CN113122469A - 一种活细胞在线检测仪校准用细菌标准物质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于校准活细胞在线检测仪的细菌标准物质。该标准物质采用免疫荧光流式分析法和平板计数法两种独立的类球红细菌的定量检测方法进行定值。经实验证明，该标准物质量值精准，且具有良好的均匀性和稳定性，在用于校准活细胞在线检测仪中不仅确保活细胞在线检测仪的准确可靠，而且使用方便，节省人力和时间。所述标准物质为活细胞在线检测仪的校准奠定了计量基础，也为发酵过程中活细胞实时快速准确测定提供技术支撑。
Description
技术领域：
本发明属于工业微生物检测领域，涉及一种活细胞在线检测仪校准用细菌标准物质及其制备方法。
技术背景：
在利用微生物进行工业生产的过程中，常常需要测量微生物浓度以及活性。比如，发酵过程中，对发酵菌的活菌数进行实时定量检测，可以在线(即在生产过程中)及时评估产品的质量、数量和发酵时间温度等发酵条件，便于及时调整各种生产参数。
微生物的在线监测是用活细胞在线检测仪完成的。在实际应用过程中因受培养环境以及微生物代谢产物的影响，活细胞在线检测仪的测量值与生产实际中的活菌数往往存在一定的偏差。因此需要对活菌数在线检测装置进行校准，从而能够准确测量生产过程中的微生物数量。
活菌数在线检测装置的校准过程中，校准人员往往只能根据工作经验配制指示菌悬液，很难保证每个批次的细菌悬液量值完全一致。此外，菌悬液配制过程较为繁琐，需要花费大量人力、物力和时间，从而大大影响了评价结果的准确性和评价工作的效率。
因此，为保证发酵过程中微生物定量的准确性和及时性，非常有必要制备一种用于校准活细胞在线检测仪的细菌标准物质。
建立一种细菌标准物质，关键在于找到能够精确测量细菌浓度的定值方法。
目前，发酵过程中微生物的定量检测方法主要有荧光定量PCR法、细胞干重法以及光密度法等。然而，荧光定量PCR法不能区分活菌和死菌的DNA，光密度法测量时会受到菌液中培养基成分的影响，细胞干重法的测定不仅不能区分死活菌，如果培养基有不溶性杂质时，检测结果会受到的影响。因此，这三种方法都无法准确的识别和测量活菌浓度。
平板计数法是细菌准确检测的金标准，也是我国测定细菌总数的国家标准。然而，不同细菌的方法技术参数不同，对于适用于校准活细胞在线检测仪的标准物质的细菌，需要对其平板计数法进行优化，从而提高平板计数法对活菌数检测的准确性，提高其检测效率。
流式分析仪以其快速针对单个细菌进行多参数定量和定性分析的特点，已广泛应用于细菌的常规工作和微生物学研究中。它采用特异性免疫荧光抗体标记细菌，并辅以膜选择通透性荧光探针对类球红细菌死菌进行标记，以区分死菌和活菌，通过计数不同荧光信号，直接获得细菌活菌的浓度。流式分析技术具有独特的高通量、高灵敏度以及高分辨率等优点，能实现死亡细菌或活性细菌的绝对定量检测。
因此，平板计数法和流式分析法有望精确测量所述标准物质的细菌浓度的定值方法。为了解决发酵过程中微生物的定量检测准确度不高，不能满足活细胞在线检测仪校准的问题，首先需要对上述平板计数法和流式分析法进行改进，才能制备出可以用于校准活细胞在线检测仪的细菌标准物质。
发明内容：
本发明的总目的是制备一种可以用于校准活细胞在线检测仪的细菌标准物质。
具体地，本发明有如下目的：
第一目的是提供一种类球红细菌标准物质；
第二目的是提供类球红细菌标准物质的制备方法，主要是定值方法，即采用两种可靠的方法进行定值，快速准确确定标准物质中类球红细菌活菌数。
第三目的是提供类球红细菌标准物质在活细胞在线检测仪校准中的应用。
本发明提供了一种可以用于校准活细胞在线检测仪的细菌标准物质。通过建立两种独立的类球红细菌的定量检测方法进行标准物质定值。两种方法互相验证，证实本发明得到的标准物质量值非常准确。
本方法具有二个技术关键点：
一是如何提高类球红细菌平板计数法的准确性；二是如何建立基于流式分析法的快速精准定量类球红细菌活菌数；
针对上述问题，本发明人进行如下工作：
1、本发明的第一方面，提供一种准确检测类球红细菌标准物质活菌数方法，本发明对类球红细菌的平板计数法进行优化，最终得到如下技术参数：
1)接种方式：涂布接种；
2)接种体积：0.05mL；
3)使用营养琼脂培养基进行培养；
4)培养时间为58～60h，培养温度是32℃。
且类球红细菌在营养琼脂培养基的菌落特征是：凸起，表面光滑，呈圆形，产生红色色素。
在一个优选例中，所述类球红细菌标准物质的平板计数方法，具体操作如下：
对类球红细菌的平板计数法进行优化，提高计数结果的准确性，所述类球红细菌平板计数法，特征是：
1)对待测菌液进行离心，用PBS重悬后再进行10倍系列稀释，得到不同稀释度的样品匀液；
2)选取上述1～6个稀释度的样品匀液，进行接种培养，接种方式是涂布接种和倾注接种，优选的接种方式是涂布接种；每个稀释度的样品匀液在平板的上样体积是0.025～1mL，优选的上样体积是0.05mL；接种的培养基是营养琼脂培养基、异养细菌培养基、平板计数培养基、LB培养基、琼脂平板培养基，优选的培养基是营养琼脂培养基；
3)将平板置于培养箱进行培养，培养温度分别是28℃、30℃、32℃、37℃，优选的培养温度是32℃。
