶取35g样品，放入250mL广口瓶中，并添加150mL超纯水，置于4℃冰箱中，每个几小时摇匀一次；经过24h后，用4层纱布进行过滤并分装样液，分别用于pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)的测定。
pH测定
pH采用pH计测定，型号为DELTA 320。
乳酸测定
乳酸采用试剂盒进行测定，其厂家为南京建成，货号为A019-2。按照其操作说明书进行乳酸的测定。
氨态氮测定
氨态氮采用比色的法，使用紫外可见分光光度计进行测定，其厂家为济南海能，型号为I9。
(6)有氧稳定性的测定
青贮结束后，每瓶取样取约200g左右置于封口袋中压实，并用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，在青贮封口袋中心插入一个高灵敏高精度的水银温度计测定温度变化。处理好的封口袋都放置于背光的房间中，每8h记录一次室温和样品中心温度的变化，当青贮样品的中心温度超过环境温度2℃时，停止记录(Nishino等2005)。
3结果与分析
3.1添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶发酵品质的影响
由表3可以看出，与对照组相比，添加乳酸杆菌组合的试验组中，pH低于对照组。在本试验中，只在对照组中检测到含有丁酸，试验组中均未检测到丁酸。试验组的氨态氮/总氮比值低于对照组。
表3乳酸菌对甘蔗尾叶青贮发酵品质的影响(mmol.kg-1)
Figure GDA0001852777260000071
3.2添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶营养价值的影响
如表4所示，甘蔗尾叶青贮试验组粗蛋白含量与对照组相比，粗蛋白含量由对照组的4.94％提高到试验组的5.53％。与对照组相比，甘蔗尾叶青贮试验组干物质含量由对照组的22.44％提高到试验组的26.35％。甘蔗尾叶青贮干物质回收率由对照组的80.52％提高到试验组的97.01％。从表1与表4对比可知，与青贮原料中粗蛋白含量相比，本次试验组的甘蔗尾叶粗蛋白含量由未青贮前的4.60％提高到青贮后试验组的5.53％。
表4乳酸菌对甘蔗尾叶青贮常规营养成分的影响(％)
Figure GDA0001852777260000072
3.3添加乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响
由表5中可知，甘蔗尾叶青贮结束后，对照组有氧稳定性为61.33h,低于试验组的有氧稳定性84.00h。
表5乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响(h)
Figure GDA0001852777260000073
实施例3
采用本发明所述植物乳杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌组合制剂对新鲜甘蔗尾叶进行青贮制作观察其青贮品质
1试验材料
青贮原料：新鲜甘蔗尾叶来源于广西大学农学院试验田，对甘蔗尾叶进行人工切割，切短长度为1～4cm。品种：新台糖22号。青贮原料甘蔗尾叶的化学成分见表6。
表6甘蔗尾叶原材料化学成分(％)
Figure GDA0001852777260000081
菌种来源：植物乳杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018437；干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTC No:C M 2018435；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018436。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
培养基：MRS液体培养基(北京陆桥，货号CM 187)，用于3种乳酸杆菌的活化和扩大培养；MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)，用于3种乳酸杆菌的平板计数,乳酸菌数量达到106CFU/g。
2试验方法，包括如下步骤：
(1)试验菌种活化和扩大培养
将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止。
采用0.9×0.9cm一次性塑料无菌平板对接种菌液进行涂平板计数，乳酸菌数量达到106CFU/g。
(2)试验设计
对照组:新鲜的甘蔗尾叶+100ml生理盐水
试验组：新鲜的甘蔗尾叶+植物乳杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+70ml生理盐水。
本试验中各试验组和对照组分别设置4个重复，每个重复以1000g新鲜甘蔗尾叶中，按照试验设计，取各菌种扩大培养液10ml，按照等体积比例混合均匀；以保证青贮甘蔗尾叶原料中，乳酸菌数量达到106CFU/g。
对照组和试验组乳酸菌计数结果如表7所示。
表7青贮处理甘蔗尾叶微生物添加剂的菌落单位(CFU/g)
Figure GDA0001852777260000091
(3)青贮制作