所述平板的制备方法如下：先将培养基各成分煮沸使其溶解，然后于121℃高压灭菌15min。营养琼脂培养基组成为：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，蔗糖10.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL；异养细菌培养基组成为：胰蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，硫酸镁0.2g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1000mL；平板计数琼脂组成为：胰蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL；LB固体培养基组成为：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL；琼脂平板培养基组成为：葡萄糖18.0g，酵母粉4.5g，谷氨酸钠2.0g，硫酸铵5.25g、硫酸镁8.75g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁1.2g，氯化钠4.2g，琼脂粉20.0g，蒸馏水1000mL。
选取类球红细菌菌落，计数典型菌落数，并记录稀释因子，活菌浓度用公式①计算：
式中，C为类球红细菌活菌浓度，CFU/mL；N为平板上类球红细菌典型菌落的总数，CFU；d为稀释因子，无量纲；v为平板上类球红细菌匀液的接种体积，mL；
用于计数的平板，选择有典型特征的类球红细菌菌落，且菌落数在30CFU至300CFU之间的平板，计数该稀释度平板上的典型菌落数，结果以活菌浓度(CFU/mL)表示。
所述有典型特征的类球红细菌菌落特征是：凸起，表面光滑，呈圆形，产生红色色素。
类球红细菌的营养琼脂平板涂布法，特征是：
1)将待测类球红细菌菌株样品中加入无菌的磷酸盐缓冲液作为稀释液进行复水溶解，然后再进行10倍系列稀释，得到不同稀释度的样品匀液；
2)选取上述1～6个稀释度的样品匀液，每个稀释度的样品匀液在平板的上样体积是0.05mL；
3)将平板置于32℃±1℃温度下培养。
进行10倍系列稀释是第一步制成1：10的稀释液S1，再用S1制成1:10的稀释液S2…，可根据需要多次稀释，得到不同稀释度的稀释液S2、S3、S4、…Sn。
所述接种于营养琼脂平板上，是涂布整个平板，但不触及平板边缘。因类球红细菌涂布不均匀会出现粘连成片的情况，影响计数结果的准确性，甚至无法计数。
所述涂布时，平板表面的样品液体应全部吸收，每个稀释液至少重复3次。
所述培养方法是，涂布好的平板在室温放置15min后，再将其倒置于培养箱，在32℃±1℃温度下培养48h至60h。
营养琼脂培养基组成为：牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，蔗糖10.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL。
通过重复性验证和复现性验证实验证明类球红细菌平板计数法具有良好的重复性和准确性。
2、本发明的第二方面，提供一种快速准确定量检测类球红细菌标准物质活菌数的方法，所述方法是免疫荧光流式分析法。
所述免疫荧光流式分析法是使用特异性免疫荧光探针对细菌进行标记，以识别细菌；使用膜选择通透性荧光探针对细菌死菌进行标记，以区分死菌和活菌；再用流式分析仪进行检测，通过计数不同荧光信号，获得细菌活菌浓度。
所述特异性免疫荧光探针是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的类球红细菌抗体；所述膜选择通透性荧光探针是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料。
在另一优选例中，所述类球红细菌标准物质，其免疫荧光流式分析法具体操作如下：
将待测的类球红细菌标准物质加入无菌的磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解，采用了偶联有绿色荧光染料的类球红细菌的抗体，对类球红细菌进行特异性荧光标记。采用了具有膜选择通透性的红色荧光染料，对死亡的类球红细菌进行荧光标记。
类球红细菌的免疫荧光流式分析法，特征是：采用荧光双标记类球红细菌，再进行流式细胞仪检测；通过计数不同荧光信号，直接获得类球红细菌活菌的浓度。
所述荧光双标记，是进行特异性免疫荧光抗体标记，并辅以膜选择通透性荧光染料标记区分死菌和活菌。
所述免疫荧光抗体是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的类球红细菌单克隆抗体，可以特异性标记鉴定特异性标记类球红细菌；
膜选择通透性荧光探针是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料，可以标记死的类球红细菌。
所述区分死菌和活菌，方法如下：
采用上述绿色荧光染料偶联的抗体对类球红细菌进行特异性标记，再采用上述膜选择通透性荧光探针将死亡的细菌进行标记，最后通过流式分析仪的荧光通道进行检测。
比如，可以在纯化的菌液中加入偶联有异硫氰酸荧光素的类球红细菌单克隆抗体(FITC-mAb)和碘化丙啶(PI)，混匀后孵育。
如果仅检测到绿色荧光，则判定为检测到的细菌是类球红细菌活菌；如果同时检测到红色和绿色两种荧光，则判定为检测到的细菌是类球红细菌死菌；如果未检测到绿色荧光，则判定为不存在类球红细菌。
所以，通过上述方法，即可完成类球红细菌活菌的定量检测。
所述流式分析仪检测：检测参数设定如下：激发光分别为450～500nm，分析速度为1～15μL/min，检测时间为15～300s，通过双荧光通道，分析计算类球红细菌活菌浓度。
所述分析计算，按本领域常规方法，通常首先通过流式分析仪得出类球红细菌活菌个数和分析样品体积，从而计算得出流式分析仪检测出的类球红细菌浓度。
3、本发明的第三方面，提供一种用于校准活细胞在线检测仪的标准物质，其组成是含指示菌菌体和菌体保护剂的冻干物；
所述菌体保护剂，其原料各成分的质量体积百分比为：
脱脂奶粉5～15％、海藻糖1～5％、谷氨酸钠1～10％、葡萄糖1～10％、乙酸钠1～10％、甘油5～15％。
所述标准物质，其制备方法的特征是，
将免疫荧光流式分析法作为初步判定细菌浓度的方法，然后基于其检测的活菌值，配制合适的浓度，最后将菌液分装于西林瓶中；将分装好的菌液于-70℃下预冻4h后冻干，得到所述标准物质。
所述的制备方法，制备得到的标准物质于-20℃下保存。
在另一个优选例中，所述的标准物质是类球红细菌标准物质。
所述的类球红细菌标准物质菌体保护剂原料各成分的质量体积百分比为脱脂奶粉5～15％、海藻糖1～5％、谷氨酸钠1～10％、葡萄糖1～10％、乙酸钠1～10％、甘油5～15％。冻干保护剂用磷酸盐缓冲液溶解；且保护剂和磷酸盐缓冲液均需要灭菌；灭菌方法为过滤除菌或高压灭菌；比如，冷冻干燥保护剂经过0.22μm滤膜过滤除菌，磷酸盐缓冲液采用高温高压灭菌121℃，20min。
挑取类球红细菌单菌落于已高压灭菌的种子培养基中，32℃±1℃下，200rpm摇床培养32h后，用高速冷冻离心机离心收集菌体，用生理盐水稀释至1013级，并使用免疫荧光流式分析法测量类球红细菌精确浓度，根据浓度精确计算，将保护剂加入菌液中混匀，用移液器分装10mL至棕色西林瓶中。将制备好的样品于-70℃下预冻4h后冻干。冻干采用的参数主要为冷阱温度-50℃，冻干温度-40℃，隔板最终温度25℃，冻干压力0.037mbar。
取3份冻干前类球红细菌与冻干保护剂的混合液，每份各30mL，采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。随即取3个单元类球红细菌冻干标准物质，用30mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将类球红细菌冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。冻干存活率(freeze-drying viability,FDV)计算公式：
式中，FDV为类球红细菌冻干存活率；C1为冻干前类球红细菌活菌浓度；C2为冻干后类球红细菌活菌浓度。
每批次至少抽取9个单元的标准物质进行定值实验。每个单元均按照以下步骤完成实验：用30mL磷酸盐缓冲溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的类球红细菌活菌浓度范围进行估算，使用流式分析法和平板计数法进行测量，结果以活菌浓度(CFU/mL)表示。
制备好的标准物质于-20℃下保存。
4、本发明的第四方面，提供类球红细菌标准物质在活细胞在线检测仪校准中的应用，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)将类球红细菌标准物质加入无菌磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解。
2)通过活细胞在线检测仪测定类球红细菌标准物质活菌数的电容值；
3)将活细胞在线检测仪检测的电容值与类球红细菌标准物质活菌数进行线性拟合。
4)选择活细胞在线检测仪测试浓度范围内的一种或几种浓度细菌标准物质作为测试目标物，评估活细胞在线检测仪准确性。
在另一优选例中，所述类球红细菌标准物质在活细胞在线检测仪校准中的应用，具体操作如下：
将待测的类球红细菌标准物质加入无菌的磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解。通过免疫荧光流式分析法对不同浓度的标准物质活菌数进行检测，同时进行电容值的测定。
采用活细胞在线检测仪对标准物质活菌数的电容值进行测定，所述方法包括：
1)利用活细胞在线检测仪对无菌磷酸盐缓冲溶液的电容值进行测定并记录电容值A0；
2)利用活细胞在线检测仪对不同稀释度标准物质菌液的电容值进行测定并记录电容值A1；
3)以细菌的电容值为A2；以式②获得细菌的电容值：
A2＝A1-A0 ②
利用活细胞在线检测仪对不同浓度标准物质菌液的电容值进行测定时，需要使检测液的细菌浓度分布均匀。
将活细胞在线检测仪检测标准物质菌液的值与标准物质的检测结果结合，待测样品中类球红细菌活菌浓度按公式③计算：
Y＝3.9111X+5.8337 ③
式中：
Y为免疫荧光流式分析法检测出的类球红细菌浓度，Log CFU/mL；
X为待测样品中类球红细菌的电容值，pF/cm。
本发明具有以下创新点：
1、建立了两种独立的类球红细菌的定量检测方法
两种方法互相验证，证实本发明得到的标准物质量值准确；
1)建立了类球红细菌平板计数法。通过对接种方式、接种量、培养基种类以及培养温度进行优化，得到了最适宜平板计数法，保证了最终平板计数结果的准确性；
2)建立了类球红细菌免疫荧光流式分析法。使用特异性免疫荧光探针对细菌进行标记，以识别细菌；使用膜选择通透性荧光探针对细菌死菌进行标记，以区分死菌和活菌；再用流式分析仪进行检测，通过计数不同荧光信号，获得细菌活菌浓度；
2、研制了有效的保护剂
制备的细菌标准物质在-20℃下可长期储存，有效降低细菌在冷冻干燥过程中的死亡率，且便于运输。
3、建立了一种活细胞在线检测仪的校准方法
通过使用类球红细菌标准物质对活细胞在线检测仪检测的电容值进行赋值，将活细胞在线检测仪检测的电容值与类球红细菌标准物质的活菌数进行线性拟合。
本发明的优点：
1、定值准确，可靠性高
标准物质量值精准，且具有良好的均匀性和稳定性，符合仪器校准工作的要求；
2、操作便捷
该标准物质使用方便：通过PBS复溶后，即可使用。避免了每次现场测试评价前，人工配制指示菌匀液耗时和操作繁琐的缺点。
附图说明
图1是实施例2中免疫荧光流式分析法检测不同死活菌浓度比例的类球红细菌的检测结果；
图2是实施例3中类球红细菌免疫荧光流式分析法检测结果与平板计数法检测结果的线性关系；
图3是实施例4中营养琼脂平板上培养生长的类球红细菌典型菌落形态；