将切割好的甘蔗尾叶，每组按试验设计取菌液稀释到相应的生理盐水中，混匀后均匀喷洒到1200g甘蔗尾叶上，并装到的2.5L磨砂口带盖的广口玻璃瓶中，灌装密度达到450kg/m3。对照组只添加相应生理盐水。装满压实后，盖好对应的密封盖，并用封口膜再次缠绕密封，避光放置于室内青贮70d，室内平均环境温度15～28℃。
(4)常规营养成分的测定
a、常规营养成分指标：干物质(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、半纤维素(HC)、有机物(OM)和干物质回收率(DMR)。
b、干物质(DM)的测定
称取约400g样品，在恒温干燥器中105℃烘2h，然后将温度调至65℃烘干48h至恒重，自然冷却至室温后称重，计算测定样品中干物质的含量。将样品烘干后，粉碎，以进行常规营养成分的测定分析，参照杨胜(1993)的方法，仪器(电热恒温干燥器，博泰)。
c、粗蛋白(CP)的测定：参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(全自动凯氏定氮仪)。
d、中性洗涤纤维(NDF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
e、酸性洗涤纤维(ADF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
f、干物质回收率(DMR)
DMR＝(青贮后原料质量×青贮后干物质率)/装袋时原料质量×原料干物质率。
(5)青贮发酵产物的测定
发酵指标：pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。
样品准备：青贮的甘蔗尾开瓶以后将样品混合均匀，每瓶取35g样品，放入250mL广口瓶中，并添加150mL超纯水，置于4℃冰箱中，每个几小时摇匀一次；经过24h后，用4层纱布进行过滤并分装样液，分别用于pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)的测定。
pH测定
pH采用pH计测定，型号为DELTA 320。
乳酸测定
乳酸采用试剂盒进行测定，其厂家为南京建成，货号为A019-2。按照其操作说明书进行乳酸的测定。
氨态氮测定
氨态氮采用比色的法，使用紫外可见分光光度计进行测定，其厂家为济南海能，型号为I9。
(6)有氧稳定性的测定
青贮结束后，每瓶取样取约200g左右置于封口袋中压实，并用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，在青贮封口袋中心插入一个高灵敏高精度的水银温度计测定温度变化。处理好的封口袋都放置于背光的房间中，每8h记录一次室温和样品中心温度的变化，当青贮样品的中心温度超过环境温度2℃时，停止记录(Nishino等2005)。
3结果与分析
3.1添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶发酵品质的影响
由表8可以看出只在对照组中检测到含有丁酸，试验组中未检测到丁酸。与对照组相比，试验组的乳酸/乙酸比值由对照组的1.09降低到试验组的0.83。与对照组相比，试验组氨态氮/总氮比值由对照组的1.95降低到试验组的1.43。
表8乳酸菌对甘蔗尾叶青贮发酵品质的影响(mmol.kg-1)
Figure GDA0001852777260000101
3.2添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶营养价值的影响
如表9所示，试验组粗蛋白含量与对照组相比，由对照组的4.94％提高到试验组的5.19％。在本次试验中，与对照组相比，试验组干物质含量由对照组的22.44％提高到25.35％。与对照组相比，试验组干物质回收率由对照组的80.52％提高到93.08％。从表6与表9对比数据可知，与未青贮甘蔗尾叶原料中粗蛋白含量4.60％相比，本次试验青贮后粗蛋白含量提高到5.19％。
表9乳酸菌对甘蔗尾叶青贮常规营养成分的影响(％)
Figure GDA0001852777260000111
3.3添加乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响
由表10中可知，甘蔗尾青贮结束后，对照组有氧稳定性为61.33h,低于试验组的有氧稳定性112.0h。
表10乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响(h)
Figure GDA0001852777260000112
实施例4
采用本发明所述植物乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌组合制剂对新鲜甘蔗尾叶进行青贮制作观察其青贮品质
1试验材料
青贮原料：新鲜甘蔗尾叶来源于广西大学农学院试验田，对甘蔗尾进行人工切割，切短长度为1～4cm。品种：新台糖22号。青贮原料甘蔗尾叶的化学成分见表11。
表11甘蔗尾叶原材料化学成分(％)
Figure GDA0001852777260000113