图4是实施例4中类球红细菌在不同培养基上的生长情况；
图5是实施例4中类球红细菌平板计数法优化前后检测效果的比较；
图6是实施例9中类球红细菌电容值与活菌数的线性关系。
具体实施方式
下面以类球红细菌为具体实施方式并结合附图对本发明作进一步详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。
以下实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中的条件，或者按照制造厂商的建议条件。实施例中涉及的菌株均属于现有技术，本领域的技术人员可很容易从公开商业渠道获得。
以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量标书，表明在不改动基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。
实施例1类球红细菌免疫荧光流式分析法的特异性
一、材料与方法
1.类球红细菌，编号GJ15；对照菌株，见表1。均购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
2.对上述所有菌株进行复壮与扩增，并稀释至适宜浓度(大约106CFU/mL)。
3.将FITC-mAb(最终浓度为2μg/mL)分别加入上述菌液，避光孵育15min。然后用流式分析仪进行检测。
二、实验结果
将类球红细菌单克隆抗体与不同菌株的菌液进行反应，然后用流式分析仪进行检测其特异性，结果如表1所示，仅类球红细菌检测到了绿色荧光，表明类球红细菌单克隆抗体具有良好的特异性。同时也表明免疫荧光流式分析法具有特异性强的优点。
表1类球红细菌单克隆抗体的特异性实验结果
实施例2类球红细菌死活菌的检测
一、材料与方法
1.将类球红细菌的标准物质加入无菌磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解，吸取1mL活菌菌液，加入异丙醇(最终浓度70％)处理30min。之后离心弃上清，菌泥使用PBS重悬，得到死菌菌液。
2.将类球红细菌死活菌菌液以不同的体积比混合(0/10，3/7，5/5，7/3，10/0)。然后用流式细胞仪检测样品。
二、实验结果
将不同浓度比的类球红细菌死活菌混合，并且用流式分析仪进行检测，所得结果如图1所示。结果表明，流式检测的类球红细菌死活菌的比例值与实际值十分接近，说明免疫荧光流式分析法可以准确定量检测液体中的类球红细菌死活菌。
实施例3免疫荧光流式分析法与平板计数法检测类球红细菌的对比
一、材料与方法
1.将待测的类球红细菌标准物质加入无菌的磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解，得到不同浓度的标准物质菌液。
2.分别采用免疫荧光流式分析法和平板计数法对不同浓度的标准物质菌液进行定量检测，分析免疫荧光流式分析法的线性。
二、实验结果
对不同浓度的标准物质菌液采用免疫荧光流式分析法和平板计数法进行检测。结果显示(表2)，类球红细菌的浓度在3.39×104～1.06×108CFU/mL测量范围内，本发明方法与平板计数法检测结果基本一致。当类球红细菌的浓度大于108CFU/mL时，由于流式分析仪自身的限制，超出其检测上限。当类球红细菌的浓度小于104CFU/mL时，流式分析结果与平板计数法偏差较大。将菌浓度在104～108CFU/mL的检测结果，绘制成标准曲线，如图2所示，流式检测法与平板计数法之间线性良好(R2＝0.998)。实验结果表明，流式检测法对类球红细菌标准物质的检测具有良好的准确性。
表2流式分析方法与平板计数法检测类球红细菌的结果
实施例4类球红细菌平板计数法的优化
一、材料和方法
1、类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)(菌种编号GJ15)由华东理工大学国家生化工程技术中心提供；分别按照营养琼脂培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉3.0g，蔗糖10.0g，琼脂粉15.0g，蒸馏水1000mL)、异养细菌培养基(胰蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，硫酸镁0.2g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾1.0g，葡萄糖0.5g，蒸馏水1000mL)、平板计数琼脂(胰蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，葡萄糖1.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL)、LB固体培养基(胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1000mL)、琼脂平板培养基(葡萄糖18g，酵母粉4.5g，谷氨酸钠2.0g，硫酸铵5.25g，硫酸镁8.75g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁1.2g，氯化钠4.2g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL)、琼脂平板培养基(葡萄糖18.0g，酵母粉4.5g，谷氨酸钠2.0g，硫酸铵5.25g，硫酸镁8.75g，磷酸二氢钾1.5g，硫酸亚铁1.2g，氯化钠4.2g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL)组分配制培养基，按照种子培养基(硫酸铵3.5g，酵母提取物2.0g，葡萄糖10.0g，玉米浆粉0.75g，氯化钠2.0g，磷酸氢二钾0.75g，磷酸二氢钾0.75g，硫酸亚铁0.1g，硫酸镁0.3g，烟酸1.0g，生物素1.0g，蒸馏水1000mL，最终用10g/L NaOH调pH为6.1～6.3)的组分配制增菌液，煮沸溶解，调节pH 7.2±0.2，然后于121℃高压灭菌15min，使用前加热溶化琼脂。