菌种来源：植物乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018437；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018438；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No:M 2018436。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
培养基：MRS液体培养基(北京陆桥，货号CM 187)，用于3种乳酸杆菌的活化和扩大培养；MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)，用于3种乳酸杆菌的平板计数。
2试验方法，包括如下步骤：
(1)试验菌种活化和扩大培养
将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止。
采用0.9×0.9cm一次性塑料无菌平板对接种菌液进行涂平板计数，乳酸菌数量达到106CFU/g。
(2)试验设计
对照组:新鲜的甘蔗尾叶+100ml生理盐水
试验组：新鲜的甘蔗尾叶+植物乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+70ml生理盐水。
本试验中各试验组和对照组分别设置4个重复，每个重复以1000g新鲜甘蔗尾叶中，按照试验设计，取各菌种扩大培养液10ml，按照等体积比例混合均匀；以保证青贮甘蔗尾叶原料中，乳酸菌数量达到106CFU/g。
对照组和试验组乳酸菌计数结果如表12所示。
表12青贮处理甘蔗尾叶微生物添加剂的菌落单位(CFU/g)
Figure GDA0001852777260000121
(3)青贮制作
将切割好的甘蔗尾叶，每组按试验设计取菌液稀释到相应的生理盐水中，混匀后均匀喷洒到1200g甘蔗尾叶上，并装到的2.5L磨砂口带盖的广口玻璃瓶中，灌装密度达到450kg/m3。对照组只添加相应生理盐水。装满压实后，盖好对应的密封盖，并用封口膜再次缠绕密封，避光放置于室内青贮70d，室内平均环境温度15～28℃。
(4)常规营养成分的测定
a、常规营养成分指标：干物质(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、半纤维素(HC)、有机物(OM)和干物质回收率(DMR)。
b、干物质(DM)的测定
称取约400g样品，在恒温干燥器中105℃烘2h，然后将温度调至65℃烘干48h至恒重，自然冷却至室温后称重，计算测定样品中干物质的含量。将样品烘干后，粉碎，以进行常规营养成分的测定分析，参照杨胜(1993)的方法，仪器(电热恒温干燥器，博泰)。
c、粗蛋白(CP)的测定：参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(全自动凯氏定氮仪)。
d、中性洗涤纤维(NDF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
e、酸性洗涤纤维(ADF)的测定:参照杨胜(1993)[77]的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
f、干物质回收率(DMR)
DMR＝(青贮后原料质量×青贮后干物质率)/装袋时原料质量×原料干物质率。
(5)发酵产物的测定
发酵指标：pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。
样品准备：青贮的甘蔗尾叶开瓶以后将样品混合均匀，每瓶取35g样品，放入250mL广口瓶中，并添加150mL超纯水，置于4℃冰箱中，每个几小时摇匀一次；经过24h后，用4层纱布进行过滤并分装样液，分别用于pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)的测定。
pH测定
pH采用pH计测定，型号为DELTA 320。
乳酸测定
乳酸采用试剂盒进行测定，其厂家为南京建成，货号为A019-2。按照其操作说明书进行乳酸的测定。
氨态氮测定
氨态氮采用比色的法，使用紫外可见分光光度计进行测定，其厂家为济南海能，型号为I9。
(6)有氧稳定性的测定
青贮结束后，每瓶取样取约200g左右置于封口袋中压实，并用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，在青贮封口袋中心插入一个高灵敏高精度的水银温度计测定温度变化。处理好的封口袋都放置于背光的房间中，每8h记录一次室温和样品中心温度的变化，当青贮样品的中心温度超过环境温度2℃时，停止记录(Nishino等2005)。
3结果与分析
3.1添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶发酵品质的影响
由表13可以看出，只在对照组中检测到含有丁酸，试验组中未检测到丁酸。与对照组相比，试验组中氨态氮/总氮比值有所降低。
表13乳酸菌对甘蔗尾叶青贮发酵品质的影响(mmol.kg-1)
Figure GDA0001852777260000141
3.2添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶营养价值的影响