2、将类球红细菌菌株划线接种于琼脂平板培养基，32℃条件下倒置培养60h，培养后用无菌接种环挑取单菌落，接种于装有100mL种子培养基的锥形瓶中，32℃±1℃摇床培养35h，取1.5mL菌液离心10min，弃去上清液，底部沉淀用1.5mL PBS重悬，再用PBS将重悬后的菌液进行梯度稀释。
3、平板计数法接种方式的选择与接种体积的优化
涂布平板计数法选择适宜稀释倍数的菌悬液，用移液器分别取5个不同体积(25μL、50μL、100μL、200μL、300μL)的菌液接种到制备好的LB培养基上，用无菌L棒涂布涂匀，注意不要触及平板边缘。每个接种体积分别进行6次重复，涂布后的平板在32℃条件下倒置培养60h，然后对平板上的菌落进行计数；倾注平板计数法选择适宜稀释倍数的菌悬液，用移液器分别取4个不同体积(0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL)菌液接种于无菌的空白平板中。随后将高压灭菌的计数培养基冷却至50℃左右，倾注15mL LB培养基至接种有菌液的平板中，并摇晃平板使其充分混匀，每个接种体积分别进行6次重复。待平板凝固后在32℃条件下倒置培养60h，然后对平板上的类球红细菌典型菌落(图3)进行计数。
4、平板计数法培养基的选择
对类球红细菌在营养琼脂培养基、异养细菌培养基、平板计数培养基、LB培养基、琼脂平板培养基的菌落数进行研究。选择适宜稀释倍数的菌悬液，分别吸取50μL菌液采用涂布平板计数法接种于不同的培养基平板。每种培养基进行6次重复。涂布后的平板在32℃条件下倒置培养60h，然后对平板上的菌落进行计数。
5、平板计数法培养温度的探究
将平板分别倒置于28℃、30℃、32℃、37℃条件下进行细菌计数，考察环境温度对细菌数量的影响。采用涂布平板计数法分别将50μL适宜稀释倍数的菌悬液接种于24个营养琼脂培养基平板，将24个平板分为4组，分别在4个温度下倒置培养60h，然后对平板上的菌落进行计数。
6、平板计数法优化前后检测效果的比较
韩庆莉等人采用涂布平板计数法，将100μL类球红细菌菌液接种于LB培养基平板，在32℃下进行平板计数。本发明建立的平板计数法的接种方式为涂布接种，接种体积为50μL，所用培养基为营养琼脂培养基，培养温度为32℃。将本发明所建方法与前人的方法进行对比：选择3份独立样本，同时使用两种方法对每个样本进行6次独立重复测量。
二、实验结果
1、不同涂布体积和倾注体积对稀释悬液中菌落计数的影响
选用25μL、50μL、100μL、200μL、300μL的涂布体积与0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL的倾注体积对同一个样品进行检测。结果如表3所示，涂布平板计数法中涂布体积为50μL时，检测结果的RSD值最小，检测的细菌活菌数最多；倾注平板计数法中倾注体积对计数结果产生影响，使用1.5mL倾注法检测到的细菌总数最多，为(5.40±0.42)×109CFU/mL，0.5mL倾注法检测到的细菌总数最少。总体而言，涂布法检测的活菌数高于倾注法。因此，类球红细菌平板计数采用涂布平板法，最佳接种体积为50μL。
表3不同涂布体积和倾注体积对稀释悬液中菌落总数的影响
2、培养基种类对细菌计数结果的影响
选取5种不同种类的培养基(营养琼脂培养基、异养细菌培养基、平板计数培养基、LB培养基、琼脂平板培养基)，采用50μL涂布法进行接种。如图(图4)所示，营养琼脂培养基检测细菌的总数最多，异养细菌培养基检测的细菌总数次之，琼脂平板培养基检测细菌的总数最少。因此，类球红细菌计数检测的最佳培养基为营养琼脂培养基。
3、培养温度对细菌计数结果的影响
将营养琼脂培养基分别倒置于28℃、30℃、32℃、37℃条件下进行细菌计数，不同温度对细菌计数结果的影响如表4所示。在32℃时，平板计数法检测细菌的RSD值最小，活菌数最多。因此，32℃为类球红细菌计数检测的最佳温度。
表4不同温度对细菌计数结果的影响
3.1.4平板计数法优化前后检测效果的比较
采用优化后的平板计数法与优化前的平板计数法对3份浓度不同的菌液进行活菌计数。结果如图5所示，本研究优化的平板计数法的测量结果显著高于优化前平板计数法的测量结果。因此，优化的平板计数法更适用于类球红细菌的计数检测。
实施例5类球红细菌标准物质的制备
一、材料、仪器与方法
1.试验材料
类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)(菌种编号GJ15)由华东理工大学国家生化工程技术中心提供；磷酸缓冲盐液(Phosphate Buffered Saline，PBS)；
脱脂奶粉、海藻糖、谷氨酸钠、葡萄糖、乙酸钠、甘油(美国Sigma公司)；棕色西林瓶(深圳市宝安区沙井博海玻璃制品厂)。
2.仪器与设备
Beta1-8 LD plus冷冻干燥机(德国Christ公司)；CR21G高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)；HVE-50高压灭菌锅(日本Hirayama公司)；HWS-400恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；Milli-Q Advantage纯水仪(美国Millipore公司)；CP225D电子天平(德国Sartorius公司)。
3.主要培养基的配制