如表14所示，试验组粗蛋白含量与对照组相比，由对照组的4.94％提高到试验组的5.63％。与对照组相比，试验组干物质回收率由对照组的80.52％提高到试验组的99.47％。
表14乳酸菌对甘蔗尾叶青贮常规营养成分的影响(％)
Figure GDA0001852777260000142
3.3添加乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响
由表15中可知，甘蔗尾叶青贮结束后，对照组有氧稳定性为61.33h,低于试验组的有氧稳定性98.67h。
表15乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响(h)
Figure GDA0001852777260000143
实施例5
采用本发明所述干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌组合制剂对新鲜甘蔗尾叶进行青贮制作观察其青贮品质
1试验材料
青贮原料：新鲜甘蔗尾叶来源于广西大学农学院试验田，对甘蔗尾进行人工切割，切短长度为1～4cm。品种：新台糖22号。青贮原料甘蔗尾叶的化学成分见表16。
表16甘蔗尾叶原材料化学成分(％)
Figure GDA0001852777260000151
菌种来源：干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌均筛选自天然青贮的甘蔗尾叶中，其中干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:M 2018435；发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:M 2018438；鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:M 2018436。保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
培养基：MRS液体培养基(北京陆桥，货号CM 187)，用于3种乳酸杆菌的活化和扩大培养；MRS固体培养基(MRS液体培养基中添加1.5％琼脂粉)，用于3种乳酸杆菌的平板计数,乳酸菌数量达到106CFU/g以上。
2试验方法，包括如下步骤：
(1)试验菌种活化和扩大培养
将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80℃甘油冻存管菌种进行活化，按3％接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止。
采用0.9×0.9cm一次性塑料无菌平板对接种菌液进行涂平板计数，乳酸菌数量达到106CFU/g。
(2)试验设计
对照组:新鲜的甘蔗尾叶+100ml生理盐水
试验组：新鲜的甘蔗尾叶+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌+70ml生理盐水。
本试验中各试验组和对照组分别设置4个重复，每个重复以1000g新鲜甘蔗尾叶中，按照试验设计，取各菌种扩大培养液10ml，按照等体积比例混合均匀；以保证青贮甘蔗尾叶原料中，乳酸菌数量达到106CFU/g。
对照组和试验组乳酸菌计数结果如表17所示。
表17青贮处理甘蔗尾叶微生物添加剂的菌落单位(CFU/g)
Figure GDA0001852777260000161
(3)青贮制作
将切割好的甘蔗尾叶，每组按试验设计取菌液稀释到相应的生理盐水中，混匀后均匀喷洒到1200g甘蔗尾叶上，并装到的2.5L磨砂口带盖的广口玻璃瓶中，灌装密度达到450kg/m3。对照组只添加相应生理盐水。装满压实后，盖好对应的密封盖，并用封口膜再次缠绕密封，避光放置于室内青贮70d，室内平均环境温度15～28℃。
(4)常规营养成分的测定
a、常规营养成分指标：干物质(DM)、粗蛋白(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、粗灰分(Ash)、半纤维素(HC)、有机物(OM)和干物质回收率(DMR)。
b、干物质(DM)的测定
称取约400g样品，在恒温干燥器中105℃烘2h，然后将温度调至65℃烘干48h至恒重，自然冷却至室温后称重，计算测定样品中干物质的含量。将样品烘干后，粉碎，以进行常规营养成分的测定分析，参照杨胜(1993)的方法，仪器(电热恒温干燥器，博泰)。
c、粗蛋白(CP)的测定：参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(全自动凯氏定氮仪)。
d、中性洗涤纤维(NDF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
e、酸性洗涤纤维(ADF)的测定:参照杨胜(1993)的方法测定，仪器(FibertecTM8000，仪器序列号：91788112)。
f、干物质回收率(DMR)
DMR＝(青贮后原料质量×青贮后干物质率)/装袋时原料质量×原料干物质率。
(5)青贮发酵产物的测定
发酵指标：pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮。
样品准备：青贮的甘蔗尾开瓶以后将样品混合均匀，每瓶取35g样品，放入250mL广口瓶中，并添加150mL超纯水，置于4℃冰箱中，每个几小时摇匀一次；经过24h后，用4层纱布进行过滤并分装样液，分别用于pH、乳酸、氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)的测定。
pH测定
pH采用pH计测定，型号为DELTA 320。
乳酸测定
乳酸采用试剂盒进行测定，其厂家为南京建成，货号为A019-2。按照其操作说明书进行乳酸的测定。
氨态氮测定
氨态氮采用比色的法，使用紫外可见分光光度计进行测定，其厂家为济南海能，型号为I9。
(6)有氧稳定性的测定
青贮结束后，每瓶取样取约200g左右置于封口袋中压实，并用牙签扎数个小孔，再套上一个宽松不封口的塑料袋，防止交叉污染和减少水分损失，在青贮封口袋中心插入一个高灵敏高精度的水银温度计测定温度变化。处理好的封口袋都放置于背光的房间中，每8h记录一次室温和样品中心温度的变化，当青贮样品的中心温度超过环境温度2℃时，停止记录(Nishino等2005)。
(7)数据分析
试验所得数据先用EXCEL软件处理，再用SPSS 22.0软件中的ANOVA过程进行单因子方差分析，差异显著性以P<0.05为判断标准，数据采用Duncan氏法进行多重比较检验；数据均采用平均值±标准误来表示。
3结果与分析
3.1添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶发酵品质的影响
由表18可以看出，与对照组相比，添加乳酸杆菌组合的试验组中，pH较低。在本试验中，只在对照组中检测到含有丁酸，试验组中未检测到丁酸。与对照组相比，试验组中氨态氮/总氮比值为1.45，低于对照组的1.95。
表18乳酸菌对甘蔗尾叶青贮发酵品质的影响(mmol.kg-1)
Figure GDA0001852777260000171
3.2添加乳酸菌对青贮甘蔗尾叶营养价值的影响
如表19所示，与对照组相比，试验组间干物质回收率由对照组的80.52％提高到95.60％。
表19乳酸菌对甘蔗尾叶青贮常规营养成分的影响(％)
Figure GDA0001852777260000181
3.3添加乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响
由表20中可知，甘蔗尾叶青贮结束后，对照组有氧稳定性61.33h,低于试验组的有氧稳定性80.00h。
表20乳酸菌对甘蔗尾叶青贮有氧稳定性的影响(h)
Figure GDA0001852777260000182
应当说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂，其特征在于，所述的乳酸菌组合制剂的乳酸菌组合有以下形式：（1）植物乳杆菌+干酪乳杆菌+发酵乳杆菌，（2）植物乳杆菌+干酪乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，（3）植物乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌，（4）干酪乳杆菌+发酵乳杆菌+鼠李糖乳杆菌；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018437；干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018435；发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018438；鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）于2018年7月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2018436；
所用的乳酸菌组合制剂的4种乳酸菌组合，需要将试验菌种进行活化和扩大培养，将-80 ℃甘油冻存管菌种进行活化，按3 %接种量转入MRS液体培养基，植物乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌培养温度均为37 ℃，静态恒温培养24h-48h，直至菌液培养有白色絮状漂浮物，且底部有白色沉淀物为止；
所用的乳酸菌组合制剂的4种乳酸菌组合均为各乳酸菌取扩大培养的菌液10mL,按照体积等比例混合均匀；
所用的乳酸菌组合制剂中，需要保证青贮甘蔗尾叶原料中植物乳杆菌数量达到3.85×106 CFU/g，发酵乳杆菌数量达到2.60×106CFU/g，鼠李糖乳杆菌数量达到2.55×106CFU/g，干酪乳杆菌数量达到4.48×106CFU/g。
2.根据权利要求1所述的甘蔗尾叶青贮的乳酸菌组合制剂在青贮甘蔗尾叶中的应用，其特征在于：甘蔗尾叶青贮料的制作步骤如下，将新鲜甘蔗尾叶切短至1cm～4cm长度，将乳酸菌混合制剂均匀喷洒到新鲜甘蔗尾原料上，并立即在青贮罐或青贮窖或青贮壕中填充、压实，密封，密度达到450kg/m3，在平均环境温度为15～28℃条件下厌氧发酵，发酵时间为70天。
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