(1)琼脂平板培养基
称取18.0g葡萄糖，4.5g酵母粉，2g味精，5.25g硫酸铵，8.75g硫酸镁，1.5g磷酸二氢钾，1.2g硫酸亚铁，4.2g氯化钠，20g琼脂粉于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.3±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(2)种子培养基
称取3.5g硫酸铵，2.0g酵母提取物，10.0g葡萄糖，0.75g玉米浆粉，2.0g氯化钠，0.75g磷酸氢二钾，0.75g磷酸二氢钾，0.1g硫酸亚铁，0.3g硫酸镁，1.0g烟酸，1.0g生物素于1000mL蒸馏水，煮沸溶解，调节pH 7.2±0.2，然后于121℃高压灭菌15min。
(3)营养琼脂(NA)
称取10.0g蛋白胨，3.0g牛肉粉，5.0g氯化钠，15.0g琼脂于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调pH值至7.3±0.2，分装试管，121℃高压灭菌15min备用。
(4)磷酸盐(PBS)缓冲液
pH 7.2～7.4PBS的磷酸盐储存液：磷酸二氢钾34.0g，氢氧化钠7.0g，加蒸馏水溶解，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；
pH7.2～7.4PBS的磷酸盐稀释液：取1.25mL磷酸盐储存液加入蒸馏水，调节pH值后用容量瓶定容至1000mL，装入高压灭菌瓶，121℃高压灭菌30min；
4.菌种复活、鉴定与培养
吸取30mL无菌生理盐水于标准类球红细菌菌种冻存管中，待其溶解后，用无菌接种环沾取少量菌液，接种于琼脂平板培养基上，32℃±1℃培养48～52h，复苏菌种。挑取单菌落接种于种子培养基32℃±1℃下培养35h。
5.保护剂的配制
菌体保护剂原料各成分的质量体积百分比为脱脂奶粉5～15％、海藻糖1～5％、谷氨酸钠1～10％、葡萄糖1～10％、乙酸钠1～10％、甘油5～15％。冻干保护剂用磷酸盐缓冲液溶解；且保护剂和磷酸盐缓冲液均需要灭菌；灭菌方法为过滤除菌或高压灭菌；比如，冷冻干燥保护剂经过0.22μm滤膜过滤除菌，磷酸盐缓冲液采用高温高压灭菌121℃，20min。
6.冻干
挑取单菌落于已高压灭菌的种子培养基中，32℃±1℃下，200×g摇床培养32h后，用高速冷冻离心机离心收集菌体，用磷酸盐缓冲溶液稀释至1013级，将保护剂与磷酸盐缓冲溶液稀释至1013级的新鲜菌匀液按照1:1比例配制混合液，用移液器分装10mL至棕色西林瓶中，共制备150个单元。将制备好的样品于-70℃下预冻4h后冻干。冻干采用的参数主要为冷阱温度-50℃，冻干温度-40℃，隔板最终温度25℃，冻干压力0.037mbar。
7.冻干存活率检测
取3份冻干前类球红细菌与冻干保护剂的混合液，每份各30mL，采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。随即取3个单元类球红细菌冻干标准物质，用30mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将类球红细菌冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。冻干存活率(freeze-drying viability,FDV)计算公式：
式中，FDV为类球红细菌冻干存活率；C1为冻干前类球红细菌活菌浓度；C2为冻干后类球红细菌活菌浓度。
8.标准物质的定值
每批次至少抽取9个单元的标准物质进行定值实验。每个单元均按照以下步骤完成实验：用30mL稳定剂水溶液对标准物质进行复水溶解，充分混匀后制备成S0样品匀液；再用无菌磷酸盐缓冲液对充分溶解后的样品S0进行10倍系列稀释；根据给出的类球红细菌活菌浓度范围进行估算，使用免疫荧光流式分析法和平板计数法进行测量，结果以活菌浓度(CFU/mL)表示。
9.标准物质的保存
制备好的标准物质于-20℃下保存。
二、实验结果
1.冻干存活率检测结果
取3份冻干前类球红细菌与冻干保护剂的混合液，每份各30mL，采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。随即取3个单元类球红细菌冻干标准物质，用30mL磷酸盐缓冲液作为稀释液将类球红细菌冻干样品进行复溶后，同样采用经验证的营养琼脂平板涂布法测定其活菌浓度。采用公式计算冻干存活率为75.33％，检测数据与计算结果见表5，证明该类球红细菌与保护剂混合后具有极高的存活率。
表5类球红细菌冻干存活率检测结果
2.标准物质的定值结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分进行测试，每个单元标准物质重复3次。按照JJF1343《标准物质定值的通用原则及统计学原理》对定值数据进行正态分布检验、可疑值检验和等精度检验合格后，取算数平均值作为标准物质的标准值，量值为1.44×109CFU/mL，相对标准偏差为10.06％(见表4)。
表6类球红细菌标准物质的定值结果(m＝9，n＝3)
以上实验证明，通过加入保护剂，可以有效的降低菌体在冷冻干燥过程中的死亡率，本发明的标准物质冻干存活率75.33％，冻干保护效果很好；本发明得到的一种用于校准活细胞在线检测仪的类球红细菌标准物质的标准值为1.44×109CFU/mL，符合活细胞在线检测仪的校准要求。
实施例6类球红细菌标准物质的均匀性评估
一、实验方法
本实验所用类球红细菌标准物质样品按实施例5方法制备。
随机抽取11瓶进行测定，结果采用方差分析法进行均匀性评估，根据自由度为(v1＝10，，v2＝22)及给定的显著性水平α＝0.05。
二、实验结果
经过公式计算得F值＝0.70<F查表值，组内与组间无明显差异，因此样品是均匀的瓶间标准偏差Sbb为0.01×109CFU/mL(详见表7)。
表7类球红细菌标准物质均匀性评估结果(m＝11，n＝3)
以上实验证明，本发明得到的一种用于校准活细胞在线检测仪的类球红细菌标准物质具有良好的均匀性。
实施例7类球红细菌标准物质的稳定性评估
一、实验方法
本实验所用类球红细菌标准物质样品按实施例5方法制备。
对标准物质在不同温度下进行短期稳定性统计评估。短期稳定性考察选取不同温度(-20℃、4℃和25℃)，不同时间点(1，3，5，7和14天)进行测试，每次随机选取3瓶样品，每瓶重复测3次(N＝3，n＝3)，取平均值。
二、实验结果
采用稳定性评估分析方法中的公式分析标准物质在不同温度(-20℃、4℃，和25℃)和不同时间点(1，3，5，7和14天)的稳定性评估实验数据(表8)，结果显示：当标准物质在-20℃保存时，可以稳定保存14天；而在4℃温度下，可以稳定保存5天；在25℃温度下，标准物质不稳定。
表8标准物质的短期稳定性评估实验数据
以上实验证明，本发明得到的用于校准活细胞在线检测仪的标准物质，在-20℃下，可储存14天，便于运输，具有良好的稳定性。
实施例8类球红细菌标准物质不确定度评定
一、实验方法
标准物质的总不确定度由3部分组成。第1部分是通过定值数据的标准偏差、测试次数及所要求的置信水平按统计学方法计算出A类相对标准不确定度urel(A)；第2部分是定值过程中B类相对标准不确定度urel(B)，它的主要来源包括：移液器带来的不确定度、样品稀释因子带来的不确定度；第3部分是标准物质均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)。将这3部分相对标准不确定度合成后计算得到标准值的合成不确定度uC和扩展不确定度U＝kuC(k＝2，置信概率95％)。
1.A类相对标准不确定度评定urel(A)
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按如下贝塞尔公式计算出标准偏差
再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)。
式中，uA为A类标准不确定度；
为平均值的标准偏差；
为平均值；Xi为每个单元标准物质测量结果的平均值；m为测量的标准物质数量。
式中，urel(A)为A类相对标准不确定度；uA为A类标准不确定度；
为平均值。
2.B类相对标准不确定度urel(B)
由营养琼脂平板涂布法结果以及对测量过程的分析，B类相对标准不确定度主要来源包括：
a)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)可通过查询移液器校准证书获得；
b)样品稀释因子带来的相对不确定度urel(d)按照公式⑧计算得到：
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为菌液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为菌液体积的相对标准不确定度。
用公式⑨计算B类类相对标准不确定度urel(B)：
式中，urel(v)为移液器带来的相对标准不确定度；
(3)考虑到A类和B类两部分标准不确定度相互独立，用公式10计算合成相对标准不确定度urel(char)：
式中，urel(char)为合成相对标准不确定度，urel(A)为A类相对标准不确定度；urel(B)为B类类相对标准不确定度；
3.均匀性引入的相对标准不确定度评定urel(bb)
均匀性引入的标准不确定度ubb是将实施例3中的均匀性检验数据通过如下公式计算标准偏差为Sbb获得。
组间差方和
组内差方和
记ν1＝m-1(组间自由度)
ν2＝N-m(组内自由度)
(1)如果
则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
(2)如果
则均匀性的标准偏差Sbb和标准不确定度ubb按如下公式计算：
均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)按如下公式计算：
式中，
为平均值。
4.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U
将A类相对标准不确定度urel(A)、B类相对标准不确定度urel(B)和均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)，按照如下公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U。
合成相对标准不确定度urel(c)为：
扩展不确定度U为：
式中，
为标准物质的标准值。
二、实验结果
1.A类相对标准不确定度评定urel(A)评定结果
将随机抽取的9个单元的标准物质分别采用营养琼脂平板涂布法进行测试，每个单元标准物质重复3次，将3次重复测试结果取平均值得出每个单元标准物质的实验数据按贝塞尔公式计算出标准偏差
为0.07×109CFU/mL，再通过公式计算得出A类相对标准不确定度urel(A)为5.93％，结果见表9。
表9标准物质A类相对标准不确定度评定结果(m＝9)
2.B类相对标准不确定度urel(B)评定结果
B类相对标准不确定度主要来源包括：a)移液器带来的相对标准不确定度urel(v)，查证书得0.14％(k＝2)，
)样品稀释因子带来的相对不确定度urel(d)。
样品稀释是由1mL菌液加入9mL无菌磷酸盐缓冲溶液进行稀释，因此设菌液体积为a，稀释液体积为b，1mL移液枪的相对标准不确定度查校准证书Urel(a)为0.39％(k＝2)，
9mL移液枪的相对标准不确定度查校准证书Urel(b)为0.6％(k＝2)，
稀释液体积是经过6次稀释，稀释倍数K为6，按照公式⑥计算得到urel(d)为0.79％。
式中，urel(d)为样品稀释因子的相对标准不确定度；k为稀释倍数；a为菌液体积(1mL)；b为稀释液体积(9mL)；ub为稀释液体积的标准不确定度；urel(a)为菌液体积的相对标准不确定度。
按照公式⑨合成B类相对不确定度为0.79％
3.均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)评定结果
将实施例2中的均匀性检验数据通过公式计算标准偏差为Sbb为1.0×107CFU/mL，均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)为0.76％，结果见表10。
表10标准物质均匀性引入的相对标准不确定度评定结果
4.合成相对标准不确定度urel(c)和扩展不确定度U评定结果
将A类相对标准不确定度、B类相对标准不确定度、均匀性引起的相对标准不确定度和稳定性引起的相对标准不确定度按照公式合成得出标准物质的合成相对标准不确定度为5.50％，再按照公式计算得扩展不确定度为0.14×109CFU/mL(k＝2)，结果见表11。
合成标准不确定度urel(c)为：
扩展不确定度U为：
表11标准物质不确定度评定结果
以上实验证明，本发明得到的用于校准活细胞在线检测仪的标准物质定值结果的不确定度来源包括：A类标准不确定度、B类标准不确定度和均匀性引起的标准不确定度。标准物质的扩展不确定度为0.14×109CFU/mL(k＝2)。
实施例9类球红细菌在活菌数在线检测仪校准中的应用
一、材料与方法
1.将待测的类球红细菌标准物质加入无菌的磷酸盐缓冲溶液作为稀释液进行复水溶解，得到不同浓度的标准物质菌液。
2.用活菌数在线检测仪检测标准物质活菌数的值。本研究活菌数在线检测装置选用基于电容原理的活细胞传感器，采用标准物质对电极法检测的电容值进行赋值。
二、实验结果
使用标准物质对电极法检测菌悬液的电容值进行赋值，以电容值X(pF/cm)为横坐标，以活菌数Y(Log CFU/mL)为纵坐标绘制电极法的标准曲线。结果显示(图6)，当活菌数在105～1010CFU/mL时，活细胞电极测定的电容值与标准物质的活菌数之间有很好的线性关系，因此可通过建立“活菌数-电容值”的标准曲线(Y＝4.2128X+5.6514，R2＝0.981)，来计算样品中活菌数。
Claims (10)
1.一种活细胞在线检测仪校准用细菌标准物质，其特征在于，所述标准物质中包括类球红细菌，且活菌浓度为1.00×106～1.00×1013CFU/mL，不确定度低于10％。
2.一种类球红细菌标准物质的定值方法，采用类球红细菌免疫荧光流式分析法和类球红细菌平板计数法两种方法定值。
3.权利要求2所述标准物质的定值方法，其特征是：
a)所述类球红细菌免疫荧光流式分析法，是使用特异性免疫荧光探针对细菌进行标记，以识别类球红细菌；使用膜选择通透性荧光探针对类球红细菌死菌进行标记，以区分死菌和活菌；再用流式分析仪进行检测，通过计数不同荧光信号，获得细菌活菌浓度；
b)所述类球红细菌免疫荧光流式分析法的不确定度低于5％；
c)所述类球红细菌平板计数法，是将一定量的类球红细菌接种于营养琼脂培养基，培养后长出肉眼可见的单菌落，通过计数菌落数得知类球红细菌的数量；
d)所述类球红细菌平板计数法的不确定度低于7％。
4.权利要求3所述标准物质的定值方法，所述特异性免疫荧光探针是荧光发射光谱在501nm～540nm的绿色荧光染料通过化学基团交联的类球红细菌抗体；所述膜选择通透性荧光探针是荧光发射光谱在601nm～640nm的红色荧光染料。
5.权利要求3所述标准物质的定值方法，所述类球红细菌平板计数法采用如下技术参数：
1)接种方式：涂布接种；
2)接种体积：0.05mL；
3)使用营养琼脂培养基进行培养；
4)培养时间：58～60h；
5)培养温度：32℃；
且类球红细菌在营养琼脂培养基的菌落特征是：凸起，表面光滑，呈圆形，产生红色色素。
6.权利要求1所述标准物质的制备方法，其特征在于：
1)判定标准物质中细菌浓度是采用免疫荧光流式分析法；
2)将确定浓度的类球红细菌菌液进行冷冻干燥，使用菌体保护剂的冻干物于-20℃下保存。
7.权利要求1所述标准物质的制备方法，制备所述菌体保护剂的原料中含有一种或多种海藻糖。
8.权利要求7所述的标准物质的制备方法，制备所述菌体保护剂的原料组成质量体积百分比为：
脱脂奶粉5％～15％、海藻糖1％～5％、谷氨酸钠1％～10％、葡萄糖1％～10％、乙酸钠1％～10％、甘油5％～15％。
9.权利要求1所述的标准物质在校准活细胞在线检测仪中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其操作方法包括以下步骤：
a)将不同浓度的所述类球红细菌标准物质加入无菌磷酸盐缓冲溶液进行复溶，得到不同浓度的标准物质菌液；
b)通过活细胞在线检测仪测定不同浓度标准物质活菌数的电容值；
c)将活细胞在线检测仪检测的电容值与标准物质的活菌数进行线性拟合；
d)选择活细胞在线检测仪测试浓度范围内的一种或几种浓度细菌标准物质作为测试目标物，评估活细胞在线检测仪准确性。
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| CN202110213958.9A CN113122469A (zh) | 2021-02-26 | 2021-02-26 | 一种活细胞在线检测仪校准用细菌标准物质及其制备方法 |
